CN103088002A

CN103088002A - 一种多聚半乳糖醛酸酶PG8fn及其基因和应用

Info

Publication number: CN103088002A
Application number: CN2012104685314A
Authority: CN
Inventors: 姚斌; 孟昆; 涂涛; 罗会颖; 石鹏君; 黄火清; 杨培龙; 王亚茹
Original assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2012-11-19
Filing date: 2012-11-19
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2032-11-19
Also published as: CN103088002B

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种多聚半乳糖醛酸酶PG8fn及其基因和应用。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。多聚半乳糖醛酸酶PG8fn在35℃和45℃下处理60min后剩余酶活性在90%以上，这说明此酶具有很好的热稳定性。利用毕赤酵母表达后，比活高达28,122U/mg。

Description

一种多聚半乳糖醛酸酶PG8fn及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种多聚半乳糖醛酸酶PG8fn及其基因和应用。

背景技术

果胶是一类带负电的高分子多糖，由不同酯化度的半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键聚合而成的多糖链，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化合物结合在一起(Stevenson et al.,1988)。它存在于所有的高等植物中，沉积于初生细胞壁和细胞间层，在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白相互交联，使各种细胞组织结构坚硬，表现出固有的形态(O′Neill et al.,2004)。

由于果胶酶能够有效降解果胶质，因此成为不同的工业领域中的新兴酶类。果胶酶中多聚半乳糖醛酸酶在食品行业中有比较广泛的应用，其通常用于果汁的提取和澄清。果汁中存在大量的果胶物质，果胶导致果汁的黏度加大并且混浊(岳强等,2005)。因此在食品工业中，人们利用果胶酶来澄清果汁，它能使果汁过滤的时间缩短很多(屈慧鸽等，2005)。比如用果胶酶处理香蕉、葡萄和苹果等的果肉，能够提高果汁的产量。高比活的多聚半乳糖醛酸酶PG8fn由于其在弱酸性条件下具有较高的酶活且pH稳定性良好，相对于极酸多聚半乳糖醛酸酶有其特有的应用优势。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效应用的多聚半乳糖醛酸酶。

本发明的再一目的是提供编码上述多聚半乳糖醛酸酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述多聚半乳糖醛酸酶的基因工程方法。

本发明从Chaetomium luteum XZ8中分离得到一种多聚半乳糖醛酸酶PG8fn，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

MIPSVLILSLGALAAANPLPAKRASCTFTDAASAISGKKSCSTITLKDITVPAGTTLDLTKLNDGTKVIFSGKTSFGYKEWAGPLISVSGNNIHVEGAPGHVIDGNGAKWWDTKGSNGGKKKPKFFYAHSMKNSNIKGLNVKNTPVQAFSINGAENLGVYDVHLDNSAGDSQGGHNTDAFDVGSSNGVYISGAVVKNQDDCLAINSGTNITFTGGSCSGGHGLSIGSVGGRKDNTVKTVRILNSSISNSQNGVRIKTVYGAKGSVSDVEYSGITLSNISKYGIVIEQDYENGSPTGKPTNGVPITDLTVKGVTGTVKSGATDVYILCAKGACSNWKWSGVSVTGGKKSSKCSNVPSPASC

该酶包括360个氨基酸，N端16个氨基酸预测为信号肽序列。

因此，成熟的多聚半乳糖醛酸酶PG8fn的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

NPLPAKRASCTFTDAASAISGKKSCSTITLKDITVPAGTTLDLTKLNDGTKVIFSGKTSFGYKEWAGPLISVSGNNIHVEGAPGHVIDGNGAKWWDTKGSNGGKKKPKFFYAHSMKNSNIKGLNVKNTPVQAFSINGAENLGVYDVHLDNSAGDSQGGHNTDAFDVGSSNGVYISGAVVKNQDDCLAINSGTNITFTGGSCSGGHGLSIGSVGGRKDNTVKTVRILNS SISNSQNGVRIKTVYGAKGSVSDVEYSGITLSNISKYGIVIEQDYENGSPTGKPTNGVPITDLTVKGVTGTVKSGATDVYILCAKGACSNWKWSGVSVTGGKKSSKCSNVPSPASC

信号肽序列为mipsvlilslgalaaa（SEQ ID NO.3）.

本发明提供了编码上述多聚半乳糖醛酸酶基因PG8fn，具体地，该基因的基因组序列（含有两个内含子）如SEQ ID NO.4所示。

Atgattccgtcggtcctcattctttccctcggcgccctggcggcggccaacccgctccccgccaagcgcgcgagctgcacctttaccgatgctgcctctgccatcagcggcaagaagagctgcagcaccatcaccctcaaggacatcaccgtccccgccggcaccacgttggacctcacaaagctcaacgacggcaccaaggtcatcttctccggcaagacctccttcggctacaaggaatgggccgggcctctcatctccgtctccggcaacaacatccacgtcgagggcgcccccggccatgtcatcgacggcaacggtgccaagtggtgggacaccaagggtagcaatggcggcaagaagaagcccaagtatggctgtccttcctcctcgaaaatccagcggtgactgaccattttgcaggttcttctacgcccatagcatgaagaactccaacatcaagggactcaacgtgaagaacacgcccgtccaggccttcagcatcaacggcgctgaaaacctcggagtgtgagtgataccttgcgtcgctaccttcagagaccacgcctaacacgtcacttaggtacgacgtccacctcgacaactcggccggcgactcccagggcggccacaacaccgacgcgttcgacgtcggttcgtccaacggcgtctacatctcgggtgccgtggtcaagaaccaggacgactgcctggccatcaactccggcaccaacatcaccttcaccggcggctcgtgcagcggcggccacggcctgtccatcggctcggtcggcgggcgcaaggacaacacggtcaagacggtgcgcatcctcaactcgtccatcagcaactcgcagaacggcgtgcgcatcaagaccgtctacggcgccaagggctccgtgtcggacgtcgagtactcgggcatcacactgtccaacatcagcaagtacggcatcgtcatcgagcaggactacgagaacggctcgcccaccggcaagcccaccaacggcgtgcccatcaccgacctgaccgtcaagggcgtcaccggcaccgtcaagtcgggcgccaccgacgtctacatcctctgcgccaagggcgcctgctccaactggaagtggtctggcgtcagcgtcaccggcggcaagaagtcgtccaagtgctccaacgttcccagccctgcctcttgctag

该基因的cDNA序列如SEQ ID NO.5所示。

Atgattccgtcggtcctcattctttccctcggcgccctggcggcggccaacccgctccccgccaagcgcgcgagctgcacctttaccgatgctgcctctgccatcagcggcaagaagagctgcagcaccatcaccctcaaggacatcaccgtccccgccggcaccacgttggacctcacaaagctcaacgacggcaccaaggtcatcttctccggcaagacctccttcggctacaaggaatgggccgggcctctcatctccgtctccggcaacaacatccacgtcgagggcgcccccggccatgtcatcgacggcaacggtgccaagtggtgggacaccaagggtagcaatggcggcaagaagaagcccaagttcttctacgcccatagcatgaagaactccaacatcaagggactcaacgtgaagaacacgcccgtccaggccttcagcatcaacggcgctgaaaacctcggagtgtacgacgtccacctcgacaactcggccggcgactcccagggcggccacaacaccgacgcgttcgacgtcggttcgtccaacggcgtctacatctcgggtgccgtggtcaagaaccaggacgactgcctggccatcaactccggcaccaacatcaccttcaccggcggctcgtgcagcggcggccacggcctgtccatcggctcggtcggcgggcgcaaggacaacacggtcaagacggtgcgcatcctcaactcgtccatcagcaactcgcagaacggcgtgcgcatcaagaccgtctacggcgccaagggctccgtgtcggacgtcgagtactcgggcatcacactgtccaacatcagcaagtacggcatcgtcatcgagcaggactacgagaacggctcgcccaccggcaagcccaccaacggcgtgcccatcaccgacctgaccgtcaagggcgtcaccggcaccgtcaagtcgggcgccaccgacgtctacatcctctgcgccaagggcgcctgctccaactggaagtggtctggcgtcagcgtcaccggcggcaagaagtcgtccaagtgctccaacgttcccagccctgcctcttgctag

去除信号肽序列后核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

aacccgctccccgccaagcgcgcgagctgcacctttaccgatgctgcctctgccatcagcggcaagaagagctgcagcaccatcaccctcaaggacatcaccgtccccgccggcaccacgttggacctcacaaagctcaacgacggcaccaaggtcatcttctccggcaagacctccttcggctacaaggaatgggccgggcctctcatctccgtctccggcaacaacatccacgtcgagggcgcccccggccatgtcatcgacggcaacggtgccaagtggtgggacaccaagggtagcaatggcggcaagaagaagcccaagttcttctacgcccatagcatgaagaactccaacatcaagggactcaacgtgaagaacacgcccgtccaggccttcagcatcaacggcgctgaaaacctcggagtgtacgacgtccacctcgacaactcggccggcgactcccagggcggccacaacaccgacgcgttcgacgtcggttcgtccaacggcgtctacatctcgggtgccgtggtcaagaaccaggacgactgcctggccatcaactccggcaccaacatcaccttcaccggcggctcgtgcagcggcggccacggcctgtccatcggctcggtcggcgggcgcaaggacaacacggtcaagacggtgcgcatcctcaactcgtccatcagcaactcgcagaacggcgtgcgcatcaagaccgtctacggcgccaagggctccgtgtcggacgtcgagtactcgggcatcacactgtccaacatcagcaagtacggcatcgtcatcgagcaggactacgagaacggctcgcccaccggcaagcccaccaacggcgtgcccatcaccgacctgaccgtcaagggcgtcaccggcaccgtcaagtcgggcgccaccgacgtctacatcctctgcgccaagggcgcctgctccaactggaagtggtctggcgtcagcgtcaccggcggcaagaagtcgtccaagtgctccaacgttcccagccctgcctcttgctag

其中，信号肽的基因序列如SEQ ID NO.7所示。

Atgattccgtcggtcctcattctttccctcggcgccctggcggcggcc

本发明还提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶PG8fn的重组载体，优选为pPIC9r-PG8fn。

本发明还提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶PG8fn的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。

本发明还提供了一种制备高比活多聚半乳糖醛酸酶PG8fn的方法，包括以下步骤：

1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组多聚半乳糖醛酸酶表达；

3）回收并纯化所表达的多聚半乳糖醛酸酶PG8fn。

此低温多聚半乳糖醛酸酶的理论分子量为35.5kDa。该多聚半乳糖醛酸酶PG8fn的最适pH为6.0,在pH4.5.0～6.0的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的70%以上。多聚半乳糖醛酸酶PG8fn在pH 3.0-8.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在60%以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性；最适温度45℃，在30℃-55℃范围内，酶活性均维持在最大酶活性的60%以上。多聚半乳糖醛酸酶PG8fn在35℃和45℃下处理60min后剩余酶活性在90%以上，这说明此酶具有很好的热稳定性。利用毕赤酵母表达后，比活高达28,122U/mg。

本发明还提供了编码上述多聚半乳糖醛酸酶PG8fn的基因PG8fn。

本发明通过PCR的方法分离克隆了这一多聚半乳糖醛酸酶基因PG8fn，DNA全序列分析结果表明，多聚半乳糖醛酸酶PG8fn结构基因PG8fn全长1083bp,编码360aa和一个终止密码子，N端16个氨基酸预测为信号肽序列。蛋白理论分子量为35.5kDa，等电点为9.11，为一个第二十八家族的催化结构域。在GenBank中的比对结果表明PG8fn是一个新的内切多聚半乳糖醛酸酶。

本发明还提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶基因的重组载体，优选为pPIC9r-PG8fn。将本发明的多聚半乳糖醛酸酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将多聚半乳糖醛酸酶基因插入到质粒pPIC9r上的8naB I和Not I限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pPIC9r-PG8fn。

本发明还提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/PG8fn。

本发明还提供了一种制备多聚半乳糖醛酸酶的方法，包括以下步骤：

1）用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组多聚半乳糖醛酸酶的表达；

3）回收并纯化所表达的多聚半乳糖醛酸酶。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞GS115，得到重组菌株GS115/PG8fn。

附图说明

图1：在毕赤酵母中表达的重组多聚半乳糖醛酸酶的SDS-PAGE分析，其中，M:低分子量蛋白质Marker；1:去糖基化处理的酶液；2:纯化的酶液。

图2：重组多聚半乳糖醛酸酶的最适pH。

图3：重组多聚半乳糖醛酸酶的pH稳定性。

图4：重组多聚半乳糖醛酸酶的最适温度。

图5：重组多聚半乳糖醛酸酶的热稳定性。

图6：用TOF-MS对重组多聚半乳糖醛酸酶以PGA为底物时的产物分析。

毛壳菌（Chaetomium luteum sp）XZ8(保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101，保藏日期：2012年9月10日)，其保藏号为：CGMCCNo.6545)

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：表达宿主Pichia pastoris GS115，表达质粒载体pPIC9r为本实验室保存。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司，多聚半乳糖醛酸购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、培养基：

（1）LB培养基（g/1）：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0,pH7.0。

（2）平板筛选培养基（g/1）：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0,琼脂15.0，pH7.0。

实施例1毛壳菌XZ8（Chaetomium luteum sp.XZ8）的分离

毛壳菌Chaetomium luteum sp.XZ8用PDA培养基在45℃的条件下筛选自宁夏沙土样品。菌落呈圆形，边缘整齐，气生菌丝白色、较长，与培养基结合紧密。XZ8在19℃下几乎不生长，在30℃下需要3d才可生长，在45℃下只需1-2d即可生长，为典型的嗜热真菌。

实施例2毛壳菌Chaetomiaceae sp.XZ8来源的多聚半乳糖醛酸酶编码基因PG8fn的克隆

提取基因组DNA及RNA。根据第二十八家族内切多聚半乳糖醛酸酶真菌基因的保守[NQDDCL(V)A和NGVRI(V)KT]序列设计合成了简并引物G28n-F和G28n-R：

G28n-F：5'-GAACCARGAYGAYTGYSTIGC-3';

G28n-R：5'-GGTCTTNAYNCKNACICCRTT-3'

以上述的毛壳菌Chaetomium luteum sp.XZ8基因组DNA为模板进行PCR扩增。降落PCR反应参数为：94℃变性5min；94℃变性30sec，51-46℃退火30sec，72℃延伸1min，10个循环（每个循环降落0.5℃），然后94℃变性30sec，46℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，72℃保温10min。得到一约180bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。

根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般20～30nt，退火温度在61℃。并将它们分别命名为8fn-uSP1,8fn-uSP2,8fn-uSP3(上游特异性引物);8fn-dSP1,8fn-dSP2,8fn-dSP3(下游特异性引物)见表1。按照改进的TAIL-PCR(Huanget al.,2010)中的程序对两端侧翼序列进行扩增。

表1.多聚半乳糖醛酸酶PG8fn TAIL-PCR特异性引物

通过改进的TAIL-PCR(Huang et al.,2010)得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。通过序列拼接获得该片段的上下游侧翼序列，全序列共长约1.2kb。再以cDNA为模板，8fn-m-F/R引物进行PCR扩增，将得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。多聚半乳糖醛酸酶基因PG8fn完整的开放阅读框（ORF）由1083个碱基组成，编码360个氨基酸和一个终止密码子，在GenBank中的比对结果表明为新基因。PG8fn编码蛋白预计分子量为35.5kDa，等电点为9.18。经预测，PG8fn前16个氨基酸为信号肽序列。

实施例3多聚半乳糖醛酸酶的制备。

将表达载体pPIC9r进行双酶切(SnaB I+Not I)，同时将编码多聚半乳糖醛酸酶的基因PG8fn双酶切(SnaB I+Not I)，切好的编码成熟多聚半乳糖醛酸酶的基因片段（去除信号肽片段）与表达载体pPIC9r连接，获得含有多聚半乳糖醛酸酶基因PG8fn的重组质粒pPIC9r-PG8fn并转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株GS115/PG8fn。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养基的1L三角瓶中，置于30°C，220rpm摇床培养48h；后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用100mL含有0.5%甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30°C，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5mL甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5%，同时取上清用于酶活性检测。

重组多聚半乳糖醛酸酶的表达量为39,110.7U/mL，比活高达28,122U/mg。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组多聚半乳糖醛酸酶在毕赤酵母中得到了表达。所表达的多聚半乳糖醛酸酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的95％以上。

将含有信号肽的基因以同样方法进行表达，也检测到多聚半乳糖醛酸酶的酶活。

实施例4重组多聚半乳糖醛酸酶的活性分析

一、DNS法：具体方法如下：在给定的pH、温度条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mLDNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下，每分钟分解多聚半乳糖醛酸生成1μmol D-(+)-半乳糖醛酸所需的酶量。

二、重组多聚半乳糖醛酸酶的性质测定

1、重组多聚半乳糖醛酸酶的最适pH和pH稳定性的测定方法如下:

将实施例3纯化的重组多聚半乳糖醛酸酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物多聚半乳糖醛酸用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中45℃下进行多聚半乳糖醛酸酶活力测定。结果(图2)表明，PG8fn的最适pH为6.0,在pH4.5.0-6.0的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的70%以上。多聚半乳糖醛酸酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min,再在pH6.0缓冲液体系中45℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图3)表明，在pH 3.0-8.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在60%以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性。

2、多聚半乳糖醛酸酶的最适温度及热稳定性测定方法如下:

多聚半乳糖醛酸酶的最适温度的测定为在0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为多聚半乳糖醛酸酶在不同温度下处理不同时间，再在45℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明,其最适温度为40-45℃。酶的热稳定性试验表明(图5)，重组酶在35℃和45℃时稳定性非常好。55℃下保温60min，剩余酶活性为30%。

3、多聚半乳糖醛酸酶的K_m值测定方法如下:

参照本实验室李宁的方法(李宁,2009)，测定反应的一级反应时间。确定测定Km及Vmax的反应时间为5min。用不同浓度的多聚半乳糖醛酸(1.25，1.0，0.8，0.4，0.2，0.15和0.1%)为底物，在最适条件下测定酶活性，计算出相应的反应速度，利用GraphPad Prism 5软件计算Km值及Vmax。

PG8fn以多聚半乳糖醛酸为底物时，在最适条件下的Km值、Vmax值分别是0.5mg/mL和1250U/min/mg。

4、不同金属离子化学试剂对PG8fn酶活的影响测定如下:

在酶促反应体系中加入1mM的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在45℃、pH6.0条件下测定酶活性。结果(表3)表明，β-Mercaptoethanol、Fe³⁺、Zn²⁺对酶活都有促进作用；Mg²⁺对酶活有轻微的抑制作用；Ag⁺、Ca²⁺对酶活有强烈的抑制作用；其它离子对该酶的作用不明显。

表2.各种金属离子和化学试剂对PG8fn活力的影响

离子和化学试剂	相对剩余活力(％)^a	离子和化学试剂	相对剩余活力(％)^a
				Control	100	Cr³⁺	80±1.9
β-Mercaptoethanol	125±2.1	Mg²⁺	63±0.69
				Ag⁺	16±1.8	Na⁺	83±0.84
Ca²⁺	39±2.1	Pb²⁺	94±0.84
				Fe³⁺	109±1.3	Li⁺	83±0.87
K⁺	94±0.84	Cu²⁺	79±0.36
				SDS	92±0.76	Co²⁺	88±1.33
Zn²⁺	109±2.1	Ni²⁺	87±2.5

EDTA

75±2.1

Mn²⁺

84±0.46

5、重组多聚半乳糖醛酸酶PG8fn的底物特异性。

纯化后重组酶底物特异性的测定是通过纯酶液与各种甲酯化的果胶(P9311，DM:34%；P9436，DM:70%；P9561,DM:85%)在最适反应条件下测定相对酶活力来完成的。以多聚半乳糖醛酸作为底物所测得的相对活性定义为100%。

以多聚半乳糖醛酸的相对酶活为100%，同等条件下，PG I对各种甲酯化的果胶(P9311，DM:34%；P9436，DM:70%；P9561,DM:85%)的酶活分别为60.99%,28.97%和25.24%。这说明甲酯化程度越高，酶对底物的降解变弱。

6、多聚半乳糖醛酸酶PG8fn的产物分析如下：

在多聚半乳糖醛酸底物中加入适量重组酶，在最适pH下37°C保温12h。用3kDa超滤管超滤去除酶和未降解的底物。将超滤液置于真空冷冻干燥器中干燥成粉末状，并托付中国医药科学研究院进行TOF-MS产物分析。产物分析发现，PG8fn在较长反应时间下，可以将底物完全降解成二聚体半乳糖醛酸（图6），通过序列比对和结构分析，以及参照其酶活力的大小，将其归类为内切型多聚半乳糖醛酸酶。

Claims

1.一种多聚半乳糖醛酸酶PG8fn，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。

2.一种多聚半乳糖醛酸酶基因PG8fn，其特征在于，其编码权利要求1所述的多聚半乳糖醛酸酶PG8fn。

3.根据权利要求2所述的多聚半乳糖醛酸酶基因PG8fn，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

4.包含权利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶基因PG8fn的重组载体。

5.包含权利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶基因PG8fn的重组载体pPIC9r-PG8fn。

6.包含权利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶基因PG8fn的重组菌株。

7.如权利要求2所述的重组菌株，其特征在于，其所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。

8.根据权利要求8所述的重组菌株，所述重组菌株为重组毕赤酵母菌株GS115/PG8fn。

9.权利要求1所述多聚半乳糖醛酸酶PG8fn的应用。

10.毛壳菌XZ8（Chaetomium luteum sp.XZ8），其保藏编号为CGMCC No.6545。