WO2019062709A1 - 一种重组牛血清蛋白成熟肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种重组牛血清蛋白成熟肽，其氨基酸残基序列如SEQ IID NO：1所示，编码所述重组牛血清蛋白成熟肽的优化核苷酸序列如SEQ IID NO：3所示；所述重组牛血清蛋白成熟肽制备方法包括：人工合成牛血清蛋白成熟肽的优化基因；然后将该基因整合到表达载体中，并用该载体转化各种宿主细胞进行表达；通过培养已转化的宿主细胞，得到的发酵液中含有大量的重组蛋白；再对发酵液进行分离纯化即得。上述重组牛血清蛋白经质谱检测与天然牛血清蛋白成熟肽序列完全一致，具有免受动物病毒污染，纯度高等优点，是天然牛血清蛋白替代品，可以应用在生化医药等行业中。

Description

一种重组牛血清蛋白成熟肽及其制备方法和应用 技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种重组牛血清蛋白成熟肽及其制备方法和应用。

背景技术

牛血清蛋白是牛血清中的主要蛋白，它可与多种阳离子、阴离子以及其他小分子物质结合。在血液中，牛血清蛋白主要起维持渗透压作用、pH缓冲作用、载体作用以及营养作用。在体外，牛血清蛋白在生化实验中有着广泛的应用，例如用作各种限制酶或修饰酶的稳定剂，免疫组化、酶联免疫吸附法等免疫反应的封闭剂，以及用作动物细胞培养基成分之一。其中，牛血清蛋白作为限制酶或修饰酶稳定剂，有着巨大的市场。

近年来，由于受到疯牛病等病毒的威胁，人们对于动物来源制品的要求也越来越高。传统从牛血液中提取制备牛血清蛋白的方法，虽然通过后续各种检测方法能检测出已知病毒等污染物，但对于未知的病毒，显得无能为力。而且一旦检测出疯牛病等病毒污染，通过这种耗时耗力的方法获得的牛血清蛋白就要被销毁掉，这无疑是一种巨大的浪费。

目前市场上销售的无动物病毒的牛血清蛋白很少，主要是新英格兰公司(NEB)开发的重组牛血清蛋白，但是上述重组蛋白与天然牛血清蛋白的成熟肽序列相比，在N端多出6个氨基酸残基，由于蛋白质的N端对蛋白质的生物活性有着非常重要的作用，这种差异在一定程度上会造成其与天然蛋白之间产生巨大的功能差异，并进一步限制其应用。

由此可见，现有技术还存在较大缺陷。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种更接近天然牛血清蛋白的成熟肽的重组牛血清蛋白成熟肽及其制备方法和应用；本发明的重组牛血清蛋白经质谱检测与天然牛血清蛋白成熟肽序列完全一致，具有免受动物病毒污染，纯度高等优点，是目前为止天然牛血清蛋白最佳替代品，可以广泛应用在生化医药等行业中。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种重组牛血清蛋白成熟肽，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO：1所示。

一种重组牛血清蛋白成熟肽，编码所述重组牛血清白蛋白成熟肽的优化核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

进一步的，所述优化的核苷酸序列是按照表达宿主密码子偏好性进行密码子优化。

进一步的，所述重组牛血清蛋白成熟肽的氨基序列与自然型牛血清白蛋白成熟肽氨基酸序列具有100％相似性。

一种含有如SEQ ID NO：3所示的优化核苷酸序列的重组载体、重组菌、重组细胞或试剂盒。

一种重组牛血清蛋白成熟肽的制备方法，操作方法包括：

(1)人工合成上述牛血清蛋白成熟肽的优化核苷酸序列；

(2)将(1)中合成基因整合到表达载体中，并用该载体转化宿主细胞进行表达；

(3)通过培养(2)中已转化的宿主细胞，得到的发酵液中含有大量的重组蛋白；

(4)对(3)中所得发酵液进行分离纯化，获得高纯度的重组牛血清蛋白成熟肽。

进一步的，步骤(2)中所述宿主细胞为食品级酵母。

进一步的，所述酵母包括克鲁维酵母细胞、酿酒酵母、马克思克鲁维酵母、汉逊氏酵母或毕赤酵母中的一种。

进一步的，步骤(4)中所述分离纯化方法采用离子交换层析法。

进一步的，所述重组牛血清蛋白成熟肽或所述方法制得的牛血清白蛋白成熟肽应用于制备医药保健食品、其他酶类的保护剂或调味品等；维持渗透压、pH缓冲、载体作用。

进一步的，所述重组牛血清蛋白成熟肽或所述方法制得的牛血清白蛋白成熟肽应用于β-葡聚糖酶的热稳定剂。

进一步的，所述重组牛血清蛋白成熟肽或所述方法制得的牛血清白蛋白成熟肽的终浓度为：0.2％-1％。

进一步的，所述重组牛血清蛋白成熟肽或所述方法制得的牛血清白蛋白成熟肽的终浓度为1％。

本发明有益效果：

本发明通过人工合成牛血清蛋白成熟肽基因，按照宿主密码子偏好性进行密码子优化，有利于BSA在宿主中进行高效表达；然后将该基因整合到表达载体中，并用该载体转化宿主细胞进行表达，再通过培养已转化的宿主细胞，得到的发酵液中含有大量的重组蛋白；然后采用离子交换层析对发酵液进行分离纯化，获得高纯度的重组牛血清蛋白成熟肽。这种方法易于工业化生产，全程操作易控，特别是对于病毒、细菌或其他因素所带来的污染，能得到有效控制甚至完全避免。且所获得的重组牛血清蛋白经质谱检测与天然牛血清蛋白成熟肽 序列完全一致，具有免受动物病毒污染，纯度高等优点，是目前为止天然牛血清蛋白最佳替代品，可以广泛应用在生化医药等行业中。

酵母已成为世界上研究最多的微生物之一，是当今生物技术产品研究开发的热点和现代生物技术发展、基因组研究的模式系统。科学证明，酵母菌作为宿主细胞有利于机遇难得多次复制。克鲁维酵母是一般认为安全(GRAS，Generally Recognized as Safe，FDA认证)的菌株之一，利用基因工程的方法大规模分泌表达牛血清蛋白成熟肽，目的蛋白可以占到上清总蛋白的80％以上，利用这种方法获取具牛血清蛋白成熟肽有明显的优势。所获得的重组蛋白在生化医学等领域具有多种用途，具有免受动物病毒污染，纯度高，成本低等优点。

附图说明

图1、重组pKLAC1-BSA物理图谱。

图2、含有重组牛血清蛋白成熟肽基因片段的核苷酸电泳：1、2泳道分别是分子量标准和BSA扩增产物。

图3、含有牛血清蛋白成熟肽基因的重组克鲁维酵母发酵上清SDS-PAGE：泳道1为Marker，泳道2为β-乳球蛋白阳性对照，泳道3为重组牛血清蛋白成熟肽，泳道4为空白对照。

图4、BSA1和BSA2为纯化后的牛血清蛋白电泳图

图5、重组牛血清蛋白作为β-葡聚糖酶的热稳定剂应用效果检测结果。

图6、重组牛血清蛋白成熟肽Western-blot：第一泳道为天然牛血清蛋白标准品(S1)，第二泳道为重组牛血清蛋白成熟肽(S2)，第三泳道为空白对照。

图7、重组牛血清蛋白质谱鉴定报告英文版；鉴定结果为天然的牛血清蛋白。

图8、重组牛血清蛋白质谱鉴定报告中文版；鉴定结果为天然的牛血清蛋白

图9、不同宿主及优化前后表达差异的蛋白电泳图，泳道1为毕赤酵母GS115表达优化后的BSA，其表达量为120ug/mL；泳道2为毕赤酵母表达野生BSA，其表达量为83ug/mL；泳道3为克鲁维酵母表达野生BSA，其表达量为210ug/mL；泳道4为克鲁维酵母表达优化后BSA，其表达量为430ug/mL、泳道五为marker。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案作进一步清楚、完整地描述。需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

重组牛血清蛋白成熟肽的表达

根据NCBI公布的牛血清蛋白成熟肽的氨基酸序列(NCBI登录号：NP_851335)，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；利用OptimumGene按照宿主密码子偏好性对其对应的碱基序列SEQ ID No.2进行优化，优化位点多达200多处，优化之后的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，SEQ ID No.3所示的序列更有利于牛血清蛋白在异源宿主克鲁维酵母的高效表达，并正确折叠包装。委托金斯瑞生物 科技有限公司人工合成优化后的牛血清蛋白的成熟肽基因序列。

对合成的基因用引入XhoI和NotI两端酶切位点，引入位点所用的引物为：

bsa-F:CCGCTCGAGGACACTCACAAGTCTGAAAT；

bsa-R:TTGCGGCCGCTTAAGCCAAAGCAGTTTGAGTAG；

扩增体系：引物BSA-F1(10mM)1uL、引物BSA-R1(10mM)1uL、模版1uL(10ng/uL)、Prime STAR Mix 25uL、补ddH2O至50uL；

扩增程序如下：98℃，10s；63℃，5s；72℃，10s；循环数30次。

扩增产物电泳显示泳道2在1700bp处有明显亮带(如图2)，获得的基因片段采用XhoI和NotI酶切，然后引入pKLAC1质粒(购于NEB公司)中，得到的重组质粒命名为pKLAC1-BSA(图1)，经酶切及测序检测(英潍捷基生物公司)，序列正确(如SEQ ID No：4)。

酶切体系(50μL)：限制性内切酶共2μL，酶切缓冲液5μL，质粒＜1μg，剩余体积用水补齐。

连接体系(15μL)：连接酶反应液7.5μL，长片段5μL，短片段2.5μL。

将pKLAC1-BSA采用SacII线性化后，电转化感受态克鲁维酵母GG799(购于NEB，货号E1000S)，电转化条件：0.2cm电转杯，3.0kV，电转一次。在终浓度为5mM乙酰胺的YCBA琼脂培养基上进行转化子筛选。

挑取转化子于YCBA平板上进行多次划线分离，挑单菌落进行菌落PCR验证，菌落PCR上下游引物为：P-F：5’GCGGATAACAAGCTCAAC3’、P-R：5’TTATCGCACAAGACAATC3’；PCR 程序如下：98℃，10s；63℃，5s；72℃，1min；总反应循环数30次，经菌落PCR验证后，挑取单菌落于15mL YPD培养基中，30℃培养20h，3000g离心5min取上清进行SDS-PAGE。分析结果如图3，可以看出发酵上清中的产物蛋白质分子量(泳道3)在66.4kDa左右，符合标准牛血清蛋白的分子量范围，可见牛血清蛋白基因在克鲁维酵母中获得了高效表达。泳道2为β-乳球蛋白对照，泳道4为空白对照。

YCBA培养基：1.17％YCB，2％琼脂,5mM乙酰胺；

YPD培养基：1％酵母粉,2％蛋白胨,2％葡萄糖。

实施例2

重组牛血清蛋白成熟肽发酵及纯化

1、重组牛血清蛋白发酵

挑取重组克鲁维酵母于YPD平板上在30℃培养40h，挑取单菌落于100mL YPD培养基中，30℃培养24h，然后转接至5L发酵罐(3000mL YPD培养基)中，30℃培养至OD ₆₀₀＝8，即为种子液。然后将种子液转入至50L发酵罐(30L发酵培养基)，维持pH在6.5，待溶氧降低至10以下后，开始流加补料培养基，通过补料来维持溶氧在30，整个发酵过程持续60h。

发酵培养基：5％酵母粉,2％大豆蛋白胨,4％葡萄糖。

补料培养基：8％酵母粉,2％葡萄糖，2％半乳糖。

2、重组牛血清蛋白成熟肽的纯化

发酵结束后，6000rpm离心收集上清，经微滤(0.45μm)除去大分子颗粒后经超滤(MWCO＝30kDa)浓缩后，上样至用0.02M NaClpH7.8缓冲液预平衡的CM柱，继续用0.1M NaCl pH7.8缓冲液 洗杂，直至基线走平；换0.2M NaCl pH7.8缓冲液洗杂直至基线走平；再用0.5M NaCl pH7.8的缓冲液将目的蛋白洗脱。含目的蛋白洗脱液经0.02M NaCl pH7.8缓冲液预平衡的G25凝胶柱进行脱盐。

纯化得到的蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色显示，与蛋白Marker对照，在56kDa处有一条目的条带(图4)，BSA1和BSA2为纯化后的样品，液相纯度达到98％以上。

pH7.8缓冲液配方：81mL 0.2M Na2HPO4+19mL 0.2M NaH2PO4，使用前用无菌水稀释10倍。

实施例3

重组牛血清蛋白成熟肽的鉴定

1、Western-Blot鉴定

将纯化得到的重组牛血清蛋白成熟肽和天然牛血清蛋白标准品分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，在80V电压下，将聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维膜上，转膜过程持续3h以上。取出硝酸纤维膜，用TBST润洗两次，然后放入含5％脱脂奶粉的TBST孵育过夜，封闭完毕后，将BSA鼠源单抗(Protntech公司)按1:5000比例加入含5％脱脂奶粉的TBST中，将硝酸纤维素膜浸入其中室温孵育1h。孵育结束后，采用TBST漂洗3次，每次10min。然后再将膜放入含有辣根过氧化氢酶标记的羊抗鼠二抗中(1:5000，Protntech公司)进行孵育，50min后，将膜取出进行漂洗，漂洗5次，每次持续6min，然后在暗房中进行显色反应。

Western-Blot结果见图6，结果表明，天然牛血清蛋白标准品1和重组牛血清蛋白成熟肽2结果极为接近，本发明纯化获得的重组牛血清蛋白与天然牛血清蛋白(BSA)大小完全一致，待质谱鉴定是否 与天然牛血清蛋白相同。

2、质谱鉴定

实验流程：

胶内酶解(trypsin，20h)→抽提酶解肽段→ZipTip脱盐MALDI-TOF/TOF质谱测试→软件分析→鉴定蛋白质

具体实验步骤：

1)胶内酶解及ZipTip脱盐

将胶粒切碎后转入EP管中，加入200-400μL100mMNH4HCO3/30％ACN脱色液，清洗脱色至透明，弃上清，加入100mM NH ₄HCO ₃，室温孵育15min。弃上清，加入5μL2.5-10ng/μL测序级Trypsin(Promega)溶液，37℃反应过夜；吸出酶解液，转移至新EP管，原管加入100μL60％ACN/0.1％TFA，超声15min，合并酶解液冻干；若有较多盐分，则用ZipTip(Millipore)进行脱盐。

2)质谱分析

冻干后的酶解样品，取2μL 20％乙腈复溶。取1μL溶解样品，直接点于样品靶上，让溶剂自然挥发干燥后，再取0.5μL过饱和CHCA基质溶液(溶剂为50％ACN0.1％TFA)点至对应靶位上并自然干燥。样品靶经氮气吹净后放入仪器进靶槽并用串联飞行时间质谱仪(5800MALDI-TOF，AB SCIEX)进行分析，激光源为355nm波长的Nd:YAG激光器，加速电压为2kV，采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据，一级质谱(MS)扫描范围为800-4000Da，选择信噪比大于50的母离子进行二级质谱(MS/MS)分析，每个样品点上选择8个母离子，二级质谱(MS/MS)累计叠加2500次，碰撞能量2kV，CID关闭。

3)数据库检索

质谱测试原始文件用Mascot2.2软件检索相应的数据库，最后得到鉴定的蛋白质结果与天然牛血清蛋白一致。见检测结果图7和图8，针对重组的BSA样品，经过质朴分析后，与NCBI牛属和克鲁维酵母蛋白数据库比对发现，在牛属匹配到相应BSA蛋白，说明在克鲁维酵母中重组表达的BSA与天然牛血清蛋白是一致的。

实施例4

重组牛血清蛋白成熟肽在毕赤酵母中的表达

根据合成后的BSA基因，引入酶切位点EcoRI和NotI，设计引物如下：

BSA-F1：CGGGAATTCGACACTCACAAGTCTGAAAT，

BSA-R1:TTGCGGCCGCTTAAGCCAAAGCAGTTTGAGTAG

在序列两端引入合适的酶切位点EcoRI和NotI。扩增体系是：引物BSA-F1(10mM)1uL、引物BSA-R1(10mM)1uL、模版1uL(10ng/uL)、Prime STAR Mix 25uL、补ddH ₂O至50uL；扩增程序如下：98℃，10s；63℃，5s；72℃，10s；循环数30次。对获得的基因片段采用EcoRI和NotI酶切，然后引入pPIC9K质粒(购于NEB公司)中，得到的重组质粒命名为pPIC9K-BSA，经酶切及测序检测(英潍捷基生物公司)，序列正确。毕赤酵母表达载体所用质粒pPIC9K为商业化质粒，其图谱和序列本领域的技术人员均可容易获取。pPIC9K-BSA载体构建中的酶切连接体系都是本领域的常规技术手段，本领域技术人员可轻松获取并执行。

将载体pPIC9K-BSA用SacII线性化后，电转GS115毕赤酵母，在MD板上筛选转化子，在添加G418的YPD板上筛选拷贝数较高的转 化子。毕赤酵母的电转为本领域的常规技术手段，可参照技术手册进行。

将转化子GS115-BSA单菌落挑于含50mLBMGY培养基的250mL的三角瓶中，30℃，250rpm过夜培养；室温3000g离心5min收集菌体，用10mL BMMY培养基重悬细胞于50mL离心管中继续培养；每隔24h添加终浓度为0.5％的甲醇继续诱导BSA表达；每隔24h取样测BSA含量，第五天表达量累计到最高峰。

实施例5

未优化的野生型BSA在克鲁维酵母和毕赤酵母中的表达

野生BSA在克鲁维酵母中的表达的具体过程如实施例1，区别仅在于用野生BSA基因替代优化后的BSA基因。

野生型BSA在毕赤酵母中的表达的具体过程如实施例4(区别仅在于用野生BSA基因替代优化后的BSA基因)。

未优化的BSA在宿主中的表达量明显低于优化后的BSA的表达量；毕赤酵母中BSA的表达量又明显低于其在克鲁维酵母中的表达量。结果参见图9，其中，泳道1为毕赤酵母GS115表达优化后的BSA，其表达量为120ug/mL；泳道2为毕赤酵母表达野生BSA，其表达量为83ug/mL；泳道3为克鲁维酵母表达野生BSA，其表达量为210ug/mL；泳道4为克鲁维酵母表达优化后BSA，其表达量为430ug/mL、泳道五为marker；说明克鲁维酵母更适合作为BSA表达的宿主，且优化后的BSA基因明显更具优势。

实施例6

重组牛血清蛋白作为β-葡聚糖酶的热稳定剂

重组BSA溶解于pH4.8的磷酸缓冲液中，β-葡聚糖酶粉末也溶 解于pH4.8的磷酸缓冲液中，终浓度为1％。

配制BSA与β-葡聚糖酶混合液，β-葡聚糖酶终浓度为0.5％，BSA分别为0％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％；将混合液至于60℃水浴中温浴1h，然后测β-葡聚糖酶残余酶活，0％组为对照组，相对活性为100％。结果如图5,1％的BSA能够显著提高β葡聚糖酶的热稳定性，随着BSA浓度的进一步提高，其对酶的保护作用并不会无限增加。BSA可以防止酶分子之间相互作用导致的聚合变性，从而提高酶的热稳定性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1. 一种重组牛血清蛋白成熟肽，其氨基酸残基序列如SEQ IID NO：1所示。
2. 根据权利要求1所述的重组牛血清蛋白成熟肽，其特征在于，编码所述重组牛血清白蛋白成熟肽的优化核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3. 根据权利要求1所述的重组牛血清蛋白成熟肽，其特征在于，所述重组牛血清蛋白成熟肽的氨基序列与自然型牛血清蛋白成熟肽氨基酸序列具有100％相似性。
4. 一种含有如SEQ IID NO：3所示的优化核苷酸序列的重组载体、重组菌或重组细胞。
5. 一种重组牛血清蛋白成熟肽的制备方法，操作方法包括：

   (1)人工合成权利要求2所述的牛血清蛋白成熟肽的优化核苷酸序列；

   (2)将(1)中合成核苷酸序列整合到表达载体中，并用该载体转化宿主细胞进行表达；

   (3)通过培养(2)中已转化的宿主细胞，得到含有大量的重组蛋白的发酵液；

   (4)对(3)中所得发酵液进行分离纯化，获得高纯度的重组牛血清蛋白成熟肽。
6. 根据权利要求5所述的重组牛血清蛋白成熟肽的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为食品级酵母。
7. 根据权利要求6所述的重组牛血清蛋白成熟肽的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为克鲁维酵母细胞、酿酒酵母、马克思克鲁维酵母、汉逊氏酵母或毕赤酵母中的一种。
8. 将权利要求1-3任一项所述的重组牛血清蛋白成熟肽、权利要求4所述的重组载体、重组菌或重组细胞，或权利要求5-7任一项所述的制备方法制得 的重组牛血清蛋白成熟肽应用于制备医药保健食品、酶类保护剂、调味品。
9. 将权利要求1-3任一项所述的重组牛血清蛋白成熟肽或权利要求5-7任一项所述的制备方法制得的重组牛血清蛋白成熟肽应用作β-葡聚糖酶的热稳定剂。
10. 将权利要求1-3任一项所述的重组牛血清蛋白成熟肽或权利要求5-7任一项所述的制备方法制得的重组牛血清蛋白成熟肽应用作β-葡聚糖酶的热稳定剂时，所述重组牛血清蛋白成熟肽的终浓度为0.2％-1％。

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