ES2451648T3 - Procedimiento de producción de koji liquido que tiene enzima digestiva de fibra vegetal potenciada, koji líquido producido por el procedimiento y uso del koji líquido - Google Patents

Procedimiento de producción de koji liquido que tiene enzima digestiva de fibra vegetal potenciada, koji líquido producido por el procedimiento y uso del koji líquido Download PDF

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Abstract

Un procedimiento de producción de koji líquido que tiene actividad potenciada de una enzima celulolítica y unaenzima xilanolítica cultivando mohos koji blanco o mohos koji negro con un medio líquido que contiene cebada, cebadadesnuda o trigo, estando la superficie cubierta enteramente con cáscaras, en el que la cantidad de cebada, cebadadesnuda o trigo en el medio líquido se hace al 1,4 al 1,8 % (p/volumen) para generar y acumular simultáneamente almenos glucoamilasa, -amilasa estable en condiciones ácidas, una enzima celulolítica y una enzima xilanolítica en elproducto de cultivo de mohos koji.

Description

Procedimiento de producción de koji liquido que tiene enzima digestiva de fibra vegetal potenciada, koji líquido producido por el procedimiento y uso del koji líquido
Campo técnico
La presente invención se refiere a un procedimiento para producir koji líquido que tiene actividades potenciadas de degradación de fibra vegetal, tales como enzimas celulolíticas y enzimas xilanolíticas y usos del koji líquido obtenido por el procedimiento.
Técnica anterior
Con respecto al koji usado en producción de bebidas alcohólicas, hay koji sólido, que se cultiva de tal manera que se inoculan esporas de hongos filamentosos a materia prima que se ha tratado con cocción y similares y koji líquido que se cultiva de tal forma que el medio líquido se prepara añadiendo materia prima y otras fuentes de nutrientes al agua y después las esporas de moho koji o los micelios precultivados de mohos koji y similares se inoculan al mismo.
En la producción convencional de alimentos fermentados y bebidas fermentadas, tales como bebidas alcohólicas que incluyen, por ejemplo sake, shochu, salsa de soja, pasta de soja fermentada, sake dulce y similares, lo que se conoce como koji sólido que se prepara con el procedimiento de cultivo sólido se ha usado ampliamente. El procedimiento de cultivo sólido es el procedimiento de cultivo en el que las esporas e mohos koji tales como Aspergillus kawachii, Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae y similares están dispersas en la materia prima sólida, tal como cereales cocidos al vapor, para permitir a los mohos koji crecer en la superficie sólida.
Por ejemplo, para la producción de shochu, el koji sólido tal como Aspergillus kawachii y Aspergillus awamori se ha usado ampliamente. Sin embargo, dado que el procedimiento de cultivo sólido es un sistema de cultivo en el que las materias primas y los mohos koji se dispersan irregularmente, es difícil hacer regulares los factores tales como temperatura, contenido de agua y diversas composiciones de nutrientes y el procedimiento de cultivo sólido es muy complicado en control de cultivo. Además, la producción de koji se lleva a cabo a menudo en condiciones abiertas y se requieren cuidados en términos de control de calidad tal como para evitar contaminación con otras bacterias. Por lo tanto, el procedimiento de cultivo sólido es inadecuado para producción a gran escala.
En contraste, el procedimiento de cultivo líquido es fácil para control de cultivo y control de calidad, de tal forma que es adecuado para producción eficiente. Sin embargo, debido a la razón de que, por ejemplo, la actividad enzimática es insuficiente para destilar shochu, el producto de cultivo obtenido cultivando en líquido mohos koji se usa raramente como koji shochu.
Además de las razones anteriormente mencionadas, una razón principal de que el producto de cultivo obtenido con el procedimiento de cultivo líquido no se use para producir alimentos fermentados y bebidas fermentadas tales como shochu es que el comportamiento de los mohos koji para producir enzimas tales como amilasa y celulasa en el cultivo líquido se sabe que es muy diferente de aquel en el cultivo sólido y la productividad del mismo se conoce también por ser pobre en general (véanse los documentos no de patente 1 y 2).
En la producción de bebidas alcohólicas tales como shochu, el alcohol se genera usualmente por sacarificación y fermentación simultáneas. Por lo tanto, las enzimas sacarolíticas de mohos de koji, que afectan al suministro de glucosa a los mohos koji, particularmente glucoamilasa y a-amilasa estable en condiciones ácidas son enzimas clave en la fermentación alcohólica. Sin embargo, se sabe que la actividad de glucoamilasa es remarcablemente baja en el producto de cultivo obtenido con el procedimiento de cultivo líquido y el comportamiento de producción del mismo es también muy diferente de aquel en el cultivo sólido (véanse documentos no de patente 3 a 6).
Como un procedimiento de mejora de actividad glucoamilasa de mohos koji, se ha comunicado el procedimiento de cultivo de mohos koji dando énfasis en el crecimiento de micelios (véase Documento de Patente 1) y el procedimiento de adición de cereales tostados a fluido de cultivo de moho koji (véase Documento de Patente 2). El procedimiento desvelado en el Documento de Patente 1 lleva a cabo cultivo en membrana porosa o inclusive en agente de inmovilización que tiene espacios de aire para permitir expresión del gen novedoso glaB que codifica glucoamilasa, para potenciar de este modo la actividad enzimática. De acuerdo con ello, el procedimiento requiere control estricto o dispositivos de cultivo específicos y de este modo no es práctico. El procedimiento descrito en el Documento de Patente 2 cultiva mohos koji en medio líquido usando cereales como, al menos, una parte de la materia prima, que requiere una etapa de producción adicional de tostar cereales.
Los inventores de la presente invención proporcionan una invención referida a un procedimiento de cultivo de mohos koji usando medio líquido que contiene los sacáridos que que los mohos koji apenas descomponen (véase Documento de Patente 3). Por mohos koji de cultivo líquido con la invención, un producto de cultivo de mohos que tiene actividad alta de enzimas glucolíticas tales como glucoamilasa, que se puede usar para producir alimentos fermentados y bebidas fermentadas tales como sake, puede obtenerse convenientemente y económicamente.
Por otro lado, recientemente, el análisis biológico molecular en a-amilasa estable en condiciones ácidas ha conducido
a los detalles (véase Documento no de patente 7). El análisis ha informado como sigue: Un moho koji blanco tiene dos genes de amilasa diferentes que son respectivamente responsables de dos características diferentes, es decir, a-amilasa inestable en condiciones ácidaso y a-amilasa estable en condiciones ácidas. Los comportamientos de expresión de los genes respectivos son muy diferentes unos de otros. En cultivo líquido, la a-amilasa inestable en condiciones ácidas se produce suficientemente, mientras que la a-amilasa estable en condiciones ácidas, una enzima clave para destilar shochu apenas se produce.
Para producir shochu, se lleva a cabo destilación en ambientes de pH bajo para evitar putrefacción de la malta de shochu. La a-amilasa inestable en ácido contribuye muy poco a glucolisis en destilación de shochu debido a que está desactivada de forma precisa en condiciones de pH bajo. Por lo tanto, es indispensable para producir shochu que la a-amilasa estable en condiciones ácidas se produzca con alto rendimiento, lo que se piensa que contribuye a la glucolisis en destilación de shochu, cultivando en líquido mohos koji.
El comportamiento de producción de a-amilasa en mohos koji de cultivo líquido se ha investigado y comunicado en detalle. Sin embargo, el procedimiento usa medio sintético que contiene solución tampón de peptona y citrato y requiere un tiempo de cultivo de 100 horas o más, así que sería difícil de aplicar a la destilación de shochu real (véanse Documentos no de patente 8 a 10).
Los inventores de la presente invención han desarrollado ya un procedimiento de producción de koji líquido que tiene suficientemente actividades de glucoamilasa y a-amilasa estable en condiciones ácidas que son necesarias para producir shochu, lo que implica cultivar mohos koji blanco y/o mohos koji negro en medio líquido que contiene el cereal del que la superficie está cubierta con cáscaras ya que se cultiva materia prima para generar y acumular simultáneamente glucoamilasa y a-amilasa estable en condiciones ácidas en el producto de cultivo. Los inventores de la invención han tenido éxito en producir shochu usando el koji líquido por primera vez (véase, por ejemplo, la memoria descriptiva de Solicitud de Patente Japonesa N.º: 2004-350661).
Mientras, se ha llevado a cabo investigación en enzimas de degradación de fibras vegetales producidas con koji con el fin de mejorar adicionalmente la productividad de sake y shochu. Se ha comunicado que la proporción de utilización de la materia prima de malta de sake está mejorada cuando las enzimas de degradación de la fibra vegetal tales como una enzima celulolítica, una enzima xilanolítica y una enzima pectolítica se emplean en la producción de sake (véanse, Documentos no de patente 11 y 12).
Se ha comunicado también que el rendimiento de alcohol en shochu está mejorado creando los mohos koji shochu recombinantes en los que el gen de la enzima celulolítica de Trichoderma viride se introduce y y produce shochu con los mohos koji shochu recombinantes (véase Documento no de patente 13).
Como se describe anteriormente, se sabe ampliamente que mejora en productividad de las enzimas de degradación de fibras vegetales para usar en producción de sake o shochu es extremadamente importante para promover eficacia en producción de alimentos fermentados y bebidas fermentadas tales como sake o shochu.
Sin embargo, emplear la preparación de enzimas de degradación de fibras vegetales en la producción de sake puede incrementar coste y no es preferible.
Además, usar el moho koji shochu recombinante dejaría a los consumidores preocupaciones acerca de la seguridad y tampoco es preferible.
Por cierto, etanol como alcohol industrial se usa como materia prima para producir alimentos y bebidas tales sake dulce, vinagre y similares, o como materia prima para producir productos químicos industriales tales como harina, detergente y similares. Adicionalmente, se espera recientemente que el etanol sirva como fuente de energía novedosa que es alternativa a un combustible fósil tal como el petróleo. Por ejemplo, se promueven investigaciones y desarrollos de un combustible de alcohol tal como gasolina E3 que se obtiene mezclando gasolina con 3 % de etanol.
Cuando el alcohol industrial se produce por procedimiento de fermentación usando cereales o tubérculos como materia prima, se necesita una preparación enzimática (enzimas de licuefacción o enzimas sacarolíticas) para usarse para actividades enzimáticas altas (véase, por ejemplo, Documento no de patente 14).
Se ha comunicado que la glucoamilasa y la a-amilasa estables en ácidos se pueden producir simultáneamente usando cultivo sumergido de Aspergillus kawachii NBRC4308 (véase Documento no de patente 15).
Sin embargo, el uso de la preparación enzimática causa un problema que, además del coste alto, el malteado no puede llevarse a cabo en alta concentración. La malta con una preparación enzimática tiene generalmente un contenido de alcohol de aproximadamente el 8 %. Así, se ha esperado el malteado a concentración más alta para mejorar productividad.
Puede sugerirse usar koji sólido en el que los mohos koji se cultivan en la superficie de cereales o judías, en vez de en la preparación enzimática. Sin embargo, el koji sólido no es adecuado para producción a gran escala debido a que se ha producido en un modo de cultivo específico, es decir, cultivo sólido.
Por otro lado, el koji líquido en el que los mohos koji se cultivan en medio líquido es capaz de controlar cultivo
fácilmente, de tal forma que es adecuado para producción eficiente. Sin embargo, se conoce por personas expertas en la técnica que el koji líquido no proporciona actividades enzimáticas requeridas para la fermentación de alcohol suficientemente, de tal forma que no hay ningún ejemplo donde se use koji líquido en producción real.
Documento no de patente 1: Iwashita K. y cols.: Biosci. Biotechnol. Biochem., 62: 1938-1946 (1998): Documento no de patente 2: Yuichi Yamane y cols. : Journal of the Brewing Society of Japan, 99, 84-92 (2004) Documento no de patente 3: Hata Y. y cols.: J. Ferment. Bioeng., 84, 532-537 (1997) Documento no de patente 4: Hata Y. y cols.: Gene., 207, 127-134 (1998) Documento no de patente 5: Ishida H. y cols.: J. Ferment. Bioeng., 86, 301-307 (1998) Documento no de patente 6: Ishida H. y cols.: Curr. Genet., 37, 373-379 (2000) Documento no de patente 7: Nagamine K. cols.: Biosci. Biotechnol. Biochem., 67: 2194-2202 (2003): Documento no de patente 8: Sudo S. y cols.: J. Ferment. Bioeng., 76, 105-110 (1993) Documento no de patente 9: Sudo S. y cols.: J. Ferment. Bioeng., 77, 483-489 (1994) Documento no de patente 10: Shigetoshi Sudo y cols.: Journal of the Brewing Society of Japan, 89, 768-774 (1994) Documento no de patente 11: Yoshizawa y cols. Journal of the Brewing Society of Japan, 76, 284-286 (1981)
Documento no de patente 12: Fukuda y cols. Journal of Bioscience and Bioengineering, 79, 299-302 (2001)
Documento no de patente 13: Nomachi W. y cols., J. Biosci. Bioeng., 93 (4), p. 382-387, 2002 Documento no de patente 14: Encyclopedia of Brewing, p. 352-371, Asakura Publishing, Co., Ltd., primera edición publicada el 10 de noviembre, 1998
Documento no de patente 15: Shoji H. y cols. J. Biosci. Bioeng., 103, 203-205 (2007) Documento de Patente 1: JP 11-225746 A Documento de Patente 2: JP 2001-321154 A Documento de Patente 3: JP 2003-265165 A
Divulgación de la invención Problemas a solucionar por la invención
Los inventores de la presente invención han hecho estudios exhaustivos para solucionar los problemas convencionales como se describen anteriormente.
Como un resultado, los inventores de la presente invención han encontrado que en el procedimiento, que los inventores de la presente invención han desarrollado, de producir koji líquido que tiene actividades altas de glucoamilasa y a-amilasa estable en condiciones ácidas (véase, por ejemplo, una memoria descriptiva del Documento de Patente Japonesa N.º: 2004-350661), en el que mohos koji blanco y/o mohos koji negro se cultivan en un medio líquido que contiene el cereal del que la superficie está cubierta con cáscaras como materia prima de cultivo para generar y acumular simultáneamente glucoamilasa y a-amilasa estable en condiciones ácidas en el producto de cultivo, la actividad de enzimas de degradación de fibras vegetales puede potenciarse controlando la cantidad del material de cultivo a usarse en el medio líquido. De acuerdo con el hallazgo, la presente invención se ha completado.
Se debería destacar que no se conoce ningún comportamiento de producción ni procedimiento de producción en rendimientos altos, de enzima de degradación de fibras vegetales, en producir koji líquido con la materia prima que tiene cáscaras como se describe en la memoria descriptiva de la Solicitud de Patente Japonesa N.º: 2004-350661. Adicionalmente, no se ha comunicado producción de shochu usando el koji líquido, en absoluto.
Es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento de producción de koji líquido que tiene actividad potenciada de enzimas de degradación de fibras vegetales, por cultivo líquido en vez de cultivo sólido sin usar una preparación enzimática de degradación de fibras vegetales cara ni una bacteria recombinante.
Adicionalmente, es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento de producción de forma eficiente de alimentos fermentados y bebidas fermentadas tales como shochu, usando el koji líquido que tiene actividad potenciada de enzimas de degradación de fibras vegetales.
El koji líquido está en estado líquido, de tal forma que proporciona una ventaja, que el manejo del mismo tal como
bombeando es fácil. Sin embargo, un producto en seco obtenido tratando el koji líquido con un procedimiento tal como secado al vacío se supone que contribuye a eficiencia en producir alimentos fermentados y bebidas fermentadas tales como shochu, si solo se puede lograr la propiedad de fermentación similar a aquella del líquido koji.
Es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento de producción de un producto seco de koji líquido que puede contribuir a eficiencia en producir alimentos fermentados y bebidas fermentadas tales como shochu.
Es decir, un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento de producción de un producto seco en koji líquido que tiene actividades altas de glucoamilasa, a-amilasa estable en condiciones ácidas y enzimas de degradación de fibras vegetales y es adicionalmente excelente en propiedad de manejo.
Adicionalmente, un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento de producción de forma eficiente de alimentos fermentados y bebidas fermentadas tales como shochu, usando el producto en seco como se describe anteriormente.
Es un objeto de la presente invención desarrollar koji líquido que tenga suficientemente actividad enzimática requerida para fermentación de alcohol y establecer un procedimiento de producción de forma eficiente de alcohol (etanol) industrial por procedimiento de fermentación usando el koji líquido.
El koji líquido a usarse para producir alcohol (etanol) industrial necesita tener actividad alta de enzimas glucolíticas tales como glucoamilasa y a-amilasa estable en condiciones ácidas y necesita tener actividad alta de enzimas de degradación de fibras vegetales. Sin embargo, no se ha divulgado aún una técnica por la que el koji líquido que tiene actividad enzimática alta se obtenga cultivando mohos koji en medio líquido. En otras palabras, la a-amilasa estable en condiciones ácidas se establece generalmente como una enzima que no se genera por cultivo líquido, de tal forma que no se ha desarrollado aún koji líquido que tenga actividad a-amilasa estable en condiciones ácidas.
Así, como se describe anteriormente, un objeto de la presente invención es desarrollar koji líquido que tenga actividades altas de glucoamilasa, a-amilasa estable en condiciones ácidas y establecer un procedimiento de producción de forma eficiente de alcohol (etanol) industrial por procedimiento de fermentación usando el koji líquido.
Medios para resolver los problemas
De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento de producción de koji líquido que tiene actividad potenciada de una enzima celulolítica y una enzima xilanolítica cultivando mohos koji blanco
o mohos koji negro con un medio líquido que contiene cebada, cebada desnuda o trigo la superficie de los cuales está cubierta enteramente con cáscaras, en las que la cantidad de cebada, cebada desnuda o trigo en el medio líquido se hace al 1,4 al 1,8 % (p/volumen) para generar y acumular simultáneamente al menos glucoamilasa, a-amilasa, una enzima celulolítica y una enzima xilanolítica en el producto de cultivo de moho koji. En una realización preferida del procedimiento de producción de koji líquido de acuerdo con el primer aspecto de la invención, la condición de cultivo se hace a 37 ºC durante 42 horas según se cultivan los mohos koji blanco o los mohos koji negro con un medio líquido que contiene cebada, cebada desnuda o trigo la superficie de los cuales está cubierta enteramente con cáscaras, generando y acumulando simultáneamente al menos glucoamilasa, a-amilasa estable en condiciones ácidas, una enzima celulolítica y una enzima xilanolítica en el producto de cultivo de mohos koji.
De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, hay proporcionado un procedimiento de producción de un producto seco de koji líquido con medio líquido que comprende, obtener koji líquido por el procedimiento descrito de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención y secar el koji líquido.
De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, hay proporcionado un procedimiento de producción de una preparación enzimática que comprende, obtener koji líquido por el procedimiento de acuerdo con el primer aspecto de la invención y usar el koji líquido.
De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención, hay proporcionado un procedimiento de producción de al menos una enzima seleccionada del grupo que consiste en glucoamilasa, a-amilasa estable en condiciones ácidas, una enzima celulolítica y una enzima xilanolítica, comprendiendo el procedimiento obtener koji líquido producido por el procedimiento de acuerdo con el primer aspecto de la invención.
De acuerdo con un quinto aspecto de la presente invención, hay proporcionado un procedimiento de producción de un alimento fermentado o una bebida fermentada que comprende, obtener koji líquido por el procedimiento de acuerdo con el primer aspecto de la invención y usar el koji líquido. En una realización preferida del procedimiento de producción de un alimento fermentado o una bebida fermentada de acuerdo con el quinto aspecto de la presente invención, el alimento fermentado o la bebida fermentada comprende shochu.
De acuerdo con un sexto aspecto de la presente invención, hay proporcionado un procedimiento de producción de un alimento fermentado o una bebida fermentada que comprende, obtener un producto seco de koji líquido por el procedimiento de acuerdo con el segundo aspecto de la invención y usar el producto seco de koji líquido.
De acuerdo con un séptimo aspecto de la presente invención, hay proporcionado un procedimiento de producción de
un alimento fermentado o una bebida fermentada que comprende, obtener una preparación enzimática por el procedimiento de acuerdo con el tercer aspecto de la invención y usar la preparación enzimática.
De acuerdo con un octavo aspecto de la presente invención, hay proporcionado un procedimiento de producción de un alimento fermentado o una bebida fermentada que comprende, obtener al menos una enzima seleccionada del grupo que consiste en glucoamilasa, a-amilasa estable en condiciones ácidas, una enzima celulolítica y una enzima xilanolítica por el procedimiento de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención y usar la enzima.
De acuerdo con un noveno aspecto de la presente invención, hay proporcionado un procedimiento de producción de etanol que comprende, obtener koji líquido por el procedimiento de acuerdo con el primer aspecto de la invención y usar el koji líquido.
De acuerdo con un décimo aspecto de la presente invención, hay proporcionado un procedimiento de producción de etanol que comprende, obtener un producto seco de koji líquido por el procedimiento de acuerdo con el segundo aspecto de la invención y usar el producto seco de koji líquido.
De acuerdo con un undécimo aspecto de la presente invención, hay proporcionado un procedimiento de producción de etanol que comprende, obtener una preparación enzimática por el procedimiento de acuerdo con el tercer aspecto de la invención y usar la preparación enzimática.
De acuerdo con un duodécimo aspecto de la presente invención, hay proporcionado un procedimiento de producción de etanol que comprende, obtener al menos una enzima seleccionada del grupo que consiste en glucoamilasa, a-amilasa estable en condiciones ácidas, una enzima celulolítica y una enzima xilanolítica por el procedimiento de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención y usar la enzima. Preferentemente, en el procedimiento de producción de koji líquido de acuerdo con el primer aspecto de la invención, el medio líquido contiene cebada o cebada desnuda la superficie de la cual está enteramente cubierta con cáscaras y la cantidad de cebada o cebada desnuda en el medio líquido se hace al 1,4 al 1,8 % (p/volumen).
Efectos de la invención
De acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, se puede producir koji líquido que tiene actividad potenciada de enzimas de degradación de fibras vegetales tales como una enzima celulolítica (celulasa) y una enzima xilanolítica por cultivo líquido en vez de por cultivo sólido sin usar una preparación enzimática de degradación de fibras vegetales cara ni una bacteria recombinante.
Adicionalmente, de acuerdo con la presente invención, hay proporcionado un procedimiento de producción de forma eficiente de alimentos fermentados y bebidas fermentadas tales como shochu, usando el koji líquido que tiene actividad potenciada de enzimas de degradación de fibras vegetales. De acuerdo con la presente invención, por ejemplo, en el caso donde shochu se produce como los alimentos fermentados y las bebidas fermentadas, puede esperarse que la viscosidad de la malta de shochu decrezca para de este modo mejorar significativamente la trabajabilidad. Además, se puede esperar también mejora en proporción de utilización de la materia prima tal como un incremento en un rendimiento de alcohol, que conduce a una eficiencia adicional en producir alimentos fermentados y bebidas fermentadas tales como shochu.
De acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención, puede haberse producido producto seco de koji líquido que tiene actividades altas de glucoamilasa, a-amilasa estable en condiciones ácidas y enzimas de degradación de fibras vegetales y es adicionalmente excelente en propiedad de manejo.
El producto está en estado seco, así hay una ventaja que está oportunamente disponible incluso para producción inesperada.
Adicionalmente, debido a las propiedades, el producto seco de koji líquido se puede usar para producir eficientemente diversos alimentos fermentados y bebidas fermentadas.
Por ejemplo, usando el producto seco de koji líquido producido de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención, el grado de fermentación casi igual a aquel de maltas remojadas de shochu obtenidas usando koji líquido no secado o koji sólido convencional, se puede obtener y el shochu producido tiene calidad casi igual a aquella del shochu producido usando el koji líquido no secado o el koji sólido sin inferioridad organoléptica.
Adicionalmente, de acuerdo con el noveno aspecto de la presente invención, hay proporcionado un procedimiento de producción de etanol por un procedimiento de fermentación usando el koji líquido.
De acuerdo con el procedimiento, llega a ser posible producir malta que tiene contenido de alcohol casi tan alto como aquel del etanol que se obtiene con un procedimiento de producción de etanol por fermentación usando el koji sólido convencional. La producción de malta que tiene contenido de alcohol alto puede contribuir a reducción a escala y a ahorro de energía.
De acuerdo con el noveno aspecto de la presente invención, se puede producir eficientemente alcohol (etanol) industrial por procedimiento de fermentación usando el koji líquido que tiene suficientemente la actividad enzimática
requerida para fermentación alcohólica.
Breve descripción de los dibujos
En los dibujos adjuntos:
FIG. 1 es una gráfica que muestra los procedimientos de fermentación en producción de shochu de cebada usando diversos koji líquidos que tienen diferentes cantidades de cebada en bruto para usarse en el Ejemplo 2;
FIG. 2 es una gráfica que muestra resultados de medida de viscosidades de malta de maltas remojadas de shochu de cebada obtenidas usando diversos koji líquidos que tienen diferentes cantidades de cebada en bruto para usarse en el Ejemplo 2; y
FIG. 3 es una gráfica que muestra los procedimientos de fermentación en el lote no secado y en el lote seco en el Ejemplo 4, dependiendo de la reducción acumulativa en peso.
Mejor realización para llevar a cabo la invención
En adelántelo que sigue, la presente invención se describirá en detalle.
Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de koji líquido que tiene actividad potenciada de una enzima celulolítica y de una enzima xilanolítica.
En el primer aspecto de la presente invención, se usa un medio líquido que contiene cebada, cebada desnuda o trigo la superficie del cual está enteramente cubierta por cáscaras. Por lo tanto, lleva mucho tiempo para la sacarificación de almidones en los cereales, se suprime la tasa de liberar sacáridos en sistemas de cultivo y se potencia la actividad enzimática de koji líquido.
En el primer aspecto de la presente invención, el cereal a usarse como materia prima de cultivo de koji líquido es cebada, cebada desnuda o trigo. Las materias primas necesitan tener la forma de la que la superficie está enteramente cubierta por cáscaras. Se puede usar una sustancia sin descortezar o que tiene igual o más de la proporción de descortezado a la que se ha descortezado de tal forma que las cáscaras están al menos permaneciendo en la superficie de los granos y se pueden usar también arroz en bruto, cebada en bruto y similares. Cuando el cereal es cebada, se puede usar la sustancia sin descortezar que tiene una proporción de descortezado del 100 %, o dado que la proporción de descortezado de la sustancia sin descortezar se define como el 100 %, la sustancia que tiene una proporción de descortezado no menor que el valor determinado restando la proporción de cáscaras de la cebada (generalmente 7 al 8 %) a partir de la proporción de descortezado de la sustancia sin descortezar (el 100 %), es decir, aproximadamente 92 % al 93 %.
Aquí, el término "proporción de descortezado" se refiere a la proporción que queda de cereales después de que los cereales se descortezan. Por ejemplo, el término "proporción de descortezado del 90 %" quiere decir que el 10 % de las cáscaras o similares en la parte de la capa de superficie de cereales está eliminada rallándola. En la presente invención, el término "cebada en bruto" comprende aquellas desde la cebada sin descortezar hasta la cebada descortezada que tiene cáscaras que permanecen en la superficie de los granos, es decir, la sustancia que tiene proporción de descortezado del 90 % o más. Además, el término "cáscara" se refiere a la parte exterior que cubre la superficie de una partícula de cereal.
"Amaranto" es un término genérico de plantas que pertenecen al género Amaranthus de la familia Amaranthaceae. Entre los cereales, el amaranto tiene contenido de proteínas alto y el contenido de lisina, que es uno de los aminoácidos, es casi igual a aquel en soja. Además, el amaranto es un cereal altamente nutritivo que contiene grandes cantidades de calcio, hierro y fibras cuando se compara con el arroz descortezado. Los países de origen son áreas específicas de los países de américa del sur/américa central, la India, el Himalaya y Nepal. Por otro lado, la quinoa es una hierba anual de la familia de las amarantáceas, que se cultiva principalmente en zonas montañosas tales como los Andes localizados en la parte meridional del Perú y la parte occidental de Bolivia. La quinoa es rica en minerales, vitaminas, proteínas y fibras dietéticas.
Las materias primas de cultivo mencionadas anteriormente se usan solas, o dos o más de ellas se usan en combinación para preparar el siguiente medio líquido.
Es decir, las materias primas de cultivo se mezclan con agua para preparar un medio líquido.
En la presente invención, es necesario controlar la cantidad de la materia prima de cultivo a usarse en el medio líquido.
En general, las enzimas de degradación de fibras vegetales tales como enzima celulolítica (celulasa) y una enzima xilanolítica (xilanasa) están potenciadas cuando la cantidad de la materia prima es ligeramente menos que aquella preferible para que se generen y se acumulen de una manera equilibrada glucoamilasa y a-amilasa estable en condiciones ácidas.
La cantidad de materia prima de cultivo a usarse en el medio líquido está dentro de un intervalo en el que la
glucoamilasa y la a-amilasa se generan y acumulan selectivamente durante el tiempo en que se cultivan los mohos koji y al mismo tiempo, las enzimas de degradación de fibras vegetales, tales como la enzima celulolítica (celulasa) y la enzima xilanolítica se potencian.
Cuando la condición de cultivo es a 37 °C durante 42 horas, el medio líquido se prepara añadiendo 1,4 a 1,8 (p/volumen) o preferentemente 1,4 al 1,7 % (p/volumen) de la cebada o de la cebada desnuda a agua. Lo mismo se aplica al caso donde se usa cebada sin descortezar o cebada desnuda y al caso donde se usa como materia prima cebada descortezada al 95 % o cebada desnuda.
Las cantidades de las materias primas de cultivo a usar para la mezcla pueden seleccionarse apropiadamente debido a que las cantidades óptimas varían dependiendo de las clases de materias primas de cultivo a usarse, los grados de descortezado de las materias primas de cultivo y similares.
Cuando los mohos koji se cultivan en el medio líquido al que se añade la materia prima de cultivo en una cantidad dentro del intervalo mencionado anteriormente, se puede producir koji líquido que tiene actividad enzimática (actividad glucoamilasa y actividad a-amilasa estable en condiciones ácidas) suficiente para usarse para producir alimentos fermentados y bebidas fermentadas tales como shochu y al mismo tiempo, tiene actividad potenciada de enzimas de degradación de fibras vegetales tales como enzima celulolítica (celulasa) y una enzima xilanolítica (xilanasa).
Cuando la cantidad de materia prima de cultivo a usarse exceda el límite superior, el koji líquido que tiene actividad potenciada de enzimas de degradación de fibras vegetales tal como enzima celulolítica (celulasa) y una enzima xilanolítica (xilanasa) no se puede obtener. Adicionalmente, la viscosidad del líquido de cultivo se incrementa y el suministro de oxígeno o aire requerido para cultivar aeróbicamente mohos koji llega a ser insuficiente. Eso disminuye contenido de oxígeno en el producto de cultivo, restringe el progreso de cultivo y no se prefiere. Por otro lado, cuando la cantidad de la materia prima a usarse es menos que el límite inferior, las enzimas deseadas no se pueden producir en rendimientos altos.
Los almidones incluidos en la materia prima de cultivo se pueden gelatinizar de forma preliminar antes de cultivar. Los almidones gelatinizantes puede llevarse a cabo de acuerdo con, pero no están particularmente limitados a, cualesquiera de los procedimientos convencionales que comprenden un procedimiento de cocción al vapor, un procedimiento de tueste y similares. En la etapa de esterilizar medio líquido como se describe más adelante, cuando los almidones se calientan a temperatura de gelificación o más alta por esterilización a temperaturas altas y presiones altas, se lleva a cabo simultáneamente la gelatinización de almidones por el tratamiento como tal.
Además de la materia prima de cultivo mencionada anteriormente, es preferible que una sustancia orgánica, una sal orgánica y similares se añadan apropiadamente como fuente de nutrientes para el medio líquido.
Esos aditivos no están particularmente limitados en la medida en que se usan generalmente para cultivar mohos koji. Ejemplos de la sustancia orgánica comprenden salvado de arroz, salvado de trigo, licor de maceración del maíz, torta de soja y soja desengrasada. Ejemplos de sal inorgánica incluyen compuestos acuosos tales como una sal de amonio, una sal de nitrato, una sal de potasio, una sal de fosfato, una sal de calcio y una sal de magnesio. Se pueden usar dos
o más sustancias orgánicas y/o sales inorgánicas simultáneamente. Las cantidades de adición de las mismas no están particularmente limitadas en la medida en que se promueve el crecimiento de los mohos de koji. La cantidad de adición de la sustancia orgánica es preferentemente aproximadamente 0,1 % al 5 % (p/volumen) y la cantidad de la sal inorgánica es preferentemente aproximadamente 0,1 % al 1 % (p/volumen).
El medio líquido de los mohos koji así obtenidos puede someterse a esterilización si es necesario y los procedimientos de tratamiento no están particularmente limitados. Por ejemplo, el procedimiento de esterilización de temperatura alta y presión alta puede llevarse a cabo a una temperatura de 121 ºC durante 15 minutos.
El medio líquido esterilizado se enfría hasta una temperatura de cultivo y después los mohos koji se inoculan al medio líquido.
Los mohos koji a usarse en el primer aspecto de la presente invención son mohos koji blancos o negros capaces de producir una enzima glucolítica, preferentemente una capaz de producir glucoamilasa y a-amilasa estable en condiciones ácidas. Ejemplos de los mismos comprenden Aspergillus kawachii, Aspergillus awamori y Aspergillus niger.
Los mohos koji blanco y los mohos koji negro se pueden usar solos, o dos o más de los mismos se pueden usar en combinación. Es preferible que los mohos koji blancos y los mohos koji negros se usen solos, o ambos se usen en combinación.
Esos mohos koji se pueden usar para el cultivo de cepa individual o para el cultivo mezclado con dos o más cepas homólogas o heterólogas. Se permite usar bien forma de las de las esporas o bien los micelios obtenidos en precultivo. Sin embargo, se usan preferentemente los micelios debido a que se requieren tiempos más cortos para la fase de crecimiento logarítmico. La cantidad de los mohos koji a inocularse en el medio líquido no está limitada particularmente, pero el número de las esporas puede estar en el intervalo de 1 x 104 a 1 x 106 por ml del medio líquido. Para los micelios, se inocula aproximadamente el 0,1 al 10 % del líquido de precultivo preferentemente.
La temperatura de cultivo de los mohos koji es preferentemente 25 a 45 °C, o más preferentemente 30 a 40 °C, pero no está particularmente limitada en la medida en que no se afecte adversamente el crecimiento. Si la temperatura de cultivo es baja, ello tiende a contaminarse por microbios infecciosos a medida que el crecimiento de los mohos koji llega a ser más lento. El tiempo de cultivo está preferentemente en el intervalo de 24 a 72 horas.
El aparato de cultivo puede ser cualquiera de aquellos capaces de llevar a cabo cultivo líquido. Los mohos koji han de cultivarse aeróbicamente. Así, el cultivo se conduciría en condiciones aeróbicas en las que se puede suministrar al medio oxígeno o aire. Además, es preferible agitar el medio de tal forma que las materias primas, el oxígeno y los mohos koji puedan distribuirse uniformemente en aparatos durante el cultivo. Las condiciones de agitación y la cantidad de aireación pueden ser arbitrariamente tan duraderas como se mantenga el ambiente de cultivo aeróbico y así pueden seleccionarse dependiendo del aparato de cultivo, la viscosidad del medio y similares.
Cultivando con el procedimiento de cultivo anteriormente mencionado, las enzimas tales como glucoamilasa y a-amilasa estable en ácido se general simultáneamente en una manera equilibrada y al mismo tiempo, la actividad de enzimas de degradación tales como una enzima celulolítica (celulasa) y una enzima xilanolítica se potencia en el koji líquido.
El koji líquido obtenido en la presente invención comprende un producto de cultivo en sí mismo, un líquido de cultivo obtenido del producto de cultivo por separación centrifugal o similar, un concentrado o un producto seco de los mismos y similares.
Como se describe anteriormente, de acuerdo con el procedimiento de cultivo anteriormente mencionado, las enzimas tales como glucoamilasa, a-amilasa estable, una enzima celulolítica y una enzima xilanolítica se producen altamente.
Por lo tanto, el procedimiento de producción de enzimas descritas en el cuarto aspecto de la presente invención es sustancialmente el mismo que el procedimiento de producción de koji líquido descrito anteriormente.
El koji líquido puede producirse por el procedimiento de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención. El koji líquido, que se obtiene por el procedimiento de la producción de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, puede usarse adecuadamente para producir alimentos fermentados y bebidas fermentadas tales como shochu, sake, salsa de soja, miso y sake dulce, según se describe en el quinto aspecto de la presente invención.
El koji líquido se puede usar en vez del koji sólido, por ejemplo, en el caso de producir shochu como se describe en el quinto aspecto de la presente invención, en la fase de malteado de shochu; en el caso de producir sake, en las fases de malteado de levaduras o de malta de sake; en el caso de producir salsa de soja, en la fase de amontonamiento; en el caso de producir miso, en la fase de malteado; en el caso de producir sake dulce, en la fase de malteado.
Cuando se producen alimentos fermentados y bebidas fermentadas usando el koji líquido anteriormente mencionado, todas las etapas pueden llevarse a cabo en fase líquida. Un procedimiento de producción de alimentos fermentados y bebidas fermentadas en la fase líquida a través de las etapas completas, por ejemplo, cuando shochu se produce, es que se calientan como materia prima maíz, trigo, arroz, patata, caña de azúcar y similares a aproximadamente 80 °C para licuar disolviendo con una preparación enzimática resistente al calor, el koji líquido anterior y la levadura se añaden a la misma para permitir a la malta fermentación alcohólica y después se destila a presión normal o a presión reducida y similares.
El koji líquido obtenido por el procedimiento de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención se puede utilizar para una preparación enzimática, un producto farmacéutico tal como un agente digestivo y similares debido a actividad enzimática alta del mismo. En este caso, el producto de cultivo de mohos koji resultante puede concentrarse y purificarse en el grado deseado por procedimiento convencional y se añaden al mismo un excipiente, un agente espesante, un edulcorante y similares apropiados.
De acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento de producción de un producto seco de koji líquido, secando el koji líquido que se obtiene como se describe anteriormente.
El procedimiento de secado preferido comprende secado por congelación y en particular es más preferible el secado por congelación al vacío debido a que la inactivación de una enzima apenas ocurre. El secado por congelación al vacío puede llevarse a cabo de acuerdo con procedimientos convencionales. Las condiciones para el secado por congelación al vacío no están particularmente limitadas, pero en general, la precongelación se puede llevar a cabo a una temperatura desde -10 hasta -40 °C durante 1 a 6 horas y se puede llevar a cabo el secado a 5 a 30 °C durante 10 a 30 horas a un grado de vacío de 133,32 pascales (1 Torr) o menos, o preferentemente 93,33 pascales (0,7 Torr) o menos.
De esta manera, se puede producir un producto seco de koji líquido deseado.
El producto en seco de koji líquido, que se obtiene por el procedimiento de producción de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención, puede usarse adecuadamente para producir alimentos fermentados y bebidas fermentadas como se describe en el sexto aspecto de la presente invención.
El producto en seco de koji líquido puede usarse en vez del koji sólido o el koji líquido por ejemplo, en el caso de producir sake, en la fase de malteado de levaduras o de malta de sake; en el caso de producir shochu, en la fase de malteado de shochu; en el caso de producir salsa de soja, en la fase de amontonamiento; en el caso de producir miso, en la fase de producir malta; en el caso de producir sake dulce, en la fase de malteado.
En el caso donde se producen alimentos fermentados y bebidas fermentadas, se puede usar producto seco de koji líquido una preparación enzimática sin modificación, el producto obtenido mezclando cebada cocida al vapor, células de levaduras y el koji líquido por adelantado y secando, o la preparación obtenida mezclando las diversas materias primas secadas. Como se describe anteriormente, si las materias primas están integradas en una suerte de kit, el kit serviría como un iniciador simple por el que se pueden llevar a cabo alimentos fermentados y bebidas fermentadas tales como shochu con adición de agua.
Cuando se producen los alimentos fermentados y las bebidas fermentadas usando el producto seco de koji líquido mencionado anteriormente, se pueden llevar a cabo todas las etapas en fase líquida. Un procedimiento de producción de alimentos fermentados y bebidas fermentadas en la fase líquida a través de las etapas completas, por ejemplo, cuando shochu se produce, es que se calientan como materia prima maíz, trigo, arroz, patata, caña de azúcar y similares a aproximadamente 80 °C para licuar disolviendo con una preparación enzimática resistente al calor, el koji líquido anterior y la levadura se añaden a la misma para permitir a la malta fermentación alcohólica, después se destila a presión normal o presión reducida y similares.
El koji líquido obtenido por el procedimiento de producción mencionado anteriormente se usa para producir etanol por un procedimiento de fermentación de acuerdo con el noveno aspecto de la presente invención. En la producción de etanol, se puede producir alcohol industrial (etanol) de acuerdo con un procedimiento conocido de producir alcohol industrial (etanol) salvo porque el koji líquido se usa en vez de koji sólido.
Un ejemplo del procedimiento de producción de etanol por un procedimiento de fermentación se representa más adelante.
La materia prima a usarse para producir etanol puede ser materia prima que contiene almidón y ejemplos del mismo comprenden cereales tales como cebada, cebada desnuda, arroz, trigo, trigo sarraceno, pata de gallo, panizo común, mijo, sorgo y maíz; y tubérculos tales como patata dulce y mandioca.
La producción de etanol por procedimiento de fermentación puede llevarse a cabo usando un aparato de cocción por vapor y hervido continuos tal como aparato de cocción por vapor y hervido continuos de baja temperatura. Primero, se añaden levadura capaz de producir etanol tal como levadura de shochu, las materias primas mencionadas anteriormente y agua al koji líquido para llevar a cabo el malteado. Se puede usar ácido láctico si es necesario.
Después de la elaboración de malta, la mezcla se cuece por vapor y se hierve a baja temperatura de aproximadamente 20 a 30 °C, para llevar a cabo de este modo malteado secundario después del malteado primario.
En el caso del noveno aspecto de la presente invención, aunque no se usa ninguna preparación enzimática y se usa solo el koji líquido, la malta obtenida después de finalización de la fermentación tiene contenido de alcohol alto del 18 al 20 %.
La malta obtenida después de la finalización de la fermentación puede destilarse con un destilador tal como un aparato de microdestilación, preferentemente un destilador continuo, para de este modo eliminar impurezas y concentrar la malta. Como resultado, se puede producir alcohol (etanol) industrial con calidad alta, que tiene concentración de alcohol del 95 % o más. De acuerdo con el noveno aspecto de la presente invención, la masa ya obtenida tiene ya contenido en alcohol alto del 18 al 20 % después de finalización de la fermentación, dando como resultado efectos tales como una reducción de escala y ahorro de energía.
A continuación en el presente documento, se describirá en detalle la presente invención por medio de ejemplos. Sin embargo, la presente invención no está limitada a dichos ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1
Producción de producto de cultivo de moho koji (koji líquido) que tiene actividad potenciada de enzimas de degradación de fibras vegetales
(I) Producción de producto de cultivo de mohos koji (koji líquido)
1) Procedimiento de precultivo: 8 g de cebada descortezada al 65 % (Stirling, de en Australia) y 100 ml de agua se pusieron dentro de un matraz cónico de 500 ml provisto de paneles y el total se esterilizó a 121 °C durante 15 minutos con autoclave, obteniéndose de este modo un medio de precultivo. Un moho koji blanco (Aspergillus kawachii NBRC4308) se inoculó a 1 x 106/ml dentro del procedimiento de precultivo y se cultivó agitando a 37 °C y a 100 rpm durante 24 horas, obteniéndose de este modo un líquido de precultivo.
2) Procedimiento de cultivo principal: Se prepararon siete medios líquidos añadiendo cebada en bruto (cebada descortezada al 95 % (Stirling, de en Australia)) en proporción de combinación del 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5 y 1,4 % (p/volumen) como se muestra en la Tabla 1 frente a agua que contiene 0,2 % (p/volumen) de nitrato de potasio y 0,3 % (p/volumen) de dihidrogenofosfato de potasio.
3.000 ml de cada uno de los medios líquidos se puso en un fermentador de jarra de 5.000 ml (elaborado por B. E. Marubishi Co., Ltd.) y el total se esterilizó a 121 °C durante 15 minutos con autoclave, obteniendose de este modo un medio de cultivo principal. Cada medio de cultivo principal se inoculó con 30 ml del líquido de precultivo mencionado anteriormente.
Después de eso, se llevó a cabo cultivo durante 42 horas a una temperatura de 37 ºC y a una velocidad de agitación de 300 rpm y con un volumen de aireación de 0,5 vvm, obteniéndose de este modo productos de cultivo de mohos koji (koji líquido).
(II) Medida de actividades enzimáticas
Los productos de cultivo de mohos koji (koji líquido) obtenidos en la sección (I) se midieron cada uno para rendimiento de glucoamilasa (GA), a-amilasa estable en condiciones ácidas (ASAA), celulasa (CEL) y xilanasa (XYL) . La tabla 1 muestra el rendimiento de glucoamilasa (GA), a-amilasa estable en condiciones ácidas (ASAA), celulasa (CEL) y xilanasa (XYL) en cada uno de los productos de cultivo de mohos koji (koji líquido) obtenidos cultivando mohos koji en los medios líquidos que contienen cebada en bruto en diferentes cantidades.
La actividad de glucoamilasa (GA) se midió usando un kit de cuantificación fraccional de capacidad de sacarificación (elaborado por Kikkoman Corporation). Para medir la actividad de a-amilasa (ASAA) estable en condiciones ácidas, se modificó ligeramente el procedimiento descrito en Sudo S. y cols.: J. Ferment. Bioeng., 76, 105-110 (1993), Sudo S. y cols.: J. Ferment. Bioeng., 77, 483-489 (1994) y Shigetoshi Sudo y cols.: Journal of the Brewing Society of Japan, 89, 768-774 (1994). Es decir, se inactivó a-amilasa inestable en condiciones ácidas tratando el producto con ácido y después se midió actividad de a-amilasa con un kit de medición de a-amilasa (elaborado por Kikkoman Corporation). Para ser más específicos, se añadieron 9 ml de solución tampón de ácido acético 100 mM (pH 3) a 1 ml del líquido de cultivo, se llevó a cabo tratamiento con ácidos a 37 °C durante 1 hora y después se midió con el kit de medición de a-amilasa (elaborado por Kikkoman Corporation).
Se midieron después las actividades de celulasa y xilanasa que son enzimas de degradación de fibras vegetales.
Primero, la actividad celulasa (CEL) se midió por el procedimiento que reduce sacárido generado a partir de hidrólisis enzimática de carboximetilcelulosa (en adelante, abreviada como CMC) como un sustrato se permitió reaccionar con DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico) y se cuantificó ese incremento de absorbancia a 540 nm. Para ser más específicos, se añadió 1 ml del líquido de cultivo a 1 ml de solución de sustrato de CMC al 1 % (Low Viscosity™ producido por Sigma-Aldrich se disolvió en solución tampón de ácido acético 100 mM (pH 5)) y el total se sometió a reacción enzimática a 40 °C de forma precisa durante 10 minutos. Después de eso, se añadieron a la mezcla 4 ml del reactivo DNS conteniendo 0,75 % de ácido dinitrosalicílico, 1,2 % de hidróxido de sodio, 22,5 % de tartrato potásico-sódico tetrahidratado y 0,3 % de monohidrato de lactosa y el total se mezcló bien, terminando de este modo la reacción. Con el fin de cuantificar la cantidad de sacárido reducida en la solución después de la finalización de la reacción, la solución después de la finalización de la reacción se calentó en baño de agua en ebullición de forma precisa durante 15 minutos. Subsiguientemente, la solución se enfrió a temperatura ambiente, se determinó la absorbancia a 540 nm, cuantificando de este modo la cantidad del sacárido reducido correspondiente a aquella de glucosa. Una unidad de la actividad de celulasa (CEL) se representó por la cantidad de enzima requerida produciendo sacárido reducido correspondiente a 1 mmol de glucosa por minuto. Para ser específicos, una unidad de la actividad de celulasa se representó por la cantidad de enzima requerida produciendo sacárido reducido correspondiente a 1 mmol de glucosa por minuto en la condición de reacción de 40 °C durante 10 minutos.
A continuación, la actividad xilanasa (XYL) se midió por aquel sacárido reducido generado a partir de hidrólisis enzimática de xilano derivado de cascarilla de avena como un sustrato se dejó reaccionar con DNS y ese incremento de absorbancia a 540 nm se cuantificó. Para ser más específico, se añadió 0,1 ml del líquido de cultivo a 1,9 ml de solución de sustrato de xilano al 1 % (Xilano, de cascarilla de avena producido por Sigma-Aldrich se disolvió en solución tampón de ácido acético 200 mM (pH 4,5)) y el total se sometió a reacción enzimática a 40 °C de forma precisa durante 10 minutos. Después de eso, se añadieron a la mezcla 4 ml del reactivo DNS conteniendo 0,75 % de ácido dinitrosalicílico, 1,2 % de hidróxido de sodio, 22,5 % de tartrato potásico-sódico tetrahidratado y 0,3 % de monohidrato de lactosa y el total se mezcló bien, terminando de este modo la reacción. Con el fin de cuantificar la cantidad de sacárido reducida en la solución después de la finalización de la reacción, la solución después de la finalización de la reacción se calentó en baño de agua hirviendo de forma precisa durante 15 minutos. Subsiguientemente, la solución se enfrió a temperatura ambiente, se determinó la absorbancia a 540 nm, cuantificando de este modo la cantidad del sacárido reducido correspondiente a aquella de xilosa. Una unidad de la actividad de xilanasa se representó por la cantidad de enzima requerida produciendo sacárido reducido correspondiente a 1 mmol de xilosa por minuto en la condición de reacción de 40 °C durante 10 minutos.
Como se muestra en la Tabla 1, se confirmó que el equilibrio de generación de diversas enzimas difiere dependiendo de la cantidad de cebada en bruto usada. En particular, se encontró que actividades de celulasa (CEL) y xilanasa (XYL) fueron aptas para incrementarse significativamente en los lotes experimentales conteniendo 1,8 % o menos cebada en bruto a usarse. En particular, se generaron celulasa (CEL) y xilanasa (XYL) en una manera equilibrada mientras que se generaron altamente también glucoamilasa (GA) y a-amilasa estable en condiciones ácidas (ASAA) en una manera equilibrada en el lote experimental al 1,7 %.
De acuerdo con ello, se reveló que actividades de las enzimas distintas de glucoamilasa (GA) y a-amilasa estable en condiciones ácidas (ASAA), particularmente las enzimas de degradación de fibras vegetales tales como celulasa (CEL) y xilanasa (XYL) fueron capaces de potenciarse controlando de forma fina la cantidad de cebada a usarse.
[Tabla 1]
Cantidad de cebada en bruto a usarse
Actividad enzimática (U/ml)
GA
ASAA CEL XYL
2,0 %
212,3 12,3 0,07 3,3
1,9 %
223,5 11,4 0,08 3,6
1,8 %
224,5 10,6 0,15 6,4
1,7 %
213,3 10,2 0,20 8,9
1,6 %
204,6 9,5 0,17 8,7
1,5 %
194,5 8,5 0,16 8,0
1,4 %
187,4 7,4 0,14 7,0
10 Ejemplo 2
Fermentación alcohólica usando producto de cultivo de mohos koji (koji líquido) que tiene actividad potenciada de enzimas de degradación de fibras vegetales
La fermentación alcohólica se llevó a cabo usando los productos de cultivo de mohos koji (koji liquido) obtenido en el Ejemplo 1 cultivando con el medio líquido al que se añadió cebada en bruto en una cantidad del 2,0 % (p/volumen), el
15 1,7 % (p/volumen) y el 1,4 % (p/volumen).
Los productos de cultivo de mohos koji se obtuvieron cada uno como en el Ejemplo 1 cultivando mohos koji con los medios líquidos preparados cada uno añadiendo a ello cebada en bruto en una cantidad de 2,0 % (p/volumen) para el lote de control, 1,7 % (p/volumen) para el lote 1 de la presente invención y 1,4 % (p/volumen) para el lote 2 de la presente invención. Se usaron 70 ml de cada uno de los productos de cultivo de mohos koji para el malteado de
20 cebada por 184,6 g en total en la combinación del malteado mostrada en la Tabla 2. La temperatura para fermentación se mantuvo a 25 °C en el malteado que comprende 5 días de elaboración de malta primaria, 2 días del malteado secundario y 13 días del malteado terciario.
Como cebada adicional, se usó Striling descortezada al 65 % de Australia que se hubo lavado con agua, seguida por inmersión de 60 minutos, drenaje de 30 minutos y después cocción al vapor de 35 minutos. Además, se suministraron
25 42,4 g de cebada adicional en el malteado primario. Se usó levadura de shochu (levadura de sorgo) como la levadura y se inoculó con 50 ml de la levadura de shochu que se hubo cultivado estáticamente en el medio YPD a 30 ºC durante 48 horas.
[Tabla 2] 10
Malta
Principal
Secundario Terciario Total
Cebada adicional (g)
42,4 71,1 71,1 184,6
Agua (ml)
45,0 107,2 38,2 190,4
Producto de cultivo de moho Koji (koji líquido) (ml)
70,0 - - 70,0
Ácido láctico al 90 % (ml)
0,2 - - 0,2
FIG. 1 muestra el procedimiento de fermentación. El procedimiento de fermentación tuvo lugar sin problemas en cada una de las áreas experimentales. En particular, la fermentación tuvo lugar de forma agresiva en el lote al 1,7 % en el que se generaron diversas enzimas en una forma equilibrada. Las maltas remojadas finales tienen contenidos de alcohol del 18,0 % para el lote al 2,0 % (lote de control), del 19,2 % para el lote al 1,7 % (lote 1 de la presente invención) y del 18,6 % para el lote al 1,4 % (lote 2 de la presente invención). Es decir, se observó contenido de alcohol alto en el lote al 1,7 % (lote 1 de la presente invención).
Además, la FIG. 2 muestra resultados de medida de viscosidad de maltas remojadas finales con un viscómetro rotacional. Como es evidente a partir de la FIG. 2, las viscosidades en el lote al 1,7 % (lote 1 de la presente invención) y en el lote al 1,4 % (lote 2 de la presente invención), cada una de las cuales tiene una actividad potenciada de una cualquiera de celulasa (CEL) y xilanasa (XYL), disminuye significativamente en comparación con aquella en el lote al 2,0 % (lote de control). La disminución se supone que tiene lugar debido a la descomposición de la fibra vegetal incluida en gran cantidad en cebada como materia prima por acción de celulasa (CEL) o xilanasa (XYL). La disminución en viscosidad se supone que da grandes efectos tales como mejora en fluidez de malta, facilitación de transferencia líquida y promoción de eficiencia en operaciones de destilación.
A partir de los resultados, se reveló que las enzimas de degradación de fibras vegetales tales como celulasa (CEL) y xilanasa (XYL) fueron capaces de generarse y acumularse de forma conjunta simultáneamente con al menos glucoamilasa y a-amilasa estable en condiciones ácidas en cultivo de mohos koji en un medio líquido, conteniendo el medio líquido como la materia prima de cultivo el cereal o similar del que la superficie está cubierta enteramente o parcialmente con al menos cáscaras. Se confirmó que cuando la fermentación con alcohol se llevó a cabo usando el producto de cultivo de mohos koji (koji líquido) en el que las actividades de esas enzimas de degradación de fibras vegetales estaban potenciadas, no solo se incrementó la cantidad de alcohol a obtenerse, sino que también se disminuyó la viscosidad de malta. Así, se proporciona posibilidad en promoción significativa de eficiencia en la producción.
La malta puede producir shochu de cebada con destilación única subsiguiente y proporciona fácilmente alcohol (etanol) industrial con destilación continua.
Ejemplo 3
Producción de producto seco de producto de cultivo de mohos koji
(I) Producción de producto de cultivo de mohos koji (koji líquido)
1) Procedimiento de precultivo: 8 g de cebada descortezada al 65 % (Stirling, de Australia) y 100 ml de agua se pusieron dentro de un matraz cónico de 500 ml provisto de paneles y el total se esterilizó a 121 °C durante 15 minutos con autoclave, obteniéndose de este modo un medio de precultivo. Un moho koji blanco (Aspergillus kawachii NBRC4308) se inoculó a 1 x 106/ml dentro del procedimiento de precultivo y se cultivó agitando a 37 °C y a 100 rpm durante 24 horas, obteniéndose de este modo un líquido de precultivo.
2) Procedimiento de cultivo principal: Se preparó un medio líquido que contiene 2,0 % (p/volumen) de cebada descortezada al 98 %, 0,2 % (p/volumen) de nitrato de potasio y 0,3 % (p/volumen) de dihidrogenofosfato de potasio.
3.000 ml del medio líquido se pusieron en un fermentador de jarra de 5.000 ml (elaborado por B. E. Marubishi Co., Ltd.) y el total se esterilizó a 121 °C durante 15 minutos con autoclave, obteniéndose de este modo un medio de cultivo principal. El medio de cultivo principal se inoculó con 30 ml del líquido de precultivo mencionado anteriormente. Después de eso, se llevó a cabo cultivo durante 42 horas a una temperatura de 37 ºC, una velocidad de agitación de 300 rpm y un volumen de aireación de 0,5 vvm, obteniéndose de este modo producto de cultivo de mohos koji (koji líquido).
(II) Producción de producto seco de producto de cultivo de mohos koji (koji líquido)
200 ml del producto de cultivo de mohos koji (koji líquido) obtenido en sección (I) se pre-congelaron a -30 °C durante 2 horas. Después de eso, el producto resultante se secó a 25 °C a un grado de vacío de 66,66 pascales (0,5 Torr) durante 24 horas, obteniéndose de este modo 2,7 g de producto seco de cultivo de mohos koji (koji líquido), es decir, producto seco de congelación al vacío del producto de cultivo de mohos koji.
(III) Medida de actividades enzimáticas
Para el producto de cultivo de mohos (koji líquido), es decir, producto no secado, que se obtuvo en sección (I) y el producto secado de producto de cultivo de mohos koji (koji líquido), es decir, producto seco, que se obtuvo en la sección (II), se midieron rendimientos de glucoamilasa (GA) y a-amilasa estable en condiciones ácidas (ASAA).
La actividad de glucoamilasa se midió usando un kit de cuantificación fraccional de de capacidad de sacarificación (elaborado por Kikkoman Corporation). Para medir la actividad de a-amilasa estable en condiciones ácidas, el procedimiento descrito en Sudo S. y cols.: J. Ferment. Bioeng., 76, 105-110 (1993), Sudo S. y cols.: J. Ferment. Bioeng., 77, 483-489 (1994) y Shigetoshi Sudo y cols.: Journal of the Brewing Society of Japan, 89, 768-774 (1994) se modificó ligeramente. Es decir, se inactivó a-amilasa inestable tratando el producto de cultivo con ácido y después se midió actividad a-amilasa estable en condiciones ácidas con un kit de medida de a-amilasa (manufacturado por Kikkoman Corporation). Siendo más específicos, se añadieron 9 ml de solución tampón de ácido acético 100 mM (pH 3) a 1 ml de líquido de cultivo y se llevó a cabo tratamiento con ácidos a 37 °C durante 1 hora y se midió con el kit de medición de a-amilasa (elaborado por Kikkoman Corporation).
5 Las actividades enzimáticas del producto seco de producto de cultivo de mohos koji (koji liquido), es decir, producto seco, se midieron con la sustancia obtenida disolviendo 270 mg del producto seco de producto de cultivo de mohos koji (koji liquido), es decir, producto seco, en 20 ml de tampón de acetato 10 mM (pH 5).
La Tabla 3 muestra los resultados de medida de las actividades enzimáticas en el producto no secado obtenido en la sección (I) y el producto seco obtenido en la sección (II).
10 Como se muestra en la tabla 3, se confirmó que el koji líquido no pierde sus actividades enzimáticas incluso cuando el koji líquido se secó por congelación y el producto en seco de koji líquido fue capaz así de usarse suficientemente para el malteado de shochu.
[Tabla 3]
Actividad enzimática (U/ml)
Glucoamilasa
a-amilasa estable frente a ácidos
Producto secado
no 156,8 10,8
Producto seco
154,0 10,2
Ejemplo 4
15 Fermentación de alcohol usando producto de cultivo de mohos koji (koji líquido)
La fermentación alcohólica se llevó a cabo usando el producto no secado y el producto seco obtenido cada uno en el Ejemplo 3 (representando lote no secado y lote seco, respectivamente).
Es decir, 100 ml del producto no secado o 1,35 g del producto seco obtenidos cada uno en el Ejemplo 3 se usaron para elmalteado de cebada a 3,7 g en total en la combinación de elaboración de malta como se muestra en las Tablas 4 y 5,
20 respectivamente. La temperatura para fermentación se mantuvo a 25 °C y se llevó a cabo elaboración de malta de dos etapas que comprende 4 días del maltado primario y 17 días del malteado secundario.
Como cebada adicional, se usó Striling descortezada al 65 % de Australia que se hubo lavado con agua, seguida por inmersión de 60 minutos, drenaje de 30 minutos y después cocción al vapor de 35 minutos. Se usó levadura de shochu (levadura de sorgo) como la levadura y se inoculó con 50 ml de la levadura de shochu que se hubo cultivado
25 estáticamente en el medio YPD a 30 ºC durante 48 horas.
[Tabla 4] [Tabla 5]
Lote no secado ( malteado con producto no secado)
malteado primario
malteado secundario Total
Cebada adicional (g)
100 207 307
Agua (ml)
50 279 329
Producto no secado (ml)
100 - 100
Ácido láctico para destilación (ml)
0,2 - 0,2
Lote seco (malteado con producto seco)
maltedo primario
malteado secundario Total
Cebada adicional (g)
100 207 307
Agua (ml)
150 279 429
Producto seco (ml)
1,35 - 1,35
Lote seco (malteado con producto seco)
malteado primario
malteado secundario Total
Ácido láctico para destilación (ml)
0,2 - 0,2
FIG. 3 muestra procesos de fermentación de maltas remojadas en el lote no secado y el lote seco, que se obtuvieron por reducción acumulativa en peso de las maltas remojadas.
5 Como un resultado, es evidente a partir de la FIG. 3, casi no se observó diferencia con respecto al proceso de fermentación entre el lote no secado que representa malteado de producto no seco y el lote seco que representa malteado de producto seco. Los contenidos de alcohol en las maltas remojadas finales obtenidas fueron el 19,6 % para el lote no secado y el 19,4 % para el lote seco. Así, la fermentación tuvo lugar bien en ambos lotes experimentales.
Ejemplo 5 (ejemplo comparativo):
10 Producción de etanol usando producto de cultivo de moho koji de arroz en bruto (koji líquido)
(I) Producción de producto de cultivo de mohos koji de arroz en bruto (koji líquido)
1) Procedimiento de precultivo: 8 g de arroz descortezado al 90 % (koshihikari) y 100 ml de agua se pusieron dentro de un matraz cónico de 500 ml provisto de paneles y el total se esterilizó a 121 °C durante 15 minutos con autoclave, obteniéndose de este modo un medio de precultivo. Un moho koji blanco (Aspergillus kawachii NBRC4308) se inoculó
15 a 1 x 106/ml dentro del medio de precultivo y se cultivó agitando a 37 °C y 100 rpm durante 24 horas, obteniéndose de este modo un líquido de precultivo.
2) Procedimiento de cultivo principal: 8 g de arroz en bruto (koshihikari) del que se eliminaron solo cascarillas del mismo, 0,2 g de KNO3, 0,3 g de KH2PO4 y 100 ml de agua se pusieron dentro de un matraz cónico de 500 ml provisto de paneles y el total se esterilizó a 121 °C durante 15 minutos con autoclave, obteniéndose de este modo un medio de
20 cultivo (se prepararon 5 matraces del medio de cultivo principal). Se inoculó 1 ml de cada uno de los líquidos de precultivo al medio de cultivo principal y después se cultivó con agitación a 37 °C y 100 rpm durante 72 horas, obteniéndose de este modo un producto de cultivo de mohos koji de arroz en bruto (koji líquido).
La Tabla 6 muestra actividades enzimáticas en el producto de cultivo de mohos koji de arroz en bruto (koji líquido).
Como se muestra en la Tabla 6, el producto de cultivo de mohos koji de arroz en bruto (koji líquido) se confirmó que 25 tiene buenas actividades de glucoamilasa y de a-amilasa estable en condiciones ácidas.
[Tabla 6]
Actividad enzimática
Producto de cultivo de mohos koji de arroz en bruto
Actividad glucoamilasa
135 U/ml
Actividad a-amilasa estable en condiciones ácidas
11 U/ml
(II) Alimentación y fermentación
La combinación de alimentación fue como se muestra en la Tabla 7. Se cultivó levadura de shochu (levadura 30 Kagoshima) en 10 ml del medio YPD a 30 °C durante 1 día. Después de eso, 1 ml de líquido de cultivo de la levadura se centrifugó y la levadura precipitada se lavó dos veces con agua esterilizada. Una cantidad total de la levadura
recogida se usó como la levadura. El producto de cultivo de mohos koji de arroz en bruto (koji líquido) obtenido en la sección (I), la levadura anteriormente mencionada, el arroz adicional (arroz descortezado de Koshihikari), ácido láctico al 90 % y agua se pusieron en un aparato de cocción al vapor continua y ebullición continua. La fermentación se llevó a cabo en la condición de temperatura constante de 25 °C durante 16 días. Después de 3 días a partir del primer malteado, se llevó a cabo el segundo malteado.
[Tabla 7]
Materia prima
Cantidad de uso
malteado primario
malteado secundario Total
Producto de cultivo de moho koji de arroz en bruto (koji líquido) (ml)
350 - 350
Arroz adicional (g)
300 600 900
Agua (ml)
500 650 1150
Ácido láctico al 90 % (ml)
1 - 1
Una malta de producto de cultivo de mohos koji de arroz en bruto (koji líquido) después de finalización de la fermentación, que se obtuvo como se describe anteriormente, tuvo un contenido de alcohol del 19,1 %.
(III) Producción de alcohol (etanol) industrial
La malta del producto de cultivo de mohos koji de arroz en bruto después de finalización de la fermentación, que se obtuvo en la sección (II), se destiló de forma continua con un aparato de microdestilación (HP-1000T de tipo especial, elaborado por Sibata Scientific Technology Ltd.), recogiendo de este modo alcohol (etanol) industrial.
El alcohol (etanol) industrial obtenido tenía un contenido de alcohol del 95,3 %.
Adicionalmente, fue también capaz de producirse una malta teniendo un contenido de alcohol alto cuando se empleó un producto de cultivo de mohos koji (koji líquido) con cebada en bruto como materia prima. Consecuentemente, fue capaz de producirse alcohol (etanol) industrial sin ningún defecto de calidad.
Como se describe anteriormente, se reveló que fue capaz de producirse alcohol (etanol) industrial usando producto de cultivo de mohos koji (koji líquido).
Aplicabilidad industrial
De acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, el koji líquido que tiene actividad potenciada de enzimas de degradación de fibras vegetales tales como enzimas celulolíticas (celulasa) y enzimas xilanolíticas se puede producir por cultivo líquido en vez de por cultivo sólido sin usar una preparación de enzimas de degradación de fibras vegetales cara y una bacteria recombinante. Además, de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención, puede haber producido producto seco de koji líquido que tiene actividades altas de glucoamilasa, a-amilasa estable en condiciones ácidas y enzimas de degradación de fibras vegetales y es adicionalmente excelente en propiedad de manejo. Adicionalmente, el producto está en estado seco, así hay una ventaja que está oportunamente disponible incluso para producción inesperada.
De acuerdo con el noveno aspecto de la presente invención, se puede producir eficientemente alcohol (etanol) industrial por un procedimiento de fermentación usando el koji líquido que tiene suficientemente actividades enzimáticas requeridas para fermentación alcohólica. Así, se espera que la presente invención se utilice de forma efectiva en un campo de producción de alimentos y bebidas, un campo de industria química y un campo de industria energética.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un procedimiento de producción de koji líquido que tiene actividad potenciada de una enzima celulolítica y una enzima xilanolítica cultivando mohos koji blanco o mohos koji negro con un medio líquido que contiene cebada, cebada desnuda o trigo, estando la superficie cubierta enteramente con cáscaras, en el que la cantidad de cebada, cebada desnuda o trigo en el medio líquido se hace al 1,4 al 1,8 % (p/volumen) para generar y acumular simultáneamente al menos glucoamilasa, a-amilasa estable en condiciones ácidas, una enzima celulolítica y una enzima xilanolítica en el producto de cultivo de mohos koji.
  2. 2.
    El procedimiento de producción de koji líquido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la condición de cultivo se hace a 37 ºC durante 42 horas según se cultivan los mohos koji blanco o los mohos koji negro con un medio líquido que contiene cebada, cebada desnuda o trigo, estando la superficie cubierta enteramente con cáscaras, generando y acumulando simultáneamente al menos glucoamilasa, a-amilasa estable en condiciones ácidas, una enzima celulolítica y una enzima xilanolítica en el producto de cultivo de mohos koji.
  3. 3.
    Un procedimiento de producción de un producto seco de koji líquido con medio líquido que comprende, obtener koji líquido por el procedimiento de la reivindicación 1 o 2 y secar el koji líquido.
  4. 4.
    Un procedimiento de producción de una preparación enzimática que comprende, obtener koji líquido por el procedimiento de la reivindicación 1 o 2 y usar el koji líquido.
  5. 5.
    Un procedimiento de producción de al menos una enzima seleccionada del grupo que consiste en glucoamilasa, a-amilasa estable en condiciones ácidas, una enzima celulolítica y una enzima xilanolítica, comprendiendo el procedimiento obtener koji líquido producido por el procedimiento de la reivindicación 1 o 2.
  6. 6.
    Un procedimiento de producción de un alimento fermentado o una bebida fermentada que comprende, obtener koji líquido por el procedimiento de la reivindicación 1 o 2 y usar el koji líquido.
  7. 7.
    El procedimiento de producción de un alimento fermentado o una bebida fermentada de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el alimento fermentado o la bebida fermentada comprende shochu.
  8. 8.
    Un procedimiento de producción de un alimento fermentado o una bebida fermentada que comprende, obtener un producto seco de koji líquido por el procedimiento de la reivindicación 3 y usar el producto en seco de koji líquido.
  9. 9.
    Un procedimiento de producción de un alimento fermentado o una bebida fermentada que comprende, obtener una preparación enzimática por el procedimiento de la reivindicación 4 y usar la preparación enzimática.
  10. 10.
    Un procedimiento de producción de un alimento fermentado o una bebida fermentada que comprende, obtener al menos una enzima seleccionada a partir del grupo que consiste en glucoamilasa, a-amilasa estable en condiciones ácidas, una enzima celulolítica y una enzima xilanolítica por el procedimiento de la reivindicación 5 y usar la enzima.
  11. 11.
    Un procedimiento de producción de etanol que comprende, obtener koji líquido por el procedimiento de la reivindicación 1 o 2 y usar el koji líquido.
  12. 12.
    Un procedimiento de producción de etanol que comprende, obtener un producto seco de koji líquido por el procedimiento de la reivindicación 3 y usar el producto en seco de koji líquido.
  13. 13.
    Un procedimiento de producción de etanol que comprende, obtener una preparación enzimática por el procedimiento de la reivindicación 4 y usar la preparación enzimática.
  14. 14.
    Un procedimiento de producción de etanol que comprende, obtener al menos una enzima seleccionada a partir del grupo que consiste en glucoamilasa, a-amilasa estable en condiciones ácidas, una enzima celulolítica y una enzima xilanolítica por el procedimiento de la reivindicación 5 y usar la enzima.
  15. 15.
    El procedimiento de producción de koji líquido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el medio líquido contiene cebada o cebada desnuda, estando la superficie enteramente cubierta con cáscaras y la cantidad de la cebada o cebada desnuda en el medio líquido se hace al 1,4 al 1,8 % (p/volumen).
    Fig. 1
    Periodo de fermentación (días)
    Fig. 2
    Fig. 3
    Periodo de fermentación (días)
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