CN117362401A - 一种牛病毒性腹泻病毒n蛋白及其作为自我切割蛋白的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种牛病毒性腹泻病毒N蛋白及其作为自我切割蛋白在制备基因工程蛋白中的应用。本发明首先意外发现了一种具有自我切割蛋白活性的牛病毒性腹泻病毒N蛋白，所述牛病毒性腹泻病毒N蛋白在大肠杆菌中可高效自我切割，其编码基因可作为原核表达载体元件，在常用启动子载体中可高效表达，与目的蛋白融合可实现可溶性表达，且在表达过程中同时实现切割，产生具有真实N端氨基酸的活性目的蛋白；同时可利用凝胶过滤色谱或目的蛋下游的标签纯化上游标签去杂的策略，最终获得具有真实N端氨基酸的活性目的蛋白。

Description

一种牛病毒性腹泻病毒N蛋白及其作为自我切割蛋白的应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种牛病毒性腹泻病毒N蛋白及其作为自我切割蛋白在制备基因工程蛋白中的应用。

背景技术

目前在基因工程蛋白生产中多利用细菌、酵母、动物细胞表达系统，在蛋白药物、酶制剂、疫苗抗原的生产中占有核心地位，具有可实现大规模、高效率蛋白生产，保证蛋白的产量和质量。其中，大肠杆菌系统具有易于快速大规模实现目标蛋白高水平表达、操作简单、成本低廉、表达调控灵活、纯化方便等优点，因而成为首选表达系统，但大肠杆菌表达外源基因易于形成包涵体，需要后续进行蛋白重新折叠，以呈现靶蛋白生物活性。大肠杆菌蛋白表达过程中由于甲酰化酶或氨肽酶的不完全作用，会导致N端甲酰甲硫氨酸的甲酰基或N端甲硫氨酸的去除不均一性。现有商品化载体大多提供融合表达的策略实现外源基因的表达，但多数生物体内的蛋白在翻译后存在切割的过程，活性对N端的氨基酸要求严格。虽然利用识别特定连接子序列的蛋白酶例如凝血酶、TEV蛋白酶、HRV 3C蛋白酶等可对N端标签蛋白进行切割，但在目的蛋白N端会保留额外氨基酸，不能获得含N端真实氨基酸的活性蛋白。溴化氰可起始甲硫氨酸和下游氨基酸残基之间的肽键，但由于存在毒性以及内源甲硫氨酸的非特异性断裂，广泛应用业存在限制。肠激酶和Xa因子完全去除标签和连接序列，但也可能造成目的蛋白的裂解，也存在蛋白酶的成本和分离难度。

发明内容

针对上述技术问题，本发明意外发现氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的1v亚型牛病毒性腹泻病毒N蛋白具有自我切割蛋白活性在，原核表达系统中可高效自我切割与下游肽分离，表达纯化后获得具有N端真实氨基酸的基因工程蛋白，可用于基因工程药物的开发。具体包括以下内容：

第一方面，本发明提供了一种牛病毒性腹泻病毒N蛋白，所述牛病毒性腹泻病毒N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明提供了一种编码上述第一方面所述牛病毒性腹泻病毒N蛋白的基因，所述基因序列如SEQ ID NO.2所示。

第三方面，本发明提供了上述第一方面所述的牛病毒性腹泻病毒N蛋白作为自我切割蛋白的应用。

第四方面，本发明提供了一种自我切割的融合蛋白，所述融合蛋白包含结构：N–Y；

其中，Y为切割后的活性目的蛋白；

N为权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒N蛋白；

所述N位于融合蛋白的氮端。

优选地，所述融合蛋白还包含His标签；所述His标签位于Y的下游。

优选地，所述融合蛋白还包含GST标签，所述GST标签位于N的上游。

优选地，所述融合蛋白还包含HA标签和/或flag标签，所述HA标签和/或flag标签位于Y的下游和/或位于GST标签的上游。

优选地，所述融合蛋白的结构为：HA标签-GST标签-N-Y-His标签。

优选地，所述Y选自TNF-α。

第五方面，本发明提供了一种表达自我切割蛋白的表达载体，所述表达载体为将编码上述第一方面所述融合蛋白的基因构建到原核表达载体后获得。

优选地，所述原核表达载体含有trc启动子或T7启动子。

优选地，所述原核表达载体选自pET系列表达载体、pQE系列表达载体或pBAD系列表达载体。

优选地，所述原核表达载体选自pPROExHTb、pET-22b、pET-32a。

第六方面，本发明提供了一种含有编码上述第四方面所述融合蛋白的基因或上述第五方面所述表达载体的重组细胞。

优选地，所述细胞选自原核细胞。

优选地，所述原核细胞选自：BL21(DE3)、Rosetta(DE3)。

第七方面，本发明提供了一种制备具有真实N端氨基酸的活性目的蛋白的方法，所述方法包括：

(1)构建含有编码上述第四方面所述融合蛋白的基因或上述第五方面所述表达载体的重组细胞；

(2)诱导培养所述重组细胞，收获培养基，或裂解细胞以收获裂解物；

(3)纯化获得具有真实N端氨基酸的活性目的蛋白。

优选地，所述步骤(1)中融合蛋白的结构为：HA标签-GST标签-N-Y-His标签。

优选地，所述步骤(3)中纯化方法包括：使用Ni-NTA琼脂糖纯化树脂对目的蛋白进行纯化，再利用GST树脂吸附保留只含C端His标签的活性目的蛋白。

本发明的有益效果是：本发明首先意外发现了一种具有自我切割蛋白活性的牛病毒性腹泻病毒N蛋白，所述牛病毒性腹泻病毒N蛋白在大肠杆菌中可高效自我切割，其编码基因可作为原核表达载体元件，在常用启动子载体中可高效表达，与目的蛋白融合可实现可溶性表达，且在表达过程中同时实现切割，产生具有真实N端氨基酸的活性目的蛋白，同时可利用凝胶过滤色谱或目的蛋下游的标签纯化上游标签去杂的策略，最终获得具有真实N端氨基酸的活性目的蛋白。

附图说明

图1本申请实施例1中N-C120-flag DNA片段PCR扩增结果；其中泳道M为DL2000marker，条带自上而下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1为N-C120-flag DNA扩增产物；

图2本申请实施例1中pPROExHTb-N-C120-flag重组菌诱导产物的Western Blot鉴定结果；其中M为蛋白Marker，条带自上而下分别为180kD，135kD，100kD，75kD，63kD，48kD，35kD，25kD，17kD，11kD；泳道1为pPROExHTb-N-C120-flag重组菌诱导产物；

图3本申请实施例2中N基因和HA-EGFP DNA片段的扩增结果；其中M1为DL2000marker，条带自上而下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；M2泳道为DL5000 marker，条带自上而下分别为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1为N基因扩增产物(frag1)；泳道2为HA-EGFP DN A扩增的产物(frag2)；

图4本申请实施例2中pET22b-N-HA-EGFP-His重组菌诱导产物的鉴定结果；其中M为蛋白marker，条带自上而下分别为180kD，135kD，100kD，75kD，63kD，48kD，35kD，25kD，17kD，11kD；泳道1为pET22b-N-HA-EHFP-His重组菌诱导产物。

图5本申请实施例3中重组质粒pET32a-HA-GST-N-TNF-His构建所用片段的扩增结果；其中M1泳道为DL5000 marker，条带自上而下分别为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；M2泳道为DL2000 marker，条带自上而下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1为pET32a载体扩增产物(frag3)；泳道2为HA-GST扩增产物(frag4)；泳道3为N基因与活性TNFα片段融合产物(frag5)。

图6本申请实施例3中pET32a-HAGST-N-TNFαHis重组菌诱导产物的Western Blot鉴定结果；其中M为蛋白marker，自上而下分别为180kD，135kD，100kD，75kD，63kD，48kD，35kD，25kD，17kD，11kD；泳道1为pET32a-HAGST-N-TNFαHis重组菌BL21(DE3)诱导上清，泳道2为pET32a-HAGST-N-TNFαHis重组菌BL21(DE3)诱导沉淀；泳道3为pET32a-HAGST-N-TNFαHis重组菌Rosetta(DE3)诱导上清，泳道4为pET32a-HAGST-N-TNFαHis重组菌Rosetta(DE3)诱导沉淀；泳道5为BL21(DE3)菌体对照；泳道6为Rosetta(DE3)菌体对照；

图7本申请实施例3中活性TNFα纯化产物；其中M为蛋白marker，自上而下分别为130kD，95kD，72kD，55kD，43kD，33kD，25kD，20kD，15kD；泳道1为活性TNFα纯化产物。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。

实施例1BVDV N基因的自我切割活性

根据大肠杆菌密码子偏好性设计1v亚型BVDV N基因(SEQ ID NO.2所示)，根据此序列由生物公司合成包含N基因及其下游C基因120nt的DNA片段(SEQ ID NO.4所示)，利用引物N-F：5’-ttcagggcgccatgggatccATGGAGTTGATTTCAAAC-3’(SEQ ID NO.5所示)和flag-C120-R：5’-ttggtaccgcatgcctcgagCTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCCGGTGGTCTCGT CTTACT-3’(SEQ ID NO.6所示)扩增N基因以及相邻C基因(120nt)，扩增结果如图1所示；表明，获得与预期大小一致的DNA片段。

回收目的片段N-C120-flag(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)，取100ng与利用BamHI、Xho双酶切处理的pPROExHTb载体(100ng)共同转化BL21(DE3)感受态细胞，利用含60μg/mL氨苄青霉素的琼脂培养基筛选阳性克隆，提取质粒测序验证后，将重组菌进行培养发酵，分别利用HRP标记的抗His单克隆抗体，检测融合蛋白His-N-C120-flag的表达获切割情况。结果表明，将N-C120-flag片段克隆至pPROExHTb载体中His标签下游获得的pPROExHTb-His-N-C120-flag重组载体具有正确的读码框。将重组菌在OD₆₀₀为0.6时加入IPTG(终浓度为1mM)，诱导培养6-8h，进行蛋白电泳转印至PVDF膜，利用抗His抗体检测，结果如图2所示，可检出约42kD的融合蛋以及切割后形成的带His标签的N端片段，约35kD，表明本申请所述的1v基因型BVDV N基因在大肠杆菌中具有良好的自我切割活性。

实施例2BVDV N基因介导HA-EGFP的切割

利用引物N22b-F：5’-tatcggaattaattcggatccgATGGAGTTGATTTCAAAC-3’(SEQ IDNO.7所示)和N-R：5’-tgggtaGCAACTTGTAACCCACAGAGGG-3’(SEQ ID NO.8所示)扩增片段1(frag1，SEQ ID NO.9所示)，利用引物HA-EGFP-F：5’-gggttacaagttgcTACCCATAC GATGTTCCAGATTACGCTGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3’(SEQ ID NO.10所示)和EGF P-R：5’-gtggtggtggtggtgctcgagCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’(SEQ ID NO.11所示)，从pCMV-N-EGFP质粒(上海碧云天生物技术有限公司)扩增片段2(frag2，SEQ ID NO.12所示)，结果如图3所示。

分别取片段1和片段2各100ng，与利用BamHI、Xho双酶切处理的pET-22b载体(100ng)，利用多片段一步法快速克隆试剂盒(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)进行重组反应，重组产物转化BL21(DE3)感受态细胞，利用含60μg/mL氨苄青霉素的琼脂培养基筛选阳性克隆，提取质粒测序验证后表明frag1和frag2重组至pET-22b载体His标签上游获得的重组质粒pET22b-N-HA-EGFP-His具有正确的读码框。将重组菌在OD₆₀₀为0.6时加入IPTG(终浓度为1mM)，诱导培养6-8h，进行蛋白电泳转印至PVDF膜，利用HRP标记的抗HA抗体进行检测，结果如图4所示，可见约63kd未完全切割的融合蛋白以及切割形成的约35kD的融合蛋白的C端部分，表明选取的BVDV N蛋白可在大肠杆菌表达过程中从N-HA-EGFP-His融合蛋白(SEQ ID NO.13所示)自我切割下来，产生HA-EGFP-His目的蛋白(SEQ ID NO.14所示)。

实施例3基于自我切割蛋白N的活性蛋白分子的表达纯化

利用引物pET-32a-F：5’-GCCAGAACCAGAACCGGC-3’(SEQ ID NO.15所示)和pET-32a-R：5’-CACCACCACCACCACCACTG-3’(SEQ ID NO.16所示)，以pET-32a为模板，扩增获得pET-32a(+)载体(frag3，SEQ ID NO.17所示))，通过这种扩增的方法，可以去掉原载体中多克隆位点上游的His标签编码序列而只保留多克隆位点下游的His标签。利用引物HA-GST-F：5'-tggccggttctggttctggctacccatacgatgttccagattacgctATGTCCCCTATACTAGGT-3'(SEQID NO.18所示)和GST-R：5'-tcaactccatGTCACGATGCGGCCGCTC-3'(SEQ ID NO.19所示)，从pGEX-4T-1扩增获得GST基因(frag4，SEQ ID NO.20所示)，以引物GST-N-F：5'-gcatcgtgacATGGAGTTGATTTCAAACGAACTTT-3'(SEQ ID NO.21所示)和TNF-N-R：5'-tctgacGCAACTTGTAACCCACAGAGGG-3'(SEQ ID NO.22所示)扩增获得N基因片段，利用引物TNF229-F：5'-gggttacaagttgcGTCAGATCATCTTCTCGAACCCC-3'(SEQ ID NO.23所示)和TNF699-R：5'-cagtggtggtggtggtggtgCAGGGCAATGATCCCAAAGTA-3'(SEQ ID NO.24所示)，以实验室保存的TNFα质粒为模板，扩增获得活性TNFα编码片段(SEQ ID NO.25所示)，利用引物GST-N-F和TNF699-R，以N基因片段和活性TNFα编码片段为模板进行融合PCR，获得片段5(frag5，SEQ ID NO.26所示)，结果如图5所示。

取frag3、frag4、frag5片段各100ng，利用多片段一步法快速克隆试剂盒(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)进行重组反应，重组产物转化JM109感受态细胞，利用含60μg/mL氨苄青霉素的琼脂培养基筛选阳性克隆，提取质粒测序验证后表明将frag4(HA-GST)和frag5(N-TNFα)重组至frag3(PCR扩增获得的只含下游His编码序列的线性化pET-32a+载体)中His编码序列上游获得的重组载体pET32a-HA-GST-N-TNFαHis具有正确的读码框。将pET32a-HA-GST-N-TNFα-His质粒转化BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态细胞，重组菌在OD₆₀₀为0.6时加入IPTG(终浓度为1mM)，诱导培养6-8h，收集菌液，利用超声波处理20min(功率100W，每破碎5s后间隔2s)，然后10 000g，4℃离心10min，分别将上清和沉淀进行蛋白电泳，转印至PVDF膜，利用HRP标记的抗GST单克隆抗体检测蛋白的表达和可溶性情况，结果如图6所示，HA-GST-N-TNFα-His融合蛋白(SEQ ID NO.27所示)在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中可实现部分可溶性表达。

参照Ni-NTA琼脂糖纯化树脂操作说明，对上清中的目的蛋白进行纯化，之后利用GST树脂吸附，保留只含C端His标签的活性TNFα，结果如图7所示，纯化后可获得条带较为单一的活性TNFα。

上述结果表明，所述牛病毒性腹泻病毒N蛋白在大肠杆菌中可高效自我切割，其编码基因可作为原核表达载体元件，在常用启动子载体中可高效表达，与目的蛋白融合可实现可溶性表达，且在表达过程中同时实现切割，产生具有真实N端氨基酸的活性目的蛋白，同时可利用凝胶过滤色谱或目的蛋下游的标签纯化上游标签去杂的策略，最终获得具有真实N端氨基酸的活性目的蛋白，可用于基因工程药物的开发。

以上所述的实施例仅表述了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可做出其它改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种牛病毒性腹泻病毒N蛋白，其特征在于，所述牛病毒性腹泻病毒N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述牛病毒性腹泻病毒N蛋白的基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒N蛋白作为自我切割蛋白的应用。

4.一种自我切割的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含结构：N–Y；

其中，Y为切割后的活性目的蛋白；

N为权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒N蛋白；

所述N位于融合蛋白的氮端。

5.如权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包含His标签；所述Hi s标签位于Y的下游。

6.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包含GST标签，所述GST标签位于N的上游。

7.如权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包含HA标签和/或flag标签，所述HA标签和/或flag标签位于Y的下游和/或位于GST标签的上游。

8.如权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述Y选自TNF-α。

9.一种表达自我切割蛋白的表达载体，其特征在于，所述表达载体为将编码权利要求4-8任一所述融合蛋白的基因构建到原核表达载体后获得。

10.一种含有编码权利要求4-8任一所述融合蛋白的基因或权利要求9所述表达载体的重组细胞。

11.一种制备具有真实N端氨基酸的活性目的蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)构建含有编码权利要求4-8任一所述融合蛋白的基因或权利要求9所述表达载体的重组细胞；

(2)诱导培养所述重组细胞，收获培养基，或裂解细胞以收获裂解物；

(3)纯化获得具有真实N端氨基酸的活性目的蛋白。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中融合蛋白的结构为：HA标签-GST标签-N-Y-His标签；

所述步骤(3)中纯化方法为：使用Ni-NTA琼脂糖纯化树脂对目的蛋白进行纯化，再利用GST树脂吸附，保留获得只含C端His标签的具有真实N端氨基酸活性的目的蛋白。