CN102533696B

CN102533696B - 一种酸性果胶酶endo-PGI及其基因和应用

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Publication number: CN102533696B
Application number: CN 201010618557
Authority: CN
Inventors: 詹志春; 张菁; 苑鹏
Original assignee: WUHAN SUNHY BIOLOGY CO Ltd
Current assignee: WUHAN SUNHY BIOLOGY CO Ltd
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2010-12-22
Publication date: 2013-10-09
Anticipated expiration: 2030-12-22
Also published as: CN102533696A

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种来源于青霉菌(Penicillium sp.)的酸性果胶酶endo-PGI及其基因和应用。根据本发明的具有强果胶降解能力的酸性果胶酶endo-PGI，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。本发明还提供了上述酸性果胶酶的应用。本发明提供了一个新的果胶酶基因，其编码的果胶酶具有嗜酸性，作用pH范围广，较好的耐热性，可作应用于饲料、食品等工业，或用于工业制备果胶酶。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产酸性果胶酶。

Description

一种酸性果胶酶endo-PGI及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种来源于青霉菌(Penicilliumsp.)的酸性果胶酶endo-PGI及其基因和应用。

背景技术

果胶主要是直链α-1，4糖苷键连接的D-半乳糖醛酸残基组成的复合多糖，是植物细胞壁和中胶层的重要组成部分(van Buren JP.Academic Press，1991.p.1-22)。果胶酶(pectinases)是分解果胶质的多种酶的总称。根据分解糖苷键的反应性质或降解底物的性质可以分为：果胶水解酶(pectin hydrolases)、果胶裂解酶(pectin lyases，PL)、果胶酯酶(pectin esterases，PE)和原果胶酶(Alkorta I，et al.Process Biochem 33：21-28，1998)。果胶酶按其作用最适pH分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。目前研究和应用较多的是酸性果胶酶，其酶作用最适pH在偏酸性范围，主要应用于食品行业的水果榨汁和果汁澄清，降低葡萄酒粘度，并可以与其它水解酶共同应用于饲料行业。

果胶酶主要来源于微生物(细菌，真菌和酵母菌)和植物。很多果胶酶已被纯化并进行了性质测定(Niture SK.Biologia 2008；63：1-19)。其中真菌来源的果胶酶大部分在酸性pH值下具有高活性(通常pH值4.0-6.0)。大多数商业化生产的果胶酶也是来源于真菌，尤其是来源于黑曲霉和青霉(Niture SK.Biologia 2008；63：1-19；Alkorta et al.Process Biochem 1998；33：21-28)。一些果胶酶素基因已被克隆，测序和并进行了表达(Mertens et al.Fungal Genet Biol 2008；45：1616-1624)。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种可以应用于食品与饲料行业的酸性果胶酶endo-PGI。

本发明的再一目的是提供编码上述果胶酶endo-PGI的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述果胶酶endo-PGI的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述果胶酶endo-PGI的应用。

本发明提供了一种果胶酶endo-PGI，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

MLLSTHSIVL GLLGSTSLAL ASPAAEPAEG NRLIPRGSAC TYSGVNGAAA

AIAGKAGCSS 60

ITLNNVAVPA GTTLDLTGLA AGTKVIFEGT TTFGHKQWVG PLISISGTNI

AVSGAAGHVI 120

DGQGARWWDG KGSNTKTNIK PKFFLAHNLK GASTITGLNI KDTPVQVFSI

DSSSGLTISG 180

VTIDNRNGDK GSLGHNTDGF DIGDSDHITI TGATVYNQDD CLAINSGTNI

IFSGGYCSGG 240

HGLSIGSVGG RSNNVVDTVH ISSTQVVNSQ NGVRVKAVAG ATGSIKGVTY

QDITLSGITS 300

QGVTIRQDYT NSGYTGNPTT QVPITGLTLN NVHGTVTSSG TDITVECGSA

ASCSGWTWTK 360

VAVSGGKADLCKNAPANTC 379

其中，该酶全长379个氨基酸和一个终止密码子，N端21个氨基酸为其预测的信号肽序列“MLLSTHSIVLGLLGSTSLALA”。

因此，成熟的酸性果胶酶endo-PGI的理论分子量为36.2kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2：

SPAAEPAEGN RLIPRGSACT YSGVNGAAAA IAGKAGCSSI TLNNVAVPAG

TTLDLTGLAA 60

GTKVIFEGTT TFGHKQWVGP LISISGTNIA VSGAAGHVID GQGARWWDGK

GSNTKTNIKP 120

KFFLAHNLKG ASTITGLNIK DTPVQVFSID SSSGLTISGV TIDNRNGDKG

SLGHNTDGFD 180

IGDSDHITIT GATVYNQDDC LAINSGTNII FSGGYCSGGH GLSIGSVGGR

SNNVVDTVHI 240

SSTQVVNSQN GVRVKAVAGA TGSIKGVTYQ DITLSGITSQ GVTIRQDYTN

SGYTGNPTTQ 300

VPITGLTLNN VHGTVTSSGT DITVECGSAA SCSGWTWTKV AVSGGKADLC

KNAPANTC 358

本发明的果胶酶来自于青霉菌(Penicillium sp.)。

本发明提供了编码上述酸性果胶酶endo-PGI的基因。

该酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所示：

atgttgttat cgacacacag tattgttctg ggcttgctag gctcaacgtc cttggccctc 60

gcttctccag ctgccgaacc ggctgaaggg aacagactca tccctcgtgg atctgcttgc 120

acctattcag gagtcaatgg tgcagctgca gcgatagccg gaaaggcagg ttgctccagt 180

attactctca ataacgttgc agtgcctgcc gggactacgc tggatttgac tggtctggcc 240

gcgggtacca aggtaagaac tctccacaaa cccatgactc tcttgctcca ccgacggcga 300

atttactgag aatgttgtag gtgatatttg agggaaccac tactttcggc cataagcagt 360

gggtgggccc tctgatctcc atctctggga ccaacatcgc agtttctggg gctgccggtc 420

acgtcattga tggccaaggt gcccgctggt gggatggaaa gggttccaac accaagacca 480

atatcaaacc taagttcttc ctcgcccaca atctcaaggg agcctccact attacggggt 540

tgaacatcaa ggatactccc gttcaggtct tcagcatcga tagctcgtcg ggtctgacga 600

tcagtggtgt cacaattgac aacagaaatg gtgataaggg ttctctcggt cacaacaccg 660

acgggttcga tatcggcgac agtgatcaca ttaccatcac tggtgctaca gtttataacc 720

aagacgactg cctggccatc aattctggga cggtaagtgc tcgaagattg tcgccctgcc 780

tagctgcagg aaataattac cacggttctt gctgaccatt aatacccaga acattatttt 840

ctccggcggt tactgctctg gtggccacgg attgtctatc ggctcagtcg gtggccgttc 900

caataatgtg gtagacaccg tccatatcag cagcacccag gtcgtcaact ctcagaatgg 960

taagcccgag ccggataatg actataagtt ttttttcgtt tcttgaactg atatttttgt 1020

caggtgtccg tgtcaaagct gtcgctggcg ccaccggtag tatcaaaggc gtgacttacc 1080

aggatattac cctctccggc attacgagcc agggagtcac catccgccaa gactacacca 1140

attctggcta cactggaaac cccacgaccc aggttccaat cactggactc accttgaata 1200

atgtgcacgg cacggtcaca tccagtggca ccgatatcac cgtcgagtgt ggaagtgctg 1260

ccagttgttc aggctggact tggactaaag ttgcagtcag tggcggcaag gcggatttgt 1320

gcaagaatgc acctgccaac acttgctaa 1349

本发明通过PCR的方法分离克隆了这一酸性果胶酶基因endo-pgI，DNA全序列分析结果表明，酸性果胶酶endo-PGI的结构基因pgI全长1,349bp，含有3个内含子，255-322bp，753-829bp，和962-1025bp为其内含子序列，cDNA长1,140bp，其cDNA序列如SEQ ID NO.4所示。

atgttgttat cgacacacag tattgttctg ggcttgctag gctcaacgtc cttggccctc 60

gcttctccag ctgccgaacc ggctgaaggg aacagactca tccctcgtgg atctgcttgc 120

acctattcag gagtcaatgg tgcagctgca gcgatagccg gaaaggcagg ttgctccagt 180

attactctca ataacgttgc agtgcctgcc gggactacgc tggatttgac tggtctggcc 240

gcgggtacca aggtgatatt tgagggaacc actactttcg gccataagca gtgggtgggc 300

cctctgatct ccatctctgg gaccaacatc gcagtttctg gggctgccgg tcacgtcatt 360

gatggccaag gtgcccgctg gtgggatgga aagggttcca acaccaagac caatatcaaa 420

cctaagttct tcctcgccca caatctcaag ggagcctcca ctattacggg gttgaacatc 480

aaggatactc ccgttcaggt cttcagcatc gatagctcgt cgggtctgac gatcagtggt 540

gtcacaattg acaacagaaa tggtgataag ggttctctcg gtcacaacac cgacgggttc 600

gatatcggcg acagtgatca cattaccatc actggtgcta cagtttataa ccaagacgac 660

tgcctggcca tcaattctgg gacgaacatt attttctccg gcggttactg ctctggtggc 720

cacggattgt ctatcggctc agtcggtggc cgttccaata atgtggtaga caccgtccat 780

atcagcagca cccaggtcgt caactctcag aatggtgtcc gtgtcaaagc tgtcgctggc 840

gccaccggta gtatcaaagg cgtgacttac caggatatta ccctctccgg cattacgagc 900

cagggagtca ccatccgcca agactacacc aattctggct acactggaaa ccccacgacc 960

caggttccaa tcactggact caccttgaat aatgtgcacg gcacggtcac atccagtggc 1020

accgatatca ccgtcgagtg tggaagtgct gccagttgtt caggctggac ttggactaaa 1080

gttgcagtca gtggcggcaa ggcggatttg tgcaagaatg cacctgccaa cacttgctaa 1140

其中，信号肽的碱基序列为：

ATGTTGTTATCGACACACAGTATTGTTCTGGGCTTGCTAG GCTCAACGTCCTTGGCCCTCGCT

本发明还提供了包含上述果胶酶基因pgI的重组载体。优选为pPIC9-pgI。将本发明的果胶酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将β-果胶酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-pgI。

本发明还提供了包含上述果胶酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/pgI。

本发明还提供了一种制备酸性果胶酶的方法，包括以下步骤：

1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组果胶酶的表达；以及

3)回收并纯化所表达的果胶酶。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/pgI。

目前报道的青霉来源的果胶酶的最适pH在pH5.5左右(Silva D，et al.ProcessBiochem 2005；40：2885-2889；Yao C，et al.Phytopathology 1996；86：1160-1166)。本发明提供的果胶酶的最适pH为3.5，与鲜榨果汁的pH(3.5-4.0)相当。真菌来源的果胶酶的最适温度为45-65℃，当温度低于30℃时，酶活很低或失活(Marcus L，et al.Physiol Plant Pathol 1986；29：325-336；Channe P，et al.Folia Microbiol 1995；40：111-117)。本发明提供的果胶酶的最适为40℃，并且在0℃时仍有7.3％的酶活。

本发明还提供了上述酸性果胶酶的应用。本发明提供了一个新的果胶酶基因，其编码的果胶酶具有嗜酸性，作用pH范围广，较好的耐热性，可作应用于饲料、食品等工业，或用于工业制备果胶酶。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产酸性果胶酶。

附图说明

图1重组果胶酶的SDS-PAGE分析，M：低分子量蛋白质Marker；1：纯化的果胶酶endo-PGI。

图2果胶酶的最适pH。

图3果胶酶的pH稳定性。

图4果胶酶作用的最适温度。

图5果胶酶的热稳定性。

具体实施方式

实验条件：

1、菌株及载体：毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。果胶、半乳糖醛酸、多聚半乳糖醛酸购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)Penicillium sp产果胶酶诱导选择培养基：0.2％MgSO₄·7H₂O，0.1％KH₂PO₄，0.1％CuSO₄·5H₂O，0.1％CaCl₂，0.5％果胶，0.5％蛋白胨，pH6.0。

(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。

(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。

(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同。

说明：本发明中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括：Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版.2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；和CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel等人编，1994)。

实施例1 Penicillium sp.果胶酶编码基因pgI的克隆

提取Penicillium sp.基因组DNA：

将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据第28家族果胶酶基因的保守(GPNTDG(A)I(F)H(D)和GHGL(V)SIGS)序列设计合成了简并引物P1，P2

P1：5′-GGCCGAAACACGGAYGSNITNVA-3′；

P2：5′-CGATCCGATNGANAINCCRTGNCC-3′

其中：Y＝C/T，W＝A/T，R＝A/G，S＝C/G，N＝A/T/G/C

以Penicillium sp总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃5min；94℃30sec，52-47℃30sec(其中每个循环后复性温度下降0.5℃)，72℃1min，10个循环，然后进入第二个循环程序：94℃30sec，48℃30sec，72℃1min，25个循环后；72℃10min，琼脂糖电泳检测。得到的片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。

根据测序得到的核甘酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为usp1，usp2，usp3(上游特异性引物)，dsp1，dsp2，dsp3(下游特异性引物)见表1。

表1.果胶酶endo-PGI TAIL-PCR特异性引物

通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。将简并引物得到的核心片段与经TAIL-PCR得到的侧翼序列进行拼接得到plI全长基因。经序列分析表明，该基因DNA全长为一个长1349bp的基因片段。

实施例2 果胶酶基因的RT-PCR分析

提取Penicillium sp.CGMCC 1669的总RNA，利用反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计恰当的引物(PGI F：5′-ATGTTGTTATCGACACACAGTATTGTTCTGG-3′，PGI R：5′-GCAAGTGTTGGCAGGTGCAT-3′)扩增该单链cDNA，获得果胶酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。

果胶酶的基因组序列和cDNA序列分析结果表明，酸性果胶酶endo-PGI的结构基因pgI全长1,349bp，含有3个内含子，255-322bp，753-829bp，和962-1025bp为其内含子序列，cDNA长1,140bp。N端21个氨基酸为其预测的信号肽序列。所测出的基因pgI的成熟蛋白部分核甘酸序列与GeneBank上的果胶酶基因序列进行同源比较，同Penicillium expansum来源的果胶酶的一致性最高为87％，与Penicilliummarneffei ATCC 18224来源的果胶酶的一致性为60％，同Aspergillus aculeatus来源的果胶酶的一致性为59％。

实施例3 重组果胶酶的制备。

将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoRI+NotI)，同时将编码果胶酶的基因pgI双酶切(EcoRI+NotI)，切出编码成熟果胶酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有Penicillium sp.果胶酶基因pgI的重组质粒pPIC-pgI并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/pgI。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于400mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于200mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导48h后，离心收集上清。测定果胶酶的活力。重组果胶酶的表达量为6.2U/mL。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组果胶酶在毕赤酵母中得到了表达。

实施例4 重组果胶酶的活性分析

酶活性测定方法采用DNS法。在pH3.5，40℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

实施例5 重组果胶酶endo-PGI的性质测定

1、重组果胶酶endo-PGI的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

经纯化的果胶酶endo-PGI在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH 2.0～8.0的0.1mol/L的McIlvaine缓冲液。纯化的果胶酶endo-PGI在不同pH的缓冲体系，40℃下测定的pH适性结果(图2)表明：endo-PGI的最适作用pH为3.5-4.5。

将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理1h，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明(图3)，endo-PGI在pH范围为3.0-6.0间都很稳定。

最适温度的测定在pH3.5的0.1mol/L的McIlvaine缓冲液体系及不同的温度(0～80℃)下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果(图4)表明，endo-PGI的最适作用温度40℃，在30℃和60℃之间，保持60％以上的酶活。并且在0℃时仍有7.3％的酶活。

测定果胶酶在40℃、50℃和60℃下分别保温不同时间测定相对酶活力，绘制酶的热稳定性曲线。在40℃和50℃下，endo-PGI热稳定性好(图5)。

不同金属离子化学试剂对endo-PGI酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子(NaCl，KCl，CaCl₂，LiCl，CoCl₂，CrCl₃，NiSO₄，CuSO₄，MgSO₄，FeCl₃，Pb(CH₃COO)₂，MnSO₄，and ZnSO₄)及化学试剂(SDS，EDTA，and β-mercaptoethanol)，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1和5mmol/L。在40℃、pH3.5条件下测定酶活性。结果(表2)表明，β-巯基乙醇对果胶酶endo-PGI有明显的激活作用，Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺和EDTA对酶活没有影响或有一定的激活作用。5mM Co²⁺，Mn²⁺和Ni²⁺部分抑制endo-PGI的活性。5mmol/L的Cu²⁺，Ca²⁺，Pb²⁺，Cr³⁺，Fe³⁺，Zn²⁺和SDS强烈抑制endo-PGI的活性。

Table 2不同金属离子化学试剂对endo-PGI酶活的影响

K⁺	102.7±3.3	101.3±2.2
			Ca²⁺	104.8±2.7	24.7±2.4
Li⁺	104.5±3.0	106.4±2.0
			Co²⁺	60.6±2.2	64.3±4.0
Cr³⁺	84.8±2.4	14.5±1.6
			Ni²⁺	102.4±3.7	86.6±4.1
Cu²⁺	45.0±2.7	24.5±3.1
			Mg²⁺	97.3±3.6	106.4±2.4
Fe³⁺	91.9±3.8	8.2±0.6
			Mn²⁺	106.8±4.4	88.0±4.2
Zn²⁺	83.7±5.3	43.9±1.2
			Pb²⁺	87.0±6.1	0.4±0.1
SDS	6.4±1.1	0
			EDTA	94.8±2.4	106.3±2.1
β-巯基乙醇	114.5±2.7	127.3±4.2

用不同浓度(1-20mg/mL)的多聚半乳糖醛酸(PGA)为底物，在pH 3.5的0.1mol/L的McIlvaine缓冲液体系中，40℃下测定酶活性，计算出其在40℃下的K_m值。经测定，此果胶酶在40℃下以PGA为底物的表观K_m值为19.5mg/ml，最大反应速度V_max为909.1μmol/min/mg。

实施例6 果胶酶endo-PGI的底物特异性

分别以PGA和酯化程度分别为34％，70％和85％的柑橘果胶为底物测定果胶酶活力。以endo-PGI对PGA的活力为100％，则以34％，70％和85％的柑橘果胶为底物测定果胶酶相对活力分别为77.5％，19.4％，和9％。

Claims

1.一种具有果胶降解能力的酸性果胶酶endo-PGI，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种酸性果胶酶endo-PGI，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种酸性果胶酶基因pgI，其特征在于，编码权利要求1或2所述的果胶酶。

4.如权利要求3所述的果胶酶基因pgI，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

5.如权利要求3所述的果胶酶基因pgI，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.4所示。

6.一种果胶酶的表达载体，其特征在于包含有权利要求3、4或5所述的果胶酶基因序列。

7.包含权利要求3、4或5所述果胶酶基因的重组菌株，其特征在于，由权利要求6所述表达载体转化宿主获得。

8.一种制备酸性果胶酶endo-PGI的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）用权利要求6表达载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组果胶酶的表达；以及

3）回收并纯化所表达的果胶酶endo-PGI。

9.权利要求1或2所述果胶酶endo-PGI用于水解多聚半乳糖醛酸的应用。