CN103409388B - 含果胶酯酶s6pe-pe和多聚半乳糖醛酸酶s6pe-pg的杂合酶s6pe-a及其基因和应用 - Google Patents
含果胶酯酶s6pe-pe和多聚半乳糖醛酸酶s6pe-pg的杂合酶s6pe-a及其基因和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种含有果胶酯酶S6PE-PE和多聚半乳糖醛酸酶S6PE-PG的双结构域杂合酶S6PE-A及其基因和应用。其氨基酸序列如SEQ ID NO.3或5所示。果胶酯酶S6PE-PE、多聚半乳糖醛酸酶S6PE-PG和双结构域杂合酶S6PE-A的最适pH值为5.0，最适温度为50℃；多聚半乳糖醛酸酶S6PE-PG和双结构域杂合酶S6PE-A在40℃下处理60min后剩余多聚半乳糖醛酸酶活性在90%以上；在pH3.0—7.0条件下处理60min后剩余多聚半乳糖醛酸酶活性在65%以上，这说明此酶具有很好的热稳定性和pH稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及含果胶酯酶S6PE-PE和多聚半乳糖醛酸酶S6PE-PG的杂合酶S6PE-A及其基因和应用。
背景技术
果胶是一类带负电的高分子多糖，由不同酯化度的半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键聚合而成的多糖链，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化合物结合在一起(Stevenson et al.,1988)。它存在于所有的高等植物中，沉积于初生细胞壁和细胞间层，在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白相互交联，使各种细胞组织结构坚硬，表现出固有的形态(O'Neill et al.,2004)。
由于果胶酶能够有效降解果胶质，因此成为不同的工业领域中的新兴酶类。果胶酶中多聚半乳糖醛酸酶在食品行业中有比较广泛的应用，其通常用于果汁的提取和澄清。果汁中存在大量的果胶物质，果胶导致果汁的黏度加大并且混浊(岳强等,2005)。因此在食品工业中，人们利用果胶酶来澄清果汁，它能使果汁过滤的时间缩短很多(屈慧鸽等，2005)。比如用果胶酶处理香蕉、葡萄和苹果等的果肉，能够提高果汁的产量。但是，通过我们研究发现，多聚半乳糖醛酸酶不能水解酯化的果胶，并且随着果胶酯化程度的提高，酶活力下降。果胶酯酶在对果胶脱酯化后能够明显提高多聚半乳糖醛酸酶的酶活力，两者显示出极好的协同效应。因此，拥有良好热稳定性和pH稳定性的果胶酯酶和多聚半乳糖醛酸酶双结构域的果胶酶，相对于单结构域的多聚半乳糖醛酸酶有其特有的应用优势。
发明内容
本发明的目的是提供一种能高效应用的含有果胶酯酶和多聚半乳糖醛酸酶的双结构域杂合酶。
本发明的再一目的是提供编码上述含有果胶酯酶和多聚半乳糖醛酸酶的双结构域杂合酶的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明的另一目的是提供一种制备上述多聚半乳糖醛酸酶的基因工程方法。
本发明从Penicilliumsp.Sx6中分离得到一种含有果胶酯酶S6PE-PE和多聚半乳糖醛酸酶S6PE-PG的双结构域杂合酶S6PE-A。
果胶酯酶S6PE-PE氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
Mktplciflaalsavshalpglaheaveertvcsgasartvpakhavvvdnsarpfpgsyntvqagvdalsktasipqtlfifpgtyneqvyiprlasnltvqgytcnaksyqhntatitynlalinttsddltatlrqwnpntkiynlnvvntfghipkngqnlavsaetghqgyygcqligyqdtllaetgtqlyakslivgavdfifgqtalawfenidirtiapgcitasgrssadnpswyvisrstitgindtiaagtnylgrpwrsfarvvfqdsylgdiidpsgwerwststpntedvtfaefknrgpgsvreegpranfseqlsspipirsilgerfedewwvdtdyl
多聚半乳糖醛酸酶S6PE-PG氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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双结构域杂合酶S6PE-A氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
Mktplciflaalsavshalpglaheaveertvcsgasartvpakhavvvdnsarpfpgsyntvqagvdalsktasipqtlfifpgtyneqvyiprlasnltvqgytcnaksyqhntatitynlalinttsddltatlrqwnpntkiynlnvvntfghipkngqnlavsaetghqgyygcqligyqdtllaetgtqlyakslivgavdfifgqtalawfenidirtiapgcitasgrssadnpswyvisrstitgindtiaagtnylgrpwrsfarvvfqdsylgdiidpsgwerwststpntedvtfaefknrgpgsvreegpranfseqlsspipirsilgerfedewwvdtdylepsdlkttkskpsastysrttanseyttittslvissplttvaatlsptaaptpssspassspsassstnctctecaqisaavkscteivlsniavpdgsavdlsglragstvrfdglttfgftnsssfnpitisgsgitvtanpgaiidgngqaywdgqgsnggvpkpdhfivvkkvtgnsiieklhiqnwpvhlftisscsdlvfqdlvlnntagdapnarsgslpaahnsdgfdvsssnnivirrsvvfnqddcvavtsgnnmtiselechgghglsigsvglksnnnvtnikftdssvhdssngcriktnynatgyvanitfsdislhgittygidvqqdylnggptgnpsngviienllfenvtgtatsaaqdyyvlcgegscselvfdgvsieggsvasscnfpmtgcps
双结构域杂合酶S6PE-A包括772个氨基酸，N端18个氨基酸为信号肽序列。
因此，成熟的果胶酯酶S6PE-PE的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
Lpglaheaveertvcsgasartvpakhavvvdnsarpfpgsyntvqagvdalsktasipqtlfifpgtyneqvyiprlasnltvqgytcnaksyqhntatitynlalinttsddltatlrqwnpntkiynlnvvntfghipkngqnlavsaetghqgyygcqligyqdtllaetgtqlyakslivgavdfifgqtalawfenidirtiapgcitasgrssadnpswyvisrstitgindtiaagtnylgrpwrsfarvvfqdsylgdiidpsgwerwststpntedvtfaefknrgpgsvreegpranfseqlsspipirsilgerfedewwvdtdyl
成熟的多聚半乳糖醛酸酶S6PE-PG氨基酸序列同SEQ ID NO.2所示。
成熟的双结构域杂合酶S6PE-A氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
lpglaheaveertvcsgasartvpakhavvvdnsarpfpgsyntvqagvdalsktasipqtlfifpgtyneqvyiprlasnltvqgytcnaksyqhntatitynlalinttsddltatlrqwnpntkiynlnvvntfghipkngqnlavsaetghqgyygcqligyqdtllaetgtqlyakslivgavdfifgqtalawfenidirtiapgcitasgrssadnpswyvisrstitgindtiaagtnylgrpwrsfarvvfqdsylgdiidpsgwerwststpntedvtfaefknrgpgsvreegpranfseqlsspipirsilgerfedewwvdtdylepsdlkttkskpsastysrttanseyttittslvissplttvaatlsptaaptpssspassspsassstnctctecaqisaavkscteivlsniavpdgsavdlsglragstvrfdglttfgftnsssfnpitisgsgitvtanpgaiidgngqaywdgqgsnggvpkpdhfivvkkvtgnsiieklhiqnwpvhlftisscsdlvfqdlvlnntagdapnarsgslpaahnsdgfdvsssnnivirrsvvfnqddcvavtsgnnmtiselechgghglsigsvglksnnnvtnikftdssvhdssngcriktnynatgyvanitfsdislhgittygidvqqdylnggptgnpsngviienllfenvtgtatsaaqdyyvlcgegscselvfdgvsieggsvasscnfpmtgcps
信号肽序列为Mktplciflaalsavsha.
本发明提供了编码上述双结构域杂合酶基因S6PE-A，具体地，该基因的基因组序列（含有两个内含子）如SEQ ID NO.6所示。
atgaaaacgccactctgtatttttcttgcggcgctatctgctgtatcgcatgcacttccagggctcgcgcatgaggctgttgaagaacgtacagtctgttccggtgcatctgcccggacagtgcctgcgaaacatgcagtagtcgtcgacaacagtgcgcggccgttccccggatcttataacacagtccaggcaggcgtcgacgctcttagcaagacggccagtattccacaaacgctatttattttccctggtacatacaacgagcaagtgtatattccacgcctcgcctccaaccttacagtccagggatatacatgcaatgccaagagctatcaacataacacagcgactatcacctacaatcttgcgctcatcaacacgaccagcgatgatctgacagcgactttgcgccaatggaatccaaacacgaagatctacaacctgaatgttgttaacaccttcggtcacattcccaagaacggtcaaaatctcgcggtgtcagcggaaaccggtcatcaggggtactacggctgccagctgataggttatcaggatactttactcgctgaaactggtacgtaggcagaggaagaccaaatgacctttctatagttcgcaaactaatgccccatactatccaggtactcaactttatgcgaagagcctgattgtgggcgctgttgactttatctttgggcaaacggctttggcgtggttcgagaacattgacattcgaaccatcgcaccggggtgcatcacagcctccggccgcagcagcgcagacaatccatcctggtatgtgatcagtcgctcaacgatcacgggtatcaacgatacaattgcagctggaacaaactacttgggccgaccgtggcgctctttcgcccgcgtggttttccaagattcctacctcggcgatatcatcgatccatcgggatgggagcgatggtccacgagtactcctaacaccgaggatgtgacatttgccgaattcaaaaatcgtggacctggatctgtgagagaagaagggcctcgagccaattttagtgaacaactttccagtcccattcctattcggtctattctgggcgagagatttgaagacgagtggtgggtagacaccgattaccttgagcccagcgacctgaaaaccacaaagtcgaaaccaagcgcttcaacctactcaagaacgactgcaaattctgaatatacaacaatcacaacttccctagtcatttcaagccccttgacaaccgtagcggcaaccctatcgcctaccgctgcgcctacgccctcatcttcacccgcatcatcgagcccttccgcctcatcaagtaccaactgtacttgcactgaatgtgcacagatctcggcggccgtgaaatcctgcactgaaattgttttgtcaaacatcgccgtccccgatggatctgccgtcgacctctctggacttcgggcaggatcgactgtgagatttgatggactgacgacttttggctttaccaactcttccagtttcaacccgataactatcagtgggtccggcattacagtgacggcaaaccctggagccatcattgacggtaatgggcaagcttactgggatggtcagggttcaaacggcggtgtgcccaagcccgaccattttattgtggtgaagaaggtgactgggaactcgatcattgagaaattacatattcagaactggccggtccatctcttcaccattagcagttgctcggacctcgtcttccaggacctggtactgaataacactgccggcgatgcgccaaacgccagaagtggaagcctgccagcagcacacaattcggatggctttgacgtcagcagttcaaacaacattgtcatccggcgcagtgttgtgttcaatcaagatgactgtgtagccgtgaccagtggtaacaacatgacgatatccgagctggaatgccatggcggacacggcctttctattggctcagtcgggctgaaatccaataataatgtgacaaacatcaaggtaaaggccgtcttcgatccaggggggctatccagtcaccccaaatttcctttatctggcgtgcagatcgctccatgaggctgcacgtttacgtcggtgcaggattgaacttttgctaacccaaaattattgactacaaatagtttactgactcatccgtccatgattcttcgaatggttgtcgcatcaagaccaactataacgcgacgggatacgttgctaacatcaccttttccgatatttcgcttcatgggattactacttatggaatcgatgtgcaacaagactacctcaacggtgggccgaccgggaacccgtcgaatggggtgatcattgaaaacctcttgttcgagaacgtgaccggcacagccacctcagctgcacaggattactatgtcctttgtggagagggctcgtgctctgagcttgtttttgatggtgtctcgatcgagggaggatctgtggccagcagttgcaactttcctatgactggatgcccgtcttga
双结构域杂合酶基因S6PE-A的cDNA序列如SEQ ID NO.7所示。
atgaaaacgccactctgtatttttcttgcggcgctatctgctgtatcgcatgcacttccagggctcgcgcatgaggctgttgaagaacgtacagtctgttccggtgcatctgcccggacagtgcctgcgaaacatgcagtagtcgtcgacaacagtgcgcggccgttccccggatcttataacacagtccaggcaggcgtcgacgctcttagcaagacggccagtattccacaaacgctatttattttccctggtacatacaacgagcaagtgtatattccacgcctcgcctccaaccttacagtccagggatatacatgcaatgccaagagctatcaacataacacagcgactatcacctacaatcttgcgctcatcaacacgaccagcgatgatctgacagcgactttgcgccaatggaatccaaacacgaagatctacaacctgaatgttgttaacaccttcggtcacattcccaagaacggtcaaaatctcgcggtgtcagcggaaaccggtcatcaggggtactacggctgccagctgataggttatcaggatactttactcgctgaaactggtactcaactttatgcgaagagcctgattgtgggcgctgttgactttatctttgggcaaacggctttggcgtggttcgagaacattgacattcgaaccatcgcaccggggtgcatcacagcctccggccgcagcagcgcagacaatccatcctggtatgtgatcagtcgctcaacgatcacgggtatcaacgatacaattgcagctggaacaaactacttgggccgaccgtggcgctctttcgcccgcgtggttttccaagattcctacctcggcgatatcatcgatccatcgggatgggagcgatggtccacgagtactcctaacaccgaggatgtgacatttgccgaattcaaaaatcgtggacctggatctgtgagagaagaagggcctcgagccaattttagtgaacaactttccagtcccattcctattcggtctattctgggcgagagatttgaagacgagtggtgggtagacaccgattaccttgagcccagcgacctgaaaaccacaaagtcgaaaccaagcgcttcaacctactcaagaacgactgcaaattctgaatatacaacaatcacaacttccctagtcatttcaagccccttgacaaccgtagcggcaaccctatcgcctaccgctgcgcctacgccctcatcttcacccgcatcatcgagcccttccgcctcatcaagtaccaactgtacttgcactgaatgtgcacagatctcggcggccgtgaaatcctgcactgaaattgttttgtcaaacatcgccgtccccgatggatctgccgtcgacctctctggacttcgggcaggatcgactgtgagatttgatggactgacgacttttggctttaccaactcttccagtttcaacccgataactatcagtgggtccggcattacagtgacggcaaaccctggagccatcattgacggtaatgggcaagcttactgggatggtcagggttcaaacggcggtgtgcccaagcccgaccattttattgtggtgaagaaggtgactgggaactcgatcattgagaaattacatattcagaactggccggtccatctcttcaccattagcagttgctcggacctcgtcttccaggacctggtactgaataacactgccggcgatgcgccaaacgccagaagtggaagcctgccagcagcacacaattcggatggctttgacgtcagcagttcaaacaacattgtcatccggcgcagtgttgtgttcaatcaagatgactgtgtagccgtgaccagtggtaacaacatgacgatatccgagctggaatgccatggcggacacggcctttctattggctcagtcgggctgaaatccaataataatgtgacaaacatcaagtttactgactcatccgtccatgattcttcgaatggttgtcgcatcaagaccaactataacgcgacgggatacgttgctaacatcaccttttccgatatttcgcttcatgggattactacttatggaatcgatgtgcaacaagactacctcaacggtgggccgaccgggaacccgtcgaatggggtgatcattgaaaacctcttgttcgagaacgtgaccggcacagccacctcagctgcacaggattactatgtcctttgtggagagggctcgtgctctgagcttgtttttgatggtgtctcgatcgagggaggatctgtggccagcagttgcaactttcctatgactggatgcccgtcttga
去除信号肽序列后核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
cttccagggctcgcgcatgaggctgttgaagaacgtacagtctgttccggtgcatctgcccggacagtgcctgcgaaacatgcagtagtcgtcgacaacagtgcgcggccgttccccggatcttataacacagtccaggcaggcgtcgacgctcttagcaagacggccagtattccacaaacgctatttattttccctggtacatacaacgagcaagtgtatattccacgcctcgcctccaaccttacagtccagggatatacatgcaatgccaagagctatcaacataacacagcgactatcacctacaatcttgcgctcatcaacacgaccagcgatgatctgacagcgactttgcgccaatggaatccaaacacgaagatctacaacctgaatgttgttaacaccttcggtcacattcccaagaacggtcaaaatctcgcggtgtcagcggaaaccggtcatcaggggtactacggctgccagctgataggttatcaggatactttactcgctgaaactggtactcaactttatgcgaagagcctgattgtgggcgctgttgactttatctttgggcaaacggctttggcgtggttcgagaacattgacattcgaaccatcgcaccggggtgcatcacagcctccggccgcagcagcgcagacaatccatcctggtatgtgatcagtcgctcaacgatcacgggtatcaacgatacaattgcagctggaacaaactacttgggccgaccgtggcgctctttcgcccgcgtggttttccaagattcctacctcggcgatatcatcgatccatcgggatgggagcgatggtccacgagtactcctaacaccgaggatgtgacatttgccgaattcaaaaatcgtggacctggatctgtgagagaagaagggcctcgagccaattttagtgaacaactttccagtcccattcctattcggtctattctgggcgagagatttgaagacgagtggtgggtagacaccgattaccttgagcccagcgacctgaaaaccacaaagtcgaaaccaagcgcttcaacctactcaagaacgactgcaaattctgaatatacaacaatcacaacttccctagtcatttcaagccccttgacaaccgtagcggcaaccctatcgcctaccgctgcgcctacgccctcatcttcacccgcatcatcgagcccttccgcctcatcaagtaccaactgtacttgcactgaatgtgcacagatctcggcggccgtgaaatcctgcactgaaattgttttgtcaaacatcgccgtccccgatggatctgccgtcgacctctctggacttcgggcaggatcgactgtgagatttgatggactgacgacttttggctttaccaactcttccagtttcaacccgataactatcagtgggtccggcattacagtgacggcaaaccctggagccatcattgacggtaatgggcaagcttactgggatggtcagggttcaaacggcggtgtgcccaagcccgaccattttattgtggtgaagaaggtgactgggaactcgatcattgagaaattacatattcagaactggccggtccatctcttcaccattagcagttgctcggacctcgtcttccaggacctggtactgaataacactgccggcgatgcgccaaacgccagaagtggaagcctgccagcagcacacaattcggatggctttgacgtcagcagttcaaacaacattgtcatccggcgcagtgttgtgttcaatcaagatgactgtgtagccgtgaccagtggtaacaacatgacgatatccgagctggaatgccatggcggacacggcctttctattggctcagtcgggctgaaatccaataataatgtgacaaacatcaagtttactgactcatccgtccatgattcttcgaatggttgtcgcatcaagaccaactataacgcgacgggatacgttgctaacatcaccttttccgatatttcgcttcatgggattactacttatggaatcgatgtgcaacaagactacctcaacggtgggccgaccgggaacccgtcgaatggggtgatcattgaaaacctcttgttcgagaacgtgaccggcacagccacctcagctgcacaggattactatgtcctttgtggagagggctcgtgctctgagcttgtttttgatggtgtctcgatcgagggaggatctgtggccagcagttgcaactttcctatgactggatgcccgtcttga
其中，信号肽的基因序列为Atgaaaacgccactctgtatttttcttgcggcgctatctgctgtatcgcatgca
本发明还提供了包含上述果胶酯酶基因S6PE-PE和多聚半乳糖醛酸酶基因S6PE-PG的双结构域杂合酶基因S6PE-A的重组载体，优选为pPIC9-S6PE-PE、pPIC9-S6PE-PG和pPIC9-S6PE-A。
本发明还提供了包含上述含有果胶酯酶S6PE-PE和多聚半乳糖醛酸酶S6PE-PG的双结构域杂合酶S6PE-A的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。
本发明还提供了一种制备含有果胶酯酶S6PE-PE和多聚半乳糖醛酸酶S6PE-PG的双结构域杂合酶S6PE-A的方法，包括以下步骤：
1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2）培养重组菌株，诱导重组果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和双结构域杂合酶表达；
3）回收并纯化所表达的果胶酯酶S6PE-PE、多聚半乳糖醛酸酶S6PE-PG和双结构域杂合酶S6PE-A。
此低温果胶酯酶S6PE-PE、多聚半乳糖醛酸酶S6PE-PG和双结构域杂合酶S6PE-A的理论分子量分别为37.1kDa、35.8kDa和79.9kDa。果胶酯酶S6PE-PE、多聚半乳糖醛酸酶S6PE-PG和双结构域杂合酶S6PE-A的最适pH均为5.0,在pH4.5～5.5的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的60%以上。多聚半乳糖醛酸酶S6PE-PG和双结构域杂合酶S6PE-A在pH3.0-7.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在65%以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性；最适温度50℃，在40℃-50℃范围内，酶活性均维持在最大酶活性的65%以上。多聚半乳糖醛酸酶S6PE-PG和双结构域杂合酶S6PE-A在40℃下处理60min后剩余酶活性在90%以上，这说明此酶具有很好的热稳定性。
本发明还提供了编码上述果胶酯酶S6PE-PE、多聚半乳糖醛酸酶S6PE-PG和双结构域杂合酶S6PE-A的基因S6PE-PE、S6PE-PG和S6PE-A。
本发明通过PCR的方法分离克隆了果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和双结构域杂合酶的基因S6PE-PE、S6PE-PG和S6PE-A，双结构域杂合酶的基因DNA全序列分析结果表明，S6PE-A结构基因S6PE-A全长2319bp,编码770aa和一个终止密码子，N端18个氨基酸为信号肽序列。蛋白理论分子量分别为37.1kDa、35.8kDa和79.9kDa。包含果胶酯酶和多聚半乳糖醛酸酶两个结构域，为一个糖酯酶第八家族和糖苷水解酶第二十八家族串联成两个催化结构域。在GenBank中的比对结果表明S6PE-A是一个新的果胶酶。
本发明还提供了包含上述果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和双结构域杂合酶基因的重组载体，优选为pPIC9-S6PE-PE、pPIC9-S6PE-PG和pPIC9-S6PE-A。将本发明的果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和双结构域杂合酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和双结构域杂合酶基因插入到质粒pPIC9r上的SnaBI和Not I限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pPIC9-S6PE-PE、pPIC9-S6PE-PG和pPIC9-S6PE-A。
本发明还提供了包含上述果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和双结构域杂合酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/S6PE-PE、GS115/S6PE-PG和GS115/S6PE-A。
本发明还提供了一种制备果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和双结构域杂合酶的方法，包括以下步骤：
1）用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2）培养重组菌株，诱导重组果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和双结构域杂合酶的表达；
3）回收并纯化所表达的果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和双结构域杂合酶。
其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞GS115，得到重组菌株GS115/S6PE-PE、GS115/S6PE-PG和GS115/S6PE-A。
附图说明
图1：在毕赤酵母中表达的重组果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和双结构域杂合酶的SDS-PAGE分析，其中，M:蛋白Marker；1:S6PE-A纯化的酶液；2：S6PE-A去糖基化处理的酶液；3:S6PE-PE纯化的酶液；4：S6PE-PE去糖基化处理的酶液；5:S6PE-PG纯化的酶液；4：S6PE-PG去糖基化处理的酶液。
图2a：重组多聚半乳糖醛酸酶和双结构域杂合酶的最适pH（多聚半乳糖醛酸酶活性）。
图2b：果胶酯酶和双结构域杂合酶的最适pH（果胶酯酶活性）。
图3：重组多聚半乳糖醛酸酶和双结构域杂合酶的pH稳定性（多聚半乳糖醛酸酶活性）。
图4a：重组多聚半乳糖醛酸酶和双结构域杂合酶的最适温度（多聚半乳糖醛酸酶活性）。
图4b：果胶酯酶和双结构域杂合酶的最适温度（果胶酯酶活性）。
图5：重组多聚半乳糖醛酸酶和双结构域杂合酶的热稳定性（多聚半乳糖醛酸酶活性）。
图6a：重组多聚半乳糖醛酸酶和双结构域杂合酶的离子抗性（多聚半乳糖醛酸酶活性）。
图6b：重组果胶酯酶和双结构域杂合酶的离子抗性（果胶酯酶活性）。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：表达宿主Pichiapastoris GS115，表达质粒载体pPIC9r为本实验室保存。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司，多聚半乳糖醛酸购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。
3、培养基：
（1）LB培养基（g/l）：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl10.0,pH7.0。
（2）平板筛选培养基（g/l）：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl10.0,琼脂15.0，pH7.0。
实施例1青霉Penicillium sp.Sx6来源的双结构域杂合酶编码基因S6PE-A的克隆
提取基因组DNA及RNA。根据糖酯酶第八家族果胶酯酶真菌基因的保守序列[F(KT)G(YF)QDT和LGRPW(RG)(DN)]设计合成了简并引物PE8-F和PE8-R：
PE8-F：5'-TTCAMNGGNTWYCARGAYAC-3';
PE8-R：5'-GTCGCBCCAGGGBCGICCIAR-3'
以上述的青霉Penicillium sp.Sx6基因组DNA为模板进行PCR扩增。降落PCR反应参数为：94℃变性5min；94℃变性30sec，55-50℃退火30sec，72℃延伸1min，10个循环（每个循环降落0.5℃），然后94℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，72℃保温10min。得到一约280bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。
根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般20～35nt，退火温度在63℃。并将它们分别命名为A-u1,A-u2,A-u3(上游特异性引物);A1-d1,A1-d2,A1-d3;A2-d1,A2-d2,A2-d3;A3-d1,A3-d2,A3-d3;(下游特异性引物)见表1。按照改进的TAIL-PCR(Huang et al.,2010)中的程序对两端侧翼序列进行扩增,通过三次TAIL-PCR扩增，获得完整序列。
表1.果胶酯酶S6PE-PE、多聚半乳糖醛酸酶S6PE-PG和双结构域杂合酶S6PE-A TAIL-PCR特异性引物
通过三轮改进的TAIL-PCR(Huang et al.,2010)得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。通过序列拼接获得该片段的上下游侧翼序列，全序列共长约2.5kb。再以cDNA为模板，分别以A-F/R、PE-F/R、PG-F/R为引物进行PCR扩增，将得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。双结构域杂合酶基因S6PE-A完整的开放阅读框（ORF）由2319个碱基组成,编码770aa和一个终止密码子，经预测，N端18个氨基酸预测为信号肽序列。在GenBank中的比对结果表明S6PE-A是一个新的果胶酶。包含果胶酯酶和多聚半乳糖醛酸酶两个结构域，为一个糖酯酶第八家族和糖苷水解酶第二十八家族串联成两个催化结构域。果胶酯酶S6PE-PE、多聚半乳糖醛酸酶S6PE-PG和双结构域杂合酶S6PE-A蛋白理论分子量分别为37.1kDa、35.8kDa和79.9kDa。
实施例2重组酶蛋白的制备。
将表达载体pPIC9进行双酶切(SnaBI+NotI)，同时将编码果胶酯酶的基因S6PE-PE、多聚半乳糖醛酸酶的基因S6PE-PG和双结构域杂合酶的基因S6PE-A双酶切(SnaBI+NotI)，切好的编码成熟果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和双结构域杂合酶的基因片段（去除信号肽片段）与表达载体pPIC9连接，获得含有果胶酯酶基因S6PE-PE、多聚半乳糖醛酸酶基因S6PE-PG和双结构域杂合酶基因S6PE-A的重组质粒pPIC9-S6PE-PE、pPIC9-S6PE-PG和pPIC9-S6PE-A。并转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株GS115/S6PE-PE、GS115/S6PE-PG和GS115/S6PE-A。
同时采用上述方法构建不去除信号肽的双结构域杂合酶的基因片段的表达载体，并转化酵母GS115。
取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养基的1L三角瓶中，置于30°C，220rpm摇床培养48h；后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用100mL含有0.5%甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30°C，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5mL甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5%，同时取上清用于酶活性检测。
对于多聚半乳糖醛酸酶活性，重组双结构域杂合酶S6PE-A的表达量为1,162.7U/mL，比活为1,139.6U/mg；重组多聚半乳糖醛酸酶S6PE-PG的表达量为1,523.0U/mL，比活为1,609.4U/mg。
对于果胶酯酶活性，重组双结构域杂合酶S6PE-A的表达量为276.6U/mL，比活为271.1U/mg；重组果胶酯酶S6PE-PE的表达量为66.5U/mL，比活为68.6U/mg。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组果胶酯酶S6PE-PE、多聚半乳糖醛酸酶S6PE-PG和双结构域杂合酶S6PE-A均在毕赤酵母中得到了表达。所表达的酶蛋白经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的90％以上。
实施例3重组酶蛋白的活性分析
一、检测方法
多聚半乳糖醛酸酶酶活性采用DNS法测定。具体方法如下：在给定的pH、温度条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下，每分钟分解多聚半乳糖醛酸生成1μmoLD-(+)-半乳糖醛酸所需的酶量。
果胶酯酶酶活性采用恒pH值滴定法测定。具体方法如下：在给定的pH、温度条件下，反应体系包括25mL底物（加入0.117M NaCl）和1mL适当稀释的酶液，反应10min。根据反应产生的羧基的量，自动滴定仪向体系中滴加0.02M的NaOH溶液以保持反应体系中pH的恒定。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下，每分钟分解酯化的果胶生成1μmoL羧基所需的酶量。
二、重组酶蛋白的性质测定
1、重组酶蛋白的最适pH和pH稳定性的测定方法如下
将实施例2纯化的重组果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和双结构域杂合酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物多聚半乳糖醛酸溶于不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中45℃下进行多聚半乳糖醛酸酶活力测定；底物酯化果胶调于不同pH值下进行果胶酯酶活力测定。结果(图2)表明，S6PE-A/PG/PE的最适pH均为5.0,在pH4.5-5.5的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的60%以上。多聚半乳糖醛酸酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min,再在pH5.0缓冲液体系中50℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图3)表明，在pH3.0-7.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在65%以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性。
2、重组酶蛋白的最适温度及热稳定性测定方法如下
将实施例2纯化的重组果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和双结构域杂合酶在不同的温度下（pH5.0）进行酶促反应以测定其最适温度。多聚半乳糖醛酸酶耐温性测定为在不同温度下处理不同时间，再在50℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明,其最适温度为50℃。多聚半乳糖醛酸酶的热稳定性试验表明(图5)，重组酶在40℃时稳定性非常好。50℃下保温60min，剩余酶活性为40%。
3、重组酶蛋白的Km值测定方法如下
参照李宁的方法(李宁,2009)，测定反应的一级反应时间。确定测定Km及Vmax的反应时间为5min。用不同浓度的多聚半乳糖醛酸(1.25，1.0，0.8，0.4，0.2，0.15和0.1%)为底物，在最适条件下测定多聚半乳糖醛酸酶酶活性；用不同浓度的甲酯化果胶（1.25，1.0，0.8，0.4，0.2，0.1，0.05%）为底物，在在最适条件下测定果胶酯酶酶活性，计算出相应的反应速度，利用GraphPad Prism5软件计算Km值及Vmax。
对于多聚半乳糖醛酸酶活性，S6PE-A在最适条件下的Km值、Vmax值分别是0.179g/L和3016U/mg/min;S6PE-PG在最适条件下的Km值、Vmax值分别是0.126g/L和3383U/mg/min。
对于果胶酯酶酶活性，S6PE-A在最适条件下的Km值、Vmax值分别是0.104g/L和410U/mg/min;S6PE-PE在最适条件下的Km值、Vmax值分别是0.128g/L和75U/mg/min;
4、不同金属离子化学试剂对酶蛋白的影响测定如下:
在酶促反应体系中加入1mM的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在50℃、pH5.0条件下测定酶活性。结果(图6)表明，Pb2+、Ca2+和Ag+强烈抑制多聚半乳糖醛酸酶酶活性，其余金属离子或化学试剂对其酶活性影响不大；大多数金属离子或化学试剂都显著提高果胶酯酶酶活性，比如Cr3+、Mg2+、Zn2+、Ni+、Mn2+、EDTA、Ca2+和Co3+等，但是Ag+强烈抑制果胶酯酶酶活性。
Claims (9)
1.一种含有果胶酯酶S6PE-PE和多聚半乳糖醛酸酶S6PE-PG的双结构域杂合酶S6PE-A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3或5所示。
2.一种含有果胶酯酶基因S6PE-PE和多聚半乳糖醛酸酶基因S6PE-PG的双结构域杂合酶基因S6PE-A，其特征在于，其编码权利要求1所述的含有果胶酯酶S6PE-PE和多聚半乳糖醛酸酶S6PE-PG的双结构域杂合酶S6PE-A。
3.根据权利要求2所述的含有果胶酯酶基因S6PE-PE和多聚半乳糖醛酸酶基因S6PE-PG的双结构域杂合酶基因S6PE-A，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。
4.包含权利要求2所述含有果胶酯酶基因S6PE-PE和多聚半乳糖醛酸酶基因S6PE-PG的双结构域杂合酶基因S6PE-A的重组载体。
5.包含权利要求2所述含有果胶酯酶基因S6PE-PE和多聚半乳糖醛酸酶基因S6PE-PG的双结构域杂合酶基因S6PE-A的重组载体pPIC9r-S6PE-A，将权利要求2所述含有果胶酯酶基因S6PE-PE和多聚半乳糖醛酸酶基因S6PE-PG的双结构域杂合酶基因S6PE-A插入到质粒pPIC9r上的SnaBI和Not I限制性酶切位点之间，得到重组载体pPIC9r-S6PE-A。
6.包含权利要求2所述含有果胶酯酶基因S6PE-PE和多聚半乳糖醛酸酶基因S6PE-PG的双结构域杂合酶基因S6PE-A的重组载体的重组菌株。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，其所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。
8.根据权利要求7所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为重组毕赤酵母菌株GS115/S6PE-A，将权利要求5所述重组载体pPIC9r-S6PE-A转化毕赤酵母细胞GS115得到重组毕赤酵母菌株GS115/S6PE-A。
9.权利要求1所述含有果胶酯酶S6PE-PE和多聚半乳糖醛酸酶S6PE-PG的双结构域杂合酶S6PE-A用于降解果胶质的应用。
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