CN104531653A - 一种液体酸性果胶酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种液体酸性果胶酶的制备方法，属于酶制剂制备技术领域。本发明液体酸性果胶酶的制备方法，无须添加化学防腐剂，无须低温处理，在常温下对发酵粗酶液和调配浓缩液采用高压脉冲电场处理，并在调配过程添加果胶分解物、中草药提取物、改性膳食纤维等天然植物原料，然后除菌过滤、无菌灌装即得一种稳定的保质期较长的液体酸性果胶酶。试验证明本发明制备的液体酸性果胶酶在室温储存12个月菌落总数为68-102CFU/mL；在40℃和0℃条件下储存12个月，酶活损失率分别为1-1.4％和0.5-1.1％。制备方法工艺简单、操作方便，节能环保。

Description

一种液体酸性果胶酶的制备方法

技术领域

本发明涉及酸性果胶酶的制备方法，具体涉及一种液体酸性果胶酶的制备方法。

背景技术

液体酶制剂是一种使用方便，绿色环保，生物降解性良好的原料。专一的催化特性及温和的反应条件，在工业界得到越来越多的使用和重视。在使用方面，液体酶制剂具有以下优点：1)液体酶制剂以分子或微粒状态分散在底物中，分散度大，吸收快，能较迅速地发生酶解反应，酶活性高；2)易于分剂量，容易复配和二次加工，使用方便；3)有利于提高酶制剂的利用率，4)直接使用，无须溶解和活化；5)纯度高、杂质含量低；6)生产过程短、成本低；7)生产加工和使用过程中不会造成粉尘污染，有利于保护环境；但是，液体酶制剂体积较大，携带、运输、贮存都不方便，酶活性容易受到高温、冷冻、光照、酸碱性、氧化、湿度等贮存环境的影响而显著降低，并且因为液体酶制剂的水分活度较高，很容易受到微生物的污染而失活。因此，液体酶制剂的应用受到限制，最主要的原因就是其稳定性较差，包括生物稳定性和物理、化学稳定性。

果胶酶(pectinases)是一大类可分解植物细胞壁组分果胶质的酶系总称，从分解方式上可以将果胶酶分为果胶水解酶和果胶裂解酶，前者主要包括原果胶酶(PPase)、果胶酯酶(PE)、低聚半乳糖醛酸水解酶、聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、聚半乳糖醛酸酶(PG)；后者主要包括聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)和聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(PMGL)。

目前对于果胶酶的研究已有大量的文献报道，其中研究时间较长的酸性果胶酶主要用于果胶组分的提取和果酒果汁的澄清，碱性果胶酶在制浆漂白，棉织物处理工艺中的应用取得了一定进展，特别是在麻类纤维的脱胶上的应用研究日趋增多。无论是酸性果胶酶还是碱性果胶酶，其研究工作主要停留在菌种筛选及对酶学性质的研究，最终目的是为果胶酶提供一个良好的、宽广的应用空间，但在果胶酶储存稳定性方面研究的较少。

目前，市场上的酸性果胶酶制剂主要有液体制剂、粉剂和颗粒制剂三种剂型。其中，液体酸性果胶酶在常温下保存酶活损失快，保质期短，难于商品化，极大地限制了液体酸性果胶酶的工业产业化应用，应用效率较低，成本升高。现有技术中，为了保证酸性果胶酶制剂的微生物指标在货架期达到食品级标准，液体酸性果胶酶制剂主要通过添加防腐剂(山梨酸钾、苯甲酸钠等)和冷链运输保藏来满足要求。很多果汁生产企业对食品添加剂的限量要求越来越严格，尤其是出口果汁加工企业，一些常用的防腐剂品种，如苯甲酸钠，甚至被规定不得检出。现有产品中若不添加防腐剂，即使在冷链运输条件下，也会发生细菌污染等问题。

中国专利CN 101684462 B公开了一种酸性果胶酶液体制剂的生产方法，以苹果渣为诱导物，以黑曲霉为菌种，经过发酵、浸提、固液分离、去渣澄清、乙醇沉淀、固液分离、复溶工序制得液体酸性果胶酶酶制剂，解决了现有技术液体酸性果胶酶在常温下保存酶活损失快、保质期短的问题。上述公开专利在制备过程用到氧化铝和山梨酸钾等化学物质，存在较大的食品安全隐患，且制备工艺复杂，同时没考虑液体酸性果胶酶非生物稳定性的问题。中国专利CN 101857857 A公开了一种食品级酸性果胶酶制剂的制备方法，其内容包括：将发酵后获得的酸性果胶酶液，降温至10-20℃，然后进行板框压滤、微滤、超滤，调节pH值后，经终端过滤进行无菌灌装。应用本发明的方法制备的酸性果胶酶制剂，在不加防腐剂的情况下，仍然能够保证酸性果胶酶制剂中细菌的生长缓慢。本发明通过控制整个制过程的温度和降低制剂中的营养源残量，应用可控的无菌包装技术，可以在不加防腐剂的情况下很好的保证酶制剂产品质量及卫生指标。上述公开的专利采用10-20℃低温和4.0-5.5的pH值不能很好的抑制过程污染的杂菌在储存期间的生长和繁殖，并且浪费冷源和原料，同时也没考虑液体酸性果胶酶非生物稳定性的问题。

因此，制备一种稳定性强的液体酸性果胶酶以拓展其应用领域和效率很重要，是酸性果胶酶研究的最重要、最具有现实意义的方向。

发明内容

本发明所解决的技术问题是克服现有液体酸性果胶酶的缺陷，无须添加化学防腐剂，无须低温处理，在常温下对发酵粗酶液和调配浓缩液采用高压脉冲电场处理，并在调配过程添加果胶分解物、中草药提取物、改性膳食纤维等天然植物原料，然后除菌过滤、无菌灌装即得一种稳定的保质期较长的液体酸性果胶酶。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种液体酸性果胶酶的制备方法，包括如下步骤：

1)将发酵后获得的酸性果胶酶发酵液添加100目-300目硅藻土，用500-800目滤布预涂硅藻土，采用板框过滤机进行过滤，操作压力为0.14-0.24Mpa，得发酵粗酶液；

所述硅藻土的添加量为每100mL发酵液添加0.5-1.5g；

2)将步骤1)发酵粗酶液于室温下在电场强度20-30kV/cm，脉冲时间200-300μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场处理；

3)步骤2)经高压脉冲电场处理的发酵粗酶液依次通过微滤膜微滤、超滤膜超滤，然后循环超滤得到浓缩酶液；

所述微滤膜孔径为0.4-0.8μm；

所述微滤进口压力为0.1-0.12MPa，压差0.07-0.09MPa，酶液温度25-30℃；

所述超滤膜孔径为0.005-0.015μm；

所述超滤进口压力为0.15-0.20MPa，压差0.08-0.10MPa，酶液温度25-35℃；

4)向步骤3)浓缩酶液中加入其质量0.5-10％的稳定剂，充分搅拌，均匀混合，用乳酸调节pH值2.8-5.2，然后于室温下在电场强度25-40kV/cm，脉冲时间400-600μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场处理，静置20-40min；

所述稳定剂的制备方法如下：按重量份数计，准确称取果胶分解物20-40份，中草药提取物15-25份，改性膳食纤维10-15份，海藻糖10-15份，天然抗氧化剂5-10份，多元醇2-5份，金属氯化物1-3份，牛血清白蛋白0.1-0.3份；首先取改性膳食纤维，加入其质量5-12倍的去离子水，室温浸泡4-6h,边升温边搅拌，40-60℃保温20-30min,搅拌，充分溶解，继续保温，边搅拌边依次加入果胶分解物、中草药提取物、海藻糖、多元醇、金属氯化物，然后降温至25-35℃，边搅拌边依次加入牛血清白蛋白、天然抗氧化剂均匀混合即得稳定剂；

所述果胶分解物具有显著的抑菌特性，尤其对大肠杆菌抑制作用最强，同时还具有较强的抗氧化性，浓度达到0.01％时即可作用，对超氧自由基、羟自由基和DPPH自由基都表现出很强的消除作用，当浓度达到1.0％时，消除效果达到100％；

所述果胶分解物添加到液体果胶酶中可起到酶解产物的拮抗作用，暂时阻止和抑制果胶酶生物活性，稳定果胶酶酶蛋白的分子结构，有效防止酶活损失，提高液体果胶酶的非生物稳定性；

进一步地，所述果胶分解物是以柠檬、橙、柚、柑桔、葡萄等果皮或山楂、甜菜、苹果等废渣经超声清洗、高压脉冲提取、热水浸提、醇沉获得果胶，然后经果胶酶酶解而制得的；

优选地，所述果胶分解物的制备方法为：将新鲜的山楂果渣、柑桔皮、苹果渣分别放入装有1.2％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、40KHz清洗5-10min，沥干，切分成相等规格,长、宽为5-10mm，厚度3-5mm的片或丁，按质量比4-7:2-4:1-3均匀混合，然后于-25—-21℃冷冻10-30min；立即进行粉碎，粒径为0.1-1mm；加入粉碎物质量3-5倍的去离子水混合均匀，用柠檬酸调节pH值为2-3，于室温下在电场强度35-45kV/cm，脉冲时间400-600μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场处理，接着常压煮沸30-50min，布袋过滤，滤渣用其质量1-3倍的滤液常压煮沸40-60min,布袋过滤，合并滤液，硅藻土过滤，使滤液澄清，在75℃下减压浓缩至固形物含量为6-10％，迅速冷却至室温，加入浓缩液1.5倍体积的pH值为2-3的95％乙醇，静置20-30min,使果胶沉淀出来，4000r/min离心5-10min，回收沉淀，用2倍体积的无水乙醇洗脱，离心，回收沉淀，如此操作2次，得到的沉淀于40-60℃真空干燥2-3h,获得果胶，加入果胶质量4-5倍的40-50℃水，搅拌，均匀混合，保温，用乳酸调节pH值为4.5-5.5，加入0.3-0.8U/mL的果胶酶酶解2-4h,酶解液过滤，滤液于沸水中灭酶10-15min，冷却至室温，超滤浓缩、冷冻干燥即得果胶分解物。

进一步地，所述中草药提取物的制备方法为：按重量份数计，准确称取艾叶50-55份，大蒜50-55份，黄芪45-55份，鱼腥草45-55份，黄芩30-45份，黄柏30-40份，柴胡30-40份，甘草25-35份，苦参15-25份，虎杖6-8份，大黄2-5份，白芥子2-5份，首乌1-3份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加混合物5倍重量的水，控制温度80℃保持3h，然后降温至50℃，加入混合物料总重量8％的复配酶进行酶解，用乳酸调节pH值为6.2，酶解3h，最后添加混合物料1.8倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的质量比为1:2，控制温度至70℃保持4h，过滤，得第一滤液；添加滤渣2倍重量的水，控制温度90℃保持2h，然后降温至30℃，过滤，得第二滤液；将第一滤液和第二滤液按照质量比2.5:1.5合并,减压浓缩、冷冻干燥、低温粉碎至粒径为0.1-0.3mm即得中草药提取物；

所述复配酶的重量份数组成为：内β-葡聚糖酶20份，外β-葡聚糖酶18份，β-葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普鲁兰酶25份，β-淀粉酶12份，酸性蛋白酶12份，果胶酶12份，葡萄糖氧化酶6份，酸性磷酸酶8份，脂肪酶6份；

所述乙醇浓度为75％。

进一步地，所述改性膳食纤维是将膳食纤维经物理、化学或生物的方法处理而得到的，可溶性膳食纤维含量高，可溶性强，具有强大的吸附能力，经改性后，纤维素的比表面积增大，网格结构丰富，吸附力增强，螯合、吸附有机分子能力更强；并且离子交换能力增强，对金属元素，特别是重金属元素吸附效果更强；同时持水性、膨胀性、增稠性更强且不受酸、碱、盐的影响；上述特性将果胶酶包埋其中，不受液体环境中其它破坏因子的影响，使得液相成分及果胶酶酶蛋白分子结构更加稳定，有效防止酶活力损失，增加了液体酸性果胶酶的非生物稳定性；

优选地，所述改性纤维是由菊粉、苹果纤维、燕麦纤维、小麦纤维、米糠、麸皮中的一种或多种经生物酶酶解而得到的；

更优选地，所述改性膳食纤维的制备方法包括以下步骤：将菊粉、苹果纤维、燕麦纤维、小麦纤维、米糠、麸皮按质量比12-15:6-9:3-5:2-4:1-3:1-2均匀混合，加入其质量3-7倍的水，室温200-300W、35-40KHz条件超声提取10-15min,同时于电场强度20-40kV/cm，脉冲时间400-500μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场提取；用乳酸调节pH值为4.5-6.5，加入混合物质量0.1-0.3％的生物酶，于45-55℃酶解20-48min；酶解液减压浓缩、冷冻干燥、低温粉碎至粒径为0.1-0.3mm即得改性膳食纤维；

所述生物酶为木聚糖酶、纤维素酶、漆酶、果胶酶、单宁酶、淀粉酶和蛋白酶按质量比8-10:4-7:3-5:2-4:1-3:1-3:1-2均匀混合。

进一步地，所述天然抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物中的任意一种或几种组合，上述产品均为市购粉状产品；

优选地，所述葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物混合的质量比为4-6:3-5:1-3。

进一步地，所述多元醇为聚乙二醇、丙三醇、山梨醇、二硫苏糖醇、疏基乙醇中的一种或几种；

优选地，所述多元醇由聚乙二醇、丙三醇、山梨醇、二硫苏糖醇按质量比5-7:4-6:1-3:1-3均匀混合。

进一步地，所述金属氯化物为氯化锌、氯化钙、氯化钠、氯化镁、氯化铁中的一种或多种；

优选地，所述金属氯化物为氯化锌、氯化钙、氯化钠、氯化镁按质量比2-3:1-3:1-2:0.1-0.3均匀混合。

5)步骤4)经调配、静置后的浓缩酶液经除菌过滤、无菌灌装即得稳定的液体酸性果胶酶。

有益效果：

本发明液体酸性果胶酶的制备方法，无须添加化学防腐剂，无须低温处理，在常温下对发酵粗酶液和调配浓缩液采用高压脉冲电场处理，并在调配过程添加果胶分解物、中草药提取物、改性膳食纤维等天然植物原料，然后除菌过滤、无菌灌装即得一种稳定的保质期较长的液体酸性果胶酶。试验证明本发明制备的液体酸性果胶酶在室温储存12个月菌落总数为68-102CFU/mL；在40℃和0℃条件下储存12个月，酶活损失率分别为1-1.4％和0.5-1.1％。

具体原理为：

1.本发明采用高压脉冲电场低温杀菌技术对发酵粗酶液进行处理，从源头上杀灭了因发酵、管线输液、除菌过滤等过程污染的杂菌，而不会影响果胶酶的活力和效力，有效降低了液体果胶酶中的微生物含量，在调配过程采用高压脉冲电场低温杀菌技术，一方面有效杀灭了浓缩、调配过程和原料引入的杂菌，同时增强了稳定剂各成分与液体果胶酶的融合、稳定，进一步提高了液体果胶酶的非生物稳定性和生物稳定性。

2.本发明制备的果胶分解物具有显著的抑菌特性，尤其对大肠杆菌抑制作用最强，同时还具有较强的抗氧化性，对超氧自由基、羟自由基和DPPH自由基都表现出很强的消除作用，所述果胶分解物添加到液体果胶酶中可起到酶解产物的拮抗作用，暂时阻止和抑制果胶酶生物活性，稳定果胶酶酶蛋白的分子结构，有效防止酶活损失，增加液体果胶酶的非生物稳定性。

3.本发明制备的改性膳食纤维，可溶性膳食纤维含量高，可溶性强，具有强大的吸附能力，经改性后，纤维素的比表面积增大，网格结构丰富，吸附力增强，螯合、吸附有机分子能力更强；并且离子交换能力增强，对金属元素，特别是重金属元素吸附效果更强；同时持水性、膨胀性、增稠性更强且不受酸、碱、盐的影响；上述特性将果胶酶包埋其中，不受液体环境中其它破坏因子的影响，使得液相成分及果胶酶酶蛋白分子结构更加稳定，有效防止酶活力损失，增加了液体酸性果胶酶的非生物稳定性。

4.本发明制备的中草药提取物以显著抑制革兰氏阴性菌的中草药为原料，采用水提醇沉和生物酶解而制得，有效成分含量高，有效替代了防腐剂的运用，提高了液体酶制剂的生物稳定性。

5.本发明将天然抗氧化剂与果胶分解物科学复配于液体果胶酶中，不仅起到了较强的抗氧化作用，避免了液体酶制剂中的溶解氧对酶分子蛋白和其它组分的氧化，更重要的是天然抗氧化剂中的原花青素有效抑制了酶制剂蛋白的硝基化反应和非酶糖基化反应，显著提高了液体酶制剂蛋白的活力稳定性。

6.本发明中的牛血清白蛋白是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，可有效防止酶的分解和非特异性吸附，对有些内切酶效果更加显著，与其它组分如：果胶分解物、改性膳食纤维、海藻糖、金属氯化物、多元醇等科学复配，大大提高了液体果胶酶的酶活稳定性。

7.本发明液体果胶酶的制备方法工艺简单、操作方便，可实现工业化生产，稳定剂效果好，节能环保，真正实现了低碳生产。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

以下主要原料来源：

1.葡萄籽原花青素购买于河南安阳晶森生物科技有限公司，有效成分：OPC/Polyphenol，Assay OPC95％/polyphenol 90％；

银杏叶提取物购买于徐州恒凯银杏制品有限公司，中国药典2010版银杏叶提取物，总黄酮醇苷≥24％，产品注册商标：公孙堂Ginkgo Town；

迷迭香提取物购买于河南森源本草天然产物股份有限公司，主要成分：迷迭香酸、迷迭香酚等，含量85％，注册商标森源本草；

上述产品均为固体粉末；

2.牛血清白蛋白购自上海如吉生物科技发展有限公司，1g国产cas:9048-46-8；

3.其余原料均为市购常规产品。

实施例1原料制备

1.果胶分解物的制备

所述果胶分解物的制备方法为：将新鲜的山楂果渣、柑桔皮、苹果渣分别放入装有1.2％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、40KHz清洗8min，沥干，切分成相等规格,长、宽为5-10mm，厚度3-5mm的片或丁，按质量比6:3:2均匀混合，然后于-23℃冷冻20min；立即进行粉碎，粒径为0.5mm；加入粉碎物质量4倍的去离子水，混合均匀，用柠檬酸调节pH值为2.5，于室温下在电场强度40kV/cm，脉冲时间500μs,脉冲频率250Hz条件下进行高压脉冲电场处理，接着常压煮沸40min，布袋过滤，滤渣用其质量2倍的滤液常压煮沸50min,布袋过滤，合并滤液，硅藻土过滤，使滤液澄清，在75℃下减压浓缩至固形物含量为8％，迅速冷却至室温，加入浓缩液1.5倍体积的pH值为2.5的95％乙醇，静置25min,使果胶沉淀出来，4000r/min离心8min，回收沉淀，用2倍体积的无水乙醇洗脱，离心，回收沉淀，如此操作2次，得到的沉淀于50℃真空干燥2.5h,获得果胶，加入果胶质量5倍的45℃水，搅拌，均匀混合，保温，用乳酸调节pH值为4.5，加入0.5U/mL的果胶酶酶解3h,酶解液过滤，滤液于沸水中灭酶12min，冷却至室温，超滤浓缩、冷冻干燥即得果胶分解物。

2.中草药提取物的制备

所述中草药提取物的制备方法为：按重量份数计，准确称取艾叶52份，大蒜52份，黄芪50份，鱼腥草50份，黄芩38份，黄柏35份，柴胡35份，甘草30份，苦参20份，虎杖7份，大黄4份，白芥子3份，首乌2份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加混合物5倍重量的水，控制温度80℃保持3h，然后降温至50℃，加入混合物料总重量8％的复配酶进行酶解，用乳酸调节pH值为6.2，酶解3h，最后添加混合物料1.8倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的质量比为1:2，控制温度至70℃保持4h，过滤，得第一滤液；添加滤渣2倍重量的水，控制温度90℃保持2h，然后降温至30℃，过滤，得第二滤液；将第一滤液和第二滤液按照质量比2.5:1.5合并,减压浓缩、冷冻干燥、低温粉碎至粒径为0.2mm即得中草药提取物；

所述复配酶的重量份数组成为：内β-葡聚糖酶20份，外β-葡聚糖酶18份，β-葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普鲁兰酶25份，β-淀粉酶12份，酸性蛋白酶12份，果胶酶12份，葡萄糖氧化酶6份，酸性磷酸酶8份，脂肪酶6份；

所述乙醇浓度为75％。

3.改性膳食纤维的制备

所述改性膳食纤维的制备方法包括以下步骤：将菊粉、苹果纤维、燕麦纤维、小麦纤维、米糠、麸皮按质量比14:8:4:3:2:1.5均匀混合，加入其质量5倍的水，室温300W、40KHz条件超声提取12min,同时于电场强度30kV/cm，脉冲时间500μs,脉冲频率250Hz条件下进行高压脉冲电场提取；用乳酸调节pH值为5.5，加入混合物质量0.2％的生物酶，于50℃酶解35min；酶解液减压浓缩、冷冻干燥、低温粉碎至粒径为0.2mm即得改性膳食纤维；

所述生物酶为木聚糖酶、纤维素酶、漆酶、果胶酶、单宁酶、淀粉酶和蛋白酶按质量比9:6:4:3:2:2:1.5均匀混合。

下述实施例2-5所使用的果胶分解物、中草药提取物和改性膳食纤维均为实施例1制备。

实施例2

一种液体酸性果胶酶的制备方法，包括如下步骤：

1)将发酵后获得的酸性果胶酶发酵液添加200目硅藻土，用600目滤布预涂硅藻土，采用板框过滤机进行过滤，操作压力为0.18Mpa，得发酵粗酶液；

所述硅藻土的添加量为每100mL发酵液添加1g；

2)将步骤1)发酵粗酶液于室温下在电场强度25kV/cm，脉冲时间300μs,脉冲频率250Hz条件下进行高压脉冲电场处理；

3)步骤2)经高压脉冲电场处理的发酵粗酶液首先通过孔径为0.6μm的微滤膜微滤，微滤进口压力为0.11MPa，压差0.08MPa，酶液温度25℃；然后通过孔径为0.01μm的超滤膜超滤，超滤进口压力为0.18MPa，压差0.09MPa，酶液温度30℃；最后循环超滤得到浓缩酶液；

4)向步骤3)浓缩酶液中加入其质量3％的稳定剂，充分搅拌，均匀混合，用乳酸调节pH值3.5，然后于室温下在电场强度35kV/cm，脉冲时间500μs,脉冲频率250Hz条件下进行高压脉冲电场处理，静置30min；

所述稳定剂的制备方法如下：按重量份数计，准确称取果胶分解物30份，中草药提取物20份，改性膳食纤维12份，海藻糖12份，天然抗氧化剂8份，多元醇3份，金属氯化物2份，牛血清白蛋白0.2份；首先取改性膳食纤维，加入其质量8倍的去离子水，室温浸泡5h,边升温边搅拌，50℃保温25min,搅拌，充分溶解，继续保温，边搅拌边依次加入果胶分解物、中草药提取物、海藻糖、多元醇、金属氯化物，然后降温至30℃，边搅拌边依次加入牛血清白蛋白、天然抗氧化剂均匀混合即得稳定剂；

所述天然抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比为5:4:2均匀混合；

所述多元醇由聚乙二醇、丙三醇、山梨醇、二硫苏糖醇按质量比6:5:2:2均匀混合；

所述金属氯化物为氯化锌、氯化钙、氯化钠、氯化镁按质量比2.5:2:1.5:0.2均匀混合；

5)步骤4)经调配、静置后的浓缩酶液经除菌过滤、无菌灌装即得稳定的液体酸性果胶酶。

经上述方法制备的液体酸性果胶酶在室温储存12个月菌落总数为68CFU/mL；在40℃和0℃条件下储存12个月，酶活损失率分别为1％和0.5％。

实施例3

一种液体酸性果胶酶的制备方法，包括如下步骤：

1)将发酵后获得的酸性果胶酶发酵液添加100目硅藻土，用500目滤布预涂硅藻土，采用板框过滤机进行过滤，操作压力为0.14Mpa，得发酵粗酶液；

所述硅藻土的添加量为每100mL发酵液添加0.5g；

2)将步骤1)发酵粗酶液于室温下在电场强度20kV/cm，脉冲时间200μs,脉冲频率200Hz条件下进行高压脉冲电场处理；

3)步骤2)经高压脉冲电场处理的发酵粗酶液首先通过孔径为0.4μm的微滤膜微滤，微滤进口压力为0.1MPa，压差0.07MPa，酶液温度25℃；然后通过孔径为0.005μm的超滤膜超滤，超滤进口压力为0.15MPa，压差0.08MPa，酶液温度25℃；最后循环超滤得到浓缩酶液；

4)向步骤3)浓缩酶液中加入其质量0.5％的稳定剂，充分搅拌，均匀混合，用乳酸调节pH值2.8，然后于室温下在电场强度25kV/cm，脉冲时间400μs,脉冲频率200Hz条件下进行高压脉冲电场处理，静置20min；

所述稳定剂的制备方法如下：按重量份数计，准确称取果胶分解物20份，中草药提取物15份，改性膳食纤维10份，海藻糖10份，天然抗氧化剂5份，多元醇2份，金属氯化物1份，牛血清白蛋白0.1份；首先取改性膳食纤维，加入其质量5倍的去离子水，室温浸泡4h,边升温边搅拌，40℃保温20min,搅拌，充分溶解，继续保温，边搅拌边依次加入果胶分解物、中草药提取物、海藻糖、多元醇、金属氯化物，然后降温至25℃，边搅拌边依次加入牛血清白蛋白、天然抗氧化剂均匀混合即得稳定剂；

所述天然抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比4:3:1均匀混合；

所述多元醇由聚乙二醇、丙三醇、山梨醇、二硫苏糖醇按质量比5:4:1:1均匀混合；

所述金属氯化物为氯化锌、氯化钙、氯化钠、氯化镁按质量比2:1:1:0.1均匀混合；

5)步骤4)经调配、静置后的浓缩酶液经除菌过滤、无菌灌装即得稳定的液体酸性果胶酶。

经上述方法制备的液体酸性果胶酶在室温储存12个月菌落总数为88CFU/mL；在40℃和0℃条件下储存12个月，酶活损失率分别为1.2％和0.8％。

实施例4

一种液体酸性果胶酶的制备方法，包括如下步骤：

1)将发酵后获得的酸性果胶酶发酵液添加300目硅藻土，用800目滤布预涂硅藻土，采用板框过滤机进行过滤，操作压力为0.24Mpa，得发酵粗酶液；

所述硅藻土的添加量为每100mL发酵液添加1.5g；

2)将步骤1)发酵粗酶液于室温下在电场强度30kV/cm，脉冲时间300μs,脉冲频率300Hz条件下进行高压脉冲电场处理；

3)步骤2)经高压脉冲电场处理的发酵粗酶液首先通过孔径为0.8μm的微滤膜微滤，微滤进口压力为0.12MPa，压差0.09MPa，酶液温度30℃；然后通过孔径为0.015μm的超滤膜超滤，超滤进口压力为0.20MPa，压差0.10MPa，酶液温度35℃；最后循环超滤得到浓缩酶液；

4)向步骤3)浓缩酶液中加入其质量10％的稳定剂，充分搅拌，均匀混合，用乳酸调节pH值5.2，然后于室温下在电场强度40kV/cm，脉冲时间600μs,脉冲频率300Hz条件下进行高压脉冲电场处理，静置40min；

所述稳定剂的制备方法如下：按重量份数计，准确称取果胶分解物40份，中草药提取物25份，改性膳食纤维15份，海藻糖15份，天然抗氧化剂10份，多元醇5份，金属氯化物3份，牛血清白蛋白0.3份；首先取改性膳食纤维，加入其质量12倍的去离子水，室温浸泡6h,边升温边搅拌，60℃保温30min,搅拌，充分溶解，继续保温，边搅拌边依次加入果胶分解物、中草药提取物、海藻糖、多元醇、金属氯化物，然后降温至35℃，边搅拌边依次加入牛血清白蛋白、天然抗氧化剂均匀混合即得稳定剂；

所述天然抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比6:5:3均匀混合；

所述多元醇由聚乙二醇、丙三醇、山梨醇、二硫苏糖醇按质量比7:6:3:3均匀混合；

所述金属氯化物为氯化锌、氯化钙、氯化钠、氯化镁按质量比3:3:2:0.3均匀混合；

5)步骤4)经调配、静置后的浓缩酶液经除菌过滤、无菌灌装即得稳定的液体酸性果胶酶。

经上述方法制备的液体酸性果胶酶在室温储存12个月菌落总数为76CFU/mL；在40℃和0℃条件下储存12个月，酶活损失率分别为1.1％和1％。

实施例5

一种液体酸性果胶酶的制备方法，包括如下步骤：

1)将发酵后获得的酸性果胶酶发酵液添加100目硅藻土，用800目滤布预涂硅藻土，采用板框过滤机进行过滤，操作压力为0.14Mpa，得发酵粗酶液；

所述硅藻土的添加量为每100mL发酵液添加1.5g；

2)将步骤1)发酵粗酶液于室温下在电场强度30kV/cm，脉冲时间200μs,脉冲频率300Hz条件下进行高压脉冲电场处理；

3)步骤2)经高压脉冲电场处理的发酵粗酶液首先通过孔径为0.4μm的微滤膜微滤，微滤进口压力为0.12MPa，压差0.07MPa，酶液温度30℃；然后通过孔径为0.005μm的超滤膜超滤，超滤进口压力为0.20MPa，压差0.08MPa，酶液温度35℃；最后循环超滤得到浓缩酶液；

4)向步骤3)浓缩酶液中加入其质量5％的稳定剂，充分搅拌，均匀混合，用乳酸调节pH值5.2，然后于室温下在电场强度25kV/cm，脉冲时间600μs,脉冲频率200Hz条件下进行高压脉冲电场处理，静置40min；

所述稳定剂的制备方法如下：按重量份数计，准确称取果胶分解物40份，中草药提取物15份，改性膳食纤维15份，海藻糖10份，葡萄籽原花青素10份，丙三醇2份，氯化锌3份，牛血清白蛋白0.1份；首先取改性膳食纤维，加入其质量12倍的去离子水，室温浸泡4h,边升温边搅拌，60℃保温20min,搅拌，充分溶解，继续保温，边搅拌边依次加入果胶分解物、中草药提取物、海藻糖、多元醇、金属氯化物，然后降温至35℃，边搅拌边依次加入牛血清白蛋白、天然抗氧化剂均匀混合即得稳定剂；

5)步骤4)经调配、静置后的浓缩酶液经除菌过滤、无菌灌装即得稳定的液体酸性果胶酶。

经上述方法制备的液体酸性果胶酶在室温储存12个月菌落总数为102CFU/mL；在40℃和0℃条件下储存12个月，酶活损失率分别为1.4％和1.1％。

实施例6液体酸性果胶酶的生物稳定性

以本发明实施例2制备的液体酸性果胶酶与市售相同生产日期的同规格液体酸性果胶酶为试验对象，在相同储藏条件(室温、通风、避光)下，采用《QB1502-92食品添加剂果胶酶制剂》中检测方法检测了pH值、菌落总数、致病菌、重金属等卫生指标，结果如表1：

表1储存12个月微生物指标检测结果

以上结果表明：市售液体酸性果胶酶虽然保质期(3个月)内检测指标均合格，但当储存至6-12个月时，其菌落总数和大肠菌群已经超标，微生物含量迅速递增，pH值从4.5降至3.5，下降明显；本发明液体酸性果胶酶污染杂菌种类少，各项检测指标储存12个月均优于国家标准，并且随着储存时间的延长，微生物含量增殖缓慢，pH值几乎无变化，显示了本发明液体酸性果胶酶优良的生物稳定性，同时本发明液体酸性果胶酶制备过程对引入的植物原料采用了超声清洗，有效降低了农残及重金属离子的含量，市售果胶酶虽然合格，但存在较大的食品安全隐患。

实施例7液体酸性果胶酶酶活力稳定性

将本发明实施例2制备的液体酸性果胶酶与市售相同生产日期的同规格液体酸性果胶酶分别于0℃和40℃条件下储存12个月，采用《《QB1502-92食品添加剂果胶酶制剂》中检测方法测定液体酸性果胶酶的酶活力，计算酶活损失率，酶活损失率是指实际检测的酶活力与产品标注酶活力的差值占标注酶活力的百分率，结果如表2

表2储存期酶活力损失率

以上结果表明，在0℃和40℃条件下储存12个月，本发明液体酸性果胶酶比市售液体酸性果胶酶酶活损失分别降低21.5％和99％，具有优良的温度储存性，酶活力非常稳定，保质期长。

Claims (10)

1.一种液体酸性果胶酶的制备方法，包括如下步骤：

1)将发酵后获得的酸性果胶酶发酵液添加100目-300目硅藻土，用500-800目滤布预涂硅藻土，采用板框过滤机进行过滤，操作压力为0.14-0.24Mpa，得发酵粗酶液；

2)将步骤1)发酵粗酶液于室温下在电场强度20-30kV/cm，脉冲时间200-300μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场处理；

3)步骤2)经高压脉冲电场处理的发酵粗酶液首先通过孔径为0.4-0.8μm的微滤膜微滤，微滤进口压力为0.1-0.12MPa，压差0.07-0.09MPa，酶液温度25-30℃；然后通过孔径为0.005-0.015μm的超滤膜超滤，超滤进口压力为0.15-0.20MPa，压差0.08-0.10MPa，酶液温度25-35℃；最后循环超滤得到浓缩酶液；

4)向步骤3)浓缩酶液中加入其质量0.5-10％的稳定剂，充分搅拌，均匀混合，用乳酸调节pH值2.8-5.2，然后于室温下在电场强度25-40kV/cm，脉冲时间400-600μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场处理，静置20-40min；

5)步骤4)经调配、静置后的浓缩酶液经除菌过滤、无菌灌装即得稳定的液体酸性果胶酶；

所述稳定剂的制备方法如下：按重量份数计，准确称取果胶分解物20-40份，中草药提取物15-25份，改性膳食纤维10-15份，海藻糖10-15份，天然抗氧化剂5-10份，多元醇2-5份，金属氯化物1-3份，牛血清白蛋白0.1-0.3份；首先取改性膳食纤维，加入其质量5-12倍的去离子水，室温浸泡4-6h,边升温边搅拌，40-60℃保温20-30min,搅拌，充分溶解，继续保温，边搅拌边依次加入果胶分解物、中草药提取物、海藻糖、多元醇、金属氯化物，然后降温至25-35℃，边搅拌边依次加入牛血清白蛋白、天然抗氧化剂均匀混合即得稳定剂。

2.如权利1所述的液体酸性果胶酶的制备方法，其特征在于，步骤1)所述硅藻土的添加量为每100mL发酵液添加0.5-1.5g。

3.如权利1所述的液体酸性果胶酶的制备方法，其特征在于，所述果胶分解物的制备方法为：将新鲜的山楂果渣、柑桔皮、苹果渣分别放入装有1.2％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、40KHz清洗5-10min，沥干，切分成相等规格,长、宽为5-10mm，厚度3-5mm的片或丁，按质量比4-7:2-4:1-3均匀混合，然后于-25—-21℃冷冻10-30min；立即进行粉碎，粒径为0.1-1mm；加入粉碎物质量3-5倍的去离子水，混合均匀，用柠檬酸调节pH值为2-3，于室温下在电场强度35-45kV/cm，脉冲时间400-600μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场处理，接着常压煮沸30-50min，布袋过滤，滤渣用其质量1-3倍的滤液常压煮沸40-60min,布袋过滤，合并滤液，硅藻土过滤，使滤液澄清，在75℃下减压浓缩至固形物含量为6-10％，迅速冷却至室温，加入浓缩液1.5倍体积的pH值为2-3的95％乙醇，静置20-30min,使果胶沉淀出来，4000r/min离心5-10min，回收沉淀，用2倍体积的无水乙醇洗脱，离心，回收沉淀，如此操作2次，得到的沉淀于40-60℃真空干燥2-3h,获得果胶，加入果胶质量4-5倍的40-50℃水，搅拌，均匀混合，保温，用乳酸调节pH值为4.5-5.5，加入0.3-0.8U/mL的果胶酶酶解2-4h,酶解液过滤，滤液于沸水中灭酶10-15min，冷却至室温，超滤浓缩、冷冻干燥即得果胶分解物。

4.如权利1所述的液体酸性果胶酶的制备方法，其特征在于，所述中草药提取物的制备方法为：按重量份数计，准确称取艾叶50-55份，大蒜50-55份，黄芪45-55份，鱼腥草45-55份，黄芩30-45份，黄柏30-40份，柴胡30-40份，甘草25-35份，苦参15-25份，虎杖6-8份，大黄2-5份，白芥子2-5份，首乌1-3份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加混合物5倍重量的水，控制温度80℃保持3h，然后降温至50℃，加入混合物料总重量8％的复配酶进行酶解，用乳酸调节pH值为6.2，酶解3h，最后添加混合物料1.8倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的质量比为1:2，控制温度至70℃保持4h，过滤，得第一滤液；添加滤渣2倍重量的水，控制温度90℃保持2h，然后降温至30℃，过滤，得第二滤液；将第一滤液和第二滤液按照质量比2.5:1.5合并,减压浓缩、冷冻干燥、低温粉碎至粒径为0.1-0.3mm即得中草药提取物；

所述复配酶的重量份数组成为：内β-葡聚糖酶20份，外β-葡聚糖酶18份，β-葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普鲁兰酶25份，β-淀粉酶12份，酸性蛋白酶12份，果胶酶12份，葡萄糖氧化酶6份，酸性磷酸酶8份，脂肪酶6份；

所述乙醇浓度为75％。

5.如权利1所述的液体酸性果胶酶的制备方法，其特征在于，所述改性膳食纤维的制备方法包括以下步骤：将菊粉、苹果纤维、燕麦纤维、小麦纤维、米糠、麸皮按质量比12-15:6-9:3-5:2-4:1-3:1-2均匀混合，加入其质量3-7倍的水，室温200-300W、35-40KHz条件超声提取10-15min,同时于电场强度20-40kV/cm，脉冲时间400-500μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场提取；用乳酸调节pH值为4.5-6.5，加入混合物质量0.1-0.3％的生物酶，于45-55℃酶解20-48min；酶解液减压浓缩、冷冻干燥、低温粉碎至粒径为0.1-0.3mm即得改性膳食纤维；

所述生物酶为木聚糖酶、纤维素酶、漆酶、果胶酶、单宁酶、淀粉酶和蛋白酶按质量比8-10:4-7:3-5:2-4:1-3:1-3:1-2均匀混合。

6.如权利1所述的液体酸性果胶酶的制备方法，其特征在于，所述天然抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物中的任意一种或几种组合。

7.如权利6所述的液体酸性果胶酶的制备方法，其特征在于，所述葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物混合的质量比为4-6:3-5:1-3。

8.如权利1所述的液体酸性果胶酶的制备方法，其特征在于，所述多元醇为聚乙二醇、丙三醇、山梨醇、二硫苏糖醇、疏基乙醇中的一种或几种。

9.如权利8所述的液体酸性果胶酶的制备方法，其特征在于，所述多元醇由聚乙二醇、丙三醇、山梨醇、二硫苏糖醇按质量比5-7:4-6:1-3:1-3均匀混合。

10.如权利1所述的液体酸性果胶酶的制备方法，其特征在于，所述金属氯化物为氯化锌、氯化钙、氯化钠、氯化镁按质量比2-3:1-3:1-2:0.1-0.3均匀混合。