WO2012128661A1 - Гибридный белок, штамм бактерий escherichia coli - продуцент гибридного белка и способ получения безметионинового интерферона альфа-2ь человека из этого гибридного белка - Google Patents

Гибридный белок, штамм бактерий escherichia coli - продуцент гибридного белка и способ получения безметионинового интерферона альфа-2ь человека из этого гибридного белка Download PDF

Info

Publication number
WO2012128661A1
WO2012128661A1 PCT/RU2011/000556 RU2011000556W WO2012128661A1 WO 2012128661 A1 WO2012128661 A1 WO 2012128661A1 RU 2011000556 W RU2011000556 W RU 2011000556W WO 2012128661 A1 WO2012128661 A1 WO 2012128661A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
methionine
protein
sumo
interferon alpha
fusion protein
Prior art date
Application number
PCT/RU2011/000556
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Дмитрий Георгиевич КОЗЛОВ
Андрей Романович ЯКОВЕНКО
Владимир Адольфович ТЕЗОВ
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Фармапарк"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Фармапарк" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Фармапарк"
Publication of WO2012128661A1 publication Critical patent/WO2012128661A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • Hybrid protein Escherichia coli bacterial strain - producer of a hybrid protein and method for producing human methionine-free interferon alpha-2b from this hybrid protein
  • the invention relates to the field of biotechnology and relates to a method for producing a methionine-free (not containing a ⁇ -terminal methionine) human interferon alpha-2b.
  • Interferon alpha-2b is a variant of human interferon alpha-2 (IFN-a2), characterized by the presence of a guanine residue (G) at position 137 of the coding region.
  • IFN-a2 human interferon alpha-2
  • G guanine residue
  • IFN-a2 belongs to the class of cytokines with antiviral activity, and is a member of the alpha-interferon family, practically secreted all types of virus-infected human cells [Pfeffer et aL, 1998, Cancer Research 58: 2489-2499].
  • IFN-a2 Recombinant IFN-a2 is used to treat viral and tumor diseases [Samuel, 2001, Clinical Microbiology Reviews, 14: 778-809; Vogeldorf et aL, 2009, Annals of Oncology, 20 (Supplement 6): vi41-vi50; Pfeffer et aL, 1998, Cancer Research 58: 2489-2499], including for the treatment of solid tumors such as bladder cancer, kidney cancer, HIV-induced aposarcoma and others [Torti, 1988, J. Clin. OncoL 6: 476-483; Vugrin et ⁇ , 1985, Cancer Treat.Rep., 69: 817-820; Rios et al, 1985, J. Clin. Oncol, 3: 506-512].
  • IFN-a2 are the main therapeutic agents used to treat chronic forms of hepatitis B and C [Clark V., Nelson D.R., 2009, Clin Liver Dis, 13: 351-363].
  • the ⁇ -terminal amino acid residue of natural IFN-ot2 is cysteine linked by a disulfide bond to 98 protein cysteine [Bodo G., Fogy I., 1985, The Interferon System, pp. 23-27; Wetzel et al, 1981, J. Interfer. Res., 1: 381-90].
  • an additional methionine (formylmethionine) residue remains at the erichia coli (E. coli) cells, which makes recombinant IFN-oc2 a modified protein.
  • the removal (processing) of the ⁇ -terminal methionine is determined by the radius of the side radical of the amino acid residue of the synthesized protein following methionine [Hirel et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86 (21 ): 8247-51; Dalb0ge et al, FEBS Lett. 1990; 266 (1-2): 1-3].
  • methionine removal using methionine aminopeptidase [Shapiro et al, 1988, Anal. Biochem 175: 450-461; Solbiati et al, 1999, J Mol Biol, 290: 607-14; Liao et al, 2004, Protein Science, 13: 1802-1810];
  • the inventive method is based on the biosynthesis in E. coli cells of the precursor of methionine-free IFN-oc2 containing the sequence of mature interferon fused to the sequence of the yeast protein SUMO (Small Ubiquitine-like protein Modifier) [Johnson et al, ⁇ 991, EMBO J, 16 : 5509-5519; Muller et al, ⁇ 99%, EMBO J, 17: 61-70], belonging to the family of ubiquitin-like proteins (UPB).
  • UPB ubiquitin-like proteins
  • UPB are tags of protein nature that are used in labeling in eukaryotic cells other proteins, as a result of which the latter change their functional activity [Hochstrasser M., 2000, Science, 289: 563-564].
  • the UPB family includes proteins SUMO, Rubl, Hubl, ISG15, Apgl2, Apg8, Urml, Ana la and Ana lb.
  • the yeast genome Saccharomyces cerevisiae contains the SMT3 gene located between the nucleotide positions 1469403-1469708 of chromosome IV [NCBI database].
  • the SMT3 gene encodes a protein SMT3 - yeast SUMO.
  • Yeast SUMO is synthesized as a 101-amino acid precursor, of which 98 are mature proteins, of which residues 13-98 are important for the formation of its native structure [Mossessova E., Lima, C. D., 2000, Mol Cell, 5: 865-876].
  • Eukaryotic SUMOs including yeast SMT3 have a similar three-dimensional structure, which is similar to that of ubiquitin and is characterized by tightly laid beta layers wrapped around a single alpha helix [Bayer et ⁇ , 1998, J Mol Biol, 280: 275-286].
  • SUMO proteins from various organisms are synthesized as precursors containing C-terminal extensions from 2 to 12 amino acid residues that are a continuation of the conserved C-terminal extensions from 2 to 12 amino acid residues that are a continuation of the conserved C Gly-Gly end-motif [Miiller et ⁇ , 2001, Nature, 2: 202-210].
  • yeast Ulpl proteinase is able to process both protein precursors [Mossessova E., Lima C. D. , 2000, Mol. Cell, 5: 865-876].
  • Proteinase Ulpl belongs to the ULP cysteine proteinase family.
  • the catalytic domain of Ulpl proteinase is localized in the C-terminal region of the protein, in particular, its C- possesses full-fledged enzymatic activity terminal fragment of 275 amino acid residues [Li S.-J., Hochstrasser M, 2003, J Cell Biol, 160: 1069-1081; Butt et al, 2005, Protein Express Purif, 43: 1-9] (hereinafter, ULP275 proteinase).
  • Ulpl proteinase deconjugates SUMO and labeled target proteins, and is also responsible for processing the native SUMO precursor.
  • Ulpl proteinase The main well-known features of Ulpl proteinase are two: 1) the action of Ulpl proteinase is aimed at hydrolysis of peptide or isopeptide bonds connecting the conserved C-terminal Gly-Gly dipeptide of mature SUMO and the amino acid residue of the target protein; 2) by binding to the target protein, the ULP family proteinases recognize not a separate site, but the three-dimensional structure of SUMO proteins [Butt et al, 2005, Protein Express Purif, 43: 1-9; Wilkinson, 1997, FASEB J, 1 1: 1245-1256; Chang CH, Back SH, 1999, Biochem Biophys Res Commun, 266: 633-640].
  • SUMO systems are used to: 1) increase the expression of proteins in the cells of eukaryotic and prokaryotic organisms; 2) increasing the solubility of expressed proteins; 3) facilitating the process of protein purification due to the inclusion of affine ⁇ -terminal polypeptides in their composition; (4) obtaining proteins with altered ⁇ -terminal residues [Malakhov et al, 2004, J Struct Fund Genom, 5: 75-86].
  • the IkB protein at the junction with SUMO does not have a cysteine residue forming a disulfide bond.
  • Ulpl processing of the SUMO-IkB hybrid results in the release of the usual amino-terminal amino acid residue of the IkB protein, rather than a strong structural element containing a disulfide bond, as is required in the case of native methionine-free IFN-a2.
  • Ulpl SUMO proteinase can be summarized as follows: 1) it is known that Ulpl proteinase is able to hydrolyze a peptide bond connecting the conserved C-terminal Gly-Gly dipeptide of mature SUMO with any subsequent amino acid residue (except proline), which, in turn, can be linked by a single peptide bond to the following amino acid residue; 2) it is known that Ulpl proteinase is able to hydrolyze an isopeptide bond connecting the conserved C-terminal Gly-Gly dipeptide of mature SUMO with an amino acid residue of a protein (lysine), which in turn can be linked by two peptide bonds to adjacent amino acid residues of the protein; 3) it was not known whether Ulpl proteinase hydrolyze the peptide bond connecting the conserved C-terminal Gly-Gly dipeptide of mature SUMO with the amino acid residue of the protein (cysteine), which is bound to other amino acid residues of the protein by both peptide and
  • the closest analogue of the claimed strains is a recombinant strain of E. coli KCCM 10053 - producer of human interferon alpha-2b containing the ⁇ -terminal methionine [KR20000065580].
  • the closest analogue of the proposed method is the method [K 20000065580] for the preparation of human methionine-free interferon alpha-2b by digestion with methionine aminopeptidase from the composition of the precursor protein methionine-containing interferon synthesized in cells of E. coli strain KCCM 10053.
  • the main disadvantage of this method is the need for a long (12-20 hours) enzymatic treatment of the protein precursor.
  • the task of the claimed group of inventions is to expand the arsenal of methods for producing methionine-free human IFN-cc2.
  • the gene coding for the SUMO-2b fusion protein the precursor of the methionine-free interferon alpha-2b, an integral part of which is the sequence of human methionine-free interferon alpha-2b, fused to the sequence of the SUMO yeast SUMcharomyces cerevisiae protein;
  • SUMO-2b fusion protein An essential part of the SUMO-2b fusion protein is the SUMIN fusion protein, which contains the sequence of methionine-free interferon alpha-2b fused to the amino acid sequence of the yeast SUMO protein from 13 to 98 amino acid residues.
  • the composition of the hybrid protein containing the sequence of the SUMIN fusion protein an additional ⁇ -terminal extension of the fusion protein may be present, which is not essential for the implementation of the proposed method.
  • the inventive method is based on the biosynthesis of a hybrid protein SUMO-2b - the precursor of bezmethionine interferon alpha-2b containing the sequence of the SUMIN fusion protein, and subsequent release of the methionine-free interferon alpha-2b from the precursor during proteolytic processing using ULP275 proteinase.
  • the proposed method is based on the fact that we have established that, in contrast to proteinases, the activity of which is inhibited near the structural element of a protein containing a disulfide bond [Hubbard et ⁇ , 1994, Protein Sci, 3: 757-768; Hubbard et al, 1998, Protein Engineering, 1 1: 349-359], ULP275 proteinase is able to efficiently hydrolyze a peptide bond near such a structural element.
  • the property of the SUMO system that we discovered is used in the claimed method by subjecting the SUMO-2b fusion protein containing correctly established disulfide bonds to the enzymatic treatment, which allows enzymatic cleavage of the precursor of methionine-free IFN-oc2 simultaneously with its renaturation and leads to a significant reduction in the duration of the process of obtaining methionine-free IFN- ⁇ CC2.
  • ULP275 proteinase for the implementation of the proposed method is obtained using the engineered E. coli strain ECR-ULP275 (example 9).
  • the biosynthesis, isolation and purification of ULP275 proteinase is carried out as described in example 12.
  • strains of E. colv. claimed VKPM B-10879 and laboratory Origami-SUMO-2b - producers of the hybrid protein SUMO-2b - the precursor of methionine-free interferon alpha-2b.
  • the process of obtaining the inventive strain-producer of the hybrid protein SUMO-2b consists of several stages.
  • Step 1 Construction of recombinant plasmids.
  • the construction of recombinant plasmid DNA for the expression of the SUMO-2b fusion gene is based on the laboratory vector pET-22-15, which is a derivative of the vectors pET-22b (+) and pET-15b (+) (Novagen), which provides inducible gene expression in E cells .COI under the control of the T7 RNA polymerase promoter.
  • the designed plasmid pET-SUMO-2b in addition to the vector part, contains a DNA fragment of 800 base pairs in size that encodes the structural gene of the hybrid protein SUMO-2b, the precursor of human methionine-free interferon alpha-2b.
  • E. coli BL21 (DE3) and Origami 2 (DE3) (Novagen) strains using the T7 phage polymerase RNA gene on the chromosome are used as recipient strains.
  • the plasmid pET-SUMO-2b is introduced into the cells of these strains using a transformation process. Cells of both strains are prepared for transformation by treatment CaCl 2 [Maniatis et al., 1984, Moscow, Mir]. Transformed strains are selected on a selective medium containing the antibiotic ampicillin-sulfate [Maniatis et al., 1984, Moscow, Mir].
  • E. coli BL21 (DE3) and Origami 2 (DE3) (Novagen) strains using the T7 phage polymerase RNA gene on the chromosome are used as recipient strains.
  • the plasmid pET-SUMO-2b is introduced into the cells of these strains using a transformation process. Cells of both strains are prepared for transformation by treatment CaCl 2 [Man
  • coli strains are obtained: the inventive one, constructed on the basis of the recipient strain BL21 (DE3), and laboratory - based on Origami 2 (DE3).
  • the obtained strains in response to the introduction of an IPTG inducer into the culture medium [Maniatis et al., 1984, Moscow, Mir] are able to synthesize the hybrid protein SUMO-2b, the precursor of human non-methionine interferon alpha-2b.
  • VKPM All-Russian Collection of Industrial Microorganisms
  • Aerob gelatin does not thin, indole does not form.
  • As a carbon source it metabolizes glucose, sucrose and various organic acids, in some cases alcohols: ethanol, glycerin.
  • both mineral salts in ammonium and nitrate forms and organic compounds in the form of amino acids, peptone, tryptone, yeast extract, etc. are used.
  • potassium phosphates magnesium sulfate, sodium chloride, iron and manganese sulfates, chalk are used.
  • the inventive strain VKPM B-10879 and laboratory Origami- SUMO-2b in response to induction using IPTG or lactoses synthesize the SUMO-2b fusion protein, a precursor of human methionine-free interferon alpha-2b.
  • bacterial strains of E. coli are used that carry DNA fragments in the plasmid DNA encoding the synthesis of the hybrid protein SUMO-2b, the precursor of human methionine-free interferon alpha-2b.
  • the strains are cultured in a suitable nutrient medium, including sources of carbon, nitrogen and mineral salts, usually used to grow E. coli cells at temperatures from 24 ° C to 37 ° C [Maniatis et al., 1984, Moscow, Mir].
  • a suitable nutrient medium including sources of carbon, nitrogen and mineral salts, usually used to grow E. coli cells at temperatures from 24 ° C to 37 ° C [Maniatis et al., 1984, Moscow, Mir].
  • the IPTG inducer in a concentration of 0.1 to 2 mM or lactose in a concentration of 0.5% to 3% is introduced into the culture medium.
  • cells of producer strains accumulate the target SUMO-2b protein in the form of insoluble inclusion bodies in an amount of 5 to 30% of the total cell protein. Insoluble inclusion bodies are isolated and purified, and synthesized in their composition SUMO-2b fusion protein is subjected to dissolution [RU2319502].
  • SUMO-2b protein renaturation is carried out as described [RU2319502], except that ULP275 proteinase enzyme is introduced into the renaturation mixture.
  • Purified human methionine-free interferon alpha-2b has the following characteristics: purity no lower than 96%, the sequence of the first five ⁇ -terminal amino acids is identical to the sequence of native human non-methionine IFN-a2, specific activity is 2.0x10 IU / mg.
  • Example 1 Cloning of the gene of human interferon alpha-2b.
  • the human interferon alpha-2b gene is amplified in the NDP reaction using primers N466 (ataccatggaaaagagatgtgatctgcctcaaacccacagagctctggtagccgt) and N467 (atctcgagtcattctttacttctcttatataggtp of template 5 of the base changes in the amino acid sequence of the encoded protein.
  • the amplified DNA fragment with a size of 510 base pairs (bp) was eluted from the agarose gel using a Qiagen whale (Qiagen, cat.No 28706), digested with restriction enzymes Ncol and Xhol and cloned in the vector pUC18-NX containing the modified polylinker plasmids pUC18 sites Ncol and Xhol.
  • Plasmid pUC18-IFN2b carries the human interferon alpha-2b gene, the sequence of which contains the unique restriction enzyme site XmaJ 1.
  • Example 2 Cloning of the S.cerevisiae yeast SMT3 gene and construction of the SUMO-2b fusion protein gene.
  • the SMT3 gene is amplified by PCR using the S. cerevisiae Y618 strain as a chromosomal DNA template [Kartasheva et ⁇ , 1996, Yeast 12: 1297-1300]. Amplification is carried out in two stages. First, two overlapping DNA fragments are amplified, for which the following pairs of primers are used:
  • Fragment 1 with a size of 129 bp
  • Fragment 2 size 230 bp:
  • N468 (5 '-tacctaggctgtgggtttgaggcagatcacatccaccaatctgttctctgtga).
  • Amplified DNA fragments are eluted from an agarose gel as in Example 1, and their mixture is used for PCR ligation. To do this, PCR amplification is carried out on a mixture of fragments 1 and 2 as a matrix.
  • the amplification primers are N450 and N468.
  • the resulting 400 bp DNA fragment from PCR elute from agarose gel, treated with restriction enzymes Ncol and XmaJl and cloned into plasmid pUC18-IFN2b (Example 1) containing the interferon alpha-2b gene and split at the same sites. Cloning yields the plasmid pUC 18-SUMO-IFN2b, in which the nucleotide sequence of the cloned SMT3 gene is confirmed by sequencing.
  • the resulting plasmid pUC 18-SUMO-IFN2b contains a unique 803 bp Ncol / Xhol DNA fragment encoding the SUMO-2b fusion protein gene (SEQ ID NO. L), of which the SUMIN fusion protein (SEQ ID NO: 2 is an integral part) ), which is a sequence of human methionine-free interferon alpha-2b, fused to the SUMO protein sequence of the yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • the DNA of the vector pET-15b (+) (Novagen) was cleaved at the unique sites of Mlul and Ncol, the resulting 827 bp DNA fragment. elute from agarose gel, and clone in plasmid pET-22b (+) (Novagen), cleaved at the same sites.
  • Cloning yields the vector pET-22-15, which is used to clone the SUMO-2b fusion protein gene.
  • Example 4 Cloning of a DNA sequence encoding a proteinase ULP275.
  • the DNA sequence encoding the ULP275 proteinase is amplified by PCR using the laboratory strain S. cerevisiae Y618 as a chromosomal DNA template.
  • the amplification primers are N447 (5'-atatggatcctctttggaaaggaacataagga) and N448 (5'-attagaattctttaatgcatcggttaaaatcaaatgggcaat).
  • the result is the plasmid pUC18-ULP275, which confirms the structure of the ULP275 gene by determining its nucleotide sequence by standard methods.
  • Plasmid pUC 18-ULP275 contains a unique
  • Example 5 Obtaining the plasmid pET-SUMO-2b.
  • the recombinant plasmid pET-SUMO-2b is a collection of Sall / Ncol DNA fragment of the vector plasmid pET-22-15 (example 3) with a size of 5420 bp and an Ncol / Xhol DNA fragment of plasmid pUC 18-SUMO-IFN2b (Example 2) of 803 bp containing the SUMO-2b gene, a hybrid precursor of bezmethionine interferon alpha 2b.
  • plasmid pUC 18-SUMO-IFN2b (Example 2) was digested with restriction enzymes Ncol and Xhol, resulting in a 803 bp DNA fragment. elute from the gel and ligate with the DNA of pET-22-15 vector digested with restriction enzymes Ncol and Sail. Ligation is carried out using T4 phage DNA ligase. The result is the plasmid pET-SUMO-2b size 6223 p.
  • Plasmid pET-SUMO-2b is expression, it is used for the biosynthesis of the hybrid protein SUMO-2b, necessary for the production of recombinant human methionine-free interferon alpha-2b.
  • the gene for the SUMO-2b fusion protein is under the control of the T7 phage promoter.
  • Example 6 Obtaining the plasmid pET28-ULP275.
  • Plasmid pET28-ULP275 is obtained on the basis of the vector pET28b (+) (Novagen) in several stages.
  • a DNA fragment located between the Ncol and BamHI restriction sites is removed from the vector.
  • the pET28b (+) plasmid DNA is digested with restriction enzymes Ncol and BamHI, the sticky ends formed are blunt using the enzyme of the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I and ligated with T4 phage DNA ligase.
  • T4 phage DNA ligase In the 'result of a plasmid rET28- NB 1, which included the two restriction sites used are recovered.
  • the next step is to change the reading frame of the polypeptide initiated from the ATG codon, which is part of the Ncol site.
  • the plasmid ⁇ 28- ⁇ 1 DNA is cleaved with the Ncol restrictase, the sticky ends formed are blunt using the enzyme of the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I and ligated with T4 phage DNA ligase.
  • the result is the plasmid pET28-NB2, which is used to clone the proteinase gene ULP275.
  • plasmid pUC18-ULP275 (Example 4) was digested with BamHI and Xhol restriction enzymes, the resulting DNA fragment size 855 bp elute from the gel as in Example 1 and ligate with the DNA of the vector pET28-NB2 digested with restriction enzymes BATCH and Xhol. The result is the plasmid pET28-ULP275 size 6091 bp
  • Plasmid pET28-ULP275 is used for biosynthesis of ULP275 proteinase.
  • the ULP275 proteinase gene is under the control of the T7 phage promoter.
  • Example 7 Construction of the inventive strain of E. coli VKPM B-10879.
  • the E. coli strain BL21 (DE3) - VKPM B-6954 is used.
  • Plasmid pET-SUMO-2b (Example 5) was introduced into the cells of the recipient strain using a transformation process using CaC reagent [Maniatis et al., 1984, Moscow, Mir]. The transformant is selected on a selective medium containing the antibiotic ampicillin sulfate.
  • Strain VKPM B-10879 carries the expression plasmid pET-SUMO-2b and, in response to introducing IPTG inducer into the culture medium, is able to synthesize SUMO-2b fusion protein, which is used to produce methionine-free interferon alpha-2b.
  • Example 8 Construction of a laboratory strain of E. coli Origami-SUMO-2b.
  • E. coli Origami 2 (DE3) strain (Novagen), VKPM B-10187, carrying the T7 phage R7 polymerase gene on the chromosome is used as the recipient strain.
  • the construction of E. coli Origami- SUMO-2b strain was carried out as in Example 7.
  • the result is a laboratory strain of E. coli Origami-SUMO-2b, which carries the expression plasmid pET-SUMO-2b and, in response to introducing IPTG inducer into the culture medium, is able to synthesize the SUMO-2b fusion protein.
  • the E. coli strain ECR-ULP275 was obtained by the method as in example 8, except that the plasmid pET28-ULP275 was used to transform the E. coli BL21 (DE3) recipient strain - VKPM B-6954 (example 7).
  • E. coli strain ECR-ULP275 is obtained.
  • This strain carries the expression plasmid pET28-ULP275 and in response to introduction into the environment cultivation of the inducer IPTG is able to synthesize the proteinase ULP275, which is used to obtain methionine-free interferon.
  • Example 10 Biosynthesis and isolation of the hybrid protein SUMO-2b from cells of the inventive strain VKPM B-10879.
  • the strain is grown in flasks containing 50 ml of medium 2xYT composition (in wt.%): Tryptone-1.6, yeast extract -1, NaCI -0.5, water - the rest containing antibiotic kanamycin at a concentration of 40 ⁇ g / ml for 16-18 hours on an orbital rocking chair at a speed of 200-300 rpm. at a temperature of 37 ° C. Then, 50 ml of fresh 2xYT medium containing the antibiotic ampicillin sulfate at a concentration of 100 ⁇ g / ml and an IPTG inducer at a concentration of 80 ⁇ M were added to the flasks. After this, cultivation is continued for 3 hours.
  • medium 2xYT composition in wt.%: Tryptone-1.6, yeast extract -1, NaCI -0.5, water - the rest containing antibiotic kanamycin at a concentration of 40 ⁇ g / ml for 16-18 hours on an orbital rocking chair at a speed of 200
  • Cell biomass is separated from the medium by centrifugation (15,000g).
  • inclusion bodies containing an insoluble form of the SUMO-2b protein, the precursor of methionine-free interferon are isolated and washed. Isolation and washing of inclusion bodies are also carried out as the isolation and purification of an insoluble form of interferon [RU2319502].
  • the result is a coarse fraction of insoluble inclusion bodies containing the precursor of methionine-free interferon with a yield of at least 10% of the wet weight of cell biomass.
  • Example 1 Biosynthesis of a SUMO-2B hybrid protein by cells of a laboratory strain of Origami- SUMO-2B.
  • the biosynthesis of the SUMO-2b fusion protein by the cells of the laboratory strain Origami- SUMO-2b is carried out as in Example 10, except that the producer strain is the laboratory strain Origami-SUMO-2b.
  • the cells of the laboratory strain Origami- SUMO-2b accumulate the target protein SUMO-2b in an amount of not less than 10% of the total cell protein.
  • Cells were collected by centrifugation (15000g) and suspended in 5 ml of cell lysis buffer (LB buffer) of 50 mM Na x H 3-x P0 4 , pH 8.0; 300 mM NaCl; 20 mM Imidazole pH8.0; water is the rest. Lysozyme is added to the cell suspension to a concentration of 1 mg / ml and the mixture is kept for 30 minutes in ice. The suspension is voiced in ice 6 times for 30 seconds with 0.5-1.0 'breaks for cooling at an ultrasonic device power of 200-300W. The lysate is clarified by centrifuging it for 30 minutes at 10,000 g at a temperature of 4 ° C.
  • LB buffer cell lysis buffer
  • a column containing 1 ml of Ni-NTA agarose (Qiagen) is washed with 5 ml of LB buffer, after which a clarified lysate is applied to the column at a flow rate of 1 ml / min.
  • the column is washed successively with 10 ml of LB buffer, 10 ml of washing buffer with a composition of 50 mM Na x H3 -x P0 4 , pH 6.0; 300 mM NaCl; 10% glycerin; water - the rest, containing Imidazole pH 6.0 at a concentration of 20 mm; and 5 ml of wash buffer containing Imidazole pH 6.0 at a concentration of 150 mm.
  • the protein is eluted from the column using 2 ml of wash buffer, containing Imidazole pH 6.0 at a concentration of 450mM. Tween-20 is added to the resulting eluate to a concentration of 0.1%.
  • the resulting eluate is dialyzed against a buffer containing 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM dithiothreitol and 0.1% Tween-20.
  • the dialyzed preparation of the protein protein CJP275_ is diluted 2 times with glycerol and stored at -18 ° C.
  • Example 13 Obtaining and purification of bezmethionine interferon alpha-2b person.
  • Step 1 Dissolution, renaturation and processing of the hybrid protein SUMO-2b
  • SUMO-2b protein renaturation is carried out by diluting the resulting solution 100 times with a buffer of the composition: 20 mM Tris-HCl (pH8.0), 35 mM NaCI, 0.8 M urea, 0.1% Triton X-1 14, 1 mM oxidized glutathione, 1 mM reduced glutathione, water - the rest. Renaturation is carried out for 18 hours at a temperature of + 5-42 ° C and constant stirring at a speed of 80 rpm
  • the renaturation mixture with stirring at a speed of 120 rpm./min. add a solution containing ULP-275 proteinase at the rate of 4 mg proteinase per 12 g of inclusion bodies.
  • the resulting mixture was incubated for 3 hours at a temperature of +12 ° C with constant stirring at a speed of 80 rpm.
  • Enzymatic cleavage of SUMO-2b protein by ULP-275 proteinase is stopped by dilution and acidification of the reaction mixture. For this in the reaction mixture with stirring at a speed of 120 rpm. add in the indicated sequence the following components:
  • solution R The resulting solution of the target protein is called solution R.
  • the target protein capture procedure was carried out using a HC 50/20 column (GE Healthcare) with a working volume of 250 ml containing Fast Flow carboxymethyl sepharose sorbent (GE Healthcare). The working flow rate is 30 ml / min.
  • the column is equilibrated with 650 ml of B-8 buffer of 50 mM sodium acetate pH 5.0, 1 mM EDTA, water - the rest, after which the solution is applied the renatured and processed target protein is solution P. After applying the protein, the column is washed with 4 L of B-8 buffer.
  • the target protein is eluted with a simple linear gradient of 0-100% B-9 buffer of 50 mM sodium acetate, 0.5 M sodium chloride, 1 mM EDTA, pH 5.5, water - the rest, a gradient volume of 1200 ml. Elution of bezmethionine interferon alpha-2b is monitored by optical density at a wavelength of 280 nm. Obtained at this stage, the solution of methionine-free interferon alpha-2b is called CM-1 solution.
  • the procedure is carried out using a column with a working volume of 400 ml containing sorbent C 18.
  • the working flow rate is 50 ml / min.
  • the column is balanced with 700 ml of buffer A composition: 30% acetonitrile, 0.2% trifluoroacetic acid, water - the rest. After that, the solution CM-1 is applied to the column and the column is washed with 700 ml of buffer A.
  • Elution of methionine-free interferon alpha-2b is carried out with a complex linear gradient of 0-100% buffer. Composition: 80% acetonitrile, 0.2% trifluoroacetic acid, the rest is water. For elution use 3 l of buffer B. Elution is carried out sequentially according to the following scheme (buffer B in buffer A): • 0-20% - 300 ml;
  • the elution of methionine-free interferon alpha-2b is monitored by measuring the optical density of the eluate solution at a wavelength of 280 nm. Upon reaching a value of 50 mUE, 8 ml fractions are collected in glass tubes containing 4 ml of buffer B-1 1. After elution, the column is washed with 700 ml of buffer B.
  • the procedure is carried out using a HC 50/20 column (GE Healthcare) with a working volume of 250 ml containing Fast Flow carboxymethyl sepharose sorbent (GE Healthcare).
  • the working flow rate is 30 ml / min.
  • the column was equilibrated with 650 ml of B-8 buffer, after which the OF-1 solution was applied and the column was washed with 650 ml of B-8 buffer.
  • Elution is carried out at a flow rate of 15 ml / min with a simple linear gradient of 0-100% buffer B-9 with a length of 400 ml.
  • the elution of methionine-free interferon alpha-2b is monitored by measuring the optical density of the eluate solution at a wavelength of 280 nm. When a value of 50 mUE is reached, 10 ml fractions are collected in glass tubes. After elution, the column is washed with 350 ml of B-9 buffer.
  • CM-2 solution The collected eluate fractions were analyzed by HPLC. Fractions containing the target protein with a purity of at least 96% and passed through a filter with a pore diameter of 0.22 ⁇ m, after which the resulting solution of methionine-free interferon alpha-2b is called CM-2 solution.
  • the result is a highly purified (with a purity of not less than 96%) preparation of human methionine-free interferon alpha-2b,
  • the authenticity, concentration and purity of the protein in the resulting preparation is analyzed by vertical polyacrylamide gel electrophoresis with / without the addition of DTT, with silver staining, as well as by HPLC [Eur. Pharm., 5 ed .: 2004].
  • the described method allows to obtain at least 500 mg of methionine-free interferon alpha-2b from 10 g of the coarse fraction of inclusion bodies containing the protein SUMO-2B - the precursor of methionine-free interferon alpha-2b.
  • Example 14 The definition of the encryption alpha-2b.
  • the sequence of the five robe seriously prolonging the sequence of the five robe seriously affecting the sequence of the isolated and purified interferon alpha-2b is determined (example 13).
  • the analysis is carried out by the Edman method. [Edman, 1950] on the Procise Sequencing System, model 492 sequencer (Applied Biosy stems).
  • the sequence determined by the analysis exactly coincides with the sequence of the first five amino acid residues of mature natural human interferon alpha-2.
  • the specific biological activity of isolated and purified interferon alpha-2b was determined by the method of La Bonnardiere & Laude [1981] in a culture of transplantable MDBK cell lines (ATCC N ° CCL-22) sensitive to alpha-type interferon in comparison with the international standard sample (MCO) (WHO) International Standard INTERFERON ALPHA 2b, (Human rDNA derived) NIBSC code 95/566) against the indicator virus.
  • MCO international standard sample
  • WHO International Standard INTERFERON ALPHA 2b, (Human rDNA derived) NIBSC code 95/566
  • As an indicator virus use the virus of vesicular stomatitis (BBC) strain "Indiana" GKV GU Research Institute of Virology named. DI.
  • Ivanovo RAMS (deposit JVb 600) with an infectious titer of not less than 10 "5 TTsdzo / ml or mouse encephalomyocarditis virus (EMC) GKV State Research Institute of Virology named after DI Ivanovsky RAMS (deposit N2 787) with an infectious titer of not less than 10 " 5 TCD 50 in 1 ml.
  • the claimed group of inventions includes descriptions of the engineered strain ECR-ULP275 - producing ULP275 proteinase, the conditions for its cultivation, as well as methods for the isolation and purification of the synthesized proteinase.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, генной инженерии, биотехнологии. На основе конструирования рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих структурный ген интерферона альфа-2Ь человека под контролем регулируемого промотора, получен штамм бактерий Escherichia coli, обеспечивающий синтез в нерастворимой форме белка-предшественника зрелого безметионинового интерферона альфа-2Ь человека. В составе белка-предшественника последовательность зрелого безметионинового интерферона альфа-2Ь слита с последовательностью белка SUMO (SMT3) дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Получен штамм бактерий Escherichia coli, обеспечивающий биосинтез протеиназы ULP275 для ферментативного процессинга белка- предшественника безметионинового интерферона. Разработан способ получения безметионинового интерферона, который предусматривает сопряженное проведение процессов ренатурации, формирования дисульфидных связей и ферментативного выщепления безметионинового интерферона альфа-2Ь из состава белка- предшественника под действием протеиназы ULP275.

Description

Гибридный белок, штамм бактерий Escherichia coli - продуцент гибридного белка и способ получения безметионинового интерферона альфа-2Ь человека из этого гибридного белка
Область техники
Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения безметионинового (не содержащего Ν-концевого метионина) интерферона альфа- 2Ь человека.
Предшествующий уровень техники
Интерферон альфа-2Ь - вариант интерферона альфа-2 человека (IFN-a2), отличающийся наличием остатка гуанина (G) в позиции 137 кодирующей области. [Kaluz et al.., 1993 Acta Virol. 37: 97-100; Kahiz et aL, 1994, Acta Virol. 38: 101-4; Lee et al, 1995, J Interferon Cytokine Res. 15:341-9], которая приводит к появлению остатка аргинина (Arg) в последовательности белка.
IFN-a2 относится к классу цитокинов, обладающих противовирусной активностью, и является представителями семейства альфа-интерферонов, секретируемых практически всеми типами вирус-инфицированных клеток человека [Pfeffer et aL, 1998, Cancer Research 58: 2489-2499].
Рекомбинантный IFN-a2 применяют для терапии вирусных и опухолевых заболеваний [Samuel, 2001, Clinical Microbiology Reviews, 14: 778-809; Schadendorf et aL, 2009, Annals of Oncology, 20 (Supplement 6): vi41-vi50; Pfeffer et aL, 1998, Cancer Research 58: 2489-2499], в том числе для лечения твердых опухолей, таких как рак мочевого пузыря, рак почки, ВИЧ-индуцированная саркома апоши и др. [Torti, 1988, J.Clin.OncoL, 6:476-483; Vugrin et αί, 1985, Cancer Treat.Rep., 69:817-820; Rios et al, 1985, J. Clin. Oncol, 3:506-512]. IFN-a2 являются основными терапевтическими средствами, используемыми для лечения хронических форм гепатитов В и С [Clark V., Nelson D.R., 2009, Clin Liver Dis, 13: 351-363].
Ν-концевым аминокислотным остатком природного IFN-ot2 является цистеин, связанный дисульфидной связью с 98 цистеином белка [Bodo G., Fogy I., 1985, The Interferon System, pp. 23-27; Wetzel et al, 1981 , J. Interfer. Res., 1 : 381- 90]. В то же время у некоторой части молекул рекомбинантных IFN-oc2, выделяемых из клеток Escherichia coli (E.coli), на Ν-конце остается дополнительный остаток метионина (формилметионина), что делает рекомбинантный IFN-oc2 модифицированным белком. Избыточный Ν-концевой метионин может влиять на стабильность и иммуногенность белков [Ben-Bassat A., Bauer К., 1987, Nature 326, 315], а также в ряде случаев приводит к потере их биологической активности [Rabbani et al., 1988, J Biol Chem, 263: 1307-1313]. В связи с тем, что с 2005 г. Европейская Фармакопея ограничила производство и использование на территории европейских стран препаратов, содержащих модифицированный IFN-a2 [Eur. Pharm., 5 ed.: 2004], проблема удаления Ν-концевого метионина из состава IFN-cc2 бактериального происхождения приобрела еще большее значение.
В клетках E.coli, остающихся одними из основных продуцентов рекомбинантных белков, удаление (процессинг) Ν-концевого метионина детерминируется радиусом бокового радикала следующего за метионином аминокислотного остатка синтезируемого белка [Hirel et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86(21):8247-51 ; Dalb0ge et al, FEBS Lett. 1990; 266(1-2): 1-3]. Однако такой процессинг часто оказывается неполным в случае гиперэкспрессии белка [Yasueda et al, 1991, Appl Microbiol Biotechnol, 36: 21 1-215; Hwang et al, 1999, Biochem J, 338: 335-342].
К числу ферментативных способов удаления N- концевого метионина из состава рекомбинантных белков относятся: удаление метионина с использованием метионинаминопептидазы [Shapiro et al , 1988, Anal. Biochem, 175: 450-461 ; Solbiati et al, 1999, J Mol Biol, 290:607-14; Liao et al, 2004, Protein Science, 13: 1802-1810];
- способы, основанные на биосинтезе удлиненного белка, между Ν-концевым метионином и зрелой частью которого введена короткая последовательность сайта узнавания какой-либо протеиназы. Последующая протеиназная обработка удлиненного белка приводит к удалению введенной последовательности вместе с N- концевым метионином [US5665566; Belagaje et al, 1997, Protein Sci, 6: 1953-1962; Hosfield Т., Lu Q., 1999, Anal Biochem, 269: 10-6; Jenny R.J. et al, 2003, Protein Express Purif, 31 : 1-1 1].
Заявляемый способ основан на биосинтезе в клетках Е. coli предшественника безметионинового IFN-oc2, содержащего в своем составе последовательность зрелого интерферона, слитого с последовательностью дрожжевого белка SUMO (Small Ubiquitine-like protein Modifier) [Johnson et al, \991, EMBO J, 16: 5509-5519; Muller et al , \99%, EMBO J, 17: 61-70], относящегося к семейству убиквитин-подобных белков (УПБ).
УПБ представляют собой метки белковой природы, которые в клетках эукариот используются для мечения других белков, в результате чего последние изменяют свою функциональную активность [Hochstrasser М., 2000, Science, 289: 563-564]. Помимо убиквитина в семейство УПБ входят белки SUMO, Rubl , Hubl , ISG15, Apgl2, Apg8, Urml, Ana la и Ana lb. В ходе мечения С-концевые остатки УПБ коньюгируют с ε-аминогруппами лизина на поверхности модифицируемых белков [Jentsch S., Pyrowolakis G., 2000, Trends Ceil Biol, 10:335-342; Muller et al, 2001, Nat Rev Mol Cell Biol 2: 202-210]. В основе большинства способов биотехнологического использования белков семейства УПБ, за исключением APG12 и URM1 , лежит их природное свойство синтезироваться в виде удлиненных предшественников, подвергающихся пост-трансляционному процессингу, приводящему к высвобождению универсальной С-концевой последовательности Гли-Гли [Malakhov et al, 2004, J Struct Fund Genom, 5:75-86].
В геноме дрожжей Saccharomyces cerevisiae (S.cerevisiae) содержится ген SMT3, расположенный между нуклеотидными позициями 1469403-1469708 хромосомы IV [база данных NCBI]. Ген SMT3 кодирует белок SMT3 - дрожжевой SUMO. Дрожжевой SUMO синтезируется в виде 101-аминокислотного предшественника, из которых 98 составляют зрелый белок, из которых остатки 13-98 важны для формирования его нативной структуры [Mossessova Е., Lima С. D., 2000, Mol Cell, 5: 865-876]. Эукариотические SUMO, включая дрожжевой SMT3, имеют сходную трехмерную структуру, которая подобна структуре убиквитина и характеризуется плотно уложенными бета- слоями, обернутыми вокруг единственной альфа-спирали [Bayer et αί, 1998, J Mol Biol, 280: 275-286]. Как и другие члены семейства УПБ белки SUMO из различных организмов синтезируются в виде предшественников, содержащих С-концевые удлинения размером от 2 до 12 аминокислотных остатков, которые являются продолжением консервативного С-концевые удлинения размером от 2 до 12 аминокислотных остатков, которые являются продолжением консервативного С-концевого мотива Гли-Гли [Miiller et αί, 2001 , Nature, 2: 202-210]. Несмотря на различные С- концевые удлинения и довольно низкую степень гомологии аминокислотных последовательностей, например, дрожжевого SUMO и SUMO-1 человека (47%), протеиназа Ulpl дрожжей S.cerevisiae способна процессировать оба белковых предшественника [Mossessova Е., Lima С. D., 2000, Mol. Cell, 5: 865-876].
Протеиназа Ulpl относится к семейству цистеиновых протеиназ ULP. Каталитический домен протеиназы Ulpl локализован в С-концевой области белка, в частности, полноценной ферментативной активностью обладает ее С- концевой фрагмент размером 275 аминокислотных остатков [Li S.-J., Hochstrasser М, 2003, J Cell Biol, 160: 1069-1081 ; Butt et al, 2005, Protein Express Purif, 43: 1-9] (в дальнейшем - протеиназа ULP275). Как и другие члены этого семейства in vivo протеиназа Ulpl осуществляет деконьюгацию SUMO и меченых белков-мишеней, а также отвечает за процессинг нативного предшественника SUMO. Основными наиболее известными особенностями протеиназы Ulpl, являются две: 1) действие протеиназы Ulpl направлено на гидролиз пептидных или изопептидных связей, соединяющих консервативный С-концевой дипептид Гли-Гли зрелого SUMO и аминокислотный остаток белка-мишени; 2) связываясь с белком-мишенью, протеиназы семейства ULP узнают не отдельный сайт, а трехмерную структуру белков SUMO [Butt et al, 2005, Protein Express Purif, 43 : 1-9; Wilkinson, 1997, FASEB J, 1 1 : 1245-1256; Chang C.H., Back S.H., 1999 , Biochem Biophys Res Commun, 266: 633-640].
Свойство нативной протеиназы Ulpl и ее С-концевого фрагмента распознавать белок SUMO и его производные в составе коньюгатов и предшественников и осуществлять их высокоспецифичный и эффективный процессинг, практически независимо от природы аминокислотного остатка (исключая пролин), соединенного с консервативным С-концевым дипептидом Гли-Гли, лежит в основе использования искусственно созданных экспрессионных SUMO-систем. Их отличительной чертой является биосинтез целевых белков в виде гибридных предшественников, содержащих в Ν-концевой области последовательность белка SUMO или его производных, удаляемых, например, в ходе протеолитического процессинга in vitro [Malakhov et al. , 2004, J StructFunctGenom, 5:75-86; Marblestone et al , 2006, Protein Science, 15: 182-189]. SUMO-системы используют для: 1) увеличения экспрессии белков в клетках эукариотических и прокариотических организмов; 2) увеличения растворимости экспрессируемых белков; 3) облегчения процесса очистки белков за счет включения в их состав аффинных Ν-концевых полипептидов; (4) получения белков с измененными Ν-концевыми остатками [Malakhov et al, 2004, J Struct Fund Genom, 5:75-86].
Известен слитый белок, состоящий из белка SUMO дрожжей и белка IkB человека [US6872551], который является рекомбинантным продуктом, его очищают из лизатов клеток Е. coli и расщепляют с помощью протеиназы Ulpl . Однако в отличие от IFN-a2 у белка IkB на стыке с SUMO отсутствует образующий дисульфидную связь остаток цистеина. Таким образом, Ulpl-процессинг гибрида SUMO-IkB приводит к высвобождению обычного аминоконцевого аминокислотного остатка белка IkB, а не прочного структурного элемента, содержащего дисульфидную связь, как это требуется в случае нативного безметионинового IFN-a2. По этой причине данные о результативности процессинга гибридных белков, подобных SUMO-IkB, не могли служить гарантией того, что Ulpl- процессинг будет эффективен и в отношении гибрида SUMO и нативного безметионинового IFN-a2. Сведений о биосинтезе слитого белка IFN- 2 с белком SUMO в источниках информации не обнаружено.
Таким образом, описанные выше свойства системы
SUMO-протеиназа Ulpl можно суммировать следующим образом: 1) известно, что протеиназа Ulpl способна гидролизовать пептидную связь, соединяющую консервативный С-концевой дипептид Гли-Гли зрелого SUMO с любым последующим аминокислотным остатком (кроме пролина), который, в свою очередь, может быть связан единичной пептидной связью со следующим аминокислотным остатком; 2) известно, что протеиназа Ulpl способна гидролизовать изопептидную связь соединяющую консервативный С-концевой дипептид Гли-Гли зрелого SUMO с аминокислотным остатком белка (лизином), который в свою очередь может быть связан двумя пептидными связями с соседними аминокислотными остатками белка; 3) было неизвестно, способна ли протеиназа Ulpl гидролизовать пептидную связь, соединяющую консервативный С-концевой дипептид Гли- Гли зрелого SUMO с аминокислотным остатком белка (цистеином), который связан с другими аминокислотными остатками белка одновременно пептидной и дисульфидной связями, т.е. входит в состав необычного структурного элемента белка. Однако именно такая активность протеиназы Ulpl была необходима для гидролиза пептидной связи между С-концевым дипептидом SUMO и Ν-концевым цистеином нативного IFN- 2 человека.
Ближайшим аналогом заявляемых штаммов является рекомбинантный штамм E.coli КССМ 10053 - продуцент интерферона альфа-2Ь человека, содержащего Ν-концевой метионин [KR20000065580].
Ближайшим аналогом заявляемого способа является способ [K 20000065580] получения безметионинового интерферона альфа-2Ь человека путем его выщепления ферментом метионинаминопептидазой из состава синтезированного в клетках штамма E.coli КССМ 10053 белка-предшественника, являющегося метионин- содержащим интерфероном. Основным недостатком известного способа является необходимость проведения длительной (12-20 часов) ферментативной обработки белка- предшественника. Дополнительные трудности может вызывать последующий перевод безметионинового белка в биологически активное состояние в условиях, необходимых для формирования дисульфидных связей [Morehead et al, 1984, Biochemistry, 23: 2500-7], а также процесс отделения целевого безметионинового интерферона от метионин- содержащего предшественника, вследствие их незначительного физико-химического отличия.
Раскрытие изобретения
Задачей заявляемой группы изобретений является расширение арсенала способов получения безметионинового IFN-cc2 человека.
Задачу решают путем конструирования:
- гена, кодирующего гибридный белок SUMO-2b - предшественник безметионинового интерферона альфа-2Ь, составной частью которого является последовательность безметионинового интерферона альфа-2Ь человека, слитая с последовательностью белка SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae;
- штамма бактерий Escherichia coli ВКПМ В- 10879 - продуцента гибридного белка SUMO-2b - предшественника безметионинового интерферона альфа-2Ь человека;
и разработки I
12
- способа получения безметионинового интерферона альфа-2Ь человека путем микробиологического синтеза и выделения гибридного белка SUMO-2b -предшественника безметионинового интерферона альфа-2Ь, составной частью которого является последовательность безметионинового интерферона альфа-2Ь человека, слитая с последовательностью белка SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae, с последующим ферментативным выщеплением из его состава безметионинового интерферона путем обработки протеиназой из семейства ULP в условиях, способствующих формированию в интерфероне правильно замкнутых дисульфидных связей.
Принципиальной частью гибридного белка SUMO-2b является слитый белок SUMIN, в состав которого входит последовательность безметионинового интерферона альфа- 2Ь, слитая с аминокислотной последовательностью белка SUMO дрожжей с 13 по 98 аминокислотный остаток. Вместе с тем, в составе гибридного белка, содержащего последовательность слитого белка SUMIN, может присутствовать дополнительное Ν-концевое удлинение слитого белка, не являющееся принципиальным для осуществления заявляемого способа.
Заявляемый способ основан на биосинтезе гибридного белка SUMO-2b - предшественника безметионинового интерферона альфа-2Ь, содержащего в своем составе последовательность слитого белка SUMIN, и на последующем высвобождении безметионинового интерферона альфа-2Ь из состава предшественника в ходе протеолитического процессинга с использованием протеиназы ULP275.
В основу заявляемого способа положен установленный нами факт, заключающийся в том, что в отличие от протеиназ, активность которых ингибируется поблизости от структурного элемента белка, содержащего дисульфидную связь [Hubbard et αί, 1994, Protein Sci, 3: 757-768; Hubbard et al, 1998, Protein Engineering, 1 1 : 349-359], протеиназа ULP275 способна эффективно гидролизовать пептидную связь вблизи такого структурного элемента. Эта открытая нами, ранее никем не описанная активность протеиназы ULP275 позволяет эффективно и корректно процессировать гибридный белок SUMO-2b, в составе которого последовательность SUMO соединена пептидной связью с первым аминокислотным остатком безметионинового интерферона, соединенном с другими аминокислотными остатками белка одновременно пептидной и дисульфидной связями. Как следствие, ферментативная обработка гибридного белка SUMO-2b протеиназой ULP275 приводит к высвобождению не обычной аминоконцевой последовательности, а целой Ν-концевой структуры безметионинового IFN-a2, содержащей корректно замкнутую дисульфидную связь
Это впервые обнаруженное свойство системы SUMO, состоящей из заявляемого слитого белка SUMIN и протеиназы ULP275, дополняет список ранее известных свойств систем SUMO и расширяет возможности их применения.
Обнаруженное нами свойство системы SUMO используют в заявляемом способе, подвергая ферментативной обработке гибридный белок SUMO-2b, содержащий корректно установленные дисульфидные связи, что позволяет проводить ферментативное расщепление предшественника безметионинового IFN-oc2 одновременно с его ренатурацией и приводит к значительному сокращениют продолжительности процесса получения безметионинового IFN-CC2.
Фермент протеиназу ULP275 для осуществления заявляемого способа получают с использованием сконструированного штамма E.coli ECR-ULP275 (пример 9). Биосинтез, выделение и очистку протеиназы ULP275 осуществляют как описано в примере 12.
Для осуществления заявляемого способа конструируют штаммы E.colv. заявляемый ВКПМ В- 10879 и лабораторный Origami-SUMO-2b - продуценты гибридного белка SUMO-2b - предшественника безметионинового интерферона альфа- 2Ь.
Процесс получения заявляемого штамма-продуцента гибридного белка SUMO-2b состоит из нескольких этапов.
Этап 1. Конструирование рекомбинантных плазмид.
Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК для экспрессии гена гибридного белка SUMO-2b осуществляют на основе лабораторного вектора рЕТ-22-15, являющегося производным векторов рЕТ-22Ь(+) и рЕТ- 15b(+) (Novagen), обеспечивающего индуцируемую экспрессию генов в клетках Е.соИ под контролем промотора РНК-полимеразы Т7. Сконструированная плазмида рЕТ- SUMO-2b помимо векторной части содержат фрагмент ДНК размером 800 пар оснований, кодирующий структурный ген гибридного белка SUMO-2b - предшественника безметионинового интерферона альфа-2Ь человека.
Этап 2. Трансформация штаммов-реципиентов.
В качестве штаммов-реципиентов используют штаммы E.coli BL21(DE3) и Origami 2(DE3) (Novagen), несущие в хромосоме ген РНК полимеразы фага Т7. Плазмиду рЕТ- SUMO-2b вводят в клетки этих штаммов с помощью процесса трансформации. Клетки обоих штаммов подготавливают для трансформации с помощью обработки СаС12 [Маниатис с соавт., 1984, Москва, Мир]. Трансформированные штаммы отбирают на селективной среде, содержащей антибиотик ампициллина-сульфат [Маниатис с соавт., 1984, Москва, Мир]. В результате трансформации получают штаммы E.coli: заявляемый, сконструированный на основе реципиентного штамма BL21 (DE3), и лабораторный - на основе Origami 2(DE3). Полученные штаммы в ответ на внесение в среду культивирования индуктора ИПТГ [Маниатис с соавт., 1984, Москва, Мир] способны синтезировать гибридный белок SUMO-2b - предшественник безметионинового интерферона альфа-2Ь человека.
Заявляемый штамм депонирован во Всероссийской Коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как штамм Escherichia coli ВКПМ В- 10879 - продуцент предшественника безметионинового интерферона альфа-2Ь человека (гибридного белка SUMO-2b).
Свойства заявляемого штамма ВКПМ В- 10879.
Морфологические.
Грамотрицательные слабоподвижные палочки с закругленными концами 1,5-2,0 мкм в длину.
Через 12 часов роста при температуре 37°С на агаре Луриа [Маниатис с соавт., 1984, Москва, Мир] образует беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1 ,5-2,5 мм; поверхность колоний гладкая, края ровные, структура однородная, консистенция пастообразная, легко суспендируются в воде.
Через 40-48 часов роста при температуре 37°С на среде М9 [Маниатис с соавт., 1984, Москва, Мир] образует серовато-беловатые полупрозрачные, слегка выпуклые с блестящей поверхностью колонии диаметром 0,5- 1,5мм.
Физиол ого-биохимические .
Аэроб, желатину не разжижает, индола не образует. В качестве источника углерода усваивает глюкозу, сахарозу и различные органические кислоты, в некоторых случаях спирты: этанол, глицерин.
В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной формах, так и органические соединения в виде аминокислот, пептона, триптона, дрожжевого экстракта и т.д.
В качестве минеральных солей используют фосфаты калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфаты железа и марганца, мел.
Устойчив к антибиотику ампициллину в концентрации
100 мкг/мл.
Растет при температуре 20-40°С рН5,0 -9,0.
Заявляемый штамм ВКПМ В- 10879 и лабораторный Origami- SUMO-2b в ответ на индукцию с помощью ИПТГ или лактозы синтезируют гибридный белок SUMO-2b - предшественник безметионинового интерферона альфа-2Ь человека.
Условия хранения.
В лиофилизованном состоянии при температуре -70°С.
Для осуществления способа используют штаммы бактерий E.coli, несущие в составе плазмидной ДНК фрагменты ДНК, кодирующие синтез гибридного белка SUMO-2b - предшественника безметионинового интерферона альфа-2Ь человека.
Штаммы культивируют в подходящей питательной среде, включающей источники углерода, азота и минеральные соли, обычно используемые для выращивания клеток E.coli при температуре от 24°С до 37°С [Маниатис с соавт., 1984, Москва, Мир]. По достижении культурами штаммов ранней логарифмической фазы роста в среду культивирования вносят индуктор ИПТГ в концентрации от 0,1 до 2 мМ или лактозу в концентрации от 0,5% до 3%. Через 0.5-10 часов роста клетки штаммов-продуцентов накапливают целевой белок SUMO-2b в виде нерастворимых телец включения в количестве от 5 до 30% от суммарного белка клеток. Нерастворимые тельца включения выделяют и очищают, а находящийся в их составе синтезированный гибридный белок SUMO-2b подвергают растворению [RU2319502].
Ренатурацию белка SUMO-2b проводят, как описано [RU2319502], за исключением того, что в ренатурационную смесь вносят фермент - протеиназу ULP275.
На этом этапе в общей ренатурационной смеси ведут одновременно три процесса, а именно: окончание ренатурации и формирования дисульфидных связей в составе целевого белка SUMO-2b, а также ферментативное удаление SUMO из его состава под действием добавленной протеиназы ULP275. Полученный целевой продукт - ренатурированный безметиониновый интерферон альфа-2Ь человека, содержащий корректно замкнутые дисульфидные связи, подвергают окончательной очистке.
Очищенный безметиониновый интерферон альфа-2Ь человека имеет следующие характеристики: чистота не ниже 96%, последовательность первых пяти Ν-концевых аминокислот идентична последовательности нативного безметионинового IFN-a2 человека, специфическая активность составляет 2,0x10 МЕ/мг.
Лучший пример осуществления изобретения
Пример 1. Клонирование гена интерферона альфа-2Ь человека. Ген интерферона альфа-2Ь человека амплифицируют в реакции ПНР с использованием праймеров N466 (ataccatggaaaagagatgtgatctgcctcaaacccacagcctaggtagccgt) и N467 (atctcgagtcattctttacttcttaaggattcttgcaagttt) и матрицы на основе ДНК плазмиды pSX50 [RU2319502], при этом в 5'- концевую область структурного гена интерферона вводят уникальный сайт рестриктазы XmaJl без изменения аминокислотной последовательности кодируемого белка. Полученный в результате амплификации фрагмент ДНК размером 510 пар оснований (п.о.) элюируют из агарозного геля с использованием кита Qiagen (Qiagen, cat.No 28706), обрабатывают рестриктазами Ncol и Xhol и клонируют в векторе pUC18-NX, содержащего в составе модифицированного полилинкера плазмиды pUC18 сайты Ncol и Xhol.
В результате получают плазмиду pUC18-IFN2b, в составе которой первичную структуру клонированного гена интерферона альфа-2Ь человека подтверждают путем определения его нуклеотидной последовательности по стандартной методике [Zimmermann J, Voss Н, Schwager С, Stegemann J, Ansorge W. FEBS Lett. 1988; 233: 432-436] с использованием стандартных pUC-праймеров. Плазмида pUC18-IFN2b несет ген интерферона альфа- 2Ь человека, в последовательности которого содержится уникальный сайт рестриктазы XmaJ 1.
Пример 2. Клонирование гена SMT3 дрожжей S.cerevisiae и конструирование гена гибридного белка SUMO-2b.
Ген SMT3 амплифицируют в ходе ПЦР с использованием в качестве матрицы хромосомной ДНК штамма S.cerevisiae Y618 [Kartasheva et αί, 1996, Yeast 12: 1297-1300]. Амплификацию проводят в две стадии. Сначала амплифицируют два перекрывающихся фрагмента ДНК, для чего используют следующие пары праймеров:
Фрагмент 1 размером 129 п.о.:
N450 (5 ' -atatccatggaaaagagatctgactcagaagtcaatcaagaa)
N454 (5 ' -cttgaagaaaatctctgaa)
Фрагмент 2 размером 230 п.о.:
N453 (5'-ttcagagattttcttcaag)
N468 (5 '-tacctaggctgtgggtttgaggcagatcacatccaccaatctgttctctgtga).
Амплифицированные фрагменты ДНК элюируют из агарозного геля как в примере 1, и их смесь используют для ПЦР-лигирования. Для этого проводят ПЦР-амплификацию на смеси фрагментов 1 и 2 в качестве матрицы. Праймерами для амплификации служат N450 и N468. Полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК размером 340 п.о. элюируют из агарозного геля, обрабатывают рестриктазами Ncol и XmaJl и клонируют в плазмиде pUC18-IFN2b (Пример 1), содержащей ген интерферона альфа-2Ь и расщепленной по тем же сайтам. В результате клонирования получают плазмиду pUC 18-SUMO-IFN2b, в составе которой нуклеотидную последовательность клонированного ген SMT3 подтверждают секвенированием.
Полученная плазмида pUC 18-SUMO-IFN2b содержит уникальный фрагмент ДНК Ncol/Xhol размером 803 п.о., кодирующий ген гибридного белка SUMO-2b (SEQ ID NO. l), составной частью которого является слитый белок SUMIN (SEQ ID NO: 2), представляющий собой последовательность безметионинового интерферона альфа- 2Ь человека, прецизионно слитого с последовательностью белка SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Пример 3. Конструирование вектора рЕТ-22-15.
ДНК вектора pET-15b(+) (Novagen) расщепляют по уникальным сайтам Mlul и Ncol, образовавшийся фрагмент ДНК размером 827 п.о. элюируют из агарозного геля, и клонируют в плазмиде pET-22b(+) (Novagen), расщепленной по тем же сайтам.
В результате клонирования получают вектор рЕТ-22-15, который используют для клонирования гена гибридного белка SUMO-2b. Пример 4. Клонирование последовательности ДНК, кодирующей протеиназу ULP275.
Последовательность ДНК, кодирующую протеиназу ULP275, амплифицируют в ходе ПЦР с использованием в качестве матрицы хромосомной ДНК лабораторного штамма S.cerevisiae Y618. Праймерами для амплификации служат N447 (5'-atatggatcctctttggaaaggaaacataagga) и N448 (5'- attagaattctttaatgcatcggttaaaatcaaatgggcaat).
Амплифицированный фрагмент ДНК размером 842 п.о. элюируют из агарозного геля как в примере 1 , обрабатывают рестриктазами BamHI и EcoRI и клонируют в вектор pUC18- His, содержащий в составе полилинкера последовательность ДНК, фланкированную сайтами EcoRI и Xhol и кодирующую полипептид, состоящий из 6 остатков гистидина.
В результате получают плазмиду pUC18-ULP275, в составе которой подтверждают структуру гена ULP275 путем определением его нуклеотидной последовательности по стандартной методике.
Плазмида pUC 18-ULP275 содержит уникальный
BamHI/XhoI фрагмент ДНК, кодирующий протеиназу ULP275, несущую на С-конце последовательность из 6 остатков гистидина, отвечающую за связывание белка с Ni- ΝΤΑ-сорбентом в условиях металло-хелатной хроматографической очистки.
Пример 5. Получение плазмиды pET-SUMO-2b.
Рекомбинантная плазмида pET-SUMO-2b представляет собой совокупность Sall/Ncol фрагмента ДНК векторной плазмиды рЕТ-22-15 (пример 3) размером 5420 п.о. и Ncol/Xhol фрагмента ДНК плазмиды pUC 18-SUMO-IFN2b (пример 2) размером 803 п.о., заключающего ген SUMO-2b - гибридного предшественника безметионинового интерферона альфа 2Ь.
Для получения плазмиды pET-SUMO-2b плазмиду pUC 18-SUMO-IFN2b (пример 2) расщепляют с помощью рестриктаз Ncol и Xhol, образовавшийся фрагмент ДНК размером 803 п.о. элюируют из геля и лигируют с ДНК вектора рЕТ-22-15, расщепленного с помощью рестриктаз Ncol и Sail. Лигирование проводят с помощью ДНК-лигазы фага Т4. В результате получают плазмиду pET-SUMO-2b размером 6223 п.о.
Плазмида pET-SUMO-2b является экспрессионной, ее используют для биосинтеза гибридного белка SUMO-2b, необходимого для получения рекомбинантного безметионинового интерферона альфа-2Ь человека. В составе плазмиды pET-SUMO-2b ген гибридого белка SUMO-2b находится под контролем промотора фага Т7. Пример 6. Получение плазмиды pET28-ULP275.
Плазмиду pET28-ULP275 получают на основе вектора pET28b(+) (Novagen) в несколько стадий. Сначала из состава вектора удаляют фрагмент ДНК, расположенный между сайтами рестрикции Ncol и BamHI. Для этого ДНК плазмиды рЕТ28Ь(+) расщепляют с помощью рестриктаз Ncol и BamHI, образовавшиеся липкие концы достраивают до тупых с использованием фермента фрагмента Klenow ДНК-полимеразы I E.coli и лигируют с помощью ДНК- лигазы фага Т4. В' результате получают плазмиду рЕТ28- NB 1 , в составе которой оказываются восстановлены оба использованных сайта рестрикции. На следующем этапе изменяют рамку считывания полипептида, инициируемого с кодона ATG, входящего в состав сайта Ncol. Для этого ДНК плазмиды ρΕΤ28-ΝΒ1 расщепляют с помощью рестриктазы Ncol, образовавшиеся липкие концы достраивают до тупых с использованием фермента фрагмента Klenow ДНК- полимеразы I E.coli и лигируют с помощью ДНК-лигазы фага Т4. В результате получают плазмиду pET28-NB2, которую используют для клонирования гена протеиназы ULP275.
Для получения плазмиды pET28-ULP275 плазмиду pUC18-ULP275 (пример 4) расщепляют с помощью рестриктаз BamHI и Xhol, образовавшийся фрагмент ДНК размером 855 п.о. элюируют из геля как в примере 1 и лигируют с ДНК вектора pET28-NB2, расщепленного с помощью рестриктаз ВатШ и Xhol. В результате получают плазмиду pET28-ULP275 размером 6091 п.о.
Плазмиду pET28-ULP275 используют для биосинтеза протеиназы ULP275. В составе плазмиды pET28-ULP275 ген протеиназы ULP275 находится под контролем промотора фага Т7.
Пример 7. Конструирование заявляемого штамма E.coli ВКПМ В-10879.
В качестве штамма-реципиента используют штамм E.coli BL21(DE3) - ВКПМ В-6954. Плазмиду pET-SUMO-2b (пример 5) вводят в клетки реципиентного штамма с помощью процесса трансформации с применением реактива СаС [Маниатис с соавт., 1984, Москва, Мир]. Трансформант отбирают на селективной среде, содержащей антибиотик ампициллина сульфат.
В результате трансформации получают заявляемый штамм, который депонирован во Всероссийской Коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Escherichia coli ВКПМ В- 10879.
Штамм ВКПМ В- 10879 несет экспрессионную плазмиду pET-SUMO-2b и в ответ на внесение в среду культивирования индуктора ИПТГ способен синтезировать гибридный белок SUMO-2b, который используют для получения безметионинового интерферона альфа-2Ь.
Пример 8. Конструирование лабораторного штамма E.coli Origami-SUMO-2b.
Для конструирования лабораторного штамма E.coli в качестве штамма-реципиента используют штамм E.coli Origami 2(DE3) (Novagen) - ВКПМ В- 10187, несущий в хромосоме ген РНК полимеразы фага Т7. Конструирование штамма E.coli Origami- SUMO-2b осуществляют, как в примере 7.
В результате получают лабораторный штамм E.coli Origami-SUMO-2b, который несет экспрессионную плазмиду pET-SUMO-2b и в ответ на внесение в среду культивирования индуктора ИПТГ способен синтезировать гибридный белок SUMO-2b.
Пример 9. Конструирование штамма E.coli ECR- ULP275.
Штамм E.coli ECR-ULP275 получают методом, как в примере 8, за исключением того, что для трансформации реципиентного штамма E.coli BL21(DE3) - ВКПМ В-6954 используют плазмиду pET28-ULP275 (пример 7).
В результате трансформации получают штамм E.coli ECR-ULP275. Этот штамм несет экспрессионную плазмиду pET28-ULP275 и в ответ на внесение в среду культивирования индуктора ИПТГ способен синтезировать протеиназу ULP275, которую используют для получения безметионинового интерферона.
Пример 10. Биосинтез и выделение гибридного белка SUMO-2b из клеток заявляемого штамма ВКПМ В- 10879.
Штамм выращивают в колбах, содержащих по 50мл среды 2xYT состава (в мас.%): триптон- 1,6 , дрожжевой экстракт -1, NaCI -0,5 , вода - остальное, содержащей антибиотик канамицин в концентрации 40 мкг/мл в течение 16-18 часов на орбитальной качалке со скоростью 200-300 об./мин. при температуре 37°С. Затем в колбы вносят по 50 мл свежей среды 2xYT, содержащей антибиотик ампициллина сульфат в концентрации 100 мкг/мл и индуктор ИПТГ в концентрации 80 мкМ. После этого продолжают культивирование в течение 3 часов.
Клеточную биомассу отделяют от среды центрифугированием (15 000g).
Из полученной биомассы выделяют и проводят отмывку тел включения, содержащих нерастворимую форму белка SUMO-2b - предшественника безметионинового интерферона. Выделение и отмывку тел включения проводят также как выделение и очистку нерастворимой формы интерферона [RU2319502]. В результате получают грубую фракцию нерастворимых телец включения, содержащих предшественник безметионинового интерферона с выходом не менее 10% от сырого веса клеточной биомассы.
Пример 1 1. Биосинтез гибридного белка SUMO-2B клетками лабораторного штамма Origami- SUMO-2B.
Биосинтез гибридного белка SUMO-2b клетками лабораторного штамма Origami- SUMO-2b осуществляют как в примере 10, за исключением того, что штаммом продуцентом служит лабораторный штамм Origami-SUMO- 2b. В условиях индукции клетки лабораторного штамма Origami- SUMO-2b накапливают целевой белок SUMO-2b в количестве не менее 10% от суммарного белка клеток.
Пример 12. Биосинтез, выделение и очистка протеиназы ULP275.
2-3 индивидуальные колонии трансформированных клеток штамма ECR-ULP275 засевают в пробирки в 5мл среды 2χΥΤ , содержащей антибиотик канамицин в концентрации 40 мкг/мл и глюкозу в концентрации 20 г/л. и выращивают в течение 16-18 часов на орбитальной качалке со скоростью 200-300 об./мин. при температуре 37°С. Клетки собирают центрифугированием и суспендируют в 100 мл свежей среды 2χΥΤ, содержащей антибиотик канамицин в концентрации 40 мкг/мл. Суспензию клеток переносят в колбы и культивируют в прежних условия в течение 1 часа, после чего к растущей культуре добавляют индуктор IPTG до концентрации 40 мкМ. Индукцию проводят в течение 3 часов, культивируя клетки в прежних условиях.
Клетки собирают центрифугированием (15000g) и суспендируют в 5 мл буфера для лизиса клеток (буфер LB) состава 50 мМ NaxH3-xP04, рН8,0; 300 мМ NaCl; 20мМ Имидазол рН8,0; вода - остальное. К клеточной суспензии добавляют лизоцим до концентрации 1 мг/мл и выдерживают смесь в течение 30 минут во льду. Суспензию озвучивают во льду 6 раз по 30 секунд с 0.5-1.0' перерывами для охлаждения при мощности ультразвукового устройства 200-300W. Лизат осветляют, подвергая его центрифугированию в течение 30 минут при 10000g при температуре 4°С.
Колонку, содержащую 1 мл Ni-NTA агарозы (Qiagen), промывают 5 мл буфера LB, после чего на колонку наносят осветленный лизат со скоростью потока 1 мл/мин. Промывают колонку последовательно 10 мл буфера LB, 10 мл промывочного буфера состава 50 мМ NaxH3-xP04, рН6,0; 300 мМ NaCl; 10% глицерин; вода - остальное, содержащего Имидазол рН6,0 в концентрации 20мМ; и 5 мл промывочного буфера, содержащего Имидазол рН6,0 в концентрации 150мМ. После этого белок элюируют с колонки, используя 2 мл промывочного буфера, содержащего Имидазол рН6,0 в концентрации 450мМ. В полученный элюат вносят Твин-20 до концентрации 0, 1 %.
Полученный элюат диализуют против буфера, содержащего 50мМ Трис-HCl рН8.0, 150 мМ NaCl, 2мМ дитиотрейтола и 0,1% Твин-20.
Концентрацию элюированного белка измеряют спектрофотометрически при длине волны 280нм. Для расчетов концентрации белка используют коэффициент экстинкции Кэкс=0.94.
После измерения " концентрации диализованный препарат белка протеиназы ЦЪР275_разводят в 2 раза глицерином и хранят при -18°С.
Пример 13. Получение и очистка безметионинового интерферона альфа-2Ь человека.
Получение и очистку интерферона альфа-2Ь человека без Ν-концевого метионина с использованием гибридного белка SUMO-2b проводят в несколько этапов.
Этап 1. Растворение, ренатурация и процессинг гибридного белка SUMO-2b
К полученной суспензии тел включения, содержащих нерастворимую форму белка SUMO-2b (пример 10), добавляют сухой гуанидин гидрохлорид (конечная концентрация составляет 6 М) или мочевину (конечная концентрация - 8 М), раствор Трис-HCl, рН8.0 (конечная концентрация - 20 мМ), ЭДТА (конечная концентрация - 5 мМ), дитиотрейтол (конечная концентрация - 50 мМ). Полученную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов. Нерастворенный материал удаляют центрифугированием (15000g), а раствор подвергают стерилизующей фильтрации через мембрану с диаметром пор 0,22 мкм.
Ренатурацию белка SUMO-2b проводят путем разбавления полученного раствора в 100 раз буфером состава: 20 мМ Трис-HCl (рН8.0), 35 мМ NaCI, 0.8 М мочевина, 0.1% Тритон Х- 1 14, 1 мМ окисленного глутатиона, 1 мМ восстановленного глутатиона, вода - остальное. Ренатурацию ведут в течение 18 часов при температуре +5-42 °С и постоянном перемешивании со скоростью 80 об/мин.
По истечении указанного времени в ренатурационную смесь при перемешивании со скоростью 120 об ./мин. добавляют раствор, содержащий протеиназу ULP-275 из расчета 4 мг протеиназы на 12 г тел включения. Полученную смесь инкубируют в течение 3 часов при температуре +12 °С при постоянном перемешивании со скоростью 80 об./мин.
Ферментативное расщепление белка SUMO-2b под действием протеиназы ULP-275 останавливают путем разбавления и закисления реакционной смеси. Для этого в реакционную смесь при перемешивании со скоростью 120 об./мин. добавляют в указанной последовательности следующие компоненты:
• 0,25 М раствор ЭДТА, рН 8.0 до конечной концентрации 1 мМ;
• воду очищенную, охлажденную до температуры +5°С, до 25% от объема ренатурационной смеси;
• 2,5 М раствор натрия ацетата, рН 4.5, до конечной концентрации 12,5 мМ.
Полученную смесь фильтруют с использованием через фильтр с номинальным размером пор 0,45 мкм. Полученный раствор целевого белка называют - раствор Р.
Этап 2. Захват целевого белка
Все последующие стадии очистки безметионинового интерферона альфа-2Ь человека проводят с использованием системы жидкостной хроматографии Akta Purifier (GE Healthcare) при температуре +2-^-8 °С.
Процедуру захвата целевого белка проводят с использованием колонны ХК 50/20 (GE Healthcare) с рабочим объемом 250 мл, содержащей сорбент карбоксиметил-сефарозу Fast Flow (GE Healthcare). Рабочая скорость потока - 30 мл/мин. Колонну уравновешивают 650 мл буфера В-8 состава 50 мМ натрия ацетата рН 5.0, 1 мМ ЭДТА, вода - остальное, после чего наносят раствор ренатурированного и процессированного целевого белка - раствор Р. После нанесения белка колонну промывают 4 л буфера В-8. Элюцию целевого белка проводят простым линейным градиентом 0-100% буфера В-9 состава 50 мМ натрия ацетата, 0,5 М натрия хлорида, 1 мМ ЭДТА, рН 5.5, вода - остальное, объем градиента 1200 мл. Элюцию безметионинового интерферона альфа-2Ь отслеживают по оптической плотности при длине волны 280 нм. Полученный на этом этапе раствор безметионинового интерферона альфа- 2Ь называют - раствор СМ- 1.
Этап 3. Обращеннофазная хроматография
Процедуру проводят с использованием колонны с рабочим объемом 400 мл, содержащей сорбент С 18. Рабочая скорость потока - 50 мл/мин. Колонну уравновешивают 700 мл буфера А состава: 30% ацетонитрил, 0,2% трифторуксусная кислота, вода - остальное. После этого на колонну наносят раствор СМ-1 и промывают колонну 700 мл буфера А.
Элюцию безметионинового интерферона альфа-2Ь проводят сложным линейным градиентом 0-100% буфера В состава: 80% ацетонитрил, 0,2% трифторуксусная кислота, вода остальное. Для элюции используют 3 л буфера В. Элюцию проводят последовательно по следующей схеме (буфер В в буфере А): • 0-20% - 300 мл;
• 20-28% - 500 мл;
• 28-40% - 1,5 л;
•40-60% - 600 мл;
«60-100% - 100 мл
Элюцию безметионинового интерферона альфа-2Ь отслеживают, измеряя при длине волны 280 нм оптическую плотность раствора элюата. При достижении значения 50 мУЕ начинают сбор фракций по 8 мл в стеклянные пробирки, содержащие по 4 мл буфера В-1 1. После элюции колонну промывают 700 мл буфера В.
Собранные фракции элюата анализируют методом ВЭЖХ. Фракции, содержащие безметиониновый интерферон альфа-2Ь с чистотой не менее 90%, объединяют и разводят в 3 раза буфером В-1 1 состава: 12,5 мМ натрия ацетата, 1 мМ ЭДТА, рН 4.5. Полученный раствор называют - раствор ОФ- 1.
Этап 4. Концентрирование
Процедуру проводят с использованием колонны ХК 50/20 (GE Healthcare) с рабочим объемом 250 мл, содержащей сорбент карбоксиметил-сефарозу Fast Flow (GE Healthcare). Рабочая скорость потока - 30 мл/мин. Колонну уравновешивают 650 мл буфера В-8, после чего наносят раствор ОФ-1 и промывают колонну 650 мл буфера В-8. Элюцию проводят при скорости потока 15 мл/мин простым линейным градиентом 0-100% буфера В-9 протяженностью 400 мл. Элюцию безметионинового интерферона альфа-2Ь отслеживают, измеряя при длине волны 280 нм оптическую плотность раствора элюата. При достижении значения 50 мУЕ осуществляют сбор фракций по 10 мл в стеклянные пробирки. После элюции колонну промывают 350 мл буфера В-9.
Собранные фракции элюата анализируют методом ВЭЖХ. Фракции, содержащие целевой белок с чистотой не ниже 96% и пропускают через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, после чего полученный раствор безметионинового интерферона альфа-2Ь называют - раствор СМ-2.
Этап 5. Гелъ-филыпрация
Процедуру проводят с использованием колонны (GE
Healthcare) с рабочим объемом 1700 мл, содержащей сорбент Superdex-75 (GE Healthcare). Рабочая скорость потока - 5 мл/мин. Колонну уравновешивают 1,7 л буфера В- 10 состава: 25 мМ натрия ацетата, 150 мМ натрия хлорида, 0,5 мМ ЭДТА, рН 5.1, вода - остальное, после чего наносят раствор СМ-2 и промывают колонну 1,7 л буфера В- 10. Элюцию безметионинового интерферона альфа-2Ь отслеживают, измеряя при длине волны 280 нм оптическую плотность раствора элюата. При достижении значения 30 мУЕ осуществляют сбор фракций в стеклянные пробирки.
Собранные фракции элюата анализируют методом ВЭЖХ. Фракции, содержащие безметиониновый интерферон альфа-2Ь с чистотой не ниже 96%, объединяют и пропускают через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.
В результате получают высокоочищенный (с чистотой не ниже 96%) препарат безметионинового интерферона альфа-2Ь человека,
Подлинность, концентрацию и чистоту белка в полученном препарате анализируют методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле с/без добавления ДТТ, с окрашиванием серебром, а также методом ВЭЖХ [Eur. Pharm., 5 ed.: 2004]. Описанный способ позволяет получить не менее 500 мг безметионинового интерферона альфа-2Ь из 10 г грубой фракции телец включения, содержащих белок SUMO-2B - предшественник безметионинового интерферона альфа-2Ь.
Пример 14. Определение Ν-концевой последовательности и специфической биологической активности интерферона альфа-2Ь.
Определяют последовательность пяти Ν-концевых аминокислот выделенного и очищенного интерферона альфа-2Ь (пример 13). Анализ проводят методом Эдмана [Edman, 1950] на секвенаторе Procise Sequencing System, model 492 (Applied Biosy stems). Последовательность, определенная в результате анализа, в точности совпадает с последовательностью пяти первых аминокислотных остатков зрелого природного интерферона альфа-2 человека.
Специфическую биологическую активность выделенного и очищенного интерферона альфа-2Ь определяют методом La Bonnardiere & Laude [1981] в культуре перевиваемых линий клеток MDBK (АТСС N° CCL-22) чувствительных к интерферону альфа-типа в сравнении с международным стандартным образцом (МСО) (WHO International Standard INTERFERON ALPHA 2b, (Human rDNA derived) NIBSC code 95/566) против индикаторного вируса. В качестве индикаторного вируса используют вирус везикулярного стоматита (ВВС) штамм «Индиана» ГКВ ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (депозит JVb 600) с инфекционным титром не менее 10"5 ТЦДзо / мл или вирус энцефаломиокардита мышей (ЕМС) ГКВ ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (депозит N2 787) с инфекционным титром не менее 10"5 ТЦД50 в 1 мл.
Специфическая активность полученного интерферона альфа-2Ь составляет 2,0x10 МЕ/мг. ч Промышленная применимость
Таким образом, заявляемая группа изобретений позволяет:
- упростить процесс получения биологически активного безметионинового IFN- 2, благодаря использованию эффективной системы ферментативного удаления N- концевого метионина;
- сократить трудозатраты, время и расход реактивов для его получения, благодаря отсутствию необходимости раздельного проведения стадий ренатурации IFN-a2, формирования в нем дисульфидных связей и ферментативного удаления Ν-концевого метионина;
- облегчить решение задачи очистки нативного IFN-a2 от других продуктов реакции, благодаря использованию в процессе ферментативного расщепления гибридного белка высокоэффективной и специфичной протеиназы ULP275, а также вследствие значительного различия физико- химических свойств безметионинового IFN-a2 и его гибридного предшественника.
К заявляемой группе изобретений приложены описания сконструированного штамма ECR-ULP275 - продуцирующего протеиназу ULP275, условия его культивирования, а также способы выделения и очистки синтезированной протеиназы.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Гибридный белок - предшественник безметионинового интерферона альфа-2Ь человека, составной частью которого является последовательность безметионинового интерферона альфа-2Ь человека, слитая с последовательностью белка SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
2. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-10879 - продуцент белка-предшественника безметионинового интерферона альфа-2Ь человека по п.1.
3. Способ получения безметионинового интерферона альфа-2Ь человека путем микробиологического синтеза белка - предшественника безметионинового интерферона альфа-2Ь человека, с последующим ферментативным выщеплением из его состава безметионинового интерферона, отличающийся тем, что в качестве продуцента белка-предшественника используют бактериальный штамм по п.2, а для ферментативного выщепления безметионинового интерферона используют протеиназу ULP275.
PCT/RU2011/000556 2011-03-24 2011-07-26 Гибридный белок, штамм бактерий escherichia coli - продуцент гибридного белка и способ получения безметионинового интерферона альфа-2ь человека из этого гибридного белка WO2012128661A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011111092/10A RU2453604C1 (ru) 2011-03-24 2011-03-24 Гибридный белок (варианты), штамм бактерий escherichia coli - продуцент гибридного белка (варианты) и способ получения безметионинового интерферона альфа-2 человека
RU2011111092 2011-03-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012128661A1 true WO2012128661A1 (ru) 2012-09-27

Family

ID=46681064

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2011/000556 WO2012128661A1 (ru) 2011-03-24 2011-07-26 Гибридный белок, штамм бактерий escherichia coli - продуцент гибридного белка и способ получения безметионинового интерферона альфа-2ь человека из этого гибридного белка

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2453604C1 (ru)
WO (1) WO2012128661A1 (ru)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2604796C1 (ru) * 2015-12-16 2016-12-10 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная компания "СКиФФ" СИСТЕМА ЭКСПРЕССИИ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕМОДИФИЦИРОВАННЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В Escherichia coli С ЕЁ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
RU2642260C1 (ru) * 2016-10-21 2018-01-24 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) Полипептид для понижения уровня сахара в крови на основе глюкагоноподобного пептида-1 человека, рекомбинантный штамм-продуцент E. coli и способ получения этого полипептида

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20000065580A (ko) * 1999-04-07 2000-11-15 허영섭 아미노 말단 메티오닌이 제거된 재조합 인터페론-α의 제조방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20000065580A (ko) * 1999-04-07 2000-11-15 허영섭 아미노 말단 메티오닌이 제거된 재조합 인터페론-α의 제조방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GENBANK [online] 30 April 2003 (2003-04-30), retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAP20099.1 Database accession no. AAP20099.1 *
ERICA S. JOHNSON ET AL.: "The ubiquitin-like protein Smt3p is activated for conjugation to other proteins by an Aoslp/Uba2p", THE EMBO JOURNAL, vol. 16, no. 18, 1997, pages 5509 - 5519 *
KHAMITOV R.A.: "Masshtabirovanie proizvodstva bifarmatsevticheskikh substantsii", GENETIKA FROM FUNDAMENTAL RESEARCH TO UNDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY, 2007 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2453604C1 (ru) 2012-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH08333395A (ja) ヒトプロインスリン誘導体およびヒトインスリンの製造方法
CN106906236B (zh) 唾液酸酶基因重组表达载体及其构建方法，唾液酸酶及其制备方法
CN111117977B (zh) 一种重组多肽连接酶原及其制备、激活方法与应用
US10000544B2 (en) Process for production of insulin and insulin analogues
KR101026526B1 (ko) 대장균에서 외래단백질을 분비 생산하는 방법
CN107488639B (zh) 甲苯单加氧酶及其在手性亚砜生物催化合成中的应用
RU2441072C1 (ru) ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗМЕТИОНИНОВОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b ЧЕЛОВЕКА ИЗ ЭТОГО ГИБРИДНОГО БЕЛКА
RU2453604C1 (ru) Гибридный белок (варианты), штамм бактерий escherichia coli - продуцент гибридного белка (варианты) и способ получения безметионинового интерферона альфа-2 человека
CN109136209B (zh) 肠激酶轻链突变体及其应用
CN110551697A (zh) 侧耳类食用菌麦角硫因合成酶pegt1和pegt2在合成麦角硫因中的应用
RU2610173C1 (ru) Рекомбинантная плазмида pFM-IFN-17, обеспечивающая экспрессию интерферона альфа-2b человека, рекомбинантная плазмида pFM-АР, обеспечивающая экспрессию фермента метионинаминопептидазы E. coli, биплазмидный штамм Escherichia coli FM-IFN-АР (pFM-IFN-17, pFM-АР) - продуцент (Met-) рекомбинантного интерферона альфа-2b человека
RU2697375C2 (ru) ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pRh15A ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗМЕТИОНИНОВОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21 DE3 - ПРОДУЦЕНТ БЕЗМЕТИОНИНОВОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗМЕТИОНИНОВОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b
CN113201074B (zh) 一种pkek融合蛋白及制备方法与应用
RU2700452C1 (ru) Рекомбинантная плазмидная днк ptrx-tevrs-ртн, кодирующая гибридный белок, способный к протеолитическому расщеплению с образованием фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона (1-34), штамм escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-ртн - продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного pth (1-34)
KR20130141001A (ko) 목적 단백질의 분리 및 정제를 위한 신규한 벡터 시스템
US20090239262A1 (en) Affinity Polypeptide for Purification of Recombinant Proteins
RU2593172C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-TA1 GyrA-AcSer, КОДИРУЮЩАЯ СЕРИНОВУЮ АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗУ, СПОСОБНУЮ in vivo АЦЕТИЛИРОВАТЬ N-КОНЦЕВОЙ СЕРИН ДЕЗАЦЕТИЛТИМОЗИНА α1 И ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ ТИМОЗИНА α1 ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ Eschrichia coli C3030/pER-TA1GyrA-AcSer - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННЫХ БЕЛКОВ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ТИМОЗИНА α1 ЧЕЛОВЕКА
JP2845558B2 (ja) メチオニンアミノペプチダーゼのｄｎａ配列
CN112759653A (zh) 一种pkek融合蛋白及其制备方法与应用
CN116731126B (zh) 内含肽ChiATP、内含肽ChiATP-二肽-2融合蛋白及二肽-2的表达方法
RU2143492C1 (ru) Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок - предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка - предшественника инсулина человека (варианты), способ получения инсулина человека
JP2844870B2 (ja) 組み替えｄｎａ法によるポリペプチドの製造法
CN114990097B (zh) L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用
RU2728611C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pF265, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА
RU2302465C2 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ГЛЮКАГОНА ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-Gl, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ ГЛЮКАГОНА ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ Escherichia coli ER-2566/pER-Gl - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННОГО БЕЛКА

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11861354

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11861354

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1