CN116731126B - 内含肽ChiATP、内含肽ChiATP-二肽-2融合蛋白及二肽-2的表达方法 - Google Patents
内含肽ChiATP、内含肽ChiATP-二肽-2融合蛋白及二肽-2的表达方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116731126B CN116731126B CN202310044442.5A CN202310044442A CN116731126B CN 116731126 B CN116731126 B CN 116731126B CN 202310044442 A CN202310044442 A CN 202310044442A CN 116731126 B CN116731126 B CN 116731126B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dipeptide
- intein
- chiatp
- expression
- fusion protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 title claims abstract description 58
- LZDNBBYBDGBADK-KBPBESRZSA-N Val-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 LZDNBBYBDGBADK-KBPBESRZSA-N 0.000 title claims abstract description 52
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 36
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 17
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 4
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 3
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 17
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 abstract description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 abstract description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 abstract description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 3
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 2
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 2
- CUKWUWBLQQDQAC-VEQWQPCFSA-N (3s)-3-amino-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s,3s)-1-[[(2s)-1-[(2s)-2-[[(1s)-1-carboxyethyl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-3-(1h-imidazol-5-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-ox Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 CUKWUWBLQQDQAC-VEQWQPCFSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002874 Acne Vulgaris Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102400000344 Angiotensin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101800000734 Angiotensin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102400000345 Angiotensin-2 Human genes 0.000 description 1
- 101800000733 Angiotensin-2 Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000496 acne Diseases 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- ORWYRWWVDCYOMK-HBZPZAIKSA-N angiotensin I Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 ORWYRWWVDCYOMK-HBZPZAIKSA-N 0.000 description 1
- 229950006323 angiotensin ii Drugs 0.000 description 1
- 229940044094 angiotensin-converting-enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- IOVVFSGCNWQFQT-UHFFFAOYSA-N bis(2,3,4,5,6-pentafluorophenyl) carbonate Chemical compound FC1=C(F)C(F)=C(F)C(F)=C1OC(=O)OC1=C(F)C(F)=C(F)C(F)=C1F IOVVFSGCNWQFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000007327 hydrogenolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007040 multi-step synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000037339 smooth wrinkles Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- RJNYIELPXWUWPG-FVGYRXGTSA-M sodium;(2s)-2-amino-3-(1h-indol-3-yl)propanoate Chemical compound [Na+].C1=CC=C2C(C[C@H](N)C([O-])=O)=CNC2=C1 RJNYIELPXWUWPG-FVGYRXGTSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
- C07K5/06052—Val-amino acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
- C07K2319/92—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing an intein ("protein splicing")domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种内含肽ChiATP，其氨基酸序列如SEQ ID:No.2所示。还公开了内含肽ChiATP‑二肽‑2融合蛋白、表达载体和表达宿主菌。以及二肽‑2的表达方法。本发明提供了一种全新的内含肽ChiATP，可以成功将目标蛋白表达出来。本发明所提供的二肽‑2表达分离系统不限于任意一种小分子活性肽，也可以是一些大分子活性肽，通过对活性物质的表达，利用内含肽ChiATP的自切割特性，可应用于药物生产、化妆品等行业。本发明的有益效果在于：利用内含肽介导的多肽纯化系统来纯化重组蛋白，利用内含肽的自我切割功能，构成一种不需要传统分离方法中所需要的昂贵的树脂和切除标签所需要的特殊酶，此方法操作简便，快速，高效而且试用成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种内含肽ChiATP、内含肽ChiATP-二肽-2融合蛋白及二肽-2的表达方法。
背景技术
二肽-2是由缬氨酸和色氨酸两个氨基酸分子键合而成的小分子活性肽，因其具有皮肤调理、保湿、抗氧化等功效，广泛应用于化妆品、护肤品等领域。二肽-2是一种有效的血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂，可以通过抑制血管紧张素I转换为血管紧张素II，从而改善眼部血液循环，促进水分排出，在快速祛除眼袋的同时，还能够紧致调节皮肤而平滑皱纹。二肽-2几乎无副作用，没有致痘性，可以安全作为化妆品、护肤品等产品的添加活性物质。目前，二肽-2一般采用生物催化或者化学合成等方法生产，例如有研究报道利用histagged蛋白连接酶在pH＝8的缓冲溶液中，37℃下催化L-缬氨酸和L-色氨酸反应16小时获得二肽-2；通过Cbz保护的缬氨酸，经双(五氟苯基)碳酸酯活化，再与色氨酸钠盐反应得到Cbz保护的二肽-2，最后经催化氢解得到二肽-2。酶法催化或化学合成方法存在成本较高、反应条件苛刻、副反应多等问题，不利于大规模工业化生产。并且二肽-2分子量小，存在分离提纯难、操作复杂、成本高等问题，进一步阻碍了二肽-2的生产应用。
分子生物学技术的发展极大的促进了合成生物学领域的拓展，通过对天然微生物基因表达系统的改造，可以实现外源肽类的高效表达，微生物合成技术有望取代酶法催化和有机合成方法制备多肽类物质。肽类的生物合成技术存在诸多的优势：1)无复杂多步合成步骤，通过分子生物学技术构建表达目的蛋白的基因工程菌，就可以持续的进行肽类的表达生产；2)成本低、操作条件温和，参与合成的底物都是一些最基础的营养物质，不需要昂贵的材料和反应装置；3)副产物少、提纯容易，基本没有合成副产物，不引入新的合成中间体，只有生命体代谢的产物，容易分离和提纯；4)对环境友好、可持续发展，助力“碳中和”目标的实现。5)合成效率高，产品得率高，易于实现多肽大规模生产制备。
但是，目前还没有通过工程微生物生产制备二肽-2的案例。
二肽-2因其分子量小，直接表达的方式难以在微生物发酵产物中分离纯化和检测。可通过构建包含自切割位点寡肽的融合基因，提高肽链的长度，使其易于在表达过程中检测寡肽的产量，并利用亲和标签来降低寡肽的纯化难度。内含肽的发现和改造能够有效地应用于短肽的融合表达和纯化。内含肽是指存在于前体蛋白当中的一段序列，在前体蛋白转化为成熟蛋白质的过程中，依靠自剪接功能将内含肽两端的外显肽以肽键连接，同时将自身从前体蛋白中释放出来。内含肽在生物技术应用中应用广泛，包括蛋白质连接、蛋白质环化、蛋白质标记、毒性蛋白表达、研究体内蛋白质互作等。利用内含肽及其变体介导肽链纯化并在大规模多肽生产中应用也日益受到关注。因此，本领域需要提供一种通用、易于操作、成本低廉获取二肽-2的方法。
在本发明中，一种内含肽介导的二肽-2表达和分离纯化技术。将通过自主设计的内含肽与二肽-2组成融合蛋白，将融合蛋白基因序列构建到PET-28a(+)上，获得二肽-2的重组表达载体。再经过诱导表达、细胞破碎、超滤、内含肽自切割、二次超滤和旋蒸冻干等简单的步骤，可以高效地获得高纯度的二肽-2。这种生物合成方法适用于二肽-2的工业化生产，具有较大的市场价值。
发明内容
本发明公开了一种内含肽ChiATP，其氨基酸序列如SEQ ID:No.2所示。
本发明还公开了上述的内含肽ChiATP的编码基因，其DNA序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还公开了一种内含肽ChiATP-二肽-2融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID:No.4所示。
本发明还公开了上述的内含肽ChiATP-二肽-2融合蛋白的编码基因，其特征在于：其DNA序列如SEQ ID No.3所示。
本发明还公开了上述的内含肽ChiATP-二肽-2融合蛋白的表达载体。
优选的，所述表达载体为PET28a。
本发明还公开了上述的内含肽ChiATP-二肽-2融合蛋白的表达宿主菌。
优选的，所述表达宿主菌为大肠杆菌。
本发明还公开了一种二肽-2的表达方法，其步骤包括：
(1)构建上述的表达载体；
(2)将表达载体转化到大肠杆菌宿主菌；选出阳性克隆；
(3)培养阳性克隆，诱导二肽-2的表达；
(4)分离纯化二肽-2。
优选的，步骤(4)具体为：
4.1收集阳性克隆的菌体细胞并进行细胞破碎，离心，取细胞破碎后的上清液稀释后进行超滤，收集浓缩液，其中含有内含肽ChiATP-二肽-2融合蛋白；
4.2加入自切割反应缓冲液，诱导内含肽的N端发生断裂反应，得到内含肽ChiATP和二肽-2的混合物；
4.3进行二次超滤，收集滤出液，旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到纯化后的二肽-2。
优选的，所述自切割反应缓冲液包括：pH6.4的Tris缓冲液，40mM Bis-Tris，0.5mMEDTA。
优选的，步骤4.3采用3KDa滤膜进行超滤。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种全新的内含肽ChiATP，该内含肽具备了普通内含肽的要求,如具有结构域,具有自剪接功能,具有温度敏感性等特征。通过实验验证此内含肽可以达到已报道内含肽的效果,成功将目标蛋白表达出来。该内含肽分子量约为15KDa，与目标肽(分子量约0.3KDa)分子量差距较大,因此通过两次超滤即可将其去除，从而得到较纯的目的蛋白。该内含肽及基于内含肽的蛋白表达纯化方法解决了传统蛋白纯化需要加入Tag形成融合蛋白,再通过亲和层析获得纯化蛋白后再加入酶将Tag裂解下来,然后还需要将酶去除等一系列复杂操作的问题，从而避免了因纯化过程导致的成本高、周期长，及对蛋白的活性、产量、稳定性、可溶性的影响。应用该内含肽纯化蛋白，无需使用蛋白酶参与裂解反应，避免了蛋白酶对蛋白的降解，不会影响蛋白质的生物学活性。本发明所提供的二肽-2表达分离系统不限于任意一种小分子活性肽，也可以是一些大分子活性肽，通过对活性物质的表达，利用内含肽ChiATP的自切割特性，可应用于药物生产、化妆品等行业。本发明的有益效果在于：利用内含肽介导的多肽纯化系统来纯化重组蛋白，利用内含肽的自我切割功能，构成一种不需要传统分离方法中所需要的昂贵的树脂和切除标签所需要的特殊酶，此方法操作简便，快速，高效而且试用成本低。
附图说明
图1是pET28a-内含肽ChiATP-二肽-2载体构建流程图。
图2是pET28a-内含肽ChiATP-二肽-2重组质粒示意图。
图3是PCR扩增的内含肽ChiATP-二肽-2基因琼脂糖电泳图，其中条带M：Marker；条带1和2：内含肽-二肽-2。
图4是大肠杆菌表达二肽-2诱导OD600优化，其中泳道M：蛋白marker(40KDa)、泳道1：BL21(空载)、泳道2:0.4(OD600)、泳道3：0.6(OD600)、泳道4：0.8(OD600)、泳道5：1(OD600)。
图5是大肠杆菌表达二肽-2诱导温度优化，其中泳道M：蛋白marker(40KDa)、泳道1：BL21(空载)、泳道2：25℃、泳道3：30℃、泳道4：37℃。
图6是大肠杆菌表达二肽-2IPTG诱导浓度优化，其中泳道M：蛋白marker(40KDa)、泳道1：BL21(空载)、泳道2：0.1mM、泳道3：0.5mM、泳道4：1mM、泳道5：2mM、泳道6：5mM。
图7是大肠杆菌表达二肽-2诱导时间优化，其中泳道M：蛋白marker(40KDa)、泳道1：BL21(空载)、泳道2：4h、泳道3：6h、泳道4：8h、泳道5：10h。
图8是HPLC检测二肽-2示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但实施例的描述不对本发明的保护范围产生任何限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
下列实施例中所用的物质或仪器，如果未进行特殊说明的话，均可以从常规的商用渠道获取。
实施例1：pET28a-内含肽-二肽-2重组质粒的构建
通过内含肽ChiATP与二肽-2组成融合蛋白，以本实验室保存的质粒pET28a和大肠杆菌DH5α为模板，利用表中引物分别克隆编码内含肽的基因和线性化PET28a(+)载体，以基因合成片段二肽-2，以内含肽基因和二肽-2基因为模板扩增出内含肽-二肽-2基因片段。采用TaKaRa公司的PrimerStar Max进行扩增，PCR条件为94℃10s，55℃10s，72℃10s，30个循环。或者直接合成内含肽-二肽-2基因片段，如SEQ ID NO:3所示。通过无缝克隆的方法，连接质粒骨架和目的基因片段，使用无缝克隆试剂盒，将pET28a(+)外骨架与内含肽-二肽-2基因片段按照摩尔比1：3比例混匀，在50℃水浴处理20min。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化细胞涂布于含50μg/mL卡那霉素的琼脂平板培养过夜。挑取平板上长出的单克隆，于5mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中震荡培养过夜。利用载体通用引物进行菌液PCR鉴定，并提取质粒用通用引物进行一代测序，测序结果表明所构建的pET28a-内含肽-二肽-2序列正确。图1为质粒构建示意流程图，最后构建好的表达载体如图2所示。
所用引物如表1所示。
表1引物表
实施例2：融合蛋白的诱导表达
将测序正确的重组载体转化进大肠杆菌DH5α用于质粒扩增，大肠杆菌BL21(DE3)作为质粒表达的宿主菌。在37℃条件下，大肠杆菌BL21在固体培养基中过夜培养出单菌落后，挑单菌落于5ml LB(含kanR抗性)液体培养基中37℃，220rmp，过夜培养。取5ml菌液于200ml TB液体培养基中37℃，180rmp培养，至OD600达到0.6-0.8左右加入IPTG(终溶度1mM)后，继续培养24h。24h后离心收集菌体，离心条件，3000rmp，4℃，15min。收集的菌体用Tris缓冲液洗涤后，进行SDS-PAGE电泳检测蛋白表达水平。SDS-PAGE分析：在样品缓冲液(BioRadXT样品缓冲液+4mM TCEP)中进行裂解物样品的考马斯染色的SDS-PAGE分析，所述裂解物样品包括诱导和未诱导细胞，以及诱导细胞的溶解和不溶解流分(所述裂解物样品通过在含有25mM磷酸钠pH 5的缓冲液中超声和离心获得)。
实施例3：诱导表达条件优化
(1)重组大肠杆菌诱导表达二肽-2诱导OD600条件优化
通过测序无误后，挑取pET28a-内含肽-二肽-2转化子接种于5mL LB含kanR抗性液体培养基中，分别按照1％的比例加入10mL LB液体，待OD600分别至0.4、0.6、0.8、1时，加入IPTG至终浓度1mM，BL21(空载)为对照，全部放入摇床37℃220rpm诱导4h，分别离心取沉淀，SDS-PAGE进行验证，如图4所示。
(2)重组大肠杆菌诱导表达二肽-2诱导诱导温度优化
通过测序无误后，挑取pET28a-内含肽-二肽-2转化子接种于5mL LB含kanR抗性液体培养基，分别按照1％的比例加入10mL LB液体，以上一步的最佳诱导OD600条件下，加入IPTG至终浓度1mM，分别在25℃、30℃、37℃条件下，220rpm诱导4h。分别离心取沉淀，SDS-PAGE进行验证，如图5所示。
(3)重组大肠杆菌诱导表达二肽-2IPTG诱导浓度确定
通过测序无误后，挑取pET28a-内含肽-二肽-2转化子接种于5mL LB含kanR抗性液体培养基，分别按照1％的比例加入10mL LB液体，以上一步的最佳诱导OD600、最佳诱导温度条件下，分别加入IPTG至终浓度为0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、5mM，220rpm诱导4h。分别离心取沉淀，SDS-PAGE进行验证，如图6所示。
(1)重组大肠杆菌诱导表达二肽-2诱导时间优化
通过测序无误后，挑取pET28a-内含肽-二肽-2转化子接种于5mL LB含kanR抗性液体培养基，分别按照1％的比例加入10mL LB液体，以上几步的最佳诱导OD600、最佳诱导温度以及最佳诱导IPTG浓度条件下，分别在220rpm诱导4h、6h、8h、10h。分别离心取沉淀，SDS-PAGE进行验证，如图7所示。
实施例4：内含肽的切割和超滤法纯化获得二肽-2
在本实施例中，我们公布了内含肽的切割条件和超滤法纯化获得二肽-2的方法，具体实施方式如下：
将表达内含肽-二肽-2融合蛋白的大肠杆菌菌株在LB培养基中扩大培养至OD600值为0.8，加入1/20体积1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)和终浓度为0.5mM的IPTG，37℃200rpm继续培养4-6h。10000rpm，4℃离心20min，收集菌体。菌体用PBS清洗2次。将菌体重悬在裂解液(20mM Tris，500mM NaCl，pH 8.0)中，使用压力破碎仪进行菌体破碎，12000rpm，4度离心20min，收集上清，经0.45um滤膜过滤。将裂解液通过10KDa超滤管，直至截留液体积小于原来体积的二十分之一，重复3次，收集浓缩液。加入三分之一至十分之一体积的cleavingbuffer，混匀后4度孵育过夜。将浓缩液通过3KDa超滤管，直至截留液体积小于原来体积的二十分之一，收集通过滤膜的滤出液。旋蒸浓缩后冷冻干燥获得二肽-2粉末。加水复溶之后采用HPLC检测复溶液中二肽-2含量和纯度。HPLC结果如图8所示，利用超滤法可以高效地获得高纯度二肽-2，纯度高达98％以上。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种内含肽ChiATP，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID: No.2所示。
2.权利要求1所述的内含肽ChiATP的编码基因，其特征在于：其DNA序列如SEQ ID No.1所示。
3.一种内含肽ChiATP-二肽-2融合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID: No.4所示。
4.权利要求3所述的内含肽ChiATP-二肽-2融合蛋白的编码基因，其特征在于：其DNA序列如SEQ ID No.3所示。
5.权利要求3所述的内含肽ChiATP-二肽-2融合蛋白的表达载体。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为PET28a。
7.权利要求3所述的内含肽ChiATP-二肽-2融合蛋白的表达宿主菌。
8.根据权利要求7所述的表达宿主菌，其特征在于所述表达宿主菌为大肠杆菌。
9.一种二肽-2的表达方法，其特征在于其步骤包括：
（1）构建权利要求5或6所述的表达载体；
（2）将表达载体转化到大肠杆菌宿主菌；选出阳性克隆；
（3）培养阳性克隆，诱导融合蛋白的表达；
（4）分离纯化二肽-2。
10.根据权利要求9所述的二肽-2的表达方法，其特征在于步骤（4）具体为：
4.1 收集阳性克隆的菌体细胞并进行细胞破碎，离心，取细胞破碎后的上清液稀释后进行超滤，收集浓缩液，其中含有内含肽ChiATP-二肽-2融合蛋白；
4.2 加入自切割反应缓冲液，诱导内含肽的N端发生断裂反应，得到内含肽ChiATP和二肽-2的混合物；
4.3 进行二次超滤，收集滤出液，旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到纯化后的二肽-2。
11.根据权利要求10所述的二肽-2的表达方法，其特征在于所述自切割反应缓冲液包括：pH6.4的Tris缓冲液，40 mM Bis-Tris，0.5 mM EDTA。
12.根据权利要求10所述的二肽-2的表达方法，其特征在于：步骤4.1中采用10KDa滤膜进行超滤，步骤4.3中采用3 KDa滤膜进行超滤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310044442.5A CN116731126B (zh) | 2023-01-30 | 2023-01-30 | 内含肽ChiATP、内含肽ChiATP-二肽-2融合蛋白及二肽-2的表达方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310044442.5A CN116731126B (zh) | 2023-01-30 | 2023-01-30 | 内含肽ChiATP、内含肽ChiATP-二肽-2融合蛋白及二肽-2的表达方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116731126A CN116731126A (zh) | 2023-09-12 |
| CN116731126B true CN116731126B (zh) | 2024-02-23 |
Family
ID=87903218
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310044442.5A Active CN116731126B (zh) | 2023-01-30 | 2023-01-30 | 内含肽ChiATP、内含肽ChiATP-二肽-2融合蛋白及二肽-2的表达方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116731126B (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004096860A1 (ja) * | 2003-04-28 | 2004-11-11 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | 目的蛋白質の製造方法、融合蛋白質及びその遺伝子、インテインの部分配列蛋白質及びその遺伝子、発現ベクター、並びに形質転換体 |
| WO2007096899A2 (en) * | 2006-02-08 | 2007-08-30 | Usv Limited | Affinity polypeptide for purification of recombinant proteins |
| AU2008327513A1 (en) * | 2007-09-21 | 2009-05-28 | Cadila Healthcare Limited | GCSF fusion protein systems suitable for high expression of peptides |
| WO2014110393A1 (en) * | 2013-01-11 | 2014-07-17 | The Texas A&M University System | Intein mediated purification of protein |
| CN104053779A (zh) * | 2011-09-28 | 2014-09-17 | 时代生物技术股份公司 | 断裂内含肽及其用途 |
| KR20160093156A (ko) * | 2015-01-28 | 2016-08-08 | 한국외국어대학교 연구산학협력단 | 인테인을 이용한 항균성 펩타이드의 제조방법 |
| CN114990089A (zh) * | 2022-05-26 | 2022-09-02 | 广州市乾相生物科技有限公司 | 微型内含肽Ssa DnaH及其在表达分离六肽-8中的应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060141570A1 (en) * | 2004-11-16 | 2006-06-29 | Wood David W | Intein-mediated protein purification using in vivo expression of an aggregator protein |
| TWI408228B (zh) * | 2010-10-29 | 2013-09-11 | Univ Nat Chunghsing | 用於生產一標的蛋白質的核酸建構物、重組型載體以及方法 |
| BR112015007466B1 (pt) * | 2012-10-03 | 2022-10-11 | Agrivida, Inc | Protease inteína-modificada, cassete de expressão, hospedeiro, método de produção de uma protease e detergente |
| KR102105352B1 (ko) * | 2014-11-03 | 2020-04-29 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 생체분자를 정제하기 위한 가용성 인테인 융합 단백질 및 방법 |
-
2023
- 2023-01-30 CN CN202310044442.5A patent/CN116731126B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004096860A1 (ja) * | 2003-04-28 | 2004-11-11 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | 目的蛋白質の製造方法、融合蛋白質及びその遺伝子、インテインの部分配列蛋白質及びその遺伝子、発現ベクター、並びに形質転換体 |
| WO2007096899A2 (en) * | 2006-02-08 | 2007-08-30 | Usv Limited | Affinity polypeptide for purification of recombinant proteins |
| AU2008327513A1 (en) * | 2007-09-21 | 2009-05-28 | Cadila Healthcare Limited | GCSF fusion protein systems suitable for high expression of peptides |
| CN104053779A (zh) * | 2011-09-28 | 2014-09-17 | 时代生物技术股份公司 | 断裂内含肽及其用途 |
| WO2014110393A1 (en) * | 2013-01-11 | 2014-07-17 | The Texas A&M University System | Intein mediated purification of protein |
| KR20160093156A (ko) * | 2015-01-28 | 2016-08-08 | 한국외국어대학교 연구산학협력단 | 인테인을 이용한 항균성 펩타이드의 제조방법 |
| CN114990089A (zh) * | 2022-05-26 | 2022-09-02 | 广州市乾相生物科技有限公司 | 微型内含肽Ssa DnaH及其在表达分离六肽-8中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116731126A (zh) | 2023-09-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106906236B (zh) | 唾液酸酶基因重组表达载体及其构建方法，唾液酸酶及其制备方法 | |
| CN106754610B (zh) | 表面展示表达谷氨酸脱羧酶的重组工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN111117977B (zh) | 一种重组多肽连接酶原及其制备、激活方法与应用 | |
| CN106754447B (zh) | 重组酿酒酵母及其在合成丙谷二肽中的应用 | |
| CN112980865A (zh) | 一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法 | |
| CN106434733B (zh) | 一种适用于谷氨酸棒杆菌的表达载体及其应用 | |
| CN109055339B (zh) | Tev蛋白酶突变体、基因、生物材料、制备方法、试剂或试剂盒和应用 | |
| CN111499759A (zh) | 一种具有细胞穿膜性的锌指蛋白-乳铁蛋白融合蛋白质及其制备与应用 | |
| CN113004375B (zh) | 一种高效介导重组多肽形成包涵体的小分子蛋白 | |
| CN112358530B (zh) | 多肽标签、高度可溶性的重组腈水解酶及其在医药化学品合成中的应用 | |
| CN107488639B (zh) | 甲苯单加氧酶及其在手性亚砜生物催化合成中的应用 | |
| CN116731126B (zh) | 内含肽ChiATP、内含肽ChiATP-二肽-2融合蛋白及二肽-2的表达方法 | |
| CN116284275A (zh) | 内含肽Ssp tau、编码基因及其在制备四肽-5中的应用 | |
| CN110923223B (zh) | 一种新型腈水解酶及其应用 | |
| RU2453604C1 (ru) | Гибридный белок (варианты), штамм бактерий escherichia coli - продуцент гибридного белка (варианты) и способ получения безметионинового интерферона альфа-2 человека | |
| RU2441072C1 (ru) | ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗМЕТИОНИНОВОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b ЧЕЛОВЕКА ИЗ ЭТОГО ГИБРИДНОГО БЕЛКА | |
| CN106119272A (zh) | 一种高效联产l‑苯甘氨酸及葡萄糖酸的策略 | |
| EP1981978A2 (en) | Affinity polypeptide for purification of recombinant proteins | |
| CN116041451B (zh) | 一种内含肽变体及其在生物法制备蓝铜胜肽中的应用 | |
| CN114292321B (zh) | 可溶性表达eg95蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN114164223B (zh) | 一种南极土壤来源的酯酶及其编码基因与应用 | |
| RU2604796C1 (ru) | СИСТЕМА ЭКСПРЕССИИ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕМОДИФИЦИРОВАННЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В Escherichia coli С ЕЁ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ | |
| CN117659212A (zh) | 一种表皮细胞生长因子的融合蛋白及其制备方法与应用 | |
| JP6379531B2 (ja) | 新規β−アミノ酸の製造方法 | |
| CN114990097A (zh) | L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |