CN104479909A - 一种含真菌α-淀粉酶的洗涤复合酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含真菌α-淀粉酶的洗涤复合酶及其制备方法，属于洗涤酶制备技术领域。以木屑作为载体，以耐高温真菌α-淀粉酶为主要原料，科学复配植物提取物、非离子表面活性剂、碱性蛋白酶、碱性脂肪酶、碱性纤维素酶、激活剂、保护剂和抗氧化剂等，制备出一种储存稳定性高、酶活力和效力高、酶系全面、去污渍效果优的具有防尘、抑菌、抗串色和增香作用的洗涤复合酶，以其生产的加酶洗衣粉与市售洗涤专用复合酶相比，去污力强，对炭黑类、蛋白类、皮脂类污垢的去污力分别提高88％、107％和129％；沉积灰分比值降低36％；衣物表面残留细菌数降低71％；对皮肤和衣物无损伤，抗串色能力强，香味持久，使用过程无粉尘。
Description
技术领域
本发明涉及洗涤复合酶，特别涉及一种含真菌α-淀粉酶的洗涤复合酶及其制备方法。
背景技术
洗涤剂行业涉及面广、量大，我国年消耗量约为300万吨，而世界年消耗量约为2500万吨。为了提高去污效果，洗涤剂中的表面活性剂和三聚磷酸钠的含量竞高达30％-40％。这些高含磷物经洗涤后流入江湖，引起湖河水的过肥化，导致微生物、藻类等有害生物的大量繁殖，造成水质污染。这严重的现象越来越引起人们的关注和重视。因此，在洗涤剂中添加酶制剂可以降低表面活性剂和三聚磷酸钠的用量，使洗涤剂朝低磷或无磷的方向发展，减少对环境的污染。洗涤剂用酶制剂的研制开发也因此成为酶制剂工业的一个主攻方向。
酶可有效地分解蛋白质、淀粉、脂肪类污垢。因此，在洗涤剂中加入酶可提高去污力，降低表面活性剂及三聚磷酸盐的用量，有利于洗涤剂朝低磷、无磷化的方向发展，以减少环境污染。目前国外已商品化的洗涤剂用酶有：碱性蛋白酶、淀粉酶、碱性纤维素酶、脂肪酶以及它们的复合物。对于酶来说，除了研究应用新的酶以外，如何抑菌、抗串色，如何避免粉尘对人的伤害，适应低温、洗涤稳定性好等仍然是面临的挑战。现在洗涤剂用酶已超过世界酶产量的40％，开发加酶洗涤剂是当前国际洗涤剂工业发展的一大潮流。
目前，碱性酶作为新型生物添加剂应用于洗涤剂行业的现象已越来越普遍，在西欧、日本和美国等一些发达国家中，加酶洗涤剂占洗涤剂市场的80％-95％，在国内加酶洗涤剂所占比例为20％左右，市场上的许多高档洗衣粉产品都添加了多种酶。从发展趋势上看，国内加酶洗涤剂要逐渐在市场上占主导地位。洗涤剂用酶已占世界酶制剂产量的1/3。这些酶作为活性生物催化剂，通过水解作用可专一有效地清除纺织物上的顽垢污迹，使衣物洗涤后获得清爽洁净效果；而且酶本身无毒，并能完全被生物降解，对环境无污染。
中国专利CN 101717699 B公开了一种含复合酶的去血渍洗涤粉，其组分包括：十二烷基硫酸钠、α-烯基磺酸钠、三聚磷酸钠、羧甲基纤维素钠、硫酸钠、硅酸钠、4A沸石、碱性蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶。
中国专利CN 103131557 B公开了一种液体洗涤剂用酶制剂复合稳定剂，涉及酶稳定剂，解决现有液体洗涤剂中酶稳定性差，且传统酶稳定剂主要使用硼砂，对人体存在潜在危害的问题。一种液体洗涤剂用酶制剂复合稳定剂，由以下重量份的各组分组成：环糊精0.05～20、氯化钙0.05～20、甘油和丙二醇混合物1～10、非离子表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚1～60、阴离子表面活性剂烷基苯磺酸钠1～60；其中所述的甘油与丙二醇混合物中甘油：丙二醇的 重量比为2:6～10，本发明可简化液体洗涤剂的生产及配方过程，显著提高和延长液体洗涤剂中酶制剂的活性，原料安全无毒，对人体无害。
中国专利CN 103773623 A公开了一种复合酶洗涤剂，所述洗涤剂由十六烷基三甲基溴化铵、月桂醇聚氧乙烯(20)醚、椰油酰胺丙基甜菜碱、二丙二醇单甲醚、三丁基铵对甲苯磺酸盐、二亚乙基三胺五乙酸五钠、双鼠李糖脂、甲基葡萄糖苷聚氧乙烯(20)醚、棉子糖、4-甲基辛酸苯酯、α-淀粉酶、碱性蛋白酶、碱性脂肪酶、薄荷提取物、丙二醇、三乙醇胺和水构成。该种新型复合酶洗涤剂表现出优良的去除蛋白、油脂等污渍的性能，可适用于织物、面料和餐具的清洗，还可用于医疗器械的清洁，具有广泛的工业化应用前景。
上述公开的专利所涉及的酶制剂种类单一，酶活力低、储存稳定性差，在实际应用时因受环境湿度、温度、光照、酸碱性等环境影响很难发挥其真正的效力，严重影响洗涤去污效果，同时也没有考虑洗涤时防尘、抑菌和抗串色问题，存在一定的缺陷。
发明内容
本发明所解决的技术问题是克服现有洗涤酶种类单一、酶活力低、储存稳定性差、功能单一等缺陷，以具有防尘、抗串色和增加洗涤效果的木屑作为载体，以耐高温真菌α-淀粉酶为主要原料，科学复配具有抑菌和增香作用的植物提取物、具有扩散和渗透作用的非离子表面活性剂、具有降解各类污渍的碱性蛋白酶、碱性脂肪酶、碱性纤维素酶、具有促进酶活力充分发挥的激活剂、具有防止复合酶因外界条件变化而失活的保护剂和抗氧化剂等，制备一种储存稳定性高、酶活力和效力高、酶系全面、去污渍效果优的具有防尘、抑菌、抗串色和增香作用的洗涤复合酶。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种含真菌α-淀粉酶的洗涤复合酶，由以下重量组分的原料制备：
木屑45-55份，真菌α-淀粉酶25-35份，碱性蛋白酶20-30份，碱性脂肪酶20-30份，植物提取物15-25份，碱性纤维素酶3-10份，非离子表面活性剂2-8份，激活剂2-6份，保护剂1-3份，抗氧化剂0.3-0.5份；
所述木屑质地蓬松、柔软，硬度适中，具有丰富的纤维网状和多孔结构，比表面积大，将其作为复合酶的复配载体具有如下作用：1)可有效将复合酶中酶制剂及其它微粉成分暂时包裹和吸附，防止在使用过程产生粉尘，减少对人的伤害和环境的污染，提高原料利用率；2)适中的硬度在洗涤过程中既可增加摩擦强度，快速清洗污物，尤其对油污效果更佳，又不会伤及皮肤、织物及清洗物品；3)因为具有良好的纤维结构和难溶性，颗粒完整性强，不会残留至清洗物品表面，容易冲洗、去除；4)可有效吸附污水中的污物及色素，防止织物串色； 5)与纤维素酶科学复配，减缓对织物的酶解伤害；6)原料来源广泛，成本低，实现可持续发展；
优选地，所述木屑的制备方法包括如下步骤：将无发霉、无病虫锯木末或废木屑除去杂物，置盛有1-2％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、30KHz清洗15-25min，冲洗、沥干，然后置微波干燥机于3000W、120℃进行微波干燥5-10min，使之水分达到8-10％，最后粉碎至粒度0.5-3mm,密封包装即得木屑；
更优选地，所述微波干燥为间歇式干燥，即微波辐照8s,间隔20s。
所述真菌α-淀粉酶是由里氏木霉(Trichoderma reesei)901-18经培养基和发酵工艺优化液体深层发酵而制备，该菌株已于2013年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC NO:M 2013602，分类命名为：里氏木霉901-18Trichoderma reesei 901-18；
所述里氏木霉901-18是由一株分离自湖南省津市市河堤食用菌培植基地土壤样本的里氏木霉菌株经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得，所述菌株特点如下：该菌株在PDA固体培养基上生长，形成的菌落特征为菌落呈棉絮状，菌落呈淡绿色，菌落扁平，高0.2-0.8mm，菌落边缘白色，整齐；生长速度快，48h菌落直径达1.5-8.5mm,72h达30-55mm；菌丝白色，有隔膜，菌丝壁光滑，直径在2-5μm。分生孢子梗从菌丝的短侧枝发生，侧枝上对生。该菌株产α-淀粉酶的最适pH 3.0-6.5；最适温度为27-30℃；
优选地，所述真菌α-淀粉酶的制备方法包括以下步骤：保存完好的里氏木霉CCTCCNO:M 2013602的菌种经斜面菌种活化、一级、二级、三级液体种子扩大培养至种子罐，将种子罐液体种子以6％接种量接入发酵罐培养基，培养温度27-30℃，搅拌速度120-180r/m，通风量1-3vvm培养时间10-15h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至10-15℃，搅拌速度250-300r/m，通风量1-2vvm,恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至2-5℃，此时，将种子罐液体种子以4％接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h；最后以1-2℃/h升温速率缓慢升温至10-15℃，搅拌速度200-400r/m，通风量1-2vvm,恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至27-30℃，恒温培养15-20h；发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体真菌α-淀粉酶；
所述真菌α-淀粉酶制备过程中发酵液酶活力高达12000-15000u/ml；酶温度适应范围较宽，为50-75℃之间，最适作用温度在65℃，70℃下保存3h仍具有80％以上酶活，具有较好的热稳定性和保存活性；该酶最适反应pH值为5.5，在pH值4.5-7.0之间酶活保持在70％以上，比现有的真菌α-淀粉酶酶活力高，酶作用最适pH值范围宽泛，耐温度高；
所述斜面培养基组成为：葡萄糖20g，琼脂20g，中草药提取物5-10g,酵母膏4g，磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，蒸馏水l000mL，pH值5.8，121℃灭菌20min。
所述一级、二级、三级种子培养基组成为：麸皮60-80g,玉米粉50-60g，豆饼粉35-40g，海藻糖10-15g，鱼粉6-10g，氯化铵10-12g，氯化钙5-10g，中草药提取物5-10g，硫酸镁2-4g，磷酸氢二钾1-3g，纯净水l000mL，pH值5-7，121℃灭菌20min；
所述种子罐培养基组成为：麸皮60-80g,玉米粉50-60g，豆饼粉35-40g，海藻糖10-15g，中草药提取物10-15g，鱼粉6-10g，氯化铵10-12g，氯化钙5-10g，硫酸镁2-4g，磷酸氢二钾1-3g，纯净水l000mL，pH值5-7，121℃灭菌20min；
所述种子罐发酵液菌体浓度为7.0x 108-8.0x 108个/ml；
所述发酵罐培养基组成为：麸皮60-80g,玉米粉50-60g，豆饼粉35-40g，中草药提取物20-30g，海藻糖10-30g，鱼粉6-10g，氯化铵10-12g，氯化钙5-10g，硫酸镁2-4g，磷酸氢二钾1-3g，硝酸钾1-2g,硫酸锌0.1-0.2g,纯净水l000mL，pH值5-7，121℃灭菌20min；
所述中草药提取物的制备方法如下：
按重量份数计，称取黄芪50-60份，当归40-50份，党参35-45份，甘草35-45份，鱼腥草25-35份，神曲20-30份，柴胡10-15份，黄芩10-15份；将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70℃-90℃保持2-4h，然后降温至45-60℃，加入混合物料总重量5-10％的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的质量比为1:1.5，控制温度至60℃-78℃保持3-4h，过滤，得第一滤液；添加滤渣1-3倍重量的水，控制温度85℃-95℃保持1-3h，然后降温至25-35℃，过滤，得第二滤液；将第一滤液和第二滤液按照质量比2-4:1-3合并,滤液真空浓缩后冷冻干燥、粉碎即得中草药提取物；
所述混合酶为葡聚糖酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、果胶酶按质量比4:4:2:1均匀混合。
所述植物提取物是以对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等致病菌和青霉、黑曲霉、交链孢霉、高大毛霉等真菌具有显著杀灭或抑制作用并且具有抗辐射、抗氧化、消除自由基、驱虫、抗病毒等效果的天然香味植物为原料，采用微波辅助超声提取和高压脉冲电场提取、常温密闭自然发酵、超滤浓缩、冷冻干燥和低温粉碎等低温提取技术，最大限度地获取了天然植物的有效成分和香味，显著提高了原料利用率和活性成分产率；
优选地，所述植物提取物的制备方法包括如下步骤：将丁香、苦丁茶、薰衣草、金银花、苦参按质量比10-15:7-11:6-9:5-8:1-3均匀混合，置盛有0.1-0.3％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、30KHz清洗10-15min，沥干，加入混合原料质量0.2-0.8倍的水润湿4-7h,于-18—-22℃冷冻1-2h后立即进行粉碎，冷冻料层厚度3-5cm，粉碎粒度0.5-3mm,接着加入粉碎原料质量0.5-2倍的水，用乳酸调节pH值为3.0-3.5，在功率200-300W、频率2000Hz 条件下进行微波提取，其中，每次微波辐照总时间100-120s,进行间隔式辐照：辐照10s，间隔10s，控制温度20-35℃，如此辐照10次，同时在功率200-300W,频率30-40KHz条件下进行超声波辅助提取；保温1-3h,然后，在功率200-400W、频率2000Hz条件下进行微波提取，其中，每次微波辐照总时间120-135s,进行间隔式辐照：辐照15s，间隔10s，控制温度40-50℃，如此辐照10次，同时在功率300-500W,频率40-50KHz条件下进行超声波辅助提取，最后自然降温至室温，于电场强度15-25kV/cm，脉冲时间300-500μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场(PEF)提取15-20min；充分搅拌提取液，密封，自然发酵3-5d，发酵液过滤得第一滤液，加滤渣2倍的水漂洗、过滤得第二滤液，将第一滤液和第二滤液按质量比1:2-5均匀混合，混合液超滤浓缩、冷冻干燥、30℃低温粉碎至粒度0.1-0.3mm即得植物提取物。
所述非离子表面活性剂可在洗涤过程中帮助渗透、脱脂和除垢，促进和延长真菌α-淀粉酶等酶制剂与织物不同部位作用污物(淀粉粒、脂肪粒、蛋白等细胞)的接触和反应时间，充分、有效降解污物，提高去污效果；
优选地，所述非离子表面活性剂为环保型非离子表面活性剂，容易生物降解，无残留，对人体、生物及环境无任何毒副作用；
更优选地，所述非离子表面活性剂的质量组份为：烷基多苷(APG)30-40份，烷基葡萄糖酰胺(AGA)20-30份，N-十二烷基乙二胺三乙酸钠(ED3A)8-12份，异构醇醚羧酸盐AEC-11078-12份，月桂酰胺醚羧酸盐(LAEC)5-8份，平平加c-1250-3份，JFC 0-3份；上述原料均为市购固体粉状商品。
所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成：硫酸钠15-25份，氯化钙10-15份，氯化锌5-7份，氯化镁3-5份。
所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖30-40份，甘油15-25份，(NH4)2SO46-10份，丙二醇2-4份。
所述抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物中的任一一种或几种组合；
优选地，所述抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比10-15:4-9:2-6均匀混合；
所述葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物均为市购商品。
上述洗涤复合酶的制备方法，包括如下步骤：
首先将所述保护剂、激活剂分别超微粉碎，均匀混合，随后立即依次加入碱性蛋白酶、木屑、非离子表面活性剂均匀混合10-15min，然后依次加入真菌α-淀粉酶、碱性脂肪酶、碱性纤维素酶均匀混合15-20min，最后依次加入植物提取物和抗氧化剂，均匀混合3-5min 后密封包装即得洗涤复合酶。
本发明另一目的是所述洗涤复合酶在洗涤剂生产中的应用。
使用方法：
1.复合酶作用条件：适应pH值4-12，最适pH值8.0；适应温度20-60℃，最适反应温度40℃；
2.使用方法：固体粉状洗涤剂中的添加量为洗涤剂质量的0.5-2.5％；液体洗涤剂每升添加复合酶10-30g(洗涤剂水分含量应小于40％)。
有益效果：
本发明含真菌α-淀粉酶的洗涤复合酶，以具有防尘、抗串色和增加洗涤效果的木屑作为载体，以耐高温真菌α-淀粉酶为主要原料，科学复配具有抑菌和增香作用的植物提取物、具有扩散和渗透作用的非离子表面活性剂、具有降解各类污渍的碱性蛋白酶、碱性脂肪酶、碱性纤维素酶、具有促进酶活力充分发挥的激活剂、具有防止复合酶因外界条件变化而失活的保护剂和抗氧化剂等，制备一种储存稳定性高、酶活力和效力高、酶系全面、去污渍效果优的具有防尘、抑菌、抗串色和增香作用的洗涤复合酶，避免和减少了化学用品的使用，保护了环境。经试验：采用本发明洗涤复合酶生产的加酶洗衣粉与市售洗涤专用复合酶生产的加酶洗衣粉相比，去污力强，对炭黑类、蛋白类、皮脂类污垢的去污力分别提高88％、107％和129％；杂质少，沉积灰分比值降低36％；抑菌性能强，衣物表面残留细菌数降低71％；对皮肤和衣物无损伤，抗串色能力强，香味持久，使用过程无粉尘。
具体表现在：
1.本发明真菌α-淀粉酶和霉菌培养物是由里氏木霉(Trichoderma reesei)901-18经培养基和发酵工艺优化液体深层发酵而制备，保藏编号为CCTCC NO:M 2013602，真菌α-淀粉酶发酵液酶活力高达12000-15000u/ml；酶温度适应范围较宽，为50-75℃之间，最适作用温度在65℃，70℃下保存3h仍具有80％以上酶活，具有较好的热稳定性和保存活性；该酶最适反应pH值为5.5，在pH值4.5-7.0之间酶活保持在70％以上，比现有的真菌α-淀粉酶酶活力高，酶作用最适pH值范围宽泛，耐温度高，更加适合洗涤工艺。
2.本发明制备的木屑经超声浸泡、清洗和微波干燥、杀菌，质地更加蓬松、柔软，硬度适中，纤维网状和多孔结构更加丰富，比表面积大，将其作为复合酶的复配载体具有如下作用：1)可有效将复合酶中酶制剂及其它微粉成分暂时包裹和吸附，防止在使用过程产生粉尘，减少对人的伤害和环境的污染，提高原料利用率；2)适中的硬度在洗涤过程中既可增加摩擦 强度，快速清洗污物，尤其对油污效果更佳，又不会伤及皮肤、织物及清洗物品；3)因为具有良好的纤维结构和难溶性，颗粒完整性强，不会残留至清洗物品表面，容易冲洗、去除；4)可有效吸附污水中的污物及色素，防止织物串色；5)与纤维素酶科学复配，减缓对织物酶解伤害；6)原料来源广泛，成本低，实现可持续发展；
3.本发明植物提取物是以对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等致病菌和青霉、黑曲霉、交链孢霉、高大毛霉等真菌具有显著杀灭或抑制作用并且具有抗辐射、抗氧化、消除自由基、驱虫、抗病毒等效果的天然植物丁香、苦丁茶、薰衣草、金银花、苦参为原料，采用微波辅助超声提取和高压脉冲电场提取、常温密闭自然发酵、超滤浓缩、冷冻干燥和低温粉碎等低温提取技术，最大限度地获取了天然植物的有效成分和香味，显著提高了原料利用率和活性成分产率；
4.本发明非离子表面活性剂主要科学复配环保型非离子表面活性剂，容易生物降解，无残留，对人体、生物及环境无任何毒副作用；可在洗涤过程中帮助渗透、脱脂和除垢，促进和延长真菌α-淀粉酶等酶制剂与织物不同部位作用污物(淀粉粒、脂肪粒、蛋白等细胞)的接触和反应时间，充分、有效降解污物，提高去污效力。
5.本发明洗涤复合酶抗氧化剂的科学复配，可有效防止复合酶酶分子结构氧化而造成酶活性损失，提高酶活力稳定性。在0℃和40℃条件下储存12个月，复合酶中单酶酶活损失分别为0.40％和0.53％，比对比例分别降低20.0％和66.9％，有效防止在包装、储存、运输、使用等环节因环境改变、操作方法不当而造成酶的失活，尤其可防止高温造成的酶失活。
6.本发明洗涤复合酶中保护剂科学复配，有效减缓了复合酶制剂的回潮和稳定、维持酶蛋白的分子结构；增强了复合酶的耐冻、耐热性能，保持相同的酶活力，其耐热温度可提高20-30℃，耐冷冻温度可降低10-15摄氏度，有效防止了复合酶在运输、保存和使用过程中酶活力的损失，延长了复合酶的保质期，达到同样的酶活力，比同类产品保质期可延长2-3年。
7.本发明洗涤复合酶添加无机盐作为激活剂，尤其科学复配了α-淀粉酶酶活力充分发挥所必须的钙离子，创造了酶催化作用的最佳条件，充分发挥了组份中各酶制剂的活力，提高了复合酶作用效力。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发 明的保护范围。
实施例1原料制备
1.真菌α-淀粉酶的制备：
所述真菌α-淀粉酶的制备方法包括如下步骤：
(1)菌种活化
将保存完好的里氏木霉CCTCC NO:M 2013602的斜面菌种接种于斜面培养基，30℃培养40h进行菌种活化，如此活化3次；
(2)液体种子扩大培养
①一级种子培养：将步骤(1)活化后斜面菌种以无菌水洗下孢子，接入500毫升摇瓶中，液体种子培养基装量100毫升，30℃、100rpm摇床培养40h；
②二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
③三级种子培养：将二级种子以8％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，液体培养基装量1000毫升，30℃、100rpm摇床培养40h；
④种子罐培养：将三级种子以8％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，种子罐培养基装量100L，控制pH值为6，培养温度29℃，搅拌速度300rpm，通风量(V/V)1:1,培养时间40h；
所述种子罐发酵液菌体浓度为8.0x 108个/ml；
(3)发酵罐发酵
将步骤(2)中种子罐液体种子以6％接种量接入发酵罐培养基，培养温度28℃，搅拌速度150r/m，通风量2vvm,培养时间12h；然后以2℃/h降温速率缓慢降温至12℃，搅拌速度280r/m，通风量1.5vvm,恒温培养18h；继续以2℃/h降温速率缓慢降温至4℃，此时，将种子罐液体种子以4％接种量追加接入发酵罐，恒温培养25h；最后以2℃/h升温速率缓慢升温至12℃，搅拌速度300r/m，通风量1.5vvm,恒温培养18h；继续以2℃/h升温速率缓慢升温至28℃，恒温培养18h；
(4)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体真菌α-淀粉酶。
经上述方法制备的真菌α-淀粉酶在室温下保存12个月后酶活损失为1.6％，发酵液α-淀粉酶酶活力可达15000U/mL。
所述斜面培养基组成为：葡萄糖20g，琼脂20g，中草药提取物7g,酵母膏4g，磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，蒸馏水l000mL，pH值5.8，121℃灭菌20min。
所述一级、二级、三级种子培养基组成为：麸皮70g,玉米粉55g，豆饼粉38g，海藻 糖12g，鱼粉8g，氯化铵11g，氯化钙8g，中草药提取物8g，硫酸镁3g，磷酸氢二钾2g，纯净水l000mL，pH值6，121℃灭菌20min；
所述种子罐培养基组成为：麸皮70g,玉米粉55g，豆饼粉38g，海藻糖12g，中草药提取物12g，鱼粉8g，氯化铵11g，氯化钙8g，硫酸镁3g，磷酸氢二钾2g，纯净水l000mL，pH值6，121℃灭菌20min；
所述发酵罐培养基组成为：麸皮70g,玉米粉55g，豆饼粉38g，中草药提取物25g，海藻糖20g，鱼粉8g，氯化铵11g，氯化钙8g，硫酸镁3g，磷酸氢二钾2g，硝酸钾2g,硫酸锌0.2g,纯净水l000mL，pH值6，121℃灭菌20min；
所述中草药提取物的制备方法如下：按重量份数计，称取黄芪55份，当归45份，党参40份，甘草40份，鱼腥草30份，神曲25份，柴胡12份，黄芩12份；将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度80℃保持3h，然后降温至52℃，加入混合物料总重量8％的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为6.2，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的质量比为1:1.5，控制温度至70℃保持4h，过滤，得第一滤液；添加滤渣2倍重量的水，控制温度90℃保持2h，然后降温至30℃，过滤，得第二滤液；将第一滤液和第二滤液按照质量比2.5:1.5合并,滤液真空浓缩后冷冻干燥、粉碎即得中草药提取物；
所述混合酶为葡聚糖酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、果胶酶按质量比4:4:2:1均匀混合。
2.木屑的制备
所述木屑的制备方法包括如下步骤：将无发霉、无病虫废木屑除去杂物，置盛有1.5％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、30KHz清洗20min，冲洗、沥干，然后置微波干燥机于3000W、120℃进行间歇式微波干燥8min，即微波辐照8s,间隔20s，使之水分达到9％，最后粉碎至粒度1.2mm,密封包装即得木屑；
3.植物提取物的制备
所述植物提取物的制备方法包括如下步骤：将丁香、苦丁茶、薰衣草、金银花、苦参按质量比12:9:8:6:2均匀混合，置盛有0.2％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、30KHz清洗12min，沥干，加入混合原料质量0.5倍的水润湿6h,于-20℃冷冻1.5h后立即进行粉碎，冷冻料层厚度4cm，粉碎粒度1.5mm,接着加入粉碎原料质量1.2倍的水，用乳酸调节pH值为3.2，在功率250W、频率2000Hz条件下进行微波提取，其中，每次微波辐照总时间110s,进行间隔式辐照：辐照10s，间隔10s，控制温度30℃，如此辐照10次，同时在功率250W,频率35KHz条件下进行超声波辅助提取；保温2h,然后，在功率300W、频率2000Hz条件下进行微波提取，其中，每次微波辐照总时间125s,进行间隔式辐照：辐照15s，间隔10s，控制温 度45℃，如此辐照10次，同时在功率400W,频率45KHz条件下进行超声波辅助提取，最后自然降温至室温，于电场强度20kV/cm，脉冲时间400μs,脉冲频率250Hz条件下进行高压脉冲电场(PEF)提取18min；充分搅拌提取液，密封，自然发酵4d，发酵液过滤得第一滤液，加滤渣2倍的水漂洗、过滤得第二滤液，将第一滤液和第二滤液按质量比1:4均匀混合，混合液超滤浓缩、冷冻干燥、30℃低温粉碎至粒度0.2mm即得植物提取物。
实施例2
一种含真菌α-淀粉酶的洗涤复合酶，由以下重量组分的原料制备：
木屑50份，真菌α-淀粉酶30份，碱性蛋白酶25份，碱性脂肪酶25份，植物提取物20份，碱性纤维素酶6份，非离子表面活性剂5份，激活剂4份，保护剂2份，抗氧化剂0.4份；
所述木屑、真菌α-淀粉酶、植物提取物均为实施例1制备；
所述非离子表面活性剂的质量组份为：烷基多苷(APG)35份，烷基葡萄糖酰胺(AGA)25份，N-十二烷基乙二胺三乙酸钠(ED3A)10份，异构醇醚羧酸盐AEC-110710份，月桂酰胺醚羧酸盐(LAEC)7份，平平加c-1251份，JFC 1份；
所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成：硫酸钠20份，氯化钙12份，氯化锌6份，氯化镁4份；
所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖35份，甘油20份，(NH4)2SO48份，丙二醇3份；
所述抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比12:6:4均匀混合；
所述洗涤复合酶的制备方法，包括如下步骤：首先将所述保护剂、激活剂分别超微粉碎，均匀混合，随后立即依次加入碱性蛋白酶、木屑、非离子表面活性剂均匀混合12min，然后依次加入真菌α-淀粉酶、碱性脂肪酶、碱性纤维素酶均匀混合18min，最后依次加入植物提取物和抗氧化剂，均匀混合4min后密封包装即得洗涤复合酶。
实施例3
一种含真菌α-淀粉酶的洗涤复合酶，由以下重量组分的原料制备：
木屑45份，真菌α-淀粉酶25份，碱性蛋白酶20份，碱性脂肪酶20份，植物提取物15份，碱性纤维素酶3份，非离子表面活性剂2份，激活剂2份，保护剂1份，抗氧化剂0.3 份；
所述木屑、真菌α-淀粉酶、植物提取物均为实施例1制备；
所述非离子表面活性剂的质量组份为：烷基多苷(APG)30份，烷基葡萄糖酰胺(AGA)20份，N-十二烷基乙二胺三乙酸钠(ED3A)8份，异构醇醚羧酸盐AEC-11078份，月桂酰胺醚羧酸盐(LAEC)5份；
所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成：硫酸钠15份，氯化钙10份，氯化锌5份，氯化镁3份；
所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖30份，甘油15份，(NH4)2SO46份，丙二醇2-4份；
所述抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比10:4:2均匀混合；
所述洗涤复合酶的制备方法同实施例2。
实施例4
一种含真菌α-淀粉酶的洗涤复合酶，由以下重量组分的原料制备：
木屑55份，真菌α-淀粉酶35份，碱性蛋白酶30份，碱性脂肪酶30份，植物提取物25份，碱性纤维素酶10份，非离子表面活性剂8份，激活剂6份，保护剂3份，抗氧化剂0.5份；
所述木屑、真菌α-淀粉酶、植物提取物均为实施例1制备；
所述非离子表面活性剂的质量组份为：烷基多苷(APG)40份，烷基葡萄糖酰胺(AGA)30份，N-十二烷基乙二胺三乙酸钠(ED3A)12份，异构醇醚羧酸盐AEC-110712份，月桂酰胺醚羧酸盐(LAEC)8份，平平加c-1253份，JFC 3份；
所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成：硫酸钠25份，氯化钙15份，氯化锌7份，氯化镁5份；
所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖40份，甘油25份，(NH4)2SO410份，丙二醇4份；
所述抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比15:9:6均匀混合；
所述洗涤复合酶的制备方法同实施例2。
实施例5
一种含真菌α-淀粉酶的洗涤复合酶，由以下重量组分的原料制备：
木屑55份，真菌α-淀粉酶25份，碱性蛋白酶30份，碱性脂肪酶20份，植物提取物25份，碱性纤维素酶3份，非离子表面活性剂8份，激活剂2份，保护剂3份，葡萄籽原花青素0.3份；
所述木屑、真菌α-淀粉酶、植物提取物均为实施例1制备；
所述非离子表面活性剂的质量组份为：烷基多苷(APG)40份，烷基葡萄糖酰胺(AGA)20份，N-十二烷基乙二胺三乙酸钠(ED3A)12份，异构醇醚羧酸盐AEC-11078份，月桂酰胺醚羧酸盐(LAEC)8份；
所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成：硫酸钠25份，氯化钙10份，氯化锌7份，氯化镁3份；
所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖40份，甘油15份，(NH4)2SO410份，丙二醇2份；
所述洗涤复合酶的制备方法同实施例2。
实施例6真菌α-淀粉酶酶学性质的测定
(1)温度对酶活性的影响以及酶的热稳定性
将实施例1真菌α-淀粉酶发酵粗酶液于40-80℃下分别测定该淀粉酶酶活力，结果表明该酶在50-75℃之间具有82％以上的酶活性，说明该酶的温度适应范围较宽。且热稳定实验表明，该酶在70℃保温3h后，于60℃，pH值5.5条件下仍然具有80％以上酶活，温度高于75℃，酶活损失严重。
(2)pH对酶活性的影响
将实施例1真菌α-淀粉酶发酵粗酶液在pH值3-8.5下分别测该酶酶活，结果表明该酶在pH值4.5-7时酶活性保持在70％以上，且pH值5.5时达到最大值。
实施例7抗氧化剂对洗涤复合酶酶活力的影响
采用本发明实施例2制备的含真菌α-淀粉酶的洗涤复合酶，其它原料、原料组份、制备方法完全相同，唯一区别是原料组分不含抗氧化剂，形成对比例，分别于0℃和40℃条件下储存12个月，采用《GB/T 23535-2009脂肪酶制剂》中检测方法测定碱性脂肪酶的酶活力，计算酶活损失率，酶活损失率是指实际检测的酶活力与产品标注酶活力的差值占标注酶活力的百分率，结果如表1
表1储存期复合酶中碱性脂肪酶酶活力损失率
以上结果表明，在0℃和40℃条件下储存12个月，实施例2复合酶中的碱性脂肪酶比对比例中的碱性脂肪酶酶活损失分别降低20％和66.9％，说明抗氧化剂的科学复配，显著提高了复合酶中各组分酶的活力，酶活损失大幅降低，尤其在高温条件下效果更加显著。
实施例8洗涤复合酶在加酶洗衣粉制备中的应用试验
一、试验地点：湖南省某一洗衣粉厂。
二、试验时间：2014年1月12日-2014年2月27日，历时40天。
三、试验方案设计：1.试验为单因子设计，设置试验组和对照组，对照组和试验组的原料、工艺、设备、操作人员、环境及管理方式均相同，区别是：试验组在加酶洗衣粉的生产过程添加本发明实施例2制备的洗涤复合酶，对照组添加市售洗涤专用复合酶。2.试验组和对照组复合酶添加量均为洗衣粉质量的1.5％。3.每升洗涤液均含试验组和对照组加酶洗衣粉1.5g。4.对试验组和对照组的部分使用性能按照中华人民共和国国家标准GB/T13171.2－2009《洗衣粉》标准检测，其中试验组和对照组分别各检测10次，计算平均值，结果如表2。
5.1去污力：洗衣粉去污力通过一个比值的大小来表示，通过模拟实际的洗涤方法，样品洗衣粉洗涤标准污布与标准的洗衣粉同时洗涤标准污布后进行比对，两块污布白度的比值大于1.0表示去污力达到国家标准，比值越大，去污力越强；未达到1.0说明去污力未达到国家标准。本次试验洗衣粉去污能力检测共进行了对碳黑类JB-01、蛋白类JB-02、皮脂类JB-033类污垢的去污能力的检测；
5.2灰分比值：检测值与标准分沉积灰分比值，应≤3，否则未达到国家标准，比值越小，质量越好；
5.3洗后衣物外观损伤：不重于标准洗衣粉，分为极重、重度、中度、轻度、无5个等级；
5.4香味程度：对洗后衣物的残留香味进行感官检测，分为浓郁、香、较香、淡香、无香味5个等级；
5.5抑菌性能：对洗后的衣物表面取样，采用ATP细菌检测仪进行细菌总数检测；
5.6抗串色性能：将容易褪色的衣物与白色洁净的衣物共同机洗，感官检测串色程度，分为极重、重度、中度、轻度、无5个等级；
5.7洗衣粉对皮肤的损伤：洗衣粉与干燥皮肤接触10s分离，感官检测损伤程度，分为极重、重度、中度、轻度、无5个等级；
5.8防尘性能：将密封包装好的洗衣粉打开，保持1米落差倾倒，观察粉尘情况，分为极重、重度、中度、轻度、无5个等级。
表2加酶洗衣粉使用性能检测结果
| 项目 | 试验组 | 对照组 | 差异 |
| 去污力JB-01 | 3.07 | 1.63 | 88％ |
| 去污力JB-02 | 2.85 | 1.38 | 107％ |
| 去污力JB-03 | 2.66 | 1.16 | 129％ |
| 沉积灰分比值 | 1.4 | 2.2 | -36％ |
| 洗后衣物外观损伤度 | 无 | 轻度 | —— |
| 防尘性能 | 无 | 重度 | —— |
| 抑菌性能(cfu/ml) | 48 | 168 | -71％ |
| 抗串色性能 | 轻度 | 重度 | —— |
| 香味呈现 | 香 | 淡香 | —— |
| 对皮肤的损伤度 | 无 | 重度 | —— |
以上结果表明：采用本发明洗涤复合酶生产的加酶洗衣粉与市售洗涤专用复合酶生产的加酶洗衣粉相比，去污力强，对炭黑类、蛋白类、皮脂类污垢的去污力分别提高88％、107％和129％；杂质少，沉积灰分比值降低36％；抑菌性能强，衣物表面残留菌降低71％；对皮肤和衣物无损伤，抗串色能力强，香味持久，使用过程无粉尘。
Claims (10)
1.一种含真菌α-淀粉酶的洗涤复合酶，由以下重量组分的原料制备：木屑45-55份，真菌α-淀粉酶25-35份，碱性蛋白酶20-30份，碱性脂肪酶20-30份，植物提取物15-25份，碱性纤维素酶3-10份，非离子表面活性剂2-8份，激活剂2-6份，保护剂1-3份，抗氧化剂0.3-0.5份；所述植物提取物是以丁香、苦丁茶、薰衣草、金银花、苦参为原料而制备的。
2.如权利要求1所述的含真菌α-淀粉酶的洗涤复合酶，其特征在于，所述木屑的制备方法包括如下步骤：将无发霉、无病虫锯木末或废木屑除去杂物，置盛有1-2％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、30KHz清洗15-25min，冲洗、沥干，然后置微波干燥机于3000W、120℃进行微波干燥5-10min，使之水分达到8-10％，最后粉碎至粒度0.5-3mm,密封包装即得木屑。
3.如权利要求2所述的含真菌α-淀粉酶的洗涤复合酶，其特征在于，所述微波干燥为间歇式干燥，即微波辐照8s,间隔20s。
4.如权利要求1所述的含真菌α-淀粉酶的洗涤复合酶，其特征在于，所述真菌α-淀粉酶的制备方法包括以下步骤：保存完好的里氏木霉CCTCC NO:M 2013602的菌种经斜面菌种活化、一级、二级、三级液体种子扩大培养至种子罐，将种子罐液体种子以6％接种量接入发酵罐培养基，培养温度27-30℃，搅拌速度120-180r/m，通风量1-3vvm,培养时间10-15h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至10-15℃，搅拌速度250-300r/m，通风量1-2vvm,恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至2-5℃，此时，将种子罐液体种子以4％接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h；最后以1-2℃/h升温速率缓慢升温至10-15℃，搅拌速度200-400r/m，通风量1-2vvm,恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至27-30℃，恒温培养15-20h；发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体真菌α-淀粉酶。
5.如权利要求1所述的含真菌α-淀粉酶的洗涤复合酶，其特征在于，所述植物提取物的制备方法包括如下步骤：将丁香、苦丁茶、薰衣草、金银花、苦参按质量比10-15:7-11:6-9:5-8:1-3均匀混合，置盛有0.1-0.3％碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中于200W、30KHz清洗10-15min，沥干，加入混合原料质量0.2-0.8倍的水润湿4-7h,于-18—-22℃冷冻1-2h后立即进行粉碎，冷冻料层厚度3-5cm，粉碎粒度0.5-3mm,接着加入粉碎原料质量0.5-2倍的水，用乳酸调节pH值为3.0-3.5，在功率200-300W、频率2000Hz条件下进行微波提取，其中，每次微波辐照总时间100-120s,进行间隔式辐照：辐照10s，间隔10s，控制温度20-35℃，如此辐照10次，同时在功率200-300W,频率30-40KHz条件下进行超声波辅助提取；保温1-3h,然后，在功率200-400W、频率2000Hz条件下进行微波提取，其中，每次微波辐照总时间120-135s,进行间隔式辐照：辐照15s，间隔10s，控制温度40-50℃，如此辐照10次，同时在功率300-500W,频率40-50KHz条件下进行超声波辅助提取，最后自然降温至室温，于电场强度15-25kV/cm，脉冲时间300-500μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场提取15-20min；充分搅拌提取液，密封，自然发酵3-5d，发酵液过滤得第一滤液，加滤渣2倍的水漂洗、过滤得第二滤液，将第一滤液和第二滤液按质量比1:2-5均匀混合，混合液超滤浓缩、冷冻干燥、30℃低温粉碎至粒度0.1-0.3mm即得植物提取物。
6.如权利要求1所述的含真菌α-淀粉酶的洗涤复合酶，其特征在于，所述非离子表面活性剂的质量组份为：烷基多苷30-40份，烷基葡萄糖酰胺20-30份，N-十二烷基乙二胺三乙酸钠8-12份，异构醇醚羧酸盐AEC-1107 8-12份，月桂酰胺醚羧酸盐5-8份，平平加c-125 0-3份，JFC 0-3份。
7.如权利要求1所述的含真菌α-淀粉酶的洗涤复合酶，其特征在于，所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成：硫酸钠15-25份，氯化钙10-15份，氯化锌5-7份，氯化镁3-5份；所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖30-40份，甘油15-25份，(NH4)2SO46-10份，丙二醇2-4份。
8.如权利要求1所述含真菌α-淀粉酶的洗涤复合酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：首先将所述保护剂、激活剂分别超微粉碎，均匀混合，随后立即依次加入碱性蛋白酶、木屑、非离子表面活性剂均匀混合10-15min，然后依次加入真菌α-淀粉酶、碱性脂肪酶、碱性纤维素酶均匀混合15-20min，最后依次加入植物提取物和抗氧化剂，均匀混合3-5min后密封包装即得洗涤复合酶。
9.如权利要求8所述含真菌α-淀粉酶的洗涤复合酶的制备方法，其特征在于，所述抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比10-15:4-9:2-6均匀混合。
10.如权利要求1所述含真菌α-淀粉酶的洗涤复合酶在洗涤剂生产中的应用。
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