CN101268180A - 生产具有增强的植物纤维降解酶的液体曲的方法，通过所述方法获得的液体曲及其应用 - Google Patents

生产具有增强的植物纤维降解酶的液体曲的方法，通过所述方法获得的液体曲及其应用 Download PDF

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Abstract

公开了一种通过使用液体培养基而无需使用任何昂贵的植物纤维消化酶制剂或遗传修饰的细菌来生产具有增强的植物纤维消化酶活性的液体曲的方法。还公开了生产干燥的液体曲产品以及使用所述液体曲生产工业酒精(乙醇)的方法。生产液体曲的方法包括在选自由下列各项的至少一种液体培养基培养曲霉(一种培养原料)的步骤：含有表面完全或部分覆盖有至少外壳的谷类的液体培养基，含有表面被皮覆盖的豆类和/或马铃薯的液体培养基，和含有未经预处理(诸如碾碎或捣碎)的苋属和/或藜属植物的液体培养基，其中控制液体培养基中的培养原料的量，以在液体曲中同时产生和积累至少葡糖淀粉酶、酸稳定的α－淀粉酶和植物纤维消化酶；还提供用液体培养基生产干燥的液体曲产品的方法，所述方法特征在于将通过上文提及的方法生产的液体曲干燥；和提供通过使用所述液体曲的发酵方法生产乙醇的方法。

Description

生产具有增强的植物纤维降解酶的液体曲的方法，通过所述方法获得的液体曲及其应用
技术领域
本发明涉及生产具有增强的植物纤维降解酶如纤维素分解酶和木聚糖分解酶的活性的液体曲的方法，和通过所述方法获得的液体曲，及其应用。
背景技术
至于用于生产酒精饮料的日本酒曲，存在固体曲，将其培养以便将丝状真菌的孢子接种到已经用蒸煮等处理的原料中，以及存在液体曲，将其培养以便通过将原料及其它营养源加入到水中而制备液体培养基，然后将曲霉的孢子或预培养的曲霉的菌丝体等接种到所述液体培养基中。
在包括例如日本清酒、烧酒(shochu)、酱油、发酵的大豆酱、甜日本清酒等的发酵食品和饮料诸如酒精饮料的常规生产中，用固体培养方法制备的称为固体曲的物质已经得到广泛的应用。固体培养方法是将曲霉诸如白曲菌(Aspergillus kawachii)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)等的孢子分散在固体原料诸如蒸汽-蒸煮的谷物上以允许曲霉在固体表面生长的培养方法。
例如，对于烧酒的生产，已经广泛地使用了固体曲诸如白曲菌和泡盛曲霉。然而，因为固体培养方法是原料和曲霉不均匀分散的培养体系，所以难以使诸如温度、含水量、和多种营养成分的因素均匀，并且固体培养方法在培养控制中是非常复杂的。另外，经常在开放条件下进行日本酒曲的生产，依据质量控制需要小心以便防止其它细菌的污染。因此，所述固体培养方法不适合于大规模生产。
相反，液体培养法容易培养控制和质量控制，所以它适于有效率的生产。然而，由于以下原因，例如，酶活性不足以酿造烧酒，所以由液体培养的曲霉获得的培养产品很少用作烧酒曲。
除上述原因之外，由液体培养法得到的培养产品不用于生产发酵食品和饮料诸如烧酒的主要原因是：已知在液体培养中曲霉产生酶诸如淀粉酶和纤维素酶的行为非常不同于在固体培养中的行为，并且还已知其生产能力总体上是低的(见非专利文献1和2)。
在酒精饮料诸如烧酒的生产中，醇通常由同时发生的糖化作用和发酵而产生。因此，来自曲霉的影响为曲霉提供葡萄糖的糖分解酶，特别是葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶，是酒精发酵中的关键酶。然而，众所周知葡糖淀粉酶的活性在由液体培养法得到的培养产品中是非常低的，并且其生产行为也非常不同于在固体培养中的生产行为(见非专利文献3至6)。
作为改善曲霉的葡糖淀粉酶活性的方法，报道了培养曲霉同时向菌丝体生长提供胁迫的方法(见专利文献1)以及将烘焙的谷类加入到曲霉培养液中的方法(见专利文献2)。专利文献1中公开的方法在多孔膜上或在具有气隙的内在固定试剂(inclusive immobilization agent)中进行培养，以允许编码葡糖淀粉酶的新基因glaB表达，因此增强酶活性。因此，所述方法要求严格的控制或特定的培养装置，因而它是不实用的。专利文献2中公开的方法利用烘焙谷类作为至少一部分原料在液体培养基中培养曲霉，所述方法需要烘焙谷类的额外的生产步骤。
本发明的发明人提供了涉及利用液体培养基培养曲霉的方法的发明，所述液体培养基含有曲霉几乎不分解的糖类(见专利文献3)。通过本发明液体培养的曲霉，可以方便地和廉价地获得具有高的糖分解酶诸如葡糖淀粉酶活性的曲霉培养产品，其可以用于生产发酵食品和饮料诸如日本清酒。
另一方面，最近，已经详细进行了关于酸-稳定的α-淀粉酶的分子生物学分析(见非专利文献7)。所述分析报道如下：白色曲霉具有分别负责两种不同性状即酸-不稳定的α-淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶的两种不同的淀粉酶基因。各自基因的表达行为相互非常不同。在液体培养中，酸不稳定的α-淀粉酶是充分产生的，而几乎不产生对于酿造烧酒是关键酶的酸稳定的α-淀粉酶。
对于生产烧酒，在低-pH环境下进行酿造，以防止烧酒醪液腐烂。由于它恰好在低pH条件下失活，所以酸不稳定的α-淀粉酶在烧酒酿造中很少有助于糖酵解。因此，对生产烧酒不可缺少的是，以高产率生产酸稳定的α-淀粉酶，所述酸稳定的α-淀粉酶被认为在通过液体培养曲霉的烧酒酿造中促进糖酵解。
已经详细地研究和报道了酸稳定的α-淀粉酶在液体培养的曲霉中的生产行为。然而，所述方法使用含有蛋白胨和柠檬酸盐缓冲溶液的合成培养基，并且需要100小时或更多的培养时间，所以将难以应用于实际的烧酒酿造(见非专利文献8至10)。
本发明的发明人已经研发了充分生产具有生产烧酒必需的葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶酶活性的液体曲的方法，所述方法包括在含有表面覆盖着外壳的谷物作为培养原料的液体培养基上培养白曲霉和/或黑曲霉，以在培养产物中同时产生并且积累葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶。本发明人已经首次成功地使用液体曲生产烧酒(参见，例如，日本专利申请号2004-350661的说明书)。
同时，为了另外提高日本清酒和烧酒的生产力，已经进行了关于使用曲产生的植物纤维降解酶的研究。已经报道，当在日本清酒的生产中应用植物纤维降解酶诸如纤维素分解酶、木聚糖分解酶和溶果胶酶时，日本清酒醪液中原料的利用比例提高(见非专利文献11和12)。
还报道通过引入viride毛束草(Trichoderma viride)的纤维素分解酶基因而产生重组的烧酒曲霉，并且利用所述重组的烧酒曲霉生产烧酒，提高烧酒中的酒精产率(见非专利文献13)。
如上文所述，广为人知，要用于日本清酒或烧酒生产的植物纤维降解酶的生产力的提高对于促进生产发酵食品和饮料如日本清酒或烧酒的效率及其重要。
然而，在日本清酒的生产中应用昂贵的植物纤维降解酶制剂可能增加成本，并且不是优选的。
另外，使用重组的烧酒曲霉将导致消费者担心安全性，并且也不是优选的。
通过这种方法，使用作为工业酒精的乙醇作为生产食品和饮料诸如甜日本清酒、醋等的原料，或者作为生产工业化学品如调味料、去污剂等的原料。此外，最近预计将乙醇用作新能源，作为化石燃料如石油的备选品。例如，促进了酒精燃料诸如通过将汽油与3％的乙醇混合而获得的E3汽油的研究和开发。
当使用谷类或块茎作为原料通过发酵方法生产工业酒精时，酶制剂(液化酶或糖分解酶)需要以高酶活性应用(例如，见非专利文献14)。
然而，酶制剂的使用引起了问题，除了高成本外，醪化(mashing)不能在高浓度下进行。用酶制剂产生的醪液通常具有约8％的酒精含量。因此，预计在更高浓度下醪化提高生产力。
可以建议使用固体曲霉，其中曲霉在谷物或豆的表面上生长，代替酶制剂。然而，由于它必须以特殊的培养模式，即固体培养生产，所以所述固体曲霉不适合大规模生产。
另一方面，曲霉培养在液体培养基中的液体曲能够容易地控制培养，以致它适用于有效率的生产。
然而，本领域的技术人员已知液体曲不充分地提供酒精发酵所需要的酶活性，因此尚不存在液体曲用于实际生产的实例。
非专利文献1：Iwashita K.等：Biosci.Biotechnol.Biochem.(生物科学，生物技术和生物化学)，62，1938-1946(1998)
非专利文献2：Yuichi Yamane等：Journal of the Brewing Society ofJapan(日本酿造协会杂志)，99，84-92(2004)
非专利文献3：Hata Y.等：J.Ferment.Bioeng.(发酵生物工业杂志)，84，532-537(1997)
非专利文献4：Hata Y.等：Gene.(遗传)，207，127-134(1998)
非专利文献5：Ishida H.等：J.Ferment.Bioeng.(发酵生物工业杂志)，86，301-307(1998)
非专利文献6：Ishida H.等：Curr.Genet.(现代遗传学)，37，373-379(2000)
非专利文献7：Nagamine K.等：Biosci.Biotechnol.Biochem(生物科学，生物技术和生物化学)，67，2194-2202(2003)
非专利文献8：Sudo S.等：J.Ferment.Bioeng.(发酵生物工业杂志)，76，105-110(1993)
非专利文献9：Sudo S.等：J.Ferment.Bioeng.(发酵生物工业杂志)，77，483-489(1994)
非专利文献10：Shigetoshi Sudo等：Journal of the Brewing Society ofJapan(日本酿造协会杂志)，89，768-774(1994)
非专利文献11：Yoshizawa等.Journal of the Brewing Society of Japan(日本酿造协会杂志)，76，284-286(1981)
非专利文献12：Fukuda等.Journal of Bioscience and Bioengineering，79，299-302(2001)
非专利文献13：Nomachi W.等.，J.Biosci.Bioeng.(生物科学和生物工业杂志)，93(4)，第382-387页，2002
非专利文献14：Encyclopedia of Brewing(酿造百科全书)，第352-371页，Asakura Publishing，Co.，Ltd.(Asakura出版有限公司)，第一版，1998年11月10日出版
专利文献1：JP 11-225746 A
专利文献2：JP 2001-321154 A
专利文献3：JP 2003-265165 A
发明内容
本发明要解决的问题
本发明的发明人已经进行了广泛的研究，以解决上文所述的常规问题。
结果，本发明的发明人已经发现，在本发明的发明人研发的生产具有高葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶活性的液体曲的方法中(参见，例如，日本专利文献号2004-350661的说明书)，其中将白曲霉和/或黑曲霉培养在含有表面覆盖着外壳的谷物作为培养原料的液体培养基中，以在培养产物中同时产生和积累葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶，植物纤维降解酶的活性可以通过控制要用于所述液体培养基中的培养原料的量而提高。按照这一发现，完成了本发明。
应该注意到，如在日本专利申请号2004-350661的说明书中公开那样，在利用具有外壳的原料生产液体曲中，尚不存在已知的植物纤维降解酶的高产率的生产行为和生产方法。此外，完全没有报道使用液体曲的烧酒生产。
本发明第一方面的一个目的是提供生产具有增强的植物纤维降解酶活性的液体曲的方法，其通过液体培养而不是固体培养，不使用昂贵的植物纤维降解酶制剂，也不使用重组细菌而进行。
此外，本发明第一方面的另一个目的是提供通过使用具有增强的植物纤维降解酶活性的液体曲有效率地生产发酵食品和饮料如烧酒的方法。
所述液体曲是液体状态，因此它提供对其进行操作如泵吸便利的优点。然而，如果只是可以获得所述液体曲的相似的发酵性质，那么推测通过用诸如真空干燥的方法处理所述液体曲获得的干产物将有助于有效率地生产发酵食品和饮料如烧酒。
本发明第六方面的一个目的是提供生产可以有助于有效率地生产发酵的食品和饮料如烧酒的液体曲干产品的方法。
即，本发明第六方面的目的是提供生产具有高的葡糖淀粉酶、酸稳定的α-淀粉酶和植物纤维降解酶活性并且还在处理性质上极好的液体曲干产品的方法。
此外，本发明第六方面的目的是提供通过应用上述液体曲干产品有效率地生产发酵食品和饮料诸如烧酒的方法。
本发明第二十一方面的目的是充分开发具有酒精发酵必需的酶活性的液体曲，和建立通过使用所述液体曲的发酵方法而有效率地生产工业酒精(乙醇)的方法。
要用于生产工业酒精(乙醇)的液体曲需要具有高的葡糖分解酶如葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶、和植物纤维降解酶活性。然而，还没有公开通过在液体培养基中培养曲霉而获得具有高的酶活性的液体曲的技术。换言之，所述酸稳定的α-淀粉酶通常表述为不通过液体培养产生的酶，因此尚未开发具有高的酸稳定α-淀粉酶活性的液体曲。
因此，如上文所述，本发明第二十一方面的目的是开发具有高的葡糖淀粉酶、酸稳定的α-淀粉酶和植物纤维降解酶的活性的液体曲，并且建立通过使用所述液体曲的发酵方法而有效率地生产工业酒精(乙醇)的方法。
解决问题的方法
按照本发明的第一方面，提供生产具有增强的植物纤维降解酶的活性的液体曲的方法，所述方法通过用选自由下列各项组成的组的至少一种液体培养基培养曲霉：含有表面完全或部分覆盖有至少外壳的谷物作为培养原料的液体培养基，含有表面被皮覆盖的豆类和/或块茎作为培养原料的液体培养基，和含有未经预处理诸如碾碎或捣碎的苋属(amaranthus)和/或藜属(quinoa)植物作为培养原料的液体培养基，其中控制要用于液体培养基的所述培养原料的量，以在曲霉培养产物中同时产生和积累至少葡糖淀粉酶、酸稳定的α-淀粉酶和植物纤维降解酶。
按照本发明的第二方面，提供生产按照本发明第一方面的液体曲的方法，其中所述植物纤维降解酶包括纤维素分解酶和/或木聚糖分解酶。
按照本发明的第三方面，提供生产按照本发明第一方面的液体曲的方法，其中所述液体曲包括白曲霉和/或黑曲霉。
按照本发明的第四方面，提供生产按照本发明第一方面的液体曲的方法，所述方法通过用选自由下列各项组成的组的至少一种液体培养基培养曲霉：含有表面完全或部分覆盖有至少外壳的谷物作为培养原料的液体培养基，含有表面被皮覆盖的豆类和/或块茎作为培养原料的液体培养基，和含有未经预处理诸如碾碎或捣碎的苋属和/或藜属植物作为培养原料的液体培养基，其中控制要用于液体培养基的所述培养原料的量在1.4-1.8％(w/vol)，并且制定培养条件在37℃42小时，以在曲霉培养产物中同时产生和积累至少葡糖淀粉酶、酸稳定的α-淀粉酶和植物纤维降解酶。
按照本发明的第五方面，提供液体曲，其通过按照第一到第四方面的任一方面的方法获得。
按照本发明的第六方面，提供应用液体培养基生产液体曲干产品的方法，其包括将按照本发明第五方面的液体曲干燥。
按照本发明的第七方面，提供液体曲干产品，其通过按照本发明第六方面的方法获得。
按照本发明的第八方面，提供生产酶制剂的方法，其包括，使用按照本发明第五方面的液体曲。
按照本发明的第九方面，提供酶制剂，其通过按照本发明第八方面的方法获得。
按照本发明的第十方面，提供生产酶的方法，其通过用选自由下列各项组成的组的至少一种液体培养基培养曲霉：含有表面完全或部分覆盖有至少外壳的谷物作为培养原料的液体培养基，含有表面被皮覆盖的豆类和/或块茎作为培养原料的液体培养基，和含有未经预处理诸如碾碎或捣碎的苋属和/或藜属植物作为培养原料的液体培养基，其中控制要用于液体培养基的所述培养原料的量，以在曲霉培养产物中同时产生和积累至少葡糖淀粉酶、酸稳定的α-淀粉酶和植物纤维降解酶。
按照本发明的第十一方面，提供按照本发明第十方面生产酶的方法，其中所述植物纤维降解酶包括纤维素分解酶和/或木聚糖分解酶。
按照本发明的第十二方面，提供按照本发明第十方面生产酶的方法，其中所述曲霉包括白曲霉和/或黑曲霉。
按照本发明的第十三方面，提供按照本发明第十方面生产酶的方法，其通过用选自由下列各项组成的组的至少一种液体培养基培养曲霉：含有表面完全或部分覆盖有至少外壳的谷物作为培养原料的液体培养基，含有表面被皮覆盖的豆类和/或块茎作为培养原料的液体培养基，和含有未经预处理诸如碾碎或捣碎的苋属和/或藜属植物作为培养原料的液体培养基，其中控制要用于液体培养基的所述培养原料的量在1.4-1.8％(w/vol)，并且制定培养条件在37℃42小时，以在曲霉培养产物中同时产生和积累至少葡糖淀粉酶、酸稳定的α-淀粉酶和植物纤维降解酶。
按照本发明的第十四方面，提供通过按照本发明第十到第十三方面的任一方面的方法获得的酶。
按照本发明的第十五方面，提供生产发酵食品或饮料的方法，其包括使用按照本发明第五方面的液体曲。
按照本发明的第十六方面，提供按照本发明第十五方面生产发酵食品或饮料的方法，其中所述发酵食品或饮料是烧酒。
按照本发明的第十七方面，提供使用按照本发明第七方面的液体曲干产品生产发酵食品或饮料的方法。
按照本发明的第十八方面，提供生产发酵食品或饮料的方法，其包括使用按照本发明第九方面的酶制剂。
按照本发明的第十九方面，提供生产发酵食品或饮料的方法，其包括使用按照本发明第十四方面的酶。
按照本发明的第二十方面，提供发酵食品或饮料，其通过按照本发明第十五到第十九方面的任一方面的方法而获得。
按照本发明的第二十一方面，提供生产乙醇的方法，其包括使用按照本发明第五方面的液体曲。
按照本发明的第二十二方面，提供生产乙醇的方法，其包括使用按照本发明第七方面的液体曲干产品。
按照本发明的第二十三方面，提供生产乙醇的方法，其包括使用按照本发明第九方面的酶制剂。
按照本发明的第二十四方面，提供生产乙醇的方法，其包括使用按照本发明第十四方面的酶。
按照本发明的第二十五方面，提供通过按照本发明第二十一到第二十四方面的任一方面的方法而获得的乙醇。
发明效果
按照本发明的第一方面，可以生产具有增强的植物纤维降解酶诸如纤维素分解酶(纤维素酶)和木聚糖分解酶的活性的液体曲，其通过液体培养而不是固体培养，不使用昂贵的植物纤维降解酶制剂也不使用重组细菌而进行。
此外，按照本发明的第一方面，提供通过使用具有增强的植物纤维降解酶活性的液体曲而有效率地生产发酵食品和饮料如烧酒的方法。
按照本发明的第一方面，例如，在烧酒作为发酵食品和饮料生产时，可以预计烧酒醪液的粘度将减小，由此显著提高可使用性。另外，还可以预计原料利用比率的提高，诸如酒精产率的增加，导致生产发酵食品和饮料诸如烧酒的额外的效率。
按照本发明的第六方面，可以生产具有高的葡糖淀粉酶、酸稳定的α-淀粉酶和植物纤维降解酶活性并且另外在处理性质上极好的液体曲干产品。
所述产品是干燥状态，因此存在甚至对于意料之外的生产它是适时可用的优点。
此外，由于这些性质，所述液体曲干产品可以用于有效率地生产各种发酵食品和饮料。
例如，通过使用按照本发明第六方面生产的液体曲干产品，可以获得发酵程度几乎等于通过使用未干燥的液体曲或常规固体曲获得的烧酒醪液，并且所生产的烧酒具有几乎等于通过使用未干燥的液体曲或固体曲生产的烧酒的质量，没有影响感官的次品。
此外，按照本发明第二十一方面。提供通过使用液体曲的发酵方法生产乙醇的方法。
按照所述方法，可以生产具有几乎如用通过使用常规固体曲的发酵方法而生产乙醇的方法所获得的乙醇的酒精含量一样高的酒精含量的醪液。具有高酒精含量的醪液的生产可以有助于规模减小和能量节约。
按照本发明的第二十一方面，可以通过使用充分具有酒精发酵所需要的酶活性的液体曲的发酵方法而有效率地生产工业酒精(乙醇)。
附图简述
在附图中：
图1是显示使用具有要用于实施例2的不同量的未加工大麦的各种液体曲生产大麦烧酒的发酵过程的图；
图2是显示通过使用具有要用于实施例2的不同量的未加工大麦的各种液体曲获得的大麦烧酒醪液的醪液粘度的测量结果的图。
图3是显示在实施例4中未干燥的情形和干燥的情形中的发酵过程的图，其取决于重量的累积减少。
实施本发明的最佳实施方案
在下文中，将详细地描述本发明。
本发明的第一方面涉及生产具有增强的植物纤维降解酶的活性的液体曲的方法，其通过用选自由下列各项组成的组的至少一种液体培养基培养曲霉：含有表面完全或部分覆盖有至少外壳的谷物作为培养原料的液体培养基，含有表面被皮覆盖的豆类和/或块茎作为培养原料的液体培养基，和含有未经预处理诸如碾碎或捣碎的苋属和/或藜属植物作为培养原料的液体培养基，其中控制要用于液体培养基的所述培养原料的量，以在曲霉培养产物中同时产生和积累至少葡糖淀粉酶、酸稳定的α-淀粉酶和植物纤维降解酶。
在本发明的第一方面中，使用选自由下列各项组成的组至少一种液体培养基：含有表面完全或部分覆盖有至少外壳的谷物作为培养原料的液体培养基，含有表面被皮覆盖的豆类和/或块茎作为培养原料的液体培养基，和含有未经预处理诸如碾碎或捣碎的苋属和/或藜属植物作为培养原料的液体培养基，并且将曲霉培养在所述液体培养基中。因此，所述谷物中淀粉的糖化作用花费许多时间，向培养系统中释放糖的速率受到抑制，并且增强液体曲的酶活性。
在本发明的第一方面中，用作液体曲培养原料的谷物的实例包括大麦、去壳大麦、大米、小麦、荞麦、谷仓前的黍(barnyard millet)、狐尾黍、黍、高粱、玉米等。所述原料需要具有其表面完全或部分覆盖有至少外壳的形式。可以使用未脱壳(unpolished)的原料或者具有等于或大于它已经被脱壳(polished)的脱壳比例(polishing ratio)的原料，以致外壳至少保留在谷粒的表面上，并且还可以使用未加工的大米、未加工的大麦等。在大米的情形中，可以使用未加工的大米、具有全部稻壳的大米和具有部分稻壳的大米。
当所述谷物是大麦时，可以使用具有100％脱壳率的未脱壳的原料，或者假定未脱壳的原料的脱壳率定义为100％，通过从未脱壳的原料的脱壳率(100％)减去大麦的外壳比率(通常7-8％)，而确定具有不小于该值的脱壳率即，约92％-93％的原料。
此处，术语“脱壳率”指在谷物脱壳后谷物的剩余比率。例如，术语“90％的脱壳率”意指在谷物表面层部分上10％的外壳(husk)等被削掉。在本发明中，术语“未加工的大麦”包括从未脱壳的大麦到在谷粒表面残留外壳的脱壳的大麦，即，具有90％或更高的脱壳率的原料的那些。另外，术语“外壳(husk)”指覆盖谷粒颗粒表面的外部部分。
在本发明的第一方面中，用作液体曲的培养原料的豆类和块茎的实例包括大豆、红豆、甘薯等。那些培养原料只经过将它们外皮上的土洗掉，而不经过诸如切割、捣碎等处理。
在本发明的第一方面中，用作液体曲培养原料的″苋属植物″是属于苋科(Amaranthaceae)的苋属植物的通用术语。在谷物中，苋属植物具有高的蛋白含量，并且作为氨基酸之一的赖氨酸的含量，几乎等于在大豆中的含量。除此之外，与脱壳的大米相比，苋属植物是含有大量的钙、铁和纤维的高营养谷物。起源的国家是南部/中部美洲国家、印度、喜马拉雅山脉和尼泊尔的特殊地区。另一方面，藜属植物是Agatha科的一年生草本植物，其主要在丘陵如位于秘鲁南部和玻利维亚西部的安第斯山脉种植。藜属植物富含矿物质、维生素、蛋白质和饮食纤维。
用作培养原料的苋属植物和藜属植物可以单独应用或组合应用。这些原料可以直接用于制备液体培养基，无需进行预处理诸如碾碎或捣碎。
上文提及的培养原料单独使用，或者它们的两种或多种组合使用，用于制备下述液体培养基。
即，，所述培养原料与水混合而制备液体培养基。
在本发明中，控制要用于所述液体培养基中的培养原料的量是有必要的。
通常，当培养原料的量略微少于葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶以平衡方式产生和积累所优选的量时，植物纤维降解酶如纤维素分解酶(纤维素酶)和木聚糖分解酶(木聚糖酶)增强。
用于液体培养基的培养原料的量在这样的范围内，即，在该范围内，在曲霉培养过程中，葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶选择性地生成和积累，并且同时，植物纤维降解酶如纤维素分解酶(纤维素酶)和木聚糖分解酶增强。
具体而言，例如，当将大麦或无壳大麦(naked barley)用作培养原料时，液体培养基通过将1-20％(w/vol)的大麦或无壳大麦加到水中而制备。当使用未脱壳的大麦或无壳大麦时，更优选地，液体培养基用8-10％(w/vol)的添加而制备。当将95％-脱壳的大麦或无壳大麦用作培养原料时，更优选地，液体培养基用1-4％(w/vol)的添加而制备。
如在本发明的第四方面中所述，当培养条件是在37℃42小时时，液体培养基通过将1.4-1.8％(w/vol)或优选地1.4-1.7％(w/vol)的大麦或无壳大麦加入到水中而制备。这也适用于使用未脱壳的大麦或无壳大麦的情形和使用95％-脱壳的大麦或无壳大麦作为原料的情形。
当使用去掉稻壳的未加工的大米作为培养原料时，液体培养基通过将1-20％(w/vol)，优选地5-13％(w/vol)，或更优选地8-10％(w/vol)的未加工的大米加入到水中而制备。
当将豆用作培养原料时，液体培养基通过将1-10％(w/vol)的豆加入到水中，或优选地，通过将8-10％(w/vol)的大豆或1-2％(w/vol)的红豆加入到水中而制备。当将块茎用作培养原料时，液体培养基通过将1-10％(w/vol)的块茎加入到水中而制备。
当苋属植物用作培养原料时，液体培养基通过将1.5-15％(w/vol)，优选地2-10％(w/vol)，或更优选地2-8％(w/vol)的苋属植物加入到水中而制备。当藜属植物用作培养原料时，液体培养基通过将1.5-7％(w/vol)，优选地2-6％(w/vol)，或更优选地2-4％(w/vol)的藜属植物加入到水中而制备。
由于最适的量取决于要用的培养原料的种类、培养原料的脱壳程度等而不同，所以可以适当地选择用于混合的培养原料的量。
当曲霉在培养原料以上文提及的范围之内的量添加的液体培养基中培养时，可以产生具有足以用于生产发酵食品或饮料如烧酒的酶活性(葡糖淀粉酶活性和酸稳定的α-淀粉酶活性)并且同时具有增强的植物纤维降解酶如纤维素分解酶(纤维素酶)和木聚糖分解酶(木聚糖酶)的活性的液体曲。
当要用的培养原料的量超过上限时，不能获得具有增强的植物纤维降解酶如纤维素分解酶(纤维素酶)和木聚糖分解酶(木聚糖酶)的活性的液体曲。此外，培养液体的粘度增加，并且需氧培养的曲霉所需要的氧或空气的供应变得不足。在培养产物中减少的氧含量，限制培养进展，并且是不优选的。另一方面，当要用的原料的量低于下限时，目的酶不能以高产率生产。
包含在培养原料中的淀粉可以在培养之前预先胶凝。胶凝淀粉可以按照，但是不特别限于，任何常规方法进行，所述常规方法包括汽蒸法、焙烧法等。在按照下文所述进行灭菌液体培养基的步骤中，当通过在高温和更压下灭菌而将淀粉加热到胶凝温度或更高温度时，淀粉的胶凝通过这样的处理同时进行。
除了上文提及培养原料，优选地，向液体培养基中适当添加有机物质、无机盐等作为营养源。
这些添加剂没有特别的限制，只要它们通常用于培养曲霉。有机物质的实例包括稻麸、小麦麸、玉米浸泡液、大豆饼和脱脂大豆。无机盐的实例包括水性化合物，如铵盐、硝酸盐、钾盐、酸式磷酸盐、钙盐和镁盐。可以同时使用两种或多种有机物质和/或无机盐。它们的添加量没有特别限制，只要促进曲霉生长就可以。有机物质的添加量优选地约0.1-5％(w/vol)，并且无机盐的量优选地约0.1-1％(w/vol)。
如果需要，这样获得的曲霉的液体培养基可以进行无菌处理，并且处理方法没有特别限制。例如，它可以是在121℃的温度进行15分钟的高温和高压灭菌方法。
将灭菌的液体培养基冷却至培养温度，然后将曲霉接种到所述液体培养基中。
用于本发明第一方面的曲霉是能够生产糖酵解酶的曲霉，优选地是能够生产葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶的曲霉。它的实例包括白曲霉如白曲菌，黑曲霉如泡盛曲霉和黑曲霉，和黄曲霉如米曲霉和酱油曲霉。
白曲霉、黑曲霉和黄曲霉可以单独使用，或者它们中的两种或多种可以组合使用。优选地，白曲霉和黑曲霉单独使用，或者它们组合使用。
这些曲霉可以用于单一菌株培养，或者用于两种或多种同源或异源菌株的混合培养。允许使用孢子或在预培养中获得的菌丝体形式。然而，由于对数生长期需要更短的时间，所以优选使用菌丝体。接种到液体培养基中的曲霉的量没有特别限制，但是孢子的数目可以在每ml液体培养基约1×104到1×106的范围。对于菌丝体，优选地接种约0.1-10％的预培养液体。
曲霉的培养温度优选地在25-45℃，或者更优选地在30-40℃，但是没有特别限制，只要生长没有受到不利的影响。如果培养温度低，由于曲霉生长变得缓慢，倾向于受到传染性微生物的污染。培养时间优选地在24-72小时的范围。
培养装置可以是任何能够进行液体培养的那些。曲霉必须需氧培养。因此，培养应该在氧或空气可以供应到培养基中的有氧条件下进行。另外，在培养过程中，优选地搅动所述培养基，以便原料、氧和曲霉可以均匀地分布在装置中。搅动条件和换气的量可以是任意的，只要维持有氧培养环境，并且因此，取决于培养装置、培养基粘度等而适当地选择。
通过用上文提及的培养方法培养，酶如葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶以平衡方式同时生成，并且同时，液体曲中植物纤维降解酶如纤维素分解酶(纤维素酶)和木聚糖分解酶的活性增强。
本发明的液体曲包括培养产物本身，通过离心分离等从所述培养产物获得的培养液体，其浓缩物或干产品，等等。
如上文所述，按照上文提及的培养方法，高度产生酶，诸如葡糖淀粉酶、酸稳定的α-淀粉酶、纤维素分解酶和木聚糖分解酶。
因此，在本发明第十方面所述的生产酶的方法基本上与上文所述的生产液体曲的方法相同。
按照本发明第五方面的液体曲可以通过按照本发明第一方面的方法而生产。
按照本发明第五方面的液体曲，其通过按照本发明第一方面的生产方法而获得，可以适用于生产发酵食品和饮料如烧酒、日本清酒、酱油、日本豆面酱和甜日本清酒，如在本发明第十五方面所述。
可以使用液体曲代替固体曲，例如，在如本发明第十六方面所述的生产烧酒的情形中，在醪化烧酒醪液阶段；在生产日本清酒的情形中，在醪化酵母或日本清酒醪液阶段；在生产酱油的情形中，在堆积阶段；在生产日本豆面酱的情形中，在醪化阶段；在生产甜日本清酒的情形中，在醪化阶段。
当使用上文提及的液体曲生产发酵食品和饮料时，所有的步骤可以在液相中进行。通过完整步骤在液相中生产发酵食品和饮料的方法，例如，当生产烧酒时，为，将作为原料的玉米、小麦、大米、马铃薯、甘蔗等在约80℃加热，以通过用抗热酶制剂溶解而液化，将上述液体曲和酵母加入到其中，以允许醪液进行酒精发酵，然后将其在正常压力或减小的压力下等蒸馏。
由于它的高酶活性，通过按照本发明第一方面的方法获得的液体曲可以用于酶制剂、药物如助消化剂等。在这种情形中，得到的曲霉培养产物可以通过常规方法浓缩和纯化到需要的程度，并且其中可以加入适当的赋形剂、增稠剂、甜味剂等。
按照本发明的第六方面，提供生产液体曲干产品的方法，其包括干燥如上文所述获得的液体曲。
优选的干燥方法包括冷冻干燥，并且，特别地，由于几乎不发生酶的灭活，所以真空冷冻干燥是更优选的。真空冷冻干燥可以按照常规方法进行。真空冷冻干燥的条件没有特别限制，但是通常，可以在从-10到-40℃的温度预冷冻1-6小时，然后可以在1 Torr或更小，或优选地0.7 Torr或更小的真空程度下，在5-30℃干燥10-30小时。
在这种方式中，可以产生目的液体曲干产物。
按照本发明第七方面的液体曲干产物，其通过按照本发明第六方面的生产方法获得，可以适合用于生产发酵食品和饮料，如在本发明第十七方面所述。
可以使用所述液体曲干产物代替固体曲或液体曲，例如，在生产日本清酒的情形中，在醪化酵母或日本清酒醪液阶段；在生产烧酒的情形中，在醪化烧酒醪液阶段；在生产酱油的情形中，在堆积阶段；在生产日本豆面酱的情形中，在醪化阶段；在生产甜日本清酒的情形中，在醪化阶段。
在使用液体曲干产物生产发酵食品和饮料的情形中，可以使用液体曲干产物，其是未经修饰的酶制剂，通过提前混合汽蒸的大麦、酵母细胞和液体曲并且干燥而获得的产物，或通过将各种干的原料混合而获得的制剂。如上文所述，如果所述原料结合在一类试剂盒中，那么所述试剂盒将作为简单的起动器，加入水，通过其可以生产发酵食品和饮料如烧酒。
当使用上文提及的液体曲干产物生产发酵食品和饮料时，所有步骤可以在液相进行。通过完整步骤在液相中生产发酵食品和饮料的方法，例如，当生产烧酒时，为，将作为原料的玉米、小麦、大米、马铃薯、甘蔗等在约80℃加热，以通过用抗热酶制剂溶解而液化，将上述液体曲和酵母加入到其中，以允许醪液进行酒精发酵，然后将其在正常压力或减小的压力下等蒸馏。
通过上文提及的生产方法获得的液体曲用于通过按照本发明第二十一方面的发酵方法生产乙醇。在乙醇生产中，除了使用液体曲代替固体曲之外，工业酒精(乙醇)可以按照已知的生产工业酒精(乙醇)的方法进行生产。
下文描述通过发酵方法生产乙醇的方法的实例。
用于生产乙醇的原料可以是含有淀粉的原料，并且其实例包括谷物，如大麦、无壳大麦、大米、小麦、荞麦、谷仓前的黍、狐尾黍、黍、高粱和玉米；和块茎，如甘薯和木薯。
通过发酵方法生产乙醇可以利用连续汽蒸和煮沸装置如低温连续汽蒸和煮沸装置进行。首先，将能够生产乙醇的酵母如烧酒酵母、上文提及的原料和水加入到液体曲中，以进行醪化。如果需要可以使用乳酸。
醪化之后，将混合物在低温下汽蒸和煮沸，并且在约20-30℃的温度下发酵，以由此在一级醪化之后进行二级醪化。
在本发明第二十一方面的情形中，尽管没有使用酶制剂，并且只使用液体曲，在完成发酵后获得的醪液具有18-20％的高酒精含量。
在完成发酵之后获得的醪液可以使用蒸馏器如微蒸馏装置、优选地连续蒸馏器进行蒸馏，由此去除杂质，并且将所述醪液浓缩。结果，可以生产具有高品质的工业酒精(乙醇)，其具有95％或更高的酒精浓度。
按照本发明的第二十一方面，所获得的醪液在完成发酵后具有18-20％的高酒精含量，导致诸如规模减小和能量节约的效果。
下文，本发明将通过实施例方式详细地描述。然而，本发明并不限于这些实例。
实施例
实施例1
生产具有增强的植物纤维降解酶活性的曲霉培养产物(液体曲)
(I)生产曲霉培养产物(液体曲)
1)预培养方法：将8g 65％-脱壳的大麦(Stirling，在澳大利亚生产)和100ml水放入500-ml带挡板的锥形瓶中，并且整体用高压锅在121℃灭菌15分钟，由此获得预培养基。将白曲霉(白曲菌NBRC4308)以1×106/ml接种到所述预培养基中，并且通过摇动在37℃和100rpm培养24小时，由此获得预培养液体。
2)主要培养的方法：通过将在表1所示的2.0，1.9，1.8，1.7，1.6，1.5和1.4％(w/vol)组合比例的未加工的大麦(95％脱壳的大麦(Stirling，在澳大利亚生产))加入到含有0.2％(w/vol)的硝酸钾和0.3％(w/vol)的磷酸二氢钾的水中，而制备7种液体培养基。
将3,000 ml每种液体培养基置于5,000-ml罐式发酵器(由B.E.Marubishi有限公司(B.E.Marubishi Co.，Ltd.)制备)中，并且整体用高压锅在121℃灭菌15分钟，由此获得主要培养基。将每种主要培养基用30ml上文提及的预培养液体接种。
在这之后，培养在37℃的温度和300rpm的搅拌速率并且用0.5vvm的换气体积进行42小时，由此获得曲霉培养产物(液体曲)。
(II)测量酶活性
分别测量在部分(I)中获得的曲霉培养产物(液体曲)的葡糖淀粉酶(GA)、酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)、纤维素酶(CEL)，和木聚糖酶(XYL)的产率。表1显示在通过在含有不同量的未加工的大麦的液体培养基中培养曲霉而获得的曲霉培养产物(液体曲)中的葡糖淀粉酶(GA)、酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)、纤维素酶(CEL)，和木聚糖酶(XYL)的产率。
葡糖淀粉酶(GA)活性通过使用糖化作用幂微分定量试剂盒(saccharification power fractional quantification kit，由Kikkoman公司制造)进行测量。为了测量酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)的活性，将在Sudo S.等：J.Ferment.Bioeng.(发酵生物工业杂志)，76，105-110(1993)，Sudo S.等：J.Ferment.Bioeng.(发酵生物工业杂志)，77，483-489(1994)，和Shigetoshi Sudo等：Journal of the Brewing Society of Japan(日本酿造协会杂志)，89，768-774(1994)所述的方法略微改进。即，通过用酸处理所述培养产物而使得酸不稳定的α-淀粉酶失活，然后用α-淀粉酶测量试剂盒(由Kikkoman公司制造)测量酸稳定的α-淀粉酶活性。更具体地，将9ml 100mM的乙酸缓冲溶液(pH3)加入到1ml培养液体中，酸处理在37℃进行1小时，然后用α-淀粉酶测量试剂盒(由Kikkoman公司制造)进行测量。
然后测量是植物纤维降解酶的纤维素酶和木聚糖酶的活性。
首先，通过下述方法测量纤维素酶(CEL)活性：允许从羧甲基纤维素(下文缩写为CMC)作为底物的酶促水解产生的还原糖与DNS(3，5-二硝基水杨酸)反应，并且量化在540nm的吸收的增加。更具体地，将1ml培养液体加入到1ml 1％CMC底物溶液(将由西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)生产的低粘度TM溶解在100mM乙酸缓冲溶液(pH5)中)中，并且整体在40℃进行酶促反应恰好10分钟。此后，将4ml含有0.75％二硝基水杨酸、1.2％氢氧化钠、22.5％酒石酸钠钾四水合物和0.3％乳糖一水合物的DNS试剂加入到所述混合物中，并且将整体充分混合，由此终止反应。为了定量在反应完成之后溶液中的还原糖的量，将反应完成后的溶液在沸水浴中恰好加热15分钟。随后，将溶液冷却到室温，确定在540nm的吸收，由此定量与葡萄糖的量相对应的还原的糖的量。1单位的纤维素酶(CEL)活性表示为每分钟产生与1μmol的葡萄糖相对应的还原的糖所需要的酶的量。具体而言，1单位的纤维素酶活性表示为在40℃10分钟的反应条件下每分钟产生与1μmol的葡萄糖相对应的还原的糖所需要的酶的量。
接着，通过下述方法测量木聚糖酶(XYL)活性：允许从来源于燕麦斯佩耳特小麦(oat spelts)的木聚糖作为底物的酶促水解产生的还原糖与DNS反应，并且量化在540nm的吸收的增加。更具体地，将0.1ml培养液体加入到1.9ml 1％木聚糖底物溶液(将木聚糖，来自于由西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)生产的燕麦斯佩耳特小麦，溶解在200mM乙酸缓冲溶液(pH4.5)中)中，并且整体在40℃进行酶促反应恰好10分钟。此后，将4ml含有0.75％二硝基水杨酸、1.2％氢氧化钠、22.5％酒石酸钠钾四水合物和0.3％乳糖一水合物的DNS试剂加入到所述混合物中，并且将整体充分混合，由此终止反应。为了定量在反应完成之后溶液中的还原糖的量，将反应完成后的溶液在沸水浴中恰好加热15分钟。随后，将溶液冷却到室温，确定在540nm的吸收，由此定量与木糖的量相对应的还原的糖的量。1单位的木聚糖酶活性表示为在40℃10分钟的反应条件下每分钟产生与1μmol的木糖相对应的还原的糖所需要的酶的量。
如在表1中所示，证实各种酶的生成平衡取决于要用的未加工的大麦的量而不同。特别地，发现纤维素酶(CEL)和木聚糖酶(XYL)的活性倾向于在含有1.8％或更少的要用的未加工的大麦的实验情形中显著增加。特别地，纤维素酶(CEL)和木聚糖酶(XYL)以平衡方式生成，而葡糖淀粉酶(GA)和酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)还在1.7％的实验情形中以平衡方式高度生成。
因此，表明除了葡糖淀粉酶(GA)和酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)之外的酶，特别是植物纤维降解酶如纤维素酶(CEL)和木聚糖酶(XYL)的活性能够通过精确控制要用的大麦的量而增强。
[表1]
Figure A20068003464700241
实施例2
使用具有增强的植物纤维降解酶活性的曲霉培养产物(液体曲)进行酒精发酵
使用在实施例1中的获得曲霉培养产物(液体曲)进行酒精发酵，其通过在其中加入2.0％(w/vol)，1.7％(w/vol)和1.4％(w/vol)的量的未处理的大麦的液体培养基中培养而进行。
曲霉培养产物分别如在实施例1中获得，通过用液体培养基培养曲霉而进行，所述液体培养基分别通过这样制备：向其中加入2.0％(w/vol)的未处理的大麦作为对照情形，加入1.7％(w/vol)的未处理的大麦作为本发明的情形1，和加入1.4％(w/vol)的未处理的大麦作为本发明的情形2。将70ml每种曲霉培养产物用于大麦醪化，总共在醪化组合中184.6g，在表2中所示。在包括5天的一级醪化，2天的二级醪化和13天的三级醪化的3步骤醪化中，发酵温度保持在25℃。
作为添加的大麦，使用在澳大利亚生产的65％-脱壳的Stirling，其已经用水洗过，然后进行60分钟的浸泡，30分钟的泄流，然后35分钟的汽蒸。另外，将42.4g添加的大麦给料到一级醪化中。烧酒酵母(鹿儿岛酵母(Kagoshima yeast))用作酵母，并且接种50μl已经在YPD培养基中在30℃静止培养48小时的烧酒酵母。
[表2]
图1显示发酵过程。在每个实验情形中，发酵过程没有问题地进行。特别地，发酵在1.7％的情形中积极地进行，其中各种酶以平衡方式生成。对于2.0％的情形(对照情形)，得到的最终醪液具有18.0％的酒精浓度，对于1.7％的情形(本发明的情形1)具有19.2％的酒精浓度，并且对于1.4％的情形(本发明的情形2)具有18.6％的酒精浓度。即，在1.7％的情形(本发明的情形1)中观察到高酒精浓度。
另外，图2显示用旋转粘度计测量的最终醪液的粘度的结果。从图2清楚看出，当与在2.0％情形(对照情形)中的粘度相比较时，在1.7％情形(本发明的情形1)中和1.4％情形(本发明的情形2)中的粘度显著减小，所述1.7％情形和1.4％情形每一种情形具有增强的任意一种纤维素酶(CEL)和木聚糖酶(XYL)的活性。推测所述减小是由于通过纤维素酶(CEL)或木聚糖酶(XYL)的作用而将作为原料的大麦中大量含有的植物纤维分解而发生的。推测醪液粘度的减小提供巨大的效果，如醪液流动性的提高，促进液体转移，并且提高蒸馏操作的效率。
从这一结果，表明当在液体培养基中培养曲霉时，通过控制要用的原料的量，植物纤维降解酶如纤维素酶(CEL)和木聚糖酶(XYL)能够在曲霉培养产物中同时生成并且与至少葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶一起积累，所述液体培养基含有表面完全或部分覆盖有至少外壳的谷物等作为培养原料。证实当通过使用其中的这些植物纤维降解酶活性增强的曲霉培养产物(液体曲)进行的酒精发酵中，不但得到的酒精的量增加，而且醪液的粘度减小。因此，这提供了显著促进所述生产的效率的可能性。
所述醪液可以通过随后的单次蒸馏而产生大麦烧酒，并且通过连续蒸馏而容易地提供工业酒精(乙醇)。
实施例3
生产曲霉培养产物的干产品
(I)生产曲霉培养产物(液体曲)
1)预培养方法：将8g 65％-脱壳的大麦(Stirling，在澳大利亚生产)和100ml水放入500-ml带挡板的锥形瓶中，并且整体用高压锅在121℃灭菌15分钟，由此获得预培养基。将白曲霉(白曲菌NBRC4308)以1×106/ml接种到所述预培养基中，并且通过摇动在37℃和100rpm培养24小时，由此获得预培养液体。
2)主要培养的方法：制备含有2.0％(w/vol)的98％-未脱壳的大麦(Stirling，在澳大利亚生产)、0.2％(w/vol)的硝酸钾和0.3％(w/vol)的磷酸二氢钾的液体培养基。将3,000ml所述液体培养基置于5,000-ml罐式发酵器(由B.E.Marubishi有限公司(B.E.Marubishi Co.，Ltd.)制备)中，并且整体用高压锅在121℃灭菌15分钟，由此获得主要培养基。将所述主要培养基用30ml上文提及的预培养液体接种。在这之后，培养在37℃的温度，300rpm的搅拌速率和0.5vvm的换气体积进行42小时，由此获得曲霉培养产物(液体曲)。
(II)生产曲霉培养产物(液体曲)的干产品
将在部分(I)获得的200ml曲霉培养产物(液体曲)在-30℃预冷冻2小时。然后，将得到物在25℃在0.5 Torr的真空程度下干燥24小时，由此获得2.7g所述曲霉培养产物(液体曲)的干产品，即，所述曲霉培养产物的真空冷冻干燥产物。
(III)测量酶活性
对于未干燥的曲霉培养产物(液体曲)，即，未干燥的产物，其在部分(I)中获得，和曲霉培养产物(液体曲)的干燥的产品，即，干产品，其在部分(II)中获得，测量葡糖淀粉酶(GA)和酸稳定的α-淀粉酶(ASAA)的产率。
葡糖淀粉酶活性通过使用糖化作用幂微分定量试剂盒(由Kikkoman公司制造)进行测量。为了测量酸稳定的α-淀粉酶的活性，将在Sudo S.等：J.Ferment.Bioeng.(发酵生物工业杂志)，76，105-110(1993)，Sudo S.等：J.Ferment.Bioeng.(发酵生物工业杂志)，77，483-489(1994)，和Shigetoshi Sudo等：Journal of the Brewing Society of Japan(日本酿造协会杂志)，89，768-774(1994)所述的方法略微改进。即，通过用酸处理所述培养产物而使得酸不稳定的α-淀粉酶失活，然后用α-淀粉酶测量试剂盒(由Kikkoman公司制造)测量酸稳定的α-淀粉酶活性。更具体地，将9ml 100mM的乙酸缓冲溶液(pH3)加入到1ml培养液体中，酸处理在37℃进行1小时，然后用α-淀粉酶测量试剂盒(由Kikkoman公司制造)进行测量。
曲霉培养产物(液体曲)的干产品，即，干产品，的酶活性，用通过将270mg曲霉培养产物(液体曲)的干产品，即，干产品，溶解在20ml 10mM的乙酸盐缓冲液(pH5)中而获得的原料进行测量。
表3显示在部分(I)中获得的未干燥的产物和在部分(II)中获得的干产品的酶活性的测量结果。
如在表3中所示，证实即使当将所述液体曲冷冻干燥时，所述液体曲仍没有失去它的酶活性，并且因此，液体曲的干产品能够充分用于烧酒醪化。
[表3]
Figure A20068003464700281
实施例4
使用曲霉培养产物(液体曲)进行酒精发酵
使用分别在实施例3中获得的未干燥的产物和干产品进行酒精发酵(分别表示未干燥的情形和干燥的情形)。
即，将分别在实施例3中获得的100ml未干燥的产物或1.35g干产品分别用于大麦醪化，在醪化组合中总共3.7g，如在表4和5中所示。发酵温度保持在25℃，进行包括4天的一级醪化和17天的二级醪化的2步骤醪化。
作为添加的大麦，使用在澳大利亚生产的65％-脱壳的Stirling，其已经用水洗过，然后进行60分钟的浸泡，30分钟的泄流，然后35分钟的汽蒸。烧酒酵母(鹿儿岛酵母)用作酵母，并且接种50μl已经在YPD培养基中在30℃静止培养48小时的烧酒酵母。
[表4]
Figure A20068003464700282
[表5]
Figure A20068003464700291
图3显示在未干燥的情形中和干燥的情形中醪液的发酵过程，其通过累积减少醪液的重量而获得。
结果，如从图3清楚可见，在表示未干燥的产物醪化的未干燥的情形和表示干燥产品醪化的干燥情形之间几乎没有观察到关于发酵过程的不同。
对于未干燥的情形，在所获得的最终醪液中的酒精含量为19.6％，并且对于干燥情形，为19.4％。因此，发酵在这两种实验情形中进行地很好。
实施例5
使用未加工的大米曲霉培养产物(液体曲)生产乙醇
(I)生产未加工的大米曲霉培养产物(液体曲)
1)预培养方法：将8g 90％-脱壳的大米(Koshihikari)和100ml水放入500-ml带挡板的锥形瓶中，并且整体用高压锅在121℃灭菌15分钟，由此获得预培养基。将白曲霉(白曲菌NBRC4308)以1×106/ml接种到所述预培养基中，并且通过摇动在37℃和100rpm培养24小时，由此获得预培养液体。
2)主要培养的方法：将8g去除其稻壳的未加工的大米(Koshihikari)，0.2g KNO3，0.3g KH2PO4，和100ml水置于500-ml带挡板的锥形瓶中，并且整体用高压锅在121℃灭菌15分钟，由此获得主要培养基(制备5烧瓶的主要培养基)。将1ml每种预培养液体接种到主要培养基中，然后通过摇动在37℃的温度和100rpm培养72小时，由此获得未加工的大米的曲霉培养产物(液体曲)。
表6显示在所得到的未加工的大米曲霉培养产物(液体曲)中的酶活性。
如表6所示，得到的未加工的大米曲霉培养产物(液体曲)证实具有良好的葡糖淀粉酶和酸稳定的α-淀粉酶活性。
[表6]
酶活性   未加工的大米曲霉培养产物
  葡糖淀粉酶活性   135U/ml
  酸稳定的α-淀粉酶活性   11U/ml
(II)给料和发酵
给料组合如在表7中所示。将烧酒酵母(鹿儿岛酵母)在10ml YPD培养基中在30℃培养1天。然后，将1ml所述酵母的培养液体离心，并且将沉淀的酵母用无菌水洗涤两次。收集的酵母总量用作酵母。
将在部分(I)中获得的未加工的大米曲霉培养产物(液体曲)，上文提及的酵母，添加的大米(脱壳的Koshihikari大米)，90％的乳酸和水置于连续汽蒸和煮沸装置中。发酵在25℃的恒定温度下进行16天。在一级醪化后3天，进行二级醪化。
[表7]
Figure A20068003464700301
在如上文所述获得的在发酵完成之后的未加工的大米曲霉培养产物(液体曲)的醪液具有19.1％的酒精含量。
(III)生产工业酒精(乙醇)
将在部分(II)中获得的在发酵完成之后的未加工的大米曲霉培养产物(液体曲)的醪液用微蒸馏装置(HP-1000T专用型，由Sibata科技有限公司制造)进行连续蒸馏，由此收集工业酒精(乙醇)。
所获得的工业酒精(乙醇)具有95.3％的酒精含量。
此外，当应用使用未加工的大麦作为原料的曲霉培养产物(液体曲)时，还能产生具有高酒精含量的醪液。因此，能够生产没有质量缺点的工业酒精(乙醇)。
如上文所述，按照本发明，表明工业酒精(乙醇)能够通过使用曲霉培养产物(液体曲)而生产。
工业适用性
按照本发明的第一方面，具有增强的植物纤维降解酶如纤维素分解酶(纤维素酶)和木聚糖分解酶的活性的液体曲可以通过液体培养而不是固体培养而产生，无需使用昂贵的植物纤维降解酶制剂和重组细菌。
另外，按照本发明的第六方面，可以生产具有高的葡糖淀粉酶、酸稳定的α-淀粉酶和植物纤维降解酶的活性并且还在处理性质上极好的液体曲干产品。此外，所述产物是干燥状态，因此存在甚至对于意料之外的生产它是适时可用的优点。
按照本发明的第二十一方面，可以通过使用充分具有酒精发酵所需要的酶活性的液体曲的发酵方法而有效率地生产工业酒精(乙醇)。
因此，本发明预计有效地用于生产食品和饮料的领域，化学工业领域和能量工业领域。

Claims (25)

1.生产具有增强的植物纤维降解酶活性的液体曲的方法，其通过用选自由下列各项组成的组的至少一种液体培养基培养曲霉：含有表面完全或部分覆盖有至少外壳的谷物作为培养原料的液体培养基，含有表面被皮覆盖的豆类和/或块茎作为培养原料的液体培养基，和含有未经预处理诸如碾碎或捣碎的苋属(amaranthus)和/或藜属(quinoa)植物作为培养原料的液体培养基，其中控制要用于液体培养基的所述培养原料的量，以在所述曲霉培养产物中同时产生和积累至少葡糖淀粉酶、酸稳定的α-淀粉酶和植物纤维降解酶。
2.按照权利要求1的生产液体曲的方法，所述植物纤维降解酶包括纤维素分解酶和/或木聚糖分解酶。
3.按照权利要求1的生产液体曲的方法，其中所述曲霉包括白曲霉和/或黑曲霉。
4.按照权利要求1的生产液体曲的方法，其通过用选自由下列各项组成的组的至少一种液体培养基培养曲霉：含有表面完全或部分覆盖有至少外壳的谷物作为培养原料的液体培养基，含有表面被皮覆盖的豆类和/或块茎作为培养原料的液体培养基，和含有未经预处理诸如碾碎或捣碎的苋属和/或藜属植物作为培养原料的液体培养基，其中控制要用于液体培养基的所述培养原料的量在1.4-1.8％(w/vol)，并且制定培养条件为在37℃42小时，以在所述曲霉培养产物中同时产生和积累至少葡糖淀粉酶、酸稳定的α-淀粉酶和植物纤维降解酶。
5.液体曲，其通过按照权利要求1-4中任一项的方法获得。
6.使用液体培养基生产液体曲的干产品的方法，其包括，干燥按照权利要求5的液体曲。
7.液体曲干产品，其通过按照权利要求6的方法获得。
8.生产酶制剂的方法，其包括，使用按照权利要求5的液体曲。
9.酶制剂，其通过按照权利要求8的方法获得.
10.生产酶的方法，其通过用选自由下列各项组成的组的至少一种液体培养基培养曲霉：含有表面完全或部分覆盖有至少外壳的谷物作为培养原料的液体培养基，含有表面被皮覆盖的豆类和/或块茎作为培养原料的液体培养基，和含有未经预处理诸如碾碎或捣碎的苋属和/或藜属植物作为培养原料的液体培养基，其中控制要用于液体培养基的所述培养原料的量，以在所述曲霉培养产物中同时产生和积累至少葡糖淀粉酶、酸稳定的α-淀粉酶和植物纤维降解酶。
11.按照权利要求10的生产酶的方法，其中所述植物纤维降解酶包括纤维素分解酶和/或木聚糖分解酶。
12.按照权利要求10的生产酶的方法，其中所述曲霉包括白曲霉和/或黑曲霉。
13.按照权利要求10的生产酶的方法，其通过用选自由下列各项组成的组的至少一种液体培养基培养曲霉：含有表面完全或部分覆盖有至少外壳的谷物作为培养原料的液体培养基，含有表面被皮覆盖的豆类和/或块茎作为培养原料的液体培养基，和含有未经预处理诸如碾碎或捣碎的苋属和/或藜属植物作为培养原料的液体培养基，其中控制要用于液体培养基的所述培养原料的量在1.4-1.8％(w/vol)，并且制定培养条件为在37℃42小时，以在所述曲霉培养产物中同时产生和积累至少葡糖淀粉酶、酸稳定的α-淀粉酶和植物纤维降解酶。
14.酶，其通过按照权利要求10-13中任一项的方法获得。
15.生产发酵食品或饮料的方法，其包括，使用按照权利要求5的液体曲。
16.按照权利要求15的生产发酵食品或饮料的方法，其中所述发酵食品或饮料包括烧酒。
17.生产发酵食品或饮料的方法，其包括，使用按照权利要求7的液体曲干产品。
18.生产发酵食品或饮料的方法，其包括，使用按照权利要求9的酶制剂。
19.生产发酵食品或饮料的方法，其包括使用按照权利要求14的酶。
20.发酵食品或饮料，其通过按照权利要求15-19中任一项的方法获得。
21.生产乙醇的方法，其包括，使用按照权利要求5的液体曲。
22.生产乙醇的方法，其包括，使用按照权利要求7的液体曲干产品。
23.生产乙醇的方法，其包括，使用按照权利要求9的酶制剂。
24.生产乙醇的方法，其包括，使用按照权利要求14的酶。
25.乙醇，其通过按照权利要求21-24中任一项的方法获得。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114774330A (zh) * 2022-05-27 2022-07-22 中国医学科学院医药生物技术研究所 解纤维素雌植菌新物种及其应用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012049737A1 (ja) * 2010-10-12 2012-04-19 アサヒグループホールディングス株式会社 デンプン分解酵素活性及び食物繊維分解酵素活性が増強された液体麹の製造方法
JP2014504506A (ja) * 2011-02-03 2014-02-24 アイ キャメルガード ジョセフ キヌア系飲料およびキヌア系飲料の製造方法
WO2012161230A1 (ja) 2011-05-23 2012-11-29 有限会社メイショウ 樹木を原料として用いたアルコールを製造する方法、及びそれによって得られたアルコール溶液
CN104745559A (zh) * 2015-04-09 2015-07-01 广西靖西梁鹏食品有限公司 一种山楂果酒用果胶酶及其制备方法
JP6618097B2 (ja) * 2018-04-10 2019-12-11 株式会社イノス 食用酵素組成物の製造方法
KR102303173B1 (ko) * 2020-02-05 2021-09-16 농업회사법인 용봉주조 주식회사 고주파 펄스를 이용한 균체의 성장속도 향상과 쌀의 도정 정도를 조정하여 효소활성 향상을 이룬 액체누룩 제조방법 및 이로부터 제조된 액체누룩을 함유하는 탁주 또는 화장품
CN114854594B (zh) * 2022-05-06 2023-09-22 江苏科技大学 一种食醋复合直投菌种保护剂的制备方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3152826B2 (ja) 1993-12-22 2001-04-03 花王株式会社 酵素含有組成物の製造法
JP3391566B2 (ja) 1994-07-19 2003-03-31 宝ホールディングス株式会社 焼酎の製造方法
JP3651003B2 (ja) 1994-10-11 2005-05-25 味の素株式会社 安定化されたトランスグルタミナーゼ及びそれを含む酵素製剤
JPH10204494A (ja) 1997-01-27 1998-08-04 Kao Corp 粉末状酵素製剤及びそれを用いた造粒物
FR2788782B1 (fr) * 1999-01-25 2003-01-31 Gie Agro Ind Produit multienzymatique a activites glucoamylasique, proteolytique et xylanasique et procede pour sa production par fermentation a l'etat solide de son de ble avec aspergillus niger
CN1112436C (zh) * 2000-09-20 2003-06-25 宋书玉 固体曲、液体曲联合发酵生产白酒的方法
JP4577706B2 (ja) 2001-08-06 2010-11-10 宝ホールディングス株式会社 液体麹の製造方法及びその利用
JP2004242532A (ja) 2003-02-12 2004-09-02 Chuo Kakoki Kk 廃棄洋菓子からの燃料の製造方法
JP3718677B2 (ja) 2004-04-09 2005-11-24 アサヒビール株式会社 液体麹の製造方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114774330A (zh) * 2022-05-27 2022-07-22 中国医学科学院医药生物技术研究所 解纤维素雌植菌新物种及其应用
CN114774330B (zh) * 2022-05-27 2023-07-21 中国医学科学院医药生物技术研究所 解纤维素雌植菌新物种及其应用

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