CN104830960A - 产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的筛选及所获基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的筛选及所获基因，通过重组质粒的构建来获得具有高效产该β-甘露聚糖酶的重组菌株的方法,以及重组酶的分离纯化和酶学性质测定，本该β-甘露聚糖酶产生菌经过对该重组菌株的发酵最高酶活可以达到484.5U/mL。对该β-甘露聚糖酶分离纯化及酶学性质研究，该酶比酶活可达8500U/mg,分子量大小约为37kDa，酶的最适温度及pH分别为50℃和5.5，金属离子Hg2+和Ag+，该菌株产生的β-甘露聚糖酶最适酶解温度为50℃，最适pH为5.5。该β-甘露聚糖酶耐碱能力良好，能够在pH3-11保持良好的稳定性。非常适合作为饲料的添加剂。

Description

产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的筛选及所获基因

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种菌种和基因，尤其是产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的筛选及所获基因。

背景技术

β-甘露聚糖酶是水解以β-1,4-D-吡喃甘露糖为主链的甘露寡糖、甘露多糖(甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖)的内切水解酶。β-甘露聚糖及其衍生物是半纤维素的第二大组分，是由β-1,4-甘露糖苷键连接的线状多糖，主链上通常还连接有α-1,6-半乳糖或葡萄糖，主要包括葡糖甘露(glucomannan)、半乳甘露聚糖(galactomannan)、葡糖醛酸甘露聚糖(glucuronomannan)等。在饲料工业中作为一种绿色饲料添加剂，用于消除β-甘露聚糖的抗营养作用。

β-甘露聚糖酶在自然界中广泛存在，植物、动物及微生物。在植物的种子、豆类植物发芽的种子及天南星科植物魔芋萌发的球茎中；在一些海洋软体动物的肠道分泌液中；在微生物如细菌、真菌、放线菌中等，均存在β-甘露聚糖酶。其中，微生物是β-甘露聚糖酶的主要来源，如细菌中的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌，真菌中的曲霉、木霉、酵母、青霉、多孔菌，以及放线菌中的链霉菌等。但是只有微生物β-甘露聚糖酶具有商业价值，微生物β-甘露聚糖酶是最重要工业用酶之一，其广泛应用于造纸行业中，近年来发现甘露聚糖酶也可以应用在食物和饲料、咖啡萃取、石油勘探和清洁剂行业中。尤其微生物β-甘露聚糖酶在饲料行业具有很大的市场。因为β-甘露聚糖酶是一种新型酶制剂，它能有效分解饲料中的β-甘露聚糖，生成甘露寡糖等物质。多项试验表明，在玉米—豆粕型日粮中添加β-甘露聚糖酶，可以提高动物的生产性能和健康水平，从而提高动物的生产水平，这在动物生产上具有重要意义。

微生物产生的β-甘露聚糖酶为多组分型,这些酶组分可能在分子量或等电点上有着微小的差别,但在水解甘露聚糖时活性却明显不同,存在一定的互补关系,这说明微生物β-甘露聚糖酶的诱导和分泌是一个复杂的代谢调节过程。不同来源的β-甘露聚糖酶,对不同来源的底物作用深度及其水解产物是不相同的。β-甘露聚糖酶水解底物的方式和深度主要与α-半乳糖残基和葡萄糖残基在主链中 的位置、含量、酯酰化的程度有关。底物本身的物理状态也会影响酶对底物的作用，如结晶状态的甘露聚糖不易被降解。甘露聚糖经β-甘露聚糖酶作用后,通过HPLC或纸层析方法分析,主要产物是低聚糖(一般2～10个残基),产物聚合度的大小与酶和底物的来源有关,但相对来说,产生单糖(甘露糖)很少或根本不产生。国内外对来源于不同菌种的β-甘露聚糖酶的生产有所报道,但多集中在碱性和中性β-甘露聚糖酶方面,而酸性β-甘露聚糖酶的微生物发酵生产国内很少有报道。而单胃动物饲料中使用的β-甘露聚糖酶要求是酸性的,因此,对酸性β-甘露聚糖酶的研究及其工业化推广将在饲料工业中具有较大的应用潜力。

利用分子生物学手段,可以开发产酶活性高、高效产酶的重组菌种。大部分的细菌来源的β-甘露聚糖酶属中性和酸性的。因此，细菌来源的β-甘露聚糖酶在适应宿主中的表达相关研究也成为了β-甘露聚糖酶研究的关键。因此开发高效产β-甘露聚糖酶在理论和工业应用上具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产耐酸耐蛋白酶甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的筛选方法。

本发明另一个目的通过扩增，获得产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的基因，利用基因重组技术获得高效表达β-甘露聚糖酶的菌株，通过发酵培养制备粗酶液，进一步通过盐析、透析和层析分离制备电泳纯级别β-甘露聚糖酶。

本发明实现目的的技术方案是：

一种产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的筛选方法，步骤如下

(1)初筛：通过LB固体培养基三区划线将来自实验室的枯草芽孢杆菌纯化和活化37℃培养24h，将平板上长出的单菌落依次点接到筛选平板培养基上，37℃培养24h，将配好的刚果红倾倒于长出茵落的筛选平板上，10～15min后，倒去刚果红溶液，用物质的量浓度为l mol/L的NaCI溶液反复冲洗2-3次，加入NaCI溶液静置15min后倒掉，此时，产生β-甘露聚糖酶的茵落周围将会出现透明圈，将具有透明圈直径较大的的菌落进行斜面保存；

(2)斜面保存：将筛选出的产生β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌株划线于斜面培养基上，在30℃恒温培养箱内培养24h，然后置于4℃冰箱保存；

(3)复筛：将初筛得到的菌株进行发酵，利用发酵产生的粗酶液进行耐酸耐蛋白酶实验；

(4)实验方法：1mL粗酶液加入到9mL50mM pH2.0的甘氨酸-盐酸缓冲液中，37℃，120r/min，孵育1h。按照侧酶活的标准方法进行酶活测定，并选取酶活残 留率较高的上述孵育液1mL，加入到含有0.1％胰蛋白酶的9mL 20mM pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液中37℃继续孵育2小时，按照测酶活的标准方法进行酶活测定，选取酶活残留率最高的菌落即为产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌，进行甘油管保存；

(5)甘油管保存：将产耐酸耐蛋白酶活力强的枯草芽孢杆菌菌株接种于LB液体培养基中37℃摇床培养24h，将0.5ml新鲜培养菌液与0.5ml 60％高温灭菌甘油分装于1.5mlEP管中充分混合后，标号后置于-70℃冰箱保存。

一种产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的基因，序列如序列1所示的基因序列。

一种包含产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的基因的基因工程菌，所述宿主菌为毕赤酵母GS115，而且，所述载体为质粒pPIC9K。

一种耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶，由基因工程菌的菌株发酵制得。

而且，所述发酵培养基为：含酵母金粉1％，葡萄糖2％，蛋白胨2％，余量为水的YPD培养基，培养条件为：活化重组菌，30℃、180rpm条件下培养24h，按2％的接种量接入种子培养基(BMGY):100mM磷酸钾PH6.01.34％YNB 4×10^-5％生物素1％甘油，30℃、180rpm条件下培养17h。

而且，将所得的菌体用发酵培养基(BMMY)洗2-3次，最后重悬于BMMY中，30℃、180rpm条件下进行发酵96h，每24h补加终浓度为0.5％的甲醇。所得发酵液于4℃、8000rpm离心20min后，去菌体取上清作为粗酶液。

本发明的优点和有益效果为：

1、本发明源于枯草芽孢杆菌的β-甘露聚糖酶具有耐酸耐蛋白酶的优势，发酵方法简单，成本低，使用刚果红及耐酸耐蛋白酶的筛选方法，操作简单。

2、本发明菌株pPIC9K-man/GS115采用常规单批发酵方式培养，以角豆角为底物测定该β-甘露聚糖酶活。该菌株产生的β-甘露聚糖酶最适酶解温度为50℃，最适pH为5.5。该β-甘露聚糖酶耐碱能力良好，能够在pH3-11保持良好的稳定性。非常适合作为饲料的添加剂。

3、本发明β-甘露聚糖酶适用于饲料添加剂用酶的开发，应用本发明提供的粗酶液进行体外肠道模拟实验，其残留酶活率为80％。

5、应用本发明提供的方法分离纯化β-甘露聚糖酶，β-甘露聚糖酶比酶活从40.1U/mg提高到781U/mg。

6、本发明提供的电泳纯β-甘露聚糖酶的储存稳定性较好，电泳纯β-甘露聚糖酶在4℃和室温下保存一个月后仍旧能够分别保持86.2％和82.7％的残留活性。

7、本发明提供酶对金属离子Hg2+和Ag+，表面活性剂SDS，吐温20，Triton100对该β-甘露聚糖酶有不同程度上的抑制作用，Na+，Ni2+，K+，Ca2+， Mg2+，Ba2+，EDTA对该酶的酶活基本没有影响，Zn2+，Co2+，Cu2+，Fe3+对该酶有明显的激活作用。

8、本发明提供酶的稳定性试验以胰蛋白酶30min处理后仍具有80％以上的残余酶活。

附图说明

图1为产β-甘露聚糖酶枯草芽孢杆菌的平板筛选图；

图2-1与图2-2为β-甘露聚糖酶的耐酸耐蛋白酶实验图；

图3-1与图3-2为转化子在浓度梯度的平板上相同时间内长势图；

图4为阳性酵母转化子的平板筛选图；

图5为本发明β-甘露聚糖酶蛋白的电泳图，其中注：M Marker；1粗酶液；2离子交换层析；3凝胶过滤层析；

图6为本发明pH对β-甘露聚糖酶的活性影响图和pH稳定性图；

图7为本发明温度对β-甘露聚糖酶的活性影响图和温度稳定性图；

图8为本发明金属离子和其他试剂对β-甘露聚糖酶的稳定性图；

图9为β-甘露聚糖酶纯化步骤。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明用的检测和试验方法如下：

以角豆胶为底物，采用分光光度法测定粗酶酶活性，具体测定和计算方法如下：

测量方法：样品：0.5ml适当稀释的酶液+1.5ml角豆胶溶液，50℃保温20min，加入2mlDNS,沸水浴10min，冷却至室温后用去离子水定容至15ml

空白：0.5ml适当稀释的酶液+2mlDNS，50℃保温20min，加入1.5ml角豆胶溶液，沸水浴10min，冷却至室温后用去离子水定容至15ml；

在550nm的条件下测定OD，计算方法：在pH5.5并50℃条件下，每分钟内底物降解释放1μmol D-甘露糖所需要的酶量为一个酶活单位U。

酶活计算公式如下：

A＝nY*1000/(0.5*20*180)

其中：A是酶活

Y是根据标曲得到的甘露糖含量n是稀释倍数 

1000由mg到μg的转化

0.5是酶液体积 

20反应时间20min

180甘露糖的分子量

第一部分：

产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的筛选

1、初筛：通过LB固体培养基三区划线将来自实验室的枯草芽孢杆菌纯化和活化37℃培养24h，将平板上长出的单菌落依次点接到筛选平板培养基上，37℃培养24h，将配好的刚果红倾倒于长出茵落的筛选平板上，10～15min后，倒去刚果红溶液，用物质的量浓度为l mol/L的NaCI溶液反复冲洗2-3次，加入NaCI溶液静置15min后倒掉，此时，产生β-甘露聚糖酶的茵落周围将会出现透明圈。将具有透明圈直径较大的的菌落进行斜面保存。

2、斜面保存：将筛选出的产生β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌株划线于斜面培养基上，在30℃恒温培养箱内培养24h，然后置于4℃冰箱保存。

3、复筛：将初筛得到的菌株进行发酵，利用发酵产生的粗酶液进行耐酸耐蛋白酶实验。

实验方法：1mL粗酶液加入到9mL50mM pH2.0的甘氨酸-盐酸缓冲液中，37℃，120r/min，孵育1h。按照侧酶活的标准方法进行酶活测定，并选取酶活残留率较高的上述孵育液1mL，加入到含有0.1％胰蛋白酶的9mL 20mM pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液中37℃继续孵育2小时，按照测酶活的标准方法进行酶活测定，选取酶活残留率最高的菌落进行甘油管保存。

4、甘油管保存：将产耐酸耐蛋白酶活力强的枯草芽孢杆菌菌株接种于LB液体培养基中37℃摇床培养24h，将0.5ml新鲜培养菌液与0.5ml 60％高温灭菌甘油分装于1.5mlEP管中充分混合后，标号后置于-70℃冰箱保存，标号为：Bacillus sp.TCCC11286。

第二部分：

产β-甘露聚糖酶编码基因(man286)的获得

1、提取Bacillus sp.TCCC11286的基因组；

2、设计以下引物，经过PCR技术扩增出man286；

286-man1F：ggAATTCCATACTgTgTCgCCTgTgAATC

286-man1R：TTgCggCCgCTCACTCAACgATTggCgTTA

3、将PCR产物连接PUCm-T载体上，送华大公司测序，测序结果在BLASTX(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)网站上进行比对。

4、重组酵母的构建GS115/pPIC9K-man286

将连接在PUCm-T载体上的目的基因man286和质粒pPIC9K用限制性内切酶 EcoRI和NotI按照如下提下体系在37摄氏度条件下对其进行酶切，酶切时间3h。

按照如下体系在16摄氏度的条件下，连接经酶切过的目的基因man286和质粒pPIC9K，构建重组质粒pPIC9K-man286，并转化至E.coli JM109感受态中。

提取E.coliJM109/pPIC9K-man286的质粒，用限制性内切酶SalI按照如下体系在37摄氏度条件下对质粒进行线性化。

通过电转将线性化的重组质粒转至毕赤酵母GS115的感受态中，涂布至组氨酸缺陷培养基平板上(MD)，初步筛选转化子。

a.将15μL线性化的质粒加入到刚刚融化的酵母感受态细胞中，用移液枪轻轻吹吸混匀，转入预冷的0.2cm的电转杯中。置于冰上冰浴5min。

b.在1500V，200Ω的条件下，电击混合物。

c.立即加入1mL预冷的1M山梨醇于电转杯中，并将其转入无菌的新的1.5mL离心管中。 

d.4000r/min的转速离心5min，弃掉800μL上清液，用移液枪混匀剩余菌液，涂布于MD平板上，置于30℃恒温培养箱中，培养至长出单克隆。

MD培养基：1.34％YNB 4×10^-5％生物素2％葡萄糖。 

5、筛选GS115/pPIC9K-man286的阳性转化子

⑴将MD平板上长出的单克隆点接到G418浓度梯度的YPD平板上(2mg/ml、4mg/ml)，30℃培养36h。

YPD培养基：葡萄糖2％酵母浸粉1％蛋白胨2％琼脂2％。

⑵将含4mg/ml G418的YPD平板上长出的转化子，点接到以甘露聚糖为唯一碳源的筛选培养基上进一步进行功能筛选：魔芋粉0.5％1.34％YNB 4×10^-5％ 生物素0.5％甲醇。

阳性转化子：可以在含4mg/ml G418的YPD平板上生长，也可以在甘露聚糖为唯一碳源的筛选培养基上生长良好，并且经过刚果红染色，1M Nacl清洗处理以后可以看到菌落周围形成透明圈。

第三部分：

重组β-甘露聚糖酶的制备及纯化

⑴配置含酵母金粉1％，葡萄糖2％，蛋白胨2％，余量为水的YPD培养基，活化重组菌，30℃、180rpm条件下培养24h。按2％的接种量接入种子培养基(BMGY):100mM磷酸钾PH6.01.34％YNB 4×10^-5％生物素1％甘油，30℃、180rpm条件下培养17h。将所得的菌体用发酵培养基(BMMY)洗2-3次，最后重悬于BMMY中，30℃、180rpm条件下进行发酵96h，每24h补加终浓度为0.5％的甲醇。所得发酵液于4℃、8000rpm离心20min后，去菌体取上清作为粗酶液。

BMMY:100mM磷酸钾pH6.01.34％YNB 4×10^-5％生物素0.5％甘油；

⑵于4℃下向粗酶液中加入硫酸铵至浓度达到其饱和浓度的80％，静置4℃冰箱内过夜，在4℃、8000rpm离心20min取沉淀，用磷酸缓冲液(pH7.0)溶解沉淀，在4℃、10000rpm离心15min去除变形蛋白沉淀，回收上清液。

⑶将上述上清液经过透析后，过0.22μm水系膜后，上样至预先用A液平衡好的强阴离子交换层析柱上，用含1M NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为1ml/min，收集含有β-甘露聚糖酶活性的组分。

⑷将离子交换层析后的β-甘露聚糖酶的活性组分收集浓缩，然后上样至预先用pH 7.0的磷酸缓冲液平衡好的分子筛上，用相同的缓冲液进行洗脱，流速为0.5ml/min，收集浓缩含有β-甘露聚糖酶活性组分。

⑸以上盐析、透析、离子交换层析和分子筛步骤如下图9。各步分离获得β-甘露聚糖酶组分的SDS-PAGE电泳图如图5所示，经过分子筛后，SDS-PAGE电泳图获得一条分子量大小约37kDa的单一条带。

第四部分：

重组菌生产制备的β-甘露聚糖酶电泳纯β-甘露聚糖酶的性质，取第二部分中分子筛收集的电泳纯β-甘露聚糖酶进行β-甘露聚糖酶学性质实验。

⑴最适反应pH及pH稳定性：采用pH2-12的0.1M的缓冲液配制β-甘露聚糖酶的催化反应体系，将反应体系于50℃反应15min后分光光度法测定酶活，结果如图6，由图6可知该β-甘露聚糖酶最适反应pH为5.5；采用pH2-12的不同的缓冲液处理酶液1h后，利用分光光度法测定酶活，结果如图6，由图6所示，该β-甘露聚糖酶在pH3-10具有良好的稳定性。

⑵最适反应温度及温度稳定性：采用pH5.5的磷酸缓冲液配置β-甘露聚糖 酶活性测定反应体系，将反应体系分别置于30-75℃的温度下反应15min后测定酶活，结果如图7，由图可得该β-甘露聚糖酶的最适反应温度在50℃；将酶液分别置于30-75℃处理60min后，利用上述分光光度法测定酶活，结果如图7，由图7可得该β-甘露聚糖酶在不同温度处理短时间内具有良好的热稳定性。

⑶金属离子对该β-甘露聚糖酶稳定性的影响：采用含金属离子为1mM和5mM的金属离子溶液和其他试剂处理酶液，4℃处理60min取样测定酶活，结果如图6，由图可知，金属离子Hg²⁺和Ag⁺，表面活性剂SDS，吐温20，Triton100对该β-甘露聚糖酶有不同程度上的抑制作用，Na⁺，Ni²⁺，K⁺，Ca²⁺，Mg²⁺，Ba²⁺，EDTA对该酶的酶活基本没有影响，Zn²⁺，Co²⁺，Cu²⁺，Fe³⁺对该酶有明显的激活作用。

⑷β-甘露聚糖酶蛋白酶稳定性

取柠檬酸盐(pH7.0)10ml，加入胰蛋白酶0.01g，猪胆盐0.3％，混合使其充分溶解，模拟肠道环境。

1ml粗酶液加入9ml甘氨酸-盐酸缓(pH2.0)冲液中，37℃放置1h。然后取1ml上述处理液加入9ml模拟肠液中，37℃继续静置2h。根据标准测酶活的方法测其残余酶活。

经过处理：测到的酶活残留率在80％以上。

本发明高效洗涤性β-甘露聚糖酶在不同金属离子存在下相对酶活的表。

Claims (7)

1.一种产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于：步骤如下

(1)初筛：通过LB固体培养基三区划线将来自实验室的枯草芽孢杆菌纯化和活化37℃培养24h，将平板上长出的单菌落依次点接到筛选平板培养基上，37℃培养24h，将配好的刚果红倾倒于长出茵落的筛选平板上，10～15min后，倒去刚果红溶液，用物质的量浓度为l mol/L的NaCI溶液反复冲洗2-3次，加入NaCI溶液静置15min后倒掉，此时，产生β-甘露聚糖酶的茵落周围将会出现透明圈，将具有透明圈直径较大的的菌落进行斜面保存；

(2)斜面保存：将筛选出的产生β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌株划线于斜面培养基上，在30℃恒温培养箱内培养24h，然后置于4℃冰箱保存；

(3)复筛：将初筛得到的菌株进行发酵，利用发酵产生的粗酶液进行耐酸耐蛋白酶实验；

(4)实验方法：1mL粗酶液加入到9mL50mM pH2.0的甘氨酸-盐酸缓冲液中，37℃，120r/min，孵育1h。按照侧酶活的标准方法进行酶活测定，并选取酶活残留率较高的上述孵育液1mL，加入到含有0.1％胰蛋白酶的9mL 20mM pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液中37℃继续孵育2小时，按照测酶活的标准方法进行酶活测定，选取酶活残留率最高的菌落即为产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌，进行甘油管保存；

(5)甘油管保存：将产耐酸耐蛋白酶活力强的枯草芽孢杆菌菌株接种于LB液体培养基中37℃摇床培养24h，将0.5ml新鲜培养菌液与0.5ml 60％高温灭菌甘油分装于1.5mlEP管中充分混合后，标号后置于-70℃冰箱保存。

2.一种产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的基因，其特征在于：序列如序列1所示的基因序列。

3.一种包含如权利要求1所述的产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的基因的基因工程菌，其特征在于：所述宿主菌为毕赤酵母GS115。

4.根据权利要求3所述的产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的基因的基因工程菌，其特征在于：所述载体为质粒pPIC9K。

5.一种耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶，其特征在于：由权利要求3所述的菌株发酵制得。

6.根据权利要求5所述的耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶，其特征在于：所述发酵培养基为：含酵母金粉1％，葡萄糖2％，蛋白胨2％，余量为水的YPD培养基，培养条件为：活化重组菌，30℃、180rpm条件下培养24h，按2％的接种量接入种子培养基(BMGY):100mM磷酸钾PH6.01.34％YNB 4×10^-5％生物素1％甘油，30℃、180rpm条件下培养17h。

7.根据权利要求5所述的耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶，其特征在于：将所得的菌体用发酵培养基洗2-3次，最后重悬于BMMY中，30℃、180rpm条件下进行发酵96h，每24h补加终浓度为0.5％的甲醇。所得发酵液于4℃、8000rpm离心20min后，去菌体取上清作为粗酶液。