WO2007034670A1 - 植物繊維溶解酵素が増強された液体麹の製造方法、該方法により得られた液体麹およびその用途 - Google Patents

Abstract

　本発明は、高価な植物繊維溶解酵素製剤や遺伝子組換え菌を使用することなく、液体培地を使用して植物繊維溶解酵素が増強された液体麹を製造する方法と、前記液体麹を用いて液体麹乾燥品および工業用アルコール（エタノール）を製造する方法を提供することを目的とする。 　本発明は、培養原料として、表面の全部又は一部が少なくとも穀皮で覆われた穀類を含む液体培地と、表面が外皮で覆われた豆類及び／又は芋類を含む液体培地と、細砕や粉砕などの前処理をしないアマランサス及び／又はキヌアを含む液体培地と、から選ばれた少なくとも１種の液体培地で麹菌を培養する際に、前記液体培地中における培養原料の使用量を調整することにより、液体麹中に少なくともグルコアミラーゼと耐酸性α－アミラーゼと植物繊維溶解酵素とを同時に生成、蓄積させることを特徴とする植物繊維溶解酵素が増強された液体麹の製造方法、前記方法により得られた液体麹を乾燥処理することを特徴とする液体培地を用いた液体麹乾燥品の製造方法、並びに、当該液体麹を用いた発酵法によるエタノールの製造方法を提供する。

Description

明 細 書

植物繊維溶解酵素が増強された液体麹の製造方法、該方法により得られ た液体麹およびその用途

技術分野

[0001] 本発明は、セルロース分解酵素ゃキシラン分解酵素などの植物繊維溶解酵素が増 強された液体麹の製造方法、該方法により得られた液体麹およびその用途に関する 背景技術

[0002] 酒類等の製造に用いられる麹は、蒸煮等の処理後の原料に糸状菌の胞子を接種 して培養する固体麹と、水に原料及びその他の栄養源を添加して液体培地を調製し 、これに麹菌の胞子又は前培養した菌糸等を接種して培養する液体麹がある。

[0003] 従来の酒類などの発酵飲食品、例えば、日本酒、焼酎、しょうゆ、みそ、みりん等の 製造では、固体培養法により製麹された、いわゆる固体麹が広く利用されている。こ の固体培養法は、ァスペルギルス'カヮチ（Aspergillus kawachii)、ァスペルギルス'ァ ヮモリ ^Aspergillus awamori)、 1スへノレ =γ レス · -ガ ~~ (Aspergillus niger 、 "7スへノレ ギルス ·オリーゼ（Aspergillus oryzae)、ァスペルギルス ·ソーャ（Aspergillus sojae)等 の麹菌の胞子を、蒸煮した穀類等の固体原料へ散布し、その表面で麹菌を増殖させ る培養方法である。

[0004] 例えば、焼酎の製造では、ァスペルギルス ·カヮチ（Aspergillus kawachii)やァスぺ ルギルス.ァヮモリ（Aspergillus awamori)等の固体麹が広く用いられている。しかしな がら、固体培養法は、原料や麹菌が不均一に分散する培養系であるため、温度や水 分含量、各種栄養成分といった因子を均一にすることが困難であり、その培養制御 は大変煩雑である。また、開放状態で製麹されることも多ぐこの場合は、雑菌による 汚染といった品質管理面での注意も要する。そのため、大規模製造には不向きな方 法とも言える。

[0005] これに対して、液体培養法は、培養制御や品質管理が容易であり、効率的な生産 に適した培養形態である。 し力しながら、例えば、焼酎醸造に必要な酵素活性が十分に得られない等の理由 から、麹菌を液体培養して得られる培養物を、実際に焼酎麹として用いた例は少な い。

[0006] 液体培養法で得られる培養物が焼酎等の発酵飲食品の製造に利用されない大き な理由として、上記理由の他に、液体培養では麹菌のアミラーゼ、セルラーゼ等の酵 素生産挙動が固体培養と大きく異なるばかりか、全般的に生産性が低下することが 知られている (非特許文献 1, 2参照)。

[0007] 通常、焼酎をはじめとする酒類の製造では、並行複発酵によりアルコールが生成さ れる。従って、麹菌へのグルコース供給に影響を与える麹菌の糖質分解関連酵素、 特にダルコアミラーゼや耐酸性ひ一アミラーゼは、アルコール発酵における鍵酵素で ある。しかしながら、液体培養法で得られる培養物において、ダルコアミラーゼの活性 は著しく低ぐ生産挙動も固体培養とは大きく異なることが知られている (非特許文献 3— 6参照)。

[0008] 麹菌のダルコアミラーゼ活性を向上させる方法として、菌糸の生育にストレスを与え ながら麹菌を培養する方法 (特許文献 1参照)ゃ焙焼した穀類を麹菌培養液に添カロ する方法 (特許文献 2参照)が報告されている。特許文献 1に開示の方法は、多孔性 膜上又は空隙を有する包括固定化剤中で培養してダルコアミラーゼをコードする新 規遺伝子 glaBを発現させて同酵素活性を高めるもので、厳密な制御又は特殊な培 養装置が必要であり、実用的ではない。また、特許文献 2に開示の方法は、原料の 少なくとも一部に焙焼した穀類を用いた液体培地で麹菌を培養するもので、穀類を 焙焼するという、新たな製造工程が加わることになる。

[0009] そこで、本発明者らは、麹菌にとって難分解性の糖質を含有する液体培地を用い た麹菌の培養方法に関する発明を提案した (特許文献 3参照)。この発明によれば、 麹菌の液体培養において、酒類などの発酵飲食品の製造に使用可能な、ダルコアミ ラーゼ等の糖質分解関連酵素の活性が高い麹菌培養物を、簡便、且つ安価に得る ことができる。

[0010] 一方、耐酸性 a アミラーゼについては、最近、分子生物学的な解析が詳細に行 なわれ始めている (非特許文献 7参照)。それによれば、白麹菌は非耐酸性ひ—アミラ ーゼと耐酸性 a—アミラーゼという性質の異なる 2種類のアミラーゼ遺伝子を有して いるが、その発現様式は大きく異なっており、液体培養においては、非耐酸性 α—ァ ミラーゼは十分に生産されるものの、焼酎醸造の鍵酵素である耐酸性 α—アミラーゼ はほとんど生産されな 、ことが報告されて 、る。

[0011] 焼酎製造では、焼酎もろみの腐造防止のために低 ρΗ環境下で醸造する。しかし、 非耐酸性 α—アミラーゼは、低 ρΗ条件では速やかに失活してしまうため、焼酎醸造 の糖質分解にはほとんど貢献しない。そのため、焼酎醸造の糖質分解に寄与してい ると考えられる耐酸性ひ—アミラーゼを、麹菌の液体培養で大量に生成させることが 、焼酎製造のために不可欠である。

[0012] 過去には、麹菌の液体培養における耐酸性 a アミラーゼの生産挙動を詳細に検 討した報告があるものの、その方法はペプトンやクェン酸緩衝液を含む合成培地を 用いている上に、培養時間が 100時間以上かかるなど、実際の焼酎醸造に適用でき るような液体麹の製造方法であるとは言 、難 、 (非特許文献 8— 10参照)。

[0013] そこで、本発明者らは、培養原料として、表面が穀皮で覆われた穀類を含む液体 培地で白麹菌及び Z又は黒麹菌を培養して、培養物中にダルコアミラーゼと耐酸性 a アミラーゼとを同時に生成、蓄積させることにより、焼酎醸造に必要なダルコアミ ラーゼ及び耐酸性 a アミラーゼ活性を充分に含有する液体麹を製造する方法を 既に開発し、この液体麹を用いた焼酎の製造に初めて成功した (例えば、特願 2004 350661号明細書参照）。

[0014] 一方、清酒や焼酎製造における更なる生産性の向上を目的に、麹の生産する植物 繊維溶解酵素に関する研究が行なわれており、清酒製造の際に植物繊維溶解酵素 であるセルロース溶解酵素、キシラン溶解酵素、ぺクチン溶解酵素を添加すると、清 酒モロミの原料利用率が向上することが報告されている (非特許文献 11, 12参照） また、トリコデルマ'ビリデ（Trichoderma viride)のセルロース溶解酵素遺伝子を導 入した遺伝子組換え焼酎麹菌を造成し、それを用いた焼酎製造で焼酎のアルコー ル収量が向上することも報告されている (非特許文献 13参照)。

[0015] このように清酒や焼酎製造に使用する植物繊維溶解酵素群の生産性を向上させる ことは、清酒や焼酎製造など発酵飲食品製造の効率ィ匕において大変重要であること が広く知られている。

し力しながら、清酒製造の際に高価な植物繊維溶解酵素製剤を添加することはコス トアップにもつながり好ましくない。

また、遺伝子組換え焼酎麹菌の使用は安全性などの点における消費者力もの懸念 も予想され、やはり好ましくない。

[0016] ところで、工業用アルコールとしてエタノールは、みりん、食酢などの飲食品製造原 料や、香料、洗剤などの化学工業原料に用いられており、さら〖こは近時、石油などの 化石燃料に代わる新たなエネルギー源としても期待されている。例えば、ガソリンに 3 o/oのエタノールを混合した E3ガソリンなど、アルコール燃料の研究'開発が進んでい る。

[0017] 工業用アルコール製造において、原料に穀類や芋類等を用いて発酵法により行う 場合、高い酵素活性からも酵素剤 (液ィ匕酵素、糖ィ匕酵素）の使用が力かせない (例え ば、非特許文献 14参照)。

[0018] し力しながら、酵素剤の使用はコストが嵩む他、高濃度仕込みができないという問 題がある。酵素剤を使用して製造したもろみのアルコール度数は、一般に 8%程度で あり、生産性向上の観点から、より高濃度仕込みが要望されていた。

そこで、酵素剤の代わりに、穀類や豆類の表面上に麹菌を生育させた固体麹を用 Vヽることが考えられるが、固体麹は固体培養と!/ヽぅ特殊な培養形態で製造されるため 、大規模製造に不向きである。

[0019] 一方、液体培地で麹菌を培養することにより得られる液体麹は、培養制御が容易で あることから、効率的な生産に適した培養形態であると言える。

しかし、この液体麹は、アルコール発酵に必要な酵素活性が十分に得られないこと が当業者に知られているため、これまで実製造に使用された例はない。

[0020] 非特許文献 1 : Iwashita K. et al : Biosci. Biotechnol. Bioche., 62, 1938-1946(1998) 非特許文献 2 :山根雄一ら：日本醸造協会誌.， 99, 84-92(2004)

非特許文献 3 : Hata Y. et. A1. :J. Ferment. Bioeng., 84, 532-537(1997)

非特許文献 4 : Hata Y. et. al. : Gene.， 207, 127-134(1998)

非特許文献 5 : Ishida H. et. al. :J. Ferment. Bioeng., 86, 301-307(1998) 非特許文献 6 : Ishida H. et. al:Curr. Genet., 37, 373-379(2000)

非特許文献 7 : Nagamine K. et.al. : Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, 2194-2202(20

03)

非特許文献 8 : Sudo S. et al :J. Ferment. Bioeng" 76, 105-110(1993)

非特許文献 9 : Sudo S. et al :J. Ferment. Bioeng., 77, 483-489(1994)

非特許文献 10 :須藤茂俊ら:日本醸造協会誌， 89, 768-774(1994)

非特許文献 11：吉沢ら，日本醸造協会誌, 76,284-286 (1981)

非特許文献 12：福田ら,生物工学会誌, 79,299-302(2001)

非特許文献 13 : Nomachi W. et.al. ,J. Biosci. Bioeng., 93(4) p382- 387,2002) 非特許文献 14 :醸造の事典、第 352〜371頁、株式会社朝倉書店、 1988年 11月 1

0日初版発行

特許文献 1：特開平 11― 225746号公報

特許文献 2：特開 2001— 321154号公報

特許文献 3：特開 2003 - 265165号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0021] 本発明者らは、上記従来の問題点を解消するため、鋭意検討を重ねた。

その結果、本発明者らは、本発明者らが既に開発している、培養原料として、表面 が穀皮が覆われた穀類を含む液体培地で白麹菌及び Z又は黒麹菌を培養して、培 養物中にダルコアミラーゼと耐酸性 α—アミラーゼとを同時に生成、蓄積させることに より、ダルコアミラーゼ及び耐酸性ひ—アミラーゼ活性の高い液体麹を製造する方法 (例えば、特願 2004— 350661号明細書参照）において、前記液体培地中における 培養原料の使用量を調整することにより、植物繊維溶解酵素が増強された液体麹を 製造することができることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った

[0022] なお、特願 2004— 350661号明細書にて開示した、穀皮のついた原料を用いた 液体麹の製造における、植物繊維溶解酵素の生産挙動や高生産方法については 知られていないし、それらを用いた焼酎製造については、これまで全く報告されてい ない。

[0023] 請求項 1に係る本発明は、高価な植物繊維溶解酵素製剤を用いたり、或いは遺伝 子組換え菌を使用したりすることなぐし力も固体培養ではなく液体培養によって、植 物繊維溶解酵素が増強された液体麹を製造する方法を提供することを目的とするも のである。

さらに、請求項 1に係る本発明は、そのような植物繊維溶解酵素が増強された液体 麹を用いて、効率よく焼酎などの発酵飲食品を製造する方法を提供することを目的と するものである。

[0024] ところで、液体麹は液状であるが故に、ポンプ移送などハンドリングが容易なことが メリットであるが、さらにこの液体麹を真空乾燥などの方法により処理した乾燥品でも 、同様の発酵性が得られれば、焼酎などの発酵飲食品製造における更なる効率化に 貢献できると考えられる。

[0025] 請求項 6に係る本発明は、焼酎などの発酵飲食品製造における更なる効率ィ匕に貢 献することのできる液体麹乾燥品を製造する方法を提供することを目的とするもので ある。

すなわち、請求項 6に係る本発明は、ダルコアミラーゼ、耐酸性 α—アミラーゼ、及 び植物繊維溶解酵素活性が高ぐしカゝもハンドリング性に一層優れた液体麹乾燥品 を製造する方法を提供することを目的とするものである。

さらに、請求項 6に係る本発明は、上記のような液体麹乾燥品を用いて、効率よく焼 酎などの発酵飲食品を製造する方法を提供することを目的とするものである。

[0026] そして、請求項 21に係る本発明の目的は、アルコール発酵に必要な酵素活性を十 分に有する液体麹を開発し、当該液体麹を使用して、発酵法による工業用アルコー ル (エタノール)の効率的な製造方法を確立することである。

[0027] 工業用アルコール (エタノール)の製造に使用する液体麹には、糖質分解関連酵 素であるダルコアミラーゼや耐酸性ひ一アミラーゼと、植物繊維溶解酵素の活性が高 いことが必要である。しかしながら、力かる酵素活性の高い液体麹を、液体培地で麹 菌を培養して得るという技術は未だ開示されていない。すなわち、この耐酸性 α—ァ ミラーゼは、液体培養では生成されない酵素であると一般的に言われており、これま でに耐酸性 a—アミラーゼの活性が高 、液体麹は開発されて 、な 、。

[0028] 従って、請求項 21に係る本発明の目的は、上記したように、ダルコアミラーゼゃ耐 酸性 α—アミラーゼ、植物繊維溶解酵素の活性が高い液体麹を開発して、当該液体 麹を用いた発酵法による工業用アルコール (エタノール)の効率的な製造方法を確 立することである。

課題を解決するための手段

[0029] 請求項 1に係る本発明は、培養原料として、表面の全部又は一部が少なくとも穀皮 で覆われた穀類を含む液体培地と、表面が外皮で覆われた豆類及び Ζ又は芋類を 含む液体培地と、細砕や粉砕などの前処理をしな 、アマランサス及び Ζ又はキヌァ を含む液体培地と、から選ばれた少なくとも 1種の液体培地で麹菌を培養する際に、 前記液体培地中における培養原料の使用量を調整することにより、麹菌培養物中に 少なくともダルコアミラーゼと、耐酸性 α—アミラーゼと、植物繊維溶解酵素と、を同 時に生成、蓄積させることを特徴とする、植物繊維溶解酵素が増強された液体麹の 製造方法を提供するものである。

請求項 2に係る本発明は、植物繊維溶解酵素が、セルロース分解酵素及び Ζ又は キシラン分解酵素である、請求項 1に記載の液体麹の製造方法を提供するものであ る。

請求項 3に係る本発明は、麹菌が、白麹菌及び Ζ又は黒麹菌である請求項 1に記 載の液体麹の製造方法を提供するものである。

請求項 4に係る本発明は、培養原料として、表面の全部又は一部が少なくとも穀皮 で覆われた穀類を含む液体培地と、表面が外皮で覆われた豆類及び Ζ又は芋類を 含む液体培地と、細砕や粉砕などの前処理をしな 、アマランサス及び Ζ又はキヌァ を含む液体培地と、から選ばれた少なくとも 1種の液体培地で麹菌を培養する際に、 前記液体培地中における培養原料の使用量を 1. 4〜1. 8% (wZvol)に調整し、か つ、培養条件を 37°C、 42時間とすることにより、麹菌培養物中に少なくともダルコアミ ラーゼと、耐酸性 α—アミラーゼと、植物繊維溶解酵素と、を同時に生成、蓄積させ ることを特徴とする、請求項 1に記載の液体麹の製造方法を提供するものである。

[0030] 請求項 5に係る本発明は、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法により得られ た液体麹を提供するものである。

請求項 6に係る本発明は、請求項 5に記載の液体麹を乾燥処理することを特徴とす る、液体培地を用いた液体麹乾燥品の製造方法を提供するものである。

請求項 7に係る本発明は、請求項 6に記載の方法により得られた液体麹乾燥品を 提供するものである。

請求項 8に係る本発明は、請求項 5に記載の液体麹を用いる酵素製剤の製造方法 を提供するものである。

請求項 9に係る本発明は、請求項 8に記載の方法により得られた酵素製剤を提供 するものである。

請求項 10に係る本発明は、培養原料として、表面の全部又は一部が少なくとも穀 皮で覆われた穀類を含む液体培地と、表面が外皮で覆われた豆類及び Z又は芋類 を含む液体培地と、細砕や粉砕などの前処理をしな!ヽアマランサス及び Z又はキヌ ァを含む液体培地と、カゝら選ばれた少なくとも 1種の液体培地で麹菌を培養する際に 、前記液体培地中における培養原料の使用量を調整することにより、麹菌培養物中 に少なくともダルコアミラーゼと、耐酸性 α—アミラーゼと、植物繊維溶解酵素と、を 同時に生成、蓄積させることを特徴とする、酵素の製造方法を提供するものである。 請求項 11に係る本発明は、植物繊維溶解酵素が、セルロース分解酵素及び Ζ又 はキシラン分解酵素である、請求項 10に記載の酵素の製造方法を提供するものであ る。

請求項 12に係る本発明は、麹菌が、白麹菌及び Ζ又は黒麹菌である請求項 10に 記載の酵素の製造方法を提供するものである。

請求項 13に係る本発明は、培養原料として、表面の全部又は一部が少なくとも穀 皮で覆われた穀類を含む液体培地と、表面が外皮で覆われた豆類及び Ζ又は芋類 を含む液体培地と、細砕や粉砕などの前処理をしな!ヽアマランサス及び Ζ又はキヌ ァを含む液体培地と、カゝら選ばれた少なくとも 1種の液体培地で麹菌を培養する際に 、前記液体培地中における培養原料の使用量を 1. 4〜1. 8% (wZvol)に調整し、 かつ、培養条件を 37°C、 42時間とすることにより、麹菌培養物中に少なくともダルコ アミラーゼと、耐酸性 α—アミラーゼと、植物繊維溶解酵素と、を同時に生成、蓄積さ せることを特徴とする、請求項 10に記載の酵素の製造方法を提供するものである。 請求項 14に係る本発明は、請求項 10〜13のいずれか 1項に記載の方法により得 られた酵素を提供するものである。

[0032] 請求項 15に係る本発明は、請求項 5に記載の液体麹を用いる発酵飲食品の製造 方法である。

請求項 16に係る本発明は、発酵飲食品が、焼酎である、請求項 15に記載の発酵 飲食品の製造方法である。

請求項 17に係る本発明は、請求項 7に記載の液体麹乾燥品を用いる発酵飲食品 の製造方法である。

請求項 18に係る本発明は、請求項 9に記載の酵素製剤を用いる発酵飲食品の製 造方法である。

請求項 19に係る本発明は、請求項 14に記載の酵素を用いる発酵飲食品の製造 方法である。

請求項 20に係る本発明は、請求項 15〜19のいずれか 1項に記載の方法により得 られた発酵飲食品である。

[0033] 請求項 21に係る本発明は、請求項 5に記載の液体麹を用いるエタノールの製造方 法である。

請求項 22に係る本発明は、請求項 7に記載の液体麹乾燥品を用いるエタノールの 製造方法である。

請求項 23に係る本発明は、請求項 9に記載の酵素製剤を用いるエタノールの製造 方法である。

請求項 24に係る本発明は、請求項 14に記載の酵素を用いるエタノールの製造方 法である。

請求項 25に係る本発明は、請求項 21〜24のいずれか 1項に記載の方法により得 られたエタノールである。

発明の効果

[0034] 請求項 1に係る本発明によれば、高価な植物繊維溶解酵素製剤を用いたり、或い は遺伝子組換え菌を使用したりすることなぐしカゝも固体培養ではなく液体培養によ つて、セルロース分解酵素 (セルラーゼ)ゃキシラン分解酵素などの植物繊維溶解酵 素が増強された液体麹を製造することができる。

さらに、請求項 1に係る本発明によれば、そのような植物繊維溶解酵素が増強され た液体麹を用いて、効率よく焼酎などの発酵飲食品を製造する方法が提供される。 請求項 1に係る本発明によれば、例えば発酵飲食品として焼酎を製造する場合、 焼酎モロミの粘度低下が期待でき、作業性を格段に向上させることができる。しかも、 アルコール収量増加などの原料利用率向上も期待でき、焼射など発酵飲食品製造 の更なる効率ィ匕が図られる。

[0035] また、請求項 6に係る本発明によれば、ダルコアミラーゼ、耐酸性 a アミラーゼ、 及び植物繊維溶解酵素活性が高ぐしかもハンドリング性に一層優れた液体麹乾燥 品を製造することができる。

し力も、乾燥品であることから、突発的な製造にもタイムリーに対応できるというメリツ トがある。

さらに、これらの特色を有するため、液体麹乾燥品を用いて、種々の発酵飲食品を 効率的に製造することができる。

例えば、請求項 6に係る本発明により製造した液体麹乾燥品を用いると、未乾燥の 液体麹並びに従来の固体麹を用いた焼酎もろみと同程度の発酵性が得られ、製造 された焼酎は、未乾燥の液体麹並びに固体麹を用いて製造された焼酎と同程度の 品質を有し、官能的にも遜色ないものとなる。

[0036] その上、請求項 21に係る本発明によれば、液体麹を用いた発酵法によるエタノー ルの製造方法が提供される。

この方法によれば、従来の固体麹を用いた発酵法によるエタノールの製造法により 得られるエタノールと同程度の高いアルコール度数のもろみを製造することが可能と なる。従って、このように高いアルコール度数のもろみを製造することにより、スケール の縮小化や省エネルギーに貢献することができる。

請求項 21に係る本発明の方法によれば、アルコール発酵に必要な酵素活性を十 分に有する液体麹を使用して、発酵法により工業用アルコール (エタノール)を効率 よく製造することができる。 図面の簡単な説明

[0037] [図 1]実施例 2における、玄麦使用量の異なる液体麹を用いた麦焼酎製造における 発酵経過を示すグラフである。

[図 2]実施例 2における、玄麦使用量の異なる液体麹を用いた麦焼酎モロミのモロミ 粘度の測定結果を示すグラフである。

[図 3]実施例 4の未乾燥区と乾燥区とにおける、重量減少積算による発酵経過を示す グラフである。

発明を実施するための最良の形態

[0038] 以下、本発明について具体的に説明する。

請求項 1に係る本発明は、植物繊維溶解酵素が増強された液体麹の製造方法に 関し、培養原料として、表面の全部又は一部が少なくとも穀皮で覆われた穀類を含 む液体培地と、表面が外皮で覆われた豆類及び Z又は芋類を含む液体培地と、細 砕や粉砕などの前処理をしないアマランサス及び Z又はキヌァを含む液体培地と、 から選ばれた少なくとも 1種の液体培地で麹菌を培養する際に、前記液体培地中に おける培養原料の使用量を調整することにより、麹菌培養物中に少なくともダルコアミ ラーゼと、耐酸性ひ アミラーゼと、植物繊維溶解酵素と、を同時に生成、蓄積させ ることを特徴とするちのである。

[0039] 請求項 1に係る本発明にお ヽては、培養原料として、表面の全部又は一部が少なく とも穀皮で覆われた穀類を含む液体培地と、表面が外皮で覆われた豆類及び Ζ又 は芋類を含む液体培地と、細砕や粉砕などの前処理をしな ヽアマランサス及び Ζ又 はキヌァを含む液体培地と、力 選ばれた少なくとも 1種の液体培地を用い、このよう な液体培地で麹菌を培養している。そのため、当該穀類等中のでん粉の糖化に時間 がかかり、培養系への糖の放出速度が抑制され、液体麹の酵素活性が増強される。

[0040] 請求項 1に係る本発明にお ヽては、液体麹の培養原料として用いる穀類としては、 大麦、裸麦、米、小麦、そば、ヒェ、ァヮ、キビ、コゥリヤン、トウモロコシ等を挙げること ができる。これらの原料の形状としては、表面の全部又は一部が少なくとも穀皮で覆 われていることが必要であって、未精白物、または少なくとも穀皮が穀粒の表面に残 されて 、る程度までに精白された精白歩合以上のもの等を用いることができ、玄米、 玄麦なども使用できる。米の場合には、玄米は勿論のこと、籾殻が全部付いているも のでもよ 、し、籾殻が一部付 、て 、るものでもよ 、。

例えば、穀類が大麦の場合、未精白の精白歩合 100%のもの、或いは未精白の精 白歩合を 100%とし、この未精白の精白歩合（100%)から大麦の穀皮歩合 (一般的 には 7〜8%)を差し引いた割合、すなわち 92〜93%程度の精白歩合以上のもので ある。

[0041] ここで、精白歩合とは、穀類を精白して残った穀類の割合を言い、例えば精白歩合 90%とは、穀類の表層部の穀皮等を 10%削り取ることを意味する。また、本発明に おいて、玄麦とは、未精白の麦力 穀皮が穀粒の表面に残されている程度までに精 白されたものであり、精白歩合 90%以上のものを含む。また、穀皮とは、穀類の粒の 表面を覆って 、る外側部位のことを言う。

[0042] 請求項 1に係る本発明にお ヽて、液体麹の培養原料として用いる豆類や芋類として は、大豆、小豆、サッマイモ等を挙げることができる。これらの培養原料は、外皮の汚 れを洗い落とすのみで、裁断、粉砕処理などの加工は全く行なわないものである。

[0043] 請求項 1に係る本発明にお 、て、液体麹の培養原料として用いるアマランサスは、 ヒュ科ヒュ属植物の総称で、穀類のなかでは蛋白質含量が高ぐアミノ酸の一つであ るリジンの含量は大豆に匹敵する。また、精白米に比べても、カルシウム、鉄分、繊維 質を多く含む高栄養価穀物であり、原産国は、中南米諸国、インド、ヒマラヤ、ネパー ルの特定地域である。一方、キヌァは、アガサ科の一年草であり、主にペルー南部や ボリビア西部のアンデス山脈などの高地で栽培されており、ミネラル、ビタミン、蛋白 質、食物繊維を豊富に含んでいる。

培養原料のアマランサスとキヌァは、単独で用いてもよぐ或いは組み合わせて用 いてもよい。これらは、細砕や粉砕などの前処理をすることなぐ液体培地の調製に 用いる。

[0044] 上記の培養原料は、単独で、或いは 2種以上を組み合わせて、以下の液体培地の 調製に用いる。

すなわち、上記の培養原料は、水と混合して液体培地を調製する。

[0045] 本発明にお ヽては、この液体培地中における培養原料の使用量を調整することが 必要である。

通常は、ダルコアミラーゼ及び耐酸性 α—アミラーゼがバランスよく生成、蓄積され るのに好適な使用量よりも若干低めの使用量にて、セルロース分解酵素（セルラーゼ )ゃキシラン分解酵素 (キシラナーゼ)などの植物繊維溶解酵素が増強される。

液体培地中における培養原料の使用量は、麹菌の培養中にダルコアミラーゼ及び 耐酸性ひ—アミラーゼが選択的に生成、蓄積されると共に、セルロース分解酵素 (セ ルラーゼ)ゃキシラン分解酵素などの植物繊維溶解酵素が増強される範囲である。

[0046] 具体的には例えば、大麦または裸麦を培養原料とした場合には、水に対して大麦 または裸麦を l〜20% (wZvol)添加した液体培地に調製される。また、無精白の大 麦または裸麦を用いた場合には、さらに好ましくは 8〜10% (w/vol)添カ卩した液体 培地に調製され、 95%精白した大麦または裸麦を原料とした場合には、さらに好まし くは 1〜4% (w/vol)添加した液体培地に調製される。

また、請求項 4に記載したように、培養条件が 37°C、 42時間である場合には、水に 対して大麦または裸麦を 1. 4〜1. 8% (wZvol)、好ましくは 1. 4〜1. 7% (w/vol )添加した液体培地に調製される。無精白の大麦または裸麦を用いた場合や、 95% 精白した大麦または裸麦を原料とした場合も同様である。

[0047] 次に、籾殻を除いた玄米を培養原料とした場合には、水に対して玄米を 1〜20% ( w/vol)、好ましくは 5〜 13% (w/vol)、より好ましくは 8〜 10% (w/vol)を添カロし た液体培地に調製される。

[0048] 豆類を培養原料とした場合には、水に対して豆類を 1〜10% (w/vol)、好ましくは 大豆であれば 8〜10% (w/vol)、小豆であれば 1〜2% (w/vol)添加した液体培 地に調製される。また、芋類を培養原料とした場合には、水に対して芋類を 1〜10% (w/vol)添加した液体培地に調製される。

[0049] また、例えば、アマランサスを培養原料とした場合は、水に対して 1. 5〜15% (wZ vol)、好ましくは 2〜 10% (w/vol)、より好ましくは 2〜8% (w/vol)を添カ卩した液 体培地に調製される。一方、キヌァの場合は、水に対して 1. 5〜7% (wZvol)、好ま しくは 2〜6% (w/vol)、より好ましくは 2〜4% (w/vol)を添カ卩した液体培地に調 製される。 [0050] さらに、使用する培養原料の種類や培養原料の精白度等によって、最適な配合使 用量は異なるので、適宜選択すればよい。

[0051] 上記範囲内の培養原料を添加した液体培地で麹菌を培養すると、焼酎などの発酵 飲食品製造に使用するのに十分な酵素活性 (ダルコアミラーゼ及び耐酸性 α—アミ ラーゼ活性)を有すると同時に、セルロース分解酵素 (セルラーゼ)ゃキシラン分解酵 素 (キシラナーゼ)などの植物繊維溶解酵素が増強された液体麹が製造される。

[0052] なお、培養原料の使用量が上限値を超えると、セルロース分解酵素（セルラーゼ） ゃキシラン分解酵素 (キシラナーゼ)などの植物繊維溶解酵素が増強された液体麹 を得ることができない。さらに、培養液の粘性が高くなり、麹菌を好気培養するために 必要な酸素や空気の供給が不十分となり、培養物中の酸素濃度が低下して、培養が 進み難くなるので好ましくない。一方、培養原料の使用量が下限値に満たないと、目 的とする酵素が高生産されな 、。

[0053] 上記原料に含まれるでん粉は、培養前に予め糊化してぉ 、てもよ 、。でん粉の糊 化方法については特に限定はなぐ蒸きよう法、焙炒法等、常法に従って行なえばよ い。後述する液体培地の殺菌工程において、高温高圧滅菌等により、でん粉の糊化 温度以上に加熱する場合は、この処理によりでん粉の糊ィ匕も同時に行なわれる。

[0054] 液体培地には、前述の原料の他に、栄養源として有機物、無機塩等を適宜添加す るのが好ましい。

これらの添加物は、麹菌の培養に一般に使用されているものであれば特に限定は ないが、有機物としては米糠、小麦麩、コーンスティープリカ一、大豆粕、脱脂大豆等 を、無機塩としてはアンモ-ゥム塩、硝酸塩、カリウム塩、酸性リン酸塩、カルシウム塩 、マグネシウム塩等の水溶性の化合物を挙げることができ、 2種類以上の有機物及び Ζ又は無機塩を同時に使用してもよい。これらの添加量は、麹菌の増殖を促進する 程度であれば特に限定はないが、有機物としては 0. l〜5% (wZvol)程度、無機塩 としては 0. 1〜1% (wZvol)程度添加するのが好ましい。

このようにして得られる麹菌の液体培地は、必要に応じて滅菌処理を行なってもよく 、処理方法には特に限定はない。例としては、高温高圧滅菌法を挙げることができ、 121°Cで 15分間行なえばよ!、。 [0055] 滅菌した液体培地を培養温度まで冷却後、麹菌を液体培地に接種する。

請求項 1に係る本発明で用いる麹菌は、糖質分解酵素生産能を有する麹菌、好ま しくはダルコアミラーゼ生産能、耐酸性 α アミラーゼ生産能を有する麹菌であり、例 えば、ァスペルギルス'カヮチ（Aspergillus kawachii)等に代表される白麹菌、ァスぺ ノレ arルス ·ァヮモリ (Aspergillus awamori)ゃァスヘル = ルス ·二 7J一 (Aspergillus niger )等に代表される黒麹菌、ァスペルギルス'オリーゼ (Aspergillus oryzae)ゃァスペル ギルス ·ソーャ（Aspergillus sojae)等に代表される黄麹菌などが挙げられる。

なお、白麹菌、黒麹菌及び黄麹菌は、それぞれ単独で用いてもよいし、或いは両 者を併用してもよい。好ましくは、白麹菌と黒麹菌をそれぞれ単独或いは両者を併用 する。

[0056] これらの麹菌は、一種類の菌株による培養、又は同種若しくは異種の二種類以上 の菌株による混合培養のどちらでも用いることができる。これらは、胞子又は前培養 により得られる菌糸のどちらの形態のものを用いても問題はないが、菌糸を用いる方 が対数増殖期に要する時間が短くなるので好ましい。麹菌の液体培地への接種量に は特に制限はないが、液体培地 lml当り、胞子であれば 1 X 10⁴〜1 X 10⁶個程度、 菌糸であれば前培養液を 0. 1〜10%程度接種することが好ましい。

[0057] 麹菌の培養温度は、生育に影響を及ぼさない限りであれば特に限定はないが、好 ましくは 25〜45°C、より好ましくは 30〜40°Cで行なうのがよい。培養温度が低いと麹 菌の増殖が遅くなるため雑菌による汚染が起きやすくなる。培養時間は 24〜72時間 で培養するのが好ましい。

培養装置は液体培養を行なうことができるものであればょ ヽが、麹菌は好気培養を 行なう必要があるので、酸素や空気を培地中に供給できる好気的条件下で行なう必 要がある。また、培養中は培地中の原料、酸素、及び麹菌が装置内に均一に分布す るように撹拌をするのが好ましい。撹拌条件や通気量については、培養環境を好気 的に保つことができる条件であればいかなる条件でもよぐ培養装置、培地の粘度等 により適宜選択すればよい。

[0058] 上記の培養法で培養することにより、ダルコアミラーゼ、及び耐酸性 a アミラーゼ の酵素が同時にバランスよく生成され、し力も同時にセルロース分解酵素（セルラー ゼ)ゃキシラン分解酵素などの植物繊維溶解酵素が増強された液体麹が得られる。 尚、本発明において液体麹とは、培養したそのものの他に、培養物を遠心分離等 することにより得られる培養液、それらの濃縮物又はそれらの乾燥物等も包含するも のとする。

[0059] 上述の通り、上記の培養法によれば、ダルコアミラーゼ、耐酸性 a アミラーゼ、セ ルロース分解酵素、及びキシラン分解酵素などの酵素を高生産することができる。 したがって、請求項 10に記載の酵素の製造方法は、上記した液体麹の製造方法と 同様である。

[0060] 請求項 1に係る本発明の方法により、請求項 5に記載の液体麹を製造することがで きる。

請求項 1に係る本発明の製造法で得られた請求項 5に記載の液体麹は、請求項 1 5に記載したように、発酵飲食品（例えば、焼酎、清酒、しょうゆ、みそ、みりん等）の製 造に好適に用いることができる。

例えば、請求項 16に記載したような焼酎を製造する場合には、もろみ仕込み段階 において、清酒を製造する場合には、酒母や各もろみ仕込み段階において、醤油を 製造する場合には、盛り込みの段階において、味噌を製造する場合には、仕込み段 階において、みりんを製造する場合は、仕込み段階において、液体麹を固体麹の代 わりに用いることができる。

[0061] また、上記した液体麹を用いて発酵飲食品を製造する場合には、基本的に全工程 を液相で行なうことができる。全工程を液相で行なう発酵飲食品の製造方法としては 、例えば、焼酎を製造する場合には、トウモロコシ、麦、米、いも、さとうきび等を掛け 原料に用い、該原料を約 80°Cの高温で耐熱性酵素剤を使用して溶力して液ィ匕した 後、これに上記した液体麹、及び酵母を添加することでアルコール発酵させたもろみ を、常圧蒸留法又は減圧蒸留法等により蒸留して製造する方法が挙げられる。

[0062] 請求項 1に係る本発明の方法で得られた液体麹は、その高い酵素活性から、酵素 製剤、並びに消化剤などの医薬品等としての利用も可能である。この場合、得られた 麹菌培養物を所望の程度に濃縮'精製し、適当な賦形剤、増粘剤、甘味料などを添 加して常法により添加すればよい。 [0063] 請求項 6に記載の本発明は、上記のようにして得られた液体麹を乾燥処理すること を特徴とする、液体麹乾燥品の製造方法を提供するものである。

乾燥処理法としては、凍結乾燥が好ましぐ特に酵素失活がほとんど起こらないこと から、真空凍結乾燥がより好ましい。真空凍結乾燥は常法により行えばよい。真空凍 結乾燥の条件は、特に限定されるものではないが、通常は、 10〜一 40°Cの温度 にて 1〜6時間予備凍結した後、 5〜30°Cにて、真空度 lTorr以下、好ましくは 0. 7 Torr以下にて、 10〜30時間乾燥すればよい。

[0064] このようにして目的とする液体麹乾燥品を製造することができる。

請求項 6に係る本発明の製造方法で得られた請求項 7に記載の液体麹乾燥品は、 請求項 17に記載したように、発酵飲食品の製造に好適に用いることができる。

例えば、清酒を製造する場合には、酒母や各もろみ仕込み段階において、焼酎を 製造する場合には、もろみ仕込み段階において、醤油を製造する場合には、盛り込 みの段階において、味噌を製造する場合には、仕込み段階において、みりんを製造 する場合は、仕込み段階において、液体麹乾燥品を固体麹や液体麹の代わりに用 いることがでさる。

[0065] なお、液体麹乾燥品を用いて発酵飲食品を製造する場合には、そのまま酵素剤的 に液体麹乾燥品を用いてもよいし、或いは蒸麦や酵母菌体と液体麹とを予め混合し た後に乾燥したものを用いてもよいし、さらには乾燥したこれら各種原料を混合し製 剤化したものを用いることもできる。このように一種キットィ匕しておくと、汲水を添加す るだけで、焼酎などの発酵飲食品が製造可能な、簡易なスターターとなる。

[0066] 上記した液体麹乾燥品を用いて発酵飲食品を製造する場合には、基本的に全ェ 程を液相で行なうことができる。全工程を液相で行なう発酵飲食品の製造方法として は、例えば、焼酎を製造する場合には、トウモロコシ、麦、米、いも、さとうきび等を掛 け原料に用い、該原料を約 80°Cの高温で耐熱性酵素剤を使用して溶力して液ィ匕し た後、これに上記した液体麹乾燥品、及び酵母を添加することでアルコール発酵さ せたもろみを、常圧蒸留法又は減圧蒸留法等により蒸留して製造する方法が挙げら れる。

[0067] また、上記の製造方法で得られた液体麹は、請求項 21に記載の本発明に係る発 酵法によるエタノールの製造に用いられる。エタノールの製造にあたり、固体麹の代 わりに当該液体麹を用いること以外は、既知の工業用アルコール (エタノール)の製 造方法に従って工業用アルコール (エタノール)を製造することができる。

[0068] 発酵法によるエタノールの製造法の一例を以下に示す。

エタノールの製造に用いられる原料としては、デンプン質原料であればよぐ大麦、 裸麦、米、小麦、そば、ヒェ、ァヮ、キビ、コゥリヤン、トウモロコシ等の穀類;サッマイモ

(甘藷)、キヤッサバ等の芋類;などを挙げることができる。

[0069] 発酵法によるエタノールの製造は、例えば低温連続蒸煮装置等の連続蒸煮装置な どを用いて行うことができ、まず前記液体麹に、焼酎用酵母などのエタノール生産能 を有する酵母、上記原料、さらに水を加えて仕込みを行う。必要に応じて乳酸を用い ることちでさる。

仕込み後は、低温で蒸煮した後、 20〜30°C程度の温度で発酵させ、一次仕込み 後、二次仕込みを行うことができる。

[0070] 請求項 21に記載の本発明の場合、酵素剤を使用せず、液体麹のみを用いている にもかかわらず、発酵終了したもろみは、 18〜20%という高いアルコール度数のもの となっている。

発酵終了したもろみを精密蒸留機などの蒸留機、好ましくは連続蒸留機にて蒸留 して不純物を除き濃縮することにより、 95%以上の高品質工業用アルコール (ェタノ ール)を製造することができる。

請求項 21に記載の本発明においては、発酵終了時のもろみが既に 18〜20%とい ぅ高 、アルコール度数を有して!/、ることから、スケールの縮小化や省エネルギー効果 を得ることができる。

[0071] 以下、本発明を実施例によってより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例 に限定されるものではない。

実施例

[0072] 実施例 1 (植物繊維溶解酵素が増強された麹菌培養物 (液体麹)の製造）

(I)麹菌培養物 (液体麹)の製造

1)前培養方法； 65%精白麦 (オーストラリア産スターリング種) 8gと水 100mlを 500ml ノ ッフル付三角フラスコに張り込み、 121°C、 15分間オートクレーブ滅菌を行って、前 培養培地とした。この前培養培地に白麹菌 [ァスペルギルス'カヮチ（Aspergillus kaw achii ) NBRC4308]胞子を 1 X 10⁶個 Zmlになるように植菌し、 37°C、 24時間、 lOOrpm で振とう培養することにより、前培養液を得た。

[0073] 2)本培養方法；玄麦 [95%精白麦 (オーストラリア産スターリング種) ]を、表 1に示す ように 2.0、 1.9、 1.8、 1.7、 1.6、 1.5、 1.4% (w/vol)の割合で、それぞれ硝酸カリウム 0.2 % (w/vol)、リン酸 2水素カリウム 0.3% (w/vol)を添カ卩した水に加えて、 7種類の液体 培地を調製した。

それぞれの液体培地につ!、て、調製した液体培地 3000mlを容量 5000mlのジャーフ アーメンター（丸菱バイオェンジ製）に張り込み、 121°C、 15分間オートクレープ滅菌し て本培養培地とした。この本培養培地へ、上記の前培養液を 30ml接種した。

その後、温度 37°C、攪拌速度 300rpm、通気量 0.5wmにて 42時間培養を行い、麹菌 培養物 (液体麹)を得た。

[0074] (Π)酵素活性の測定

前記 (I)で得られた麹菌培養物 (液体麹）につ 、て、ダルコアミラーゼ (GA)、耐酸 性 (X アミラーゼ (ASAA)、セルラーゼ（CEL)、キシラナーゼ（XYL)の生成量を測定 した。表 1に、玄麦の使用量別の液体培地で培養して得られた麹菌培養物 (液体麹） のダルコアミラーゼ（GA)、及び而酸性 a アミラーゼ (ASAA)、セルラーゼ（CEL)、 キシラナーゼ (XYL)の生成量を示した。

[0075] 尚、ダルコアミラーゼ (GA)の酵素活性の測定には、糖ィ匕カ分別定量キット（キッコ 一マン製)を用いた。また、耐酸性 α アミラーゼ (ASAA)の酵素活性の測定は、「Su do S. et al: J. Ferment. Bioeng., 76,105-110(1993)、 Sudo b. et al: J. Ferment. Bioe ng., 77, 483-489(1994)、須藤茂俊ら：日本醸造協会誌.， 89, 768-774(1994)」に記載 の方法を若干改良し、培養物を酸処理することで非耐酸性 α アミラーゼを失活さ せた後、 a アミラーゼ測定キット (キッコーマン製)を用いて耐酸性 α—アミラーゼ を測定した。より具体的には、培養液 lmlに 9mlの lOOmM酢酸緩衝液 (ρΗ3)を添加し 、 37°Cで 1時間酸処理を行なった後に、 a アミラーゼ測定キット（キッコーマン製)を 用いて測定した。 [0076] また、植物繊維溶解酵素として、セルラーゼ活性とキシラナーゼ活性を測定した。 まず、セルラーゼ活性（CEL)は、カルボキシメチルセルロース（以下、 CMCと略）を 基質とした酵素加水分解により生成する還元糖を DNS (3,5—ジニトロサリチル酸)と 反応させ、 540應の吸光度の増加で定量する方法により測定した。より具体的には、 1%CMC基質溶液（シグマ社製 low viscosityを lOOmM酢酸緩衝液 (pH5)に溶解） lml に培養液 lmlをカ卩えて、 40°Cにて正確に 10分間酵素反応を行なわせた後、 DNS試薬 (ジニトロサリチル酸 0.75%、水酸ィ匕ナトリウム 1.2%、酒石酸ナトリウムカリウム 4水和 物 22.5%、乳糖 1水和物 0.3%を含む) 4mlを加えてよく混合し、反応を停止した。反 応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で 15分 間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した後、 540nmの吸光度を測定することで グルコースに相当する還元糖量として定量した。 1単位のセルラーゼ活性 (CEL)は、 1分間に 1 μ molのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。 1単 位のセルラーゼ活性は、 40°C、 10分間の反応条件下で、 1分間に 1 molのダルコ一 スに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。

[0077] 次に、キシラナーゼ活性 (XYL)は、 oat spelts由来のキシランを基質とした酵素加水 分解により生成した還元糖を DNSと反応させ、 540nmの吸光度の増加で定量した。よ り具体的には 1%キシラン基質溶液 [シグマ社製 Xylan,from oat speltsを 200mM酢酸 緩衝液 (PH4.5)に溶解] 1.9mlに培養液 0.1mlをカ卩えて、 40°Cにて正確に 10分間酵 素反応を行なわせた後、 DNS試薬 (ジニトロサリチル酸 0.75%、水酸ィ匕ナトリウム 1.2% 、酒石酸ナトリウムカリウム 4水和物 22.5%、乳糖 1水和物 0.3%を含む) 4mlをカ卩えてよ く混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応 停止液を沸騰水浴中で 15分間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した後、 540η mの吸光度を測定することでキシロースに相当する還元糖量として定量した。 1単位 のキシラナーゼ活性は、 40°C、 10分間の反応条件下で、 1分間に 1 molのキシロー スに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。

[0078] 表 1に示すように、玄麦の使用量に従って、各種酵素の生成バランスが変化するこ とがわかった。特にセルラーゼ (CEL)ゃキシラナーゼ (XYL)は、玄麦使用量 1.8%以 下の試験区で顕著に増加する傾向にあることを見出した。特に、 1.7%試験区では、 ダルコアミラーゼ (GA)、耐酸性 a—アミラーゼ (ASAA)もバランスよく高生産させなが ら、セルラーゼ (CEL)、キシラナーゼ (XYL)もバランスよく生成していた。

このように、玄麦使用量を微調整することで、ダルコアミラーゼ (GA)、耐酸性 a—ァ ミラーゼ (ASAA)以外の酵素、特にセルラーゼ（CEL)、キシラナーゼ (XYL)などの植 物繊維溶解酵素を増強できることが示された。

[0079] [表 1]

[0080] 実施例 2 (植物繊維溶解酵素が増強された麹菌培養物 (液体麹)を用いたアルコー ル発酵）

実施例 1において、玄麦を 2.0% (w/vol) 1.7% (w/vol)、 1.4% (w/vol)加えて調製 した液体培地で培養して得られた麹菌培養物 (液体麹)を用いてアルコール発酵を 行った。

すなわち、実施例 1における玄麦を、それぞれ対照区 ;2.0% (w/vol)、本発明 1区； 1.7% (w/vol)、本発明 2区； 1.4% (w/vol)添カ卩して調製された液体培地で培養して 得られた麹菌培養物（液体麹）の 70mlを用いて、表 2に示した仕込み配合にて、総麦 184.6gの仕込みを行ない、発酵温度を 25°Cに保ち、一次仕込み 5日間、二次仕込み 2日間、三次仕込み 13日間の三段仕込みを行なった。

尚、掛け麦としては、オーストラリア産スターリング種を 65%精白したものを水で洗浄 後、 60分間浸漬、水切り 30分間行なった後、 35分間蒸きようしたものを用いた。また、 一次仕込みにおいて、掛麦 42.4gを仕込んだ。なお、酵母は焼酎酵母 (鹿児島酵母） を用い、 YPD培地で 30°C、 48時間静置培養したものを 50 μ L植菌した。

[0081] [表 2]

[0082] その発酵経過を図 1に示した。各試験区とも発酵経過は順調であつたが、特に各種 酵素がバランスよく生成された 1.7%使用区の発酵が旺盛であった。得られた最終モ ロミのアルコール度数は、 2.0%使用区 (対照区）が 18.0%、 1.7%使用区 (本発明 1) が 19.2%、 1.4%使用区 (本発明 2)が 18.6%であり、 1.7%使用区 (本発明 1)で高！、ァ ルコール収量となった。

また、熟成モロミの粘度を回転式粘度計にて測定した結果を図 2に示した。図 2から 明らかなように、セルラーゼ (CEL)ゃキシラナーゼ (XYL)が増強された 1.7%使用区（ 本発明 1)や 1.4%使用区 (本発明 2)では、 2.0%使用区 (対照区）に比べて、粘度が 顕著に低下していた。これは、原料である大麦に大量に含まれる植物繊維素力 セ ルラーゼ (CEL)ゃキシラナーゼ (XYL)の作用により分解されたことに起因すると推察 された。モロミの粘度低下は、モロミの流動性向上や、送液の容易化、蒸留作業の効 率ィ匕など大きな効果をもたらすと考えられる。

[0083] 以上の結果より、培養原料として、表面の全部又は一部が少なくとも穀皮で覆われ た穀類等を含む液体培地で麹菌を培養する際に、前記原料の使用量を調整するこ とにより、麹菌培養物中に少なくともダルコアミラーゼ、耐酸性 α—アミラーゼと共に、 セルラーゼ (CEL)ゃキシラナーゼ (XYL)などの植物繊維溶解酵素を同時に生成、 蓄積させることが可能なことが明らとなった。これら植物組織溶解酵素が増強された 麹菌培養物（液体麹）を用いてアルコール発酵を行なうと、アルコール取得量が向上 するばかりか、モロミの粘度も低下することが示され、製造作業の大幅な効率化の可 能性が広がった。 引き続き、これらのモロミを用いて単式蒸留を行えば麦焼酎を製造することが可能 であるし、連続蒸留を行えば工業アルコール (エタノール)を容易に回収することがで きる。

[0084] 実施例 3 (麹菌培養物乾燥品の製造）

(I)麹菌培養物 (液体麹)の製造

1)前培養方法； 65%精白麦 (オーストラリア産スターリング種) 8gと水 100mlを 500ml ノ ッフル付三角フラスコに張り込み、 121°C、 15分間オートクレーブ滅菌を行って、前 培養培地とした。この前培養培地に白麹菌 [ァスペルギルス'カヮチ（Aspergillus kaw achii ) NBRC4308]を分生子数が 1 X 10⁶個 Zmlになるように植菌し、 37°C、 24時間、 1 OOrpmで振とう培養することにより、前培養液を得た。

[0085] 2)本培養方法; 98%精白麦 (オーストラリア産スターリング種) 2.0% (w/vol)、硝酸 カリウム 0.2% (w/vol)、リン酸二水素カリウム 0.3% (w/vol)の液体培地 3000mlを調製 し、容量 5000mlのジャーフアーメンター（丸菱バイオェンジ製）に張り込み、 121°C、 15 分間オートクレープ滅菌して本培養培地とした。この本培養培地へ上記の前培養液 を 30ml接種した。その後、温度 37°C、攪拌速度 300rpm、通気量 0.5wmにて 42時間培 養を行!ヽ、麹菌培養物 (液体麹)を得た。

[0086] (Π)麹菌培養物 (液体麹)乾燥品の製造

前記 (I)で得られた麹菌培養物 (液体麹) 200mlを- 30°Cで 2時間予備凍結後、 25°C 、真空度 0.5Torrにて 24時間乾燥することにより、麹菌培養物 (液体麹)乾燥品 (麹菌 培養物真空凍結乾燥品) 2.7gを得た。

[0087] (III)酵素活性の測定

前記 (I)で得られた未乾燥の麹菌培養物 (液体麹）（未乾燥品）と前記 (II)で得られ た麹菌培養物 (液体麹)乾燥品（乾燥品）とにっ ヽて、ダルコアミラーゼ (GA)と耐酸 性 a アミラーゼ (ASAA)の生成量を測定した。

尚、ダルコアミラーゼの酵素活性の測定には、糖ィ匕カ分別定量キット（キッコーマン 製)を用いた。また、耐酸性 α アミラーゼの酵素活性の測定は、 rsudo S. et al :J. F erment. Bioeng., 76, 105—110(1993)、 Sudo S. et al :J. Ferment. Bioeng., 77, 483—48 9(1994)、須藤茂俊ら：日本醸造協会誌， 89, 768-774(1994)」に記載の方法を若干改 良し、培養物を酸処理することで非耐酸性 α アミラーゼを失活させた後、ひ—アミ ラーゼ測定キット (キッコーマン製)を用いて耐酸性 a—アミラーゼ活性を測定した。 より具体的には、培養液 lmlに 9mlの lOOmM酢酸緩衝液 (pH3)を添加して 37°Cで 1時間酸処理を行なった後に、 a アミラーゼ測定キット (キッコーマン製)を用いて 測定した。

また、麹菌培養物 (液体麹)乾燥品 (乾燥品)の酵素活性測定は、麹菌培養物 (液 体麹）乾燥品（乾燥品） 270mgを 10mM酢酸緩衝液 (pH5) 20mlに溶解したものを用い て測定した。

[0088] 前記 (I)で得られた未乾燥品と前記 (Π)で得られた乾燥品の酵素活性測定結果を 以下の表 3に示す。

表 3によれば、凍結乾燥しても酵素失活は殆ど起こらず、焼酎仕込みにも充分に使 用可能であることが示された。

[0089] [表 3]

[0090] 実施例 4 (麹菌培養物 (液体麹）を用いたアルコール発酵）

実施例 3において得られた未乾燥品と乾燥品とをそれぞれ用いてアルコール発酵 を行った (それぞれ未乾燥区と乾燥区)。

[0091] すなわち、実施例 3にお 、て得られた未乾燥品 100ml又は乾燥品 1.35gを用 、て、 表 4又は表 5に示した仕込み配合にて、総麦 3.7gの仕込みを行った。発酵温度は 25 °Cに保ち、一次仕込み 4日間、二次仕込み 17日間の二段仕込みを行った。

なお、掛け麦としては、オーストラリア産スターリング種を 65%精白したものを水で洗 浄後、 60分間浸潰し、水切り 30分間行った後、 35分間蒸きようしたものを用いた。酵 母は、焼酎酵母 (鹿児島酵母)を用い、 YPD培地で 30°C、 48時間静置培養したものを 50 μ L植菌した。

[0092] [表 4] 未乾燥区 （未乾燥品仕込み）

一次仕込み 二次仕込み Λ =4- 掛け麦 ( g ) 100 207 307 汲水 (ml ) 50 279 329 未乾燥品 （m l ) 100 100 醸造用乳酸 （ml ) 0. 2 0. 2

[表 5] 乾燥区 （乾燥品仕込み）

一次仕込み 二次仕込み Η 1 掛け麦 ( g ) 100 207 307 汲水 (ml ) 150 279 429 乾燥品 （g ) 1. 35 1. 35 醸造用乳酸 （ml ) 0. 2 0. 2

[0094] 未乾燥区と乾燥区とにおける、重量減少積算によるもろみ発酵経過を図 3に示す。

その結果、図 3から明らかなように、未乾燥区である未乾燥品仕込みと、乾燥区で ある乾燥品仕込みとで、発酵経過に差は殆ど認められな力 た。

また、得られた最終もろみのアルコール度数は、未乾燥区 19.6%、乾燥区 19.4%で あり、両試験区とも良好に発酵した。

[0095] 実施例 5 (玄米麹菌培養物 (液体麹)を用いたエタノールの製造）

(I)玄米麹菌培養物 (液体麹)の製造

1)前培養方法； 90%精白米（こしひかり） 8gと水 100mlを 500mlバッフル付三角フラス コに張り込み、 121°C、 15分間オートクレープ滅菌を行って、前培養培地とした。この 前培養培地に白麹菌 [ァスペルギルス ·カヮチ（Aspergillus kawachii) NBRC4308]を 分生子数力 SI X 10⁶個 Zmlになるように植菌し、 37°C、 24時間、 lOOrpmで振とう培養す ることにより、前培養液を得た。

[0096] 2)本培養方法；籾殻のみを取り除いた玄米（こしひかり） 8g、 KNO 0.2g、 KH PO 0.

3 2 4

3gと水 100mlを 500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、 121°C、 15分間オートクレー ブ滅菌して本培養培地とした (5本準備した)。この本培養培地へ上記の前培養液を lmlずつ植菌し、 37°C、 72時間、 lOOrpmで振とう培養して、玄米麹菌培養物（液体麹) を得た。

[0097] 得られた玄米麹菌培養物 (液体麹)の酵素活性を以下の表 6に示す。

表 6によれば、得られた玄米麹菌培養物 (液体麹）は、ダルコアミラーゼ活性、耐酸 性 α アミラーゼ活性、共に良好であることが分かる。

[0098] [表 6]

[0099] (Π)仕込み'発酵

仕込み配合は表 7の通りとした。酵母は、焼酎用酵母 (鹿児島酵母)を 10mlの YPD 培地にて 30°Cで 1日間培養した後、培養液 lmlを遠心分離し、沈殿した酵母を 2回滅 菌水で洗浄し、回収した酵母全量を用いた。

連続蒸煮装置を用い、これに前記 (I)で得られた玄米麹菌培養物 (液体麹)、上記 酵母、掛米 (こしひかりの白米）、 90%乳酸及び水を投入した。発酵条件は、 25°C— 定とし、 16日間発酵させた。一次仕込み 3日後、二次仕込みを行った。

[0100] [表 7]

[0101] 上記のようにして得られた、発酵終了後の玄米麹菌培養物 (液体麹)仕込みのもろ みのアルコール度数は 19. 1%であった。

[0102] (III)工業用アルコール（エタノール）の製造

上記 (Π)で得られた、発酵終了後の玄米麹菌培養物 (液体麹)仕込みのもろみを、 精密蒸留機 (柴田科学株式会社製、 HP— 1000T特型）にて連続蒸留し、工業用ァ ルコール（エタノール）を回収した。

得られた工業用アルコール（エタノール）のアルコール度数は 95. 3%であった。

[0103] さらに、上記麹菌培養物 (液体麹)の原料として玄麦を用いた麹菌培養物 (液体麹) を使用した場合にも、同様に高いアルコール度数のもろみを製造することができ、そ の結果、品質的に全く問題のない工業用アルコール (エタノール)を製造することが できた。

[0104] 以上から、本発明によれば、麹菌培養物 (液体麹)を用いて工業用アルコール (ェ タノール)を製造することが可能であることが明らかとなつた。

産業上の利用可能性

[0105] 請求項 1に係る本発明によれば、高価な植物繊維溶解酵素製剤を用いたり、或い は遺伝子組換え菌を使用したりすることなぐしカゝも固体培養ではなく液体培養によ つて、セルロース分解酵素 (セルラーゼ)ゃキシラン分解酵素などの植物繊維溶解酵 素が増強された液体麹を製造することができる。

また、請求項 6に係る本発明によれば、ダルコアミラーゼ、耐酸性 α—アミラーゼ、 及び植物繊維溶解酵素活性が高ぐしかもハンドリング性に一層優れた液体麹乾燥 品を製造することができる。し力も、乾燥品であることから、突発的な製造にもタイムリ 一に対応できるというメリットがある。

請求項 21に係る本発明の方法によれば、アルコール発酵に必要な酵素活性を十 分に有する液体麹を使用して、発酵法により工業用アルコール (エタノール)を効率 よく製造することができる。

従って、本発明は、飲食品製造分野や、化学工業分野、さらにはエネルギー産業 分野などにおいて有効に利用することが期待される。

Claims

請求の範囲

[1] 培養原料として、表面の全部又は一部が少なくとも穀皮で覆われた穀類を含む液 体培地と、表面が外皮で覆われた豆類及び Z又は芋類を含む液体培地と、細砕や 粉砕などの前処理をしな!、アマランサス及び Z又はキヌァを含む液体培地と、力も選 ばれた少なくとも 1種の液体培地で麹菌を培養する際に、前記液体培地中における 培養原料の使用量を調整することにより、麹菌培養物中に少なくともダルコアミラーゼ と、耐酸性ひ アミラーゼと、植物繊維溶解酵素と、を同時に生成、蓄積させることを 特徴とする、植物繊維溶解酵素が増強された液体麹の製造方法。

[2] 植物繊維溶解酵素が、セルロース分解酵素及び Ζ又はキシラン分解酵素である、 請求項 1に記載の液体麹の製造方法。

[3] 麹菌が、白麹菌及び Ζ又は黒麹菌である請求項 1に記載の液体麹の製造方法。

[4] 培養原料として、表面の全部又は一部が少なくとも穀皮で覆われた穀類を含む液 体培地と、表面が外皮で覆われた豆類及び Ζ又は芋類を含む液体培地と、細砕や 粉砕などの前処理をしな!、アマランサス及び Ζ又はキヌァを含む液体培地と、力も選 ばれた少なくとも 1種の液体培地で麹菌を培養する際に、前記液体培地中における 培養原料の使用量を 1. 4〜1. 8% (w/vol)に調整し、かつ、培養条件を 37°C、 42 時間とすることにより、麹菌培養物中に少なくともダルコアミラーゼと、耐酸性 α アミ ラーゼと、植物繊維溶解酵素と、を同時に生成、蓄積させることを特徴とする、請求項 1に記載の液体麹の製造方法。

[5] 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法により得られた液体麹。

[6] 請求項 5に記載の液体麹を乾燥処理することを特徴とする、液体培地を用いた液 体麹乾燥品の製造方法。

[7] 請求項 6に記載の方法により得られた液体麹乾燥品。

[8] 請求項 5に記載の液体麹を用いる酵素製剤の製造方法。

[9] 請求項 8に記載の方法により得られた酵素製剤。

[10] 培養原料として、表面の全部又は一部が少なくとも穀皮で覆われた穀類を含む液 体培地と、表面が外皮で覆われた豆類及び Ζ又は芋類を含む液体培地と、細砕や 粉砕などの前処理をしな!、アマランサス及び Ζ又はキヌァを含む液体培地と、力も選 ばれた少なくとも 1種の液体培地で麹菌を培養する際に、前記液体培地中における 培養原料の使用量を調整することにより、麹菌培養物中に少なくともダルコアミラーゼ と、耐酸性 α—アミラーゼと、植物繊維溶解酵素と、を同時に生成、蓄積させることを 特徴とする、酵素の製造方法。

[11] 植物繊維溶解酵素が、セルロース分解酵素及び Ζ又はキシラン分解酵素である、 請求項 10に記載の酵素の製造方法。

[12] 麹菌が、白麹菌及び Ζ又は黒麹菌である請求項 10に記載の酵素の製造方法。

[13] 培養原料として、表面の全部又は一部が少なくとも穀皮で覆われた穀類を含む液 体培地と、表面が外皮で覆われた豆類及び Ζ又は芋類を含む液体培地と、細砕や 粉砕などの前処理をしな!、アマランサス及び Ζ又はキヌァを含む液体培地と、力も選 ばれた少なくとも 1種の液体培地で麹菌を培養する際に、前記液体培地中における 培養原料の使用量を 1. 4〜1. 8% (w/vol)に調整し、かつ、培養条件を 37°C、 42 時間とすることにより、麹菌培養物中に少なくともダルコアミラーゼと、耐酸性 α—アミ ラーゼと、植物繊維溶解酵素と、を同時に生成、蓄積させることを特徴とする、請求項 10に記載の酵素の製造方法。

[14] 請求項 10〜13のいずれか 1項に記載の方法により得られた酵素。

[15] 請求項 5に記載の液体麹を用いる発酵飲食品の製造方法。

[16] 発酵飲食品が、焼酎である、請求項 15に記載の発酵飲食品の製造方法。

[17] 請求項 7に記載の液体麹乾燥品を用いる発酵飲食品の製造方法。

[18] 請求項 9に記載の酵素製剤を用いる発酵飲食品の製造方法。

[19] 請求項 14に記載の酵素を用いる発酵飲食品の製造方法。

[20] 請求項 15〜19のいずれか 1項に記載の方法により得られた発酵飲食品。

[21] 請求項 5に記載の液体麹を用いるエタノールの製造方法。

[22] 請求項 7に記載の液体麹乾燥品を用いるエタノールの製造方法。

[23] 請求項 9に記載の酵素製剤を用いるエタノールの製造方法。

[24] 請求項 14に記載の酵素を用いるエタノールの製造方法。

[25] 請求項 21〜24のいずれ力 1項に記載の方法により得られたエタノール。