CN104099314A - 一种稳定的液体复配酶 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种稳定的液体复配酶及其制备方法，属于液体复配酶制备技术领域，以啤酒酿造用液体酶制剂为主要原料，科学复配糖、多元醇、氨基酸、增稠剂、白蛋白、金属离子等稳定剂和促进酶制剂更加稳定的酒花提取物、中草药提取液、抗菌肽等具有防腐作用的物质，完全替代了防腐剂的添加，不仅有效的抑制了有害微生物的繁殖和生长，而且能够和其它组分协同稳定液体复配酶的活性，从根本上提高了液体复配酶的生物稳定性和酶活力稳定性，有效延长了液体酶制剂的保质期。制备的液体复配酶在室温储存12个月菌落总数为168-214CFU/mL；在40℃和0℃条件下储存12个月，酶活损失率分别为2-2.5％和1-1.7％。

Description

一种稳定的液体复配酶
技术领域
本发明涉及液体复配酶，具体涉及一种稳定的液体复配酶。
背景技术
液体酶制剂是一种使用方便，绿色环保，生物降解性良好的原料。专一的催化特性及温和的反应条件，在工业界得到越来越多的使用和重视。在使用方面液体酶制剂具有以下优点：1)液体酶制剂以分子或微粒状态分散在底物中，分散度大，吸收快，能较迅速地发生酶解反应，酶活性高；2)易于分剂量，容易复配和二次加工，使用方便；3)有利于提高酶制剂的利用率，4)直接使用，无须溶解和活化；5)纯度高、杂质含量低；6)生产过程短、成本低；7)生产加工和使用过程中不会造成粉尘污染，有利于保护环境；但是，液体酶制剂体积较大，携带、运输、贮存都不方便，酶活性容易受到高温、冷冻、光照、酸碱性、氧化、湿度等贮存环境的影响而显著降低，并且因为液体酶制剂的水分活度较高，很容易受到微生物的污染而失活。因此，液体酶制剂的应用受到限制，最主要的原因就是其稳定性较差，包括生物稳定性和物理、化学稳定性。
为了解决上述问题，现有的酶制剂生产厂家便将经浓缩、分离后的液体酶制剂添加稳定剂、防腐剂、表面活性剂、金属离子等，以提高液体酶制剂的生物稳定性、非生物稳定性和使用效果，拓宽其在食品、纺织、造纸、洗涤、饲料等领域的应用范围，由此，液体复配酶应运而生，总体来说，液体复配酶分为两种，一种是单一液体复配酶，即由一种液体酶制剂和添加剂加工而成；另一种是多种液体复配酶，是由多种液体酶制剂和添加剂加工而成。因为酶制剂作用底物的单一性和作用条件的多样性、差异性，目前，市场上用于工业化的液体酶制以单一液体复配酶为主，多种液体复配酶较少，几乎没有。
液体复配酶复配的首要前提条件是应用领域，要具体到加工成品的产品特性，如果不考虑产品特性的因素而进行盲目的为了提高稳定性的复配，不但不会有效发挥酶制剂的作用，反而会产生严重的副作用，甚至会酿成重大生产事故。因此液体复配酶的制备要综合考虑多方面的因素。
目前，市场上的液体复配酶主要集中在造纸、洗涤、食品、饲料、酒精制备等技术领域，且以单种液体复配酶为主，其中添加稳定剂有甘油等多元醇和黄原胶、明胶，CMC等表面活性剂、聚醇类表面活性剂、脂肪醇聚氧乙烯醚化合物、pvp等高分子化合物、氯化钠等金属氯化物、阴阳离子表面活性剂、苯甲酸钠等防腐剂等，添加剂的种类还与酶的种类、同一酶的作用底物和条件、添加剂的物理和化学性质、酶作用效果等多种因素有关，并非能够统一添加、使用。
与其它发酵工业不同的是，在轰轰烈烈的消泡战役中，啤酒酿造自始至终在最大限度的保持泡沫，啤酒泡持性是啤酒的重要理化和感官指标之一。啤酒在外观上不同于其它饮料的一个重要特点:就是在倒入杯中时,会产生洁白细腻的泡沫,给人以洁净、清爽感,促进人们的饮欲。因此啤酒的泡持性成为消费者认识啤酒品牌的重要特征。啤酒的泡持性通常是指:啤酒的起泡性,持久性和附着性。液体复配酶某些稳定剂和表面活性剂会起到强力消泡剂的作用，氯化钠的添加会是啤酒产生咸味，影响口感，防腐剂的添加会对人体产生毒害……。
因此，对于啤酒酿造工业来说，制备一种安全、稳定、作用效果显著的液体复配酶限制条件较多，尤其显得困难，制备一种适合啤酒酿造的多种液体复配酶更加困难，目前，还未见公开的啤酒多种液体复配酶的报道。中国专利CN 101617740B公开了一种酶活保有率高的饲用液体植酸酶制剂。本发明是在植酸酶原酶液中加入聚乙二醇6000、海藻糖、苯甲酸钠、纯水，调节PH值为4.5～5.5：其中聚乙二醇6000中的羟基与酶蛋白分子表面及其活性中心的羧基、氨基等以共价键、氢键及范德华力等结合，从而使酶蛋白分子的活性中心和整个酶蛋白分子得到保护；海藻糖(稳定剂)，提高酶溶液的渗透压，使酶蛋白分子的舒展度降低，分子相对处于脱水状态而收缩，从而提高稳定性；苯甲酸钠(防腐剂)及优选pH范围(4.5～5.5)，均起到提高液体酶的生物稳定性的作用。中国专利CN 101717765B公开一种环糊精葡萄糖基转移酶复配酶制剂，其特征在于该酶制剂是一种液体酶制剂；其组成为：环糊精葡萄糖基转移酶、甘油、CaCl2、PEG400以及明胶；所述环糊精葡萄糖基转移酶为蛋白质含量为3g/L-5g/L的发酵液，甘油浓度为10％-20％(体积分数)，CaCl2浓度为0.1g/L-0.2g/L，PEG400浓度为5％-10％(体积分数)，明胶浓度为0.5％-1％(质量分数)。具有极其优异的储存稳定性，在40℃保存60天，其酶活保留率仍高达95％以上，解决了由于产品运送或储存时间较长导致产品应用性能下降的问题。本发明提供的液体酶制剂复配方法简单，原料来源丰富并且成本低，特别适合在工业上推广。中国专利CN 103131557B公开了一种液体洗涤剂用酶制剂复合稳定剂，涉及酶稳定剂，解决现有液体洗涤剂中酶稳定性差，且传统酶稳定剂主要使用硼砂，对人体存在潜在危害的问题。一种液体洗涤剂用酶制剂复合稳定剂，由以下重量份的各组分组成：环糊精0.05～20、氯化钙0.05～20、甘油和丙二醇混合物1～10、非离子表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚1～60、阴离子表面活性剂烷基苯磺酸钠1～60；其中所述的甘油与丙二醇混合物中甘油：丙二醇的重量比为2:6～10。本发明可简化液体洗涤剂的生产及配方过程，显著提高和延长液体洗涤剂中酶制剂的活性，原料安全无毒，对人体无害。上述公开的液体酶制剂及稳定剂均不适合啤酒酿造生产。
综上，制备一种适合啤酒酿造的安全、稳定、效果显著的多种液体复配酶具有广阔的市场空间和良好的市场价值。
发明内容
本发明所解决的技术问题是将一种或多种经浓缩、分离的液体酶制剂按照啤酒酿造用途合理调配，并科学复配糖、多元醇、氨基酸、增稠剂、白蛋白、金属离子等稳定剂和促进酶制剂更加稳定的酒花提取物、中草药提取液、抗菌肽等具有防腐作用的物质，有效地提高了液体复配酶的酶活力稳定性和生物稳定性，在啤酒酿造中发挥了重要的催化剂作用，同时还改善了啤酒的口感和泡沫性能等质量指标，无须添加防腐剂，制备出一种适合啤酒酿造的安全、稳定、效果显著的液体复配酶。
本发明的首要目的是提供一种稳定的液体复配酶。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种稳定的液体复配酶，由以下重量份数的原料制备：
液体酶制剂40-60份，啤酒花提取液10-15份，糖5-10份，天然抗氧化剂6-10份，中草药提取液6-10份，抗菌肽8-10份，增稠剂3-5份，β-环糊精3-5份，多元醇2-5份，谷胱甘肽2-4份，金属氯化物1-3份，硫酸铵1-2份，半胱氨酸0.5-1份，牛血清白蛋白0.1-0.3份。
所述液体酶制剂的适宜温度为35-115℃，适宜pH值为2.5-6；
进一步地，所述液体酶制剂选自由葡聚糖酶、木聚糖酶、中温淀粉酶、α-淀粉酶、耐高温α-淀粉酶、真菌α-淀粉酶、异淀粉酶、糖化酶、β-淀粉酶、普鲁兰酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、脯氨酸蛋白酶、无花果蛋白酶、β-葡聚糖酶、耐温β-葡聚糖复合酶、β-葡聚糖复合酶、甘露聚糖酶、戊聚糖酶、酸性磷酸酶、脂肪酶、磷酸酯酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖异构酶、单宁酶、乳糖酶、过氧化氢酶、α-乙酰乳酸脱羧酶组成的组中的任一种或几种，但不局限于这些酶，也可适用于其他工业酶制剂。液体酶不仅包括来自自然条件下的菌株产生的酶，而且包括通过基因工程改造的工程菌产生的酶；
优选地，所述液体酶制剂由中温淀粉酶、葡聚糖酶、木聚糖酶按体积比5-6:2-4:1-3均匀混合；
进一步地，所述啤酒花提取液的制备方法为：将啤酒花置超声波清洗机中于200W、40KHz清洗10-15min,沥干，于-18—-22℃冷冻1-2h后立即进行粉碎，冷冻料层厚度3-5cm，粉碎粒度0.5-3mm,加入粉碎啤酒花重量1-3倍的乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的质量比为2-4:1-3,用乳酸调节pH值为3.0-3.5，在功率150-300W、频率2000Hz、温度20-35℃条件下进行微波提取20-30min,同时在功率200-300W,频率30-40KHz条件下进行超声波辅助提取；保温1-3h,然后，在功率200-400W、频率2000Hz条件下进行微波提取15-20min，同时在功率300-500W,频率40-50KHz条件下进行超声波辅助提取，最后自然降温至室温，过滤，滤液于电场强度35-45kV/cm，脉冲时间400-600μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场(PEF)杀菌20-30min即得啤酒花提取液；
所述啤酒花为新鲜成熟啤酒花、压缩片花或压缩颗粒酒花，优选新鲜成熟啤酒花；在采用颗粒酒花时，无须清洗；
优选地，所述超声波清洗采用质量百分比浓度为0.2-0.8％的碳酸氢钠溶液为清洗剂；
优选地，所述乙醇和丙醇混合的质量比为3:2；
优选地，所述微波提取采用间歇式提取，即微波辐照20s,停止10s,如此循环；
所述乙醇浓度≥75％。
进一步地，所述糖为海藻糖、灵芝多糖、葡萄糖中一种或多种；
优选地，所述糖为海藻糖、灵芝多糖、葡萄糖按质量比8-10:1-3:5-9均匀混合。
进一步地，所述天然抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物中的任一一种或几种组合；
优选地，所述葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物混合的质量比为6-8:5-7:2-4；
进一步地，所述中草药提取液的制备方法为：按重量份数计，准确称取黄芪60-70份，当归55-65份，党参40-45份，甘草40-45份，鱼腥草35-45份，神曲35-45份，金银花25-35份，茯苓20-30份，远志15-25份，炒茴香15-25份，白术10-20份，厚朴10-20份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70℃-90℃保持2-4h，然后降温至45-60℃，加入混合物料总重量5-10％的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60℃-78℃保持3-4h，过滤，得第一滤液；添加滤渣1-3倍重量的水，控制温度85℃-95℃保持1-3h，然后降温至25-35℃，过滤，得第二滤液；将第一滤液和第二滤液按照质量比2-3:1-2合并,于电场强度35-45kV/cm，脉冲时间400-600μs,脉冲频率300-400Hz条件下进行高压脉冲电场(PEF)杀菌20-30min即得中草药提取液；
优选地，所述第一滤液和第二滤液合并的质量比为2.5:1.5；
所述混合酶的重量份数组成为：内β-葡聚糖酶10-20份，外β-葡聚糖酶10-20份，β-葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普鲁兰酶20-30份，β-淀粉酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，果胶酶10-15份，甘露糖酶10-15份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份，脂肪酶5-8份；
所述乙醇和丙醇混合的质量比为1:1-2，所述乙醇浓度≥75％。
进一步地，所述多元醇为聚乙二醇、丙三醇、山梨醇、二硫苏糖醇、疏基乙醇中的一种或几种；
优选地，所述多元醇由聚乙二醇、丙三醇、山梨醇、二硫苏糖醇按质量比8-10:4-6:2-4:1-3均匀混合。
进一步地，所述增稠剂为卡拉胶、阿拉伯胶、明胶、黄原胶、海藻胶、CMC、琼脂、蜂胶、紫胶、果胶、瓜尔豆胶、皂荚糖胶、亚麻子胶、魔芋胶中一种或者多种；
优选地，所述增稠剂由卡拉胶、阿拉伯胶、明胶、黄原胶、CMC按质量比3-5:2-4:1-3:1-2:0.5-1均匀混合。
进一步地，所述金属氯化物为氯化锌、氯化钙、氯化钠、氯化镁、氯化铁中的一种或多种；
优选地，所述金属氯化物为氯化锌、氯化钙、氯化钠、氯化镁、氯化铁按质量比3-5:2-3:1-3:1-2:0.1-0.3均匀混合。
本发明另一目的是提供一种稳定的液体复配酶的制备方法，包括如下步骤：
以重量份数计，按照上述配方首先准确称取增稠剂，加入其质量4-6倍的无菌水，室温浸泡3-8h,边升温边搅拌，80-90℃保温20-30min,搅拌，充分溶解，继续保温，边搅拌边依次加入β-环糊精、多元醇、糖、金属氯化物，然后降温至25-35℃，边搅拌边依次加入硫酸铵、半胱氨酸、谷胱甘肽、抗菌肽、天然抗氧化剂、牛血清白蛋白、中草药提取液、啤酒花提取液、液体酶制剂充分溶解、混合，用乳酸调节液体复配酶pH值为2.5-6，稳定0.5-2h,同时于电场强度35-45kV/cm，脉冲时间400-600μs,脉冲频率300-400Hz条件下进行高压脉冲电场(PEF)杀菌，除菌过滤、无菌灌装即得液体复配酶。
本发明还有一个目的是液体复配酶在啤酒酿造中的应用。
使用方法：
糖化阶段将本发明啤酒液体复配酶加入糖化锅
添加量：根据麦芽质量的不同和酿造辅料的比例高低，每t干麦芽添加500-1000ml；
作用条件：最适PH值4.5-5.5；最适温度35-68℃；最佳料水质量比1:4.5-5.5。
有益效果：
1.本发明制备的啤酒花提取液、中草药提取液采用低温提取技术，最大限度地将酒花和中草药中的有效成分保留，并与抗菌肽科学复配，完全替代了防腐剂的添加，不仅有效的抑制了有害微生物的繁殖和生长，而且能够和其它组分协同稳定液体复配酶的活性，从根本上提高了液体复配酶的生物稳定性和酶活力稳定性，有效延长了液体酶制剂的保质期。制备的液体复配酶在室温储存12个月菌落总数为168-214CFU/mL；在40℃和0℃条件下储存12个月，酶活损失率分别为2-2.5％和1-1.7％。
2.本发明在长时间的试验基础上，科学复配了具有消泡剂作用的多元醇，多元醇是一类效果较好的酶制剂稳定剂，与其它组分如啤酒花提取液、糖、增稠剂、β-环糊精、中草药提取液等一起，不仅没有对糖化麦汁、发酵液、成品的泡沫性能和口感产生影响，反而有所提升，取得了意想不到的效果。与市售液体糖化酶相比，麦芽香味与酒花香味明显、柔和协调，泡沫性能优良，泡持性时间长；浊度较低，双乙酰含量较低，发酵良好，酒精度较高，成品啤酒无论是感官指标还是理化指标都远远优先于普通啤酒复配酶，达到或超过了国家现行啤酒优级标准。
3.本发明将天然抗氧化剂与谷胱甘肽科学复配于液体酶制剂中，不仅起到了较强的抗氧化作用，避免了液体酶制剂中的溶解氧对酶分子蛋白和其它组分的氧化，更重要的是天然抗氧化剂中的原花青素有效抑制了酶制剂蛋白的硝基化反应和非酶糖基化反应，显著提高了液体酶制剂蛋白的活力稳定性。
4.本发明中的牛血清白蛋白是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，可有效防止酶的分解和非特异性吸附，对有些内切酶效果更加显著，与其它组分如：谷胱甘肽、金属氯化物、多元醇、硫酸铵等科学复配，大大提高了液体复配酶的酶活稳定性。
5.本发明的液体复配酶的制备方法工艺简单、操作方便、可规模化工业生产，采用高压脉冲电场低温杀菌技术(PEF)，既保证了液体酶制剂蛋白的生化活性，又有效杀灭和抑制了微生物的繁殖和生长，显著提高了液体酶制剂的酶活稳定性和生物稳定性，有效延长了液体酶制剂的保质期。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
以下主要原料来源：
1.经分离、浓缩的液体中温淀粉酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、糖化酶均由湖南鸿鷹生物科技股份有限公司生产，其中：
中温淀粉酶的活力为500-2000U/mL，最适反应温度为60-70℃，最适pH值为5-6；
葡聚糖酶的活力为5000-12000U/mL，最适反应温度为40-65℃，最适pH值为4-5.5；
木聚糖酶的活力为5000-20000U/mL，最适反应温度为50-65℃，最适pH值为3.5-6；
糖化酶的活力为150000-200000U/mL，最适反应温度为60-70℃，最适pH值为5-6。
2.新鲜成熟啤酒花采自新疆啤酒花股份有限公司种植基地。
3.糖、增稠剂、β-环糊精、半胱氨酸均购自上海权旺生物科技有限公司。
4.葡萄籽原花青素购买于河南安阳晶森生物科技有限公司，有效成分：OPC/Polyphenol，Assay OPC95％/polyphenol90％；
银杏叶提取物购买于徐州恒凯银杏制品有限公司，中国药典2010版银杏叶提取物，总黄酮醇苷≥24％，产品注册商标：公孙堂Ginkgo Town；
迷迭香提取物购买于河南森源本草天然产物股份有限公司，主要成分：迷迭香酸、迷迭香酚等，含量85％，注册商标森源本草；
上述产品均为固体粉末。
5.抗菌肽购自广东天浩生物工程股份有限公司，为食品用抗菌肽K-100,型号K-100。
6.谷胱甘肽购自西安融升生物科技有限公司，为食品用谷胱甘肽，谷胱甘肽含量99％，产品编号：P0200375。
7.牛血清白蛋白购自上海如吉生物科技发展有限公司，1g国产cas:9048-46-8。
实施例1 啤酒花提取液的制备
所述啤酒花提取液的制备方法为：将新鲜成熟啤酒花置超声波清洗机中于200W、40KHz清洗12min,沥干，于-20℃冷冻1.5h后立即进行粉碎，冷冻料层厚度4cm，粉碎粒度2mm,加入粉碎啤酒花重量2倍的乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的质量比为3:2,用乳酸调节pH值为3.2，在功率200W、频率2000Hz、温度30℃条件下进行微波间歇式提取25min,同时在功率300W,频率35KHz条件下进行超声波辅助提取；保温2h,然后，在功率300W、频率2000Hz条件下进行微波提取18min，同时在功率400W,频率45KHz条件下进行超声波辅助提取，最后自然降温至室温，过滤，滤液于电场强度40kV/cm，脉冲时间500μs,脉冲频率250Hz条件下进行高压脉冲电场(PEF)杀菌25min即得啤酒花提取液；
所述超声波清洗采用质量百分比浓度为0.2-0.8％的碳酸氢钠溶液为清洗剂；
所述间歇式提取为微波辐照20s,停止10s,如此循环；
所述乙醇浓度为80％。
实施例2 中草药提取液的制备
所述中草药提取液的制备方法为：按重量份数计，准确称取黄芪65份，当归60份，党参42份，甘草42份，鱼腥草40份，神曲40份，金银花30份，茯苓25份，远志20份，炒茴香20份，白术15份，厚朴15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度80℃保持3h，然后降温至50℃，加入混合物料总重量8％的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为6.2，酶解3h，最后添加混合物料1.8倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的质量比为1:2，控制温度至70℃保持4h，过滤，得第一滤液；添加滤渣2倍重量的水，控制温度90℃保持2h，然后降温至30℃，过滤，得第二滤液；将第一滤液和第二滤液按照质量比2.5:1.5合并,于电场强度40kV/cm，脉冲时间500μs,脉冲频率350Hz条件下进行高压脉冲电场(PEF)杀菌25min即得中草药提取液；
所述混合酶的重量份数组成为：内β-葡聚糖酶20份，外β-葡聚糖酶18份，β-葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普鲁兰酶25份，β-淀粉酶12份，酸性蛋白酶12份，果胶酶12份，甘露糖酶12份，葡萄糖氧化酶6份，酸性磷酸酶8份，脂肪酶6份；
所述乙醇浓度为75％。
实施例3
一种稳定的液体复配酶，由以下重量份数的原料制备：
液体酶制剂50份，啤酒花提取液12份，糖8份，天然抗氧化剂8份，中草药提取液8份，抗菌肽9份，增稠剂4份，β-环糊精4份，多元醇3份，谷胱甘肽3份，金属氯化物2份，硫酸铵2份，半胱氨酸0.8份，牛血清白蛋白0.2份。
所述液体酶制剂由中温淀粉酶、葡聚糖酶、木聚糖酶按体积比5.5:3:2均匀混合；
所述糖为海藻糖、灵芝多糖、葡萄糖按质量比9:2:7均匀混合；
所述天然抗氧化剂由葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比7:6:3均匀混合；
所述增稠剂由卡拉胶、阿拉伯胶、明胶、黄原胶、CMC按质量比4:3:2:1.5:0.8均匀混合；
所述多元醇由聚乙二醇、丙三醇、山梨醇、二硫苏糖醇按质量比9:5:3:2均匀混合；
所述金属氯化物为氯化锌、氯化钙、氯化钠、氯化镁、氯化铁按质量比4:2.5:2:1.5:0.2均匀混合；
所述啤酒花提取液由实施例1制备；
所述中草药提取液由实施例2制备；
制备方法：以重量份数计，按照上述配方首先准确称取增稠剂，加入其质量5倍的无菌水，室温浸泡6h,边升温边搅拌，85℃保温25min,搅拌，充分溶解，继续保温，边搅拌边依次加入β-环糊精、多元醇、糖、金属氯化物，然后降温至30℃，边搅拌边依次加入硫酸铵、半胱氨酸、谷胱甘肽、抗菌肽、天然抗氧化剂、牛血清白蛋白、中草药提取液、啤酒花提取液、液体酶制剂充分溶解、混合，用乳酸调节液体复配酶pH值为5.2，稳定1.5h,同时于电场强度40kV/cm，脉冲时间500μs,脉冲频率350Hz条件下进行高压脉冲电场(PEF)杀菌，除菌过滤、无菌灌装即得液体复配酶。
经上述方法制备的液体复配酶在室温储存12个月菌落总数为168CFU/mL；在40℃和0℃条件下储存12个月，酶活损失率分别为2％和1％。
实施例4
一种稳定的液体复配酶，由以下重量份数的原料制备：
液体酶制剂40份，啤酒花提取液10份，海藻糖5份，葡萄籽原花青素6份，中草药提取液6份，抗菌肽8份，明胶3份，β-环糊精3份，多元醇2份，谷胱甘肽2份，金属氯化物1份，硫酸铵1份，半胱氨酸0.5份，牛血清白蛋白0.1份。
所述液体酶制剂由中温淀粉酶、葡聚糖酶、木聚糖酶按体积比5:2:1均匀混合；
所述多元醇由聚乙二醇、丙三醇、山梨醇、二硫苏糖醇按质量比8:4:2:1均匀混合；
所述金属氯化物为氯化锌、氯化钙、氯化钠、氯化镁、氯化铁按质量比3:2:1:1:0.1均匀混合；
所述啤酒花提取液由实施例1制备；
所述中草药提取液由实施例2制备；
制备方法同实施例3。
经上述方法制备的液体复配酶在室温储存12个月菌落总数为208CFU/mL；在40℃和0℃条件下储存12个月，酶活损失率分别为2.2％和1.3％。
实施例5
一种稳定的液体复配酶，由以下重量份数的原料制备：
液体酶制剂60份，啤酒花提取液15份，糖10份，天然抗氧化剂10份，中草药提取液10份，抗菌肽10份，黄原胶5份，β-环糊精5份，二硫苏糖醇5份，谷胱甘肽4份，氯化锌3份，硫酸铵2份，半胱氨酸1份，牛血清白蛋白0.3份。
所述液体酶制剂由中温淀粉酶、葡聚糖酶、木聚糖酶按体积比6:4:3均匀混合；
所述糖为海藻糖、灵芝多糖、葡萄糖按质量比10:3:9均匀混合；
所述天然抗氧化剂由葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比8:7:4均匀混合；
所述啤酒花提取液由实施例1制备；
所述中草药提取液由实施例2制备；
制备方法同实施例3。
经上述方法制备的液体复配酶在室温储存12个月菌落总数为214CFU/mL；在40℃和0℃条件下储存12个月，酶活损失率分别为2.5％和1.7％。
实施例6
一种稳定的液体糖化酶，由以下重量份数的原料制备：
糖化酶50份，啤酒花提取液12份，糖8份，天然抗氧化剂8份，中草药提取液8份，抗菌肽9份，增稠剂4份，β-环糊精4份，多元醇3份，谷胱甘肽3份，金属氯化物2份，硫酸铵2份，半胱氨酸0.8份，牛血清白蛋白0.2份。
所述糖为海藻糖、灵芝多糖、葡萄糖按质量比9:2:7均匀混合；
所述天然抗氧化剂由葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比7:6:3均匀混合；
所述增稠剂由卡拉胶、阿拉伯胶、明胶、黄原胶、CMC按质量比4:3:2:1.5:0.8均匀混合；
所述多元醇由聚乙二醇、丙三醇、山梨醇、二硫苏糖醇按质量比9:5:3:2均匀混合；
所述金属氯化物为氯化锌、氯化钙、氯化钠、氯化镁、氯化铁按质量比4:2.5:2:1.5:0.2均匀混合；
所述啤酒花提取液由实施例1制备；
所述中草药提取液由实施例2制备；
制备方法同实施例3。
经上述方法制备的液体糖化酶在室温储存12个月菌落总数为168CFU/mL；在40℃和0℃条件下储存12个月，酶活损失率分别为2％和1％。
实施例7 液体复配酶的生物稳定性
以本发明实施例6制备的液体糖化酶与市售相同生产日期的同规格液体糖化酶为试验对象，在相同储藏条件(室温、通风、避光)下，采用《GB8726-2006食品添加剂糖化酶制剂》中检测方法检测了pH值、菌落总数、致病菌等卫生指标，结果如表1：
表1  储存12个月微生物指标检测结果
以上结果表明：市售液体糖化酶虽然保质期(3个月)内检测指标均合格，但当储存至6-12个月时，其菌落总数和大肠菌群已经超标，微生物含量迅速递增，pH值从5.5降至3.6，下降明显；本发明液体糖化酶污染杂菌种类少，各项检测指标储存12个月均优于国家标准，并且随着储存时间的延长，微生物含量增殖缓慢，pH值几乎无变化，显示了本发明液体复配酶优良的生物稳定性。
实施例8 液体复配酶酶活力稳定性
将本发明实施例6制备的液体糖化酶与市售相同生产日期的同规格液体糖化酶分别于0℃和40℃条件下储存12个月，采用《GB8726-2006食品添加剂糖化酶制剂》中检测方法测定液体糖化酶的酶活力，计算酶活损失率，酶活损失率是指实际检测的酶活力与产品标注酶活力的差值占标注酶活力的百分率，结果如表2
表2  储存期酶活力损失率
以上结果表明，在0℃和40℃条件下储存12个月，本发明液体糖化酶比市售液体糖化酶酶活损失分别降低19％和98％，具有优良的温度储存性，酶活力非常稳定，保质期长。
实施例9  本发明实施3制备的液体复配酶在啤酒酿造中的应用试验
进口大麦中澳洲大麦水分含量低(0.8-1.1)％，蛋白质含量不高不低(9.45-10.22％)，发芽率高(98.7-99.3％)，容重、千粒重高，杂质含量低，比其他进口大麦质量较好，特别适合酿造优质啤酒。本发明实施例3制备的液体复配酶科学复配葡聚糖酶、木聚糖酶和中温淀粉酶，特别适合澳洲麦芽在糖化阶段添加。
1.使用方法：
(1)原料重量百分比组成：进口澳洲(澳大利亚)麦芽40％，大米20％，碎米40％；
(2)糖化阶段将本发明实施例3制得的液体糖化酶加入糖化锅：
(3)添加量：每t干麦芽添加700ml；
作用条件：麦芽醪最适PH值5.2；蛋白休止温度50℃、时间90min；最佳料水质量比1:5。混合糖化醪(麦芽醪与糊化醪混合)最适PH值5.4；糖化温度66℃；糖化时间60min。
2.使用效果：
表3  酿造10°淡爽型啤酒糖化阶段效果对照表
注：糖化酶—市售液体糖化酶  复配酶—本发明液体复配酶
从表中数据分析：在高辅料比例(60％)酿造啤酒时，人员、设备、原料、工艺、水质等生产条件相同情况下，本发明液体复配酶与普通液体糖化酶相比过滤时间平均缩短38.28％，原麦汁浓度平均提高4.58％，麦汁浊度平均降低68.83％，α–氨基氮含量平均提高24.84％，麦汁产量平均提高8.3％，麦汁产量和质量明显提高。
表4  酿造10°淡爽型啤酒发酵阶段效果对照表
注：糖化酶—市售液体糖化酶  复配酶—本发明液体复配酶
从表中数据分析：在高辅料比例(60％)酿造啤酒时，人员、设备、原料、工艺、水质等生产条件相同情况下，本发明啤酒复配酶与普通啤酒复配酶相比挥发酸平均降低71.67％，醛类平均降低52.09％，双乙酰平均降低51.78％，发酵度平均提高7.08％，回收酵母死亡率平均降低60％，发酵液质量明显提高，酵母生长及繁殖性能明显改善。
表5  酿造10°淡爽型啤酒成品效果对照表
注：A—市售普通啤酒糖化酶  B—本发明液体复配酶
从表中数据分析：高辅料比例(60％)酿造出的成品啤酒，本发明液体复配酶与普通啤酒糖化酶相比麦芽香味与酒花香味明显、柔和协调，泡沫性能优良，泡持性时间长；浊度较低，双乙酰含量较低，发酵良好，酒精度较高，成品啤酒无论是感官指标还是理化指标都远远优先于普通啤酒复配酶，达到或超过了国家现行啤酒优级标准。

Claims (10)

1.一种稳定的液体复配酶，由以下重量份数的原料制备：液体酶制剂40-60份，啤酒花提取液10-15份，糖5-10份，天然抗氧化剂6-10份，中草药提取液6-10份，抗菌肽8-10份，增稠剂3-5份，β-环糊精3-5份，多元醇2-5份，谷胱甘肽2-4份，金属氯化物1-3份，硫酸铵1-2份，半胱氨酸0.5-1份，牛血清白蛋白0.1-0.3份。
2.如权利要求1所述的稳定的液体复配酶，其特征在于，所述液体酶制剂由中温淀粉酶、葡聚糖酶、木聚糖酶按体积比5-6:2-4:1-3均匀混合。
3.如权利要求1所述的稳定的液体复配酶，其特征在于，所述啤酒花提取液的制备方法为：将啤酒花置超声波清洗机中于200W、40KHz清洗10-15min,沥干，于-18—-22℃冷冻1-2h后立即进行粉碎，冷冻料层厚度3-5cm，粉碎粒度0.5-3mm,加入粉碎啤酒花重量1-3倍的乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的质量比为2-4:1-3,用乳酸调节pH值为3.0-3.5，在功率150-300W、频率2000Hz、温度20-35℃条件下进行微波提取20-30min,同时在功率200-300W,频率30-40KHz条件下进行超声波辅助提取；保温1-3h,然后，在功率200-400W、频率2000Hz条件下进行微波提取15-20min，同时在功率300-500W,频率40-50KHz条件下进行超声波辅助提取，最后自然降温至室温，过滤，滤液于电场强度35-45kV/cm，脉冲时间400-600μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场杀菌20-30min即得啤酒花提取液。
4.如权利要求1所述的稳定的液体复配酶，其特征在于，所述糖为海藻糖、灵芝多糖、葡萄糖中一种或多种。
5.如权利要求1所述的稳定的液体复配酶，其特征在于，所述天然抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物中的任一一种或几种。
6.如权利要求1所述的稳定的液体复配酶，其特征在于，所述中草药提取液的制备方法为：按重量份数计，准确称取黄芪60-70份，当归55-65份，党参40-45份，甘草40-45份，鱼腥草35-45份，神曲35-45份，金银花25-35份，茯苓20-30份，远志15-25份，炒茴香15-25份，白术10-20份，厚朴10-20份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70℃-90℃保持2-4h，然后降温至45-60℃，加入混合物料总重量5-10％的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的质量比为1:1-2，控制温度至60℃-78℃保持3-4h，过滤，得第一滤液；添加滤渣1-3倍重量的水，控制温度85℃-95℃保持1-3h，然后降温至25-35℃，过滤，得第二滤液；将第一滤液和第二滤液按照质量比2-3:1-2合并,于电场强度35-45kV/cm，脉冲时间400-600μs,脉冲频率300-400Hz条件下进行高压脉冲电场杀菌20-30min即得中草药提取液；
所述混合酶的重量份数组成为：内β-葡聚糖酶10-20份，外β-葡聚糖酶10-20份，β-葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普鲁兰酶20-30份，β-淀粉酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，果胶酶10-15份，甘露糖酶10-15份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份，脂肪酶5-8份；
所述乙醇浓度≥75％。
7.如权利要求1-6任一所述稳定的液体复配酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以重量份数计，按照配方首先准确称取增稠剂，加入其质量4-6倍的无菌水，室温浸泡3-8h,边升温边搅拌，80-90℃保温20-30min,搅拌，充分溶解，继续保温，边搅拌边依次加入β-环糊精、多元醇、糖、金属氯化物，然后降温至25-35℃，边搅拌边依次加入硫酸铵、半胱氨酸、谷胱甘肽、抗菌肽、天然抗氧化剂、牛血清白蛋白、中草药提取液、啤酒花提取液、液体酶制剂充分溶解、混合，用乳酸调节液体复配酶pH值为2.5-6，稳定0.5-2h,同时于电场强度35-45kV/cm，脉冲时间400-600μs,脉冲频率300-400Hz条件下进行高压脉冲电场杀菌，除菌过滤、无菌灌装即得液体复配酶。
8.如权利要求7所述稳定的液体复配酶的制备方法，其特征在于，所述糖为海藻糖、灵芝多糖、葡萄糖按质量比8-10:1-3:5-9均匀混合。
9.如权利要求7所述稳定的液体复配酶的制备方法，其特征在于，所述天然抗氧化剂由葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比6-8:5-7:2-4均匀混合。
10.如权利要求1-6任一所述稳定的液体复配酶在啤酒酿造中的应用。
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