KR20160093156A

KR20160093156A - 인테인을 이용한 항균성 펩타이드의 제조방법

Info

Publication number: KR20160093156A
Application number: KR1020150013486A
Authority: KR
Inventors: 이현환; 신혜라; 조재형; 송가은; 서윤채
Original assignee: 한국외국어대학교 연구산학협력단
Priority date: 2015-01-28
Filing date: 2015-01-28
Publication date: 2016-08-08

Abstract

본 발명은 항균성 펩타이드의 대량 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 Mycobacterium xenopi strain 의 DNA gyrase 로부터 유래된 단백질 스플라이싱 분절(protein splicing element)인 Mxe gyrA intein 과 아미노산 서열의 일부가 변형되어 높은 항균 활성을 가지는 인간 락토페리신 펩타이드를 융합하여 대장균에 도입 및 발현시킨 후, 상기 과정을 통하여 제조된 융합단백질로부터 변형된 인간 락토페리신 펩타이드만을 분리하는 과정을 통하여 제조되는 항균성 펩타이드의 대량 제조방법을 포함한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 융합단백질로부터 항균성 펩타이드의 분리 및 정제를 단일스텝으로 수행할 수 있어 매우 간단하고 경제적이며 생산 수율이 높은 항균성 펩타이드의 대량 제조방법을 제공함으로써, 다중약물내성 미생물의 급증으로 인하여 새로운 항생제의 개발이 시급한 현 시점에서, 천연에 존재하는 항균성 펩타이드를 제약산업, 식품산업, 사료 산업 등에 폭넓게 이용할 수 있는 효과가 있다.

Description

인테인을 이용한 항균성 펩타이드의 제조방법{METHOD FOR PRODUCING ANTIMICROBIAL PEPTIDE USING INTEIN}

본 발명은 항균성 펩타이드의 대량 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 단백질 스플라이싱 분절(protein splicing element)인 인테인(intein)과 높은 항균 활성을 가지는 인간 락토페리신 펩타이드를 융합하여 대장균에 도입 및 발현시킨 후, 상기 과정을 통하여 제조된 융합단백질로부터 인간 락토페리신 펩타이드만을 분리하는 과정을 통하여 제조되는 항균성 펩타이드의 대량 제조방법에 관한 것이다.

인류는 페니실린 이후 수많은 종류의 항생제가 개발되어 사용되어 왔으나, 근래에 들어서 이들 항생제에 내성을 가지는 균주들이 과거와는 달리 빠른 속도로 등장하고 있다. 특히 서로 다른 두 개 이상의 항생, 항균제에 내성을 나타내는 다중약물내성 미생물이 급증하고 있어, 이들 내성 균주를 퇴치할 수 있는 새로운 작용 메커니즘을 가지는 항생제의 개발이 시급하다.

이로 인해 천연에 존재하는 항균성 펩타이드는 새로운 항생제의 후보물질로서 대두되었고, 이는 기존에 사용되고 있는 화합물성 항생제와 다른 작용 기작을 통하여 항균 활성을 나타내므로 항생제 내성 균주에 대한 문제를 해결할 수 있을 것으로 기대되고 있다.

그 중 하나로 인간 락토페리신(Human lactoferricin, hLfcin)을 들 수 있는데 상기 락토페리신은 인간 락토페린(Human lactoferrin, hLf)을 펩신(pepsin)으로 분해하여 발견된 것으로 상기 락토페린은 출산한 여성의 초유에 약 7~8 g/ℓ의 농도로 다량 함유되어 있으며, 눈물, 땀, 소화액 등 점액성 분비액에 포함되어 있는 것으로 알려져 있다.

상기 인간 락토페리신은 인간 락토페린의 N-terminal에 위치한 amino acid residues 1-47(혹은 49)로 인간 락토페린의 N-terminal에 위치한 첫번째 α- helix구조에 해당되며, 양이온 항균성 펩타이드(cationic antimicrobial peptide)로 알려져 있다. 인간 락토페리신의 항균 활성은 Cys20과 Cys37 사이의 disulfide bond로 형성된 루프(loop) 구조를 구성하는 18 residues에 의한 것으로 알려져 있다.

또한, 인간 락토페리신은 지금까지 알려진 다른 동물로부터 유래된 락토페리신에 비해 항균활성이 매우 높은 것으로 보고되고 있다.

이와 같이, 기존의 항생제를 대체할 다양한 종류의 천연 항생제의 후보물질들이 발견되고 있고 이에 따라 자연계에 존재하는 항균성 펩타이드들을 그대로 이용하거나 유사체들을 합성하여 이용하고자 하는 시도들이 있었으나, 항균성 펩타이드는 항균 활성의 증가와 동시에 세포독성의 척도인 적혈구 용혈현상도 동시에 증가시키기 때문에 실제적인 응용에 많은 제약을 받고 있다.

또한, 항균성 펩타이드의 상용화란 측면에서 가장 중요한 요소인 대량생산을 위한 연구도 다양하게 시도되어 왔으나 현재까지 산업적으로 활용할만한 수준에 이르지 못하였다. 왜냐하면 화학합성으로 항균성 펩타이드를 생산하는 경우에는 경제성이 낮고, 미생물을 이용한 유전공학적 기법으로 항균성 펩타이드를 생산하는 경우에는 경제성은 있으나, 발현된 항균성 펩타이드가 숙주 미생물의 성장을 저해하여 펩타이드 생산의 수율이 매우 낮다는 문제점이 있기 때문이다.

이에 따라, 본 발명자들은 유전자 조작이 용이하고 경제적인 대장균 발현 시스템을 이용하되, 숙주 미생물의 생장 저해 및 사멸의 문제를 해결하기 위하여 cytotoxic protein을 단백질의 스플라이싱(splicing)과정에서 잘려져 나가는 영역인 인테인(intein) 과 융합하여 발현시킬 경우 타깃 단백질의 활성을 잃게 한다는 점을 착안하여 Mycobacterium xenopi strain의 DNA gyrase로부터 유래된 단백질 스플라이싱 분절인 Mxe gyrA intein 과 기존의 인간 락토페리신보다 더욱 높은 항균 활성을 나타내도록 특정 아미노산이 치환된 인간 락토페리신을 융합하여 대장균 내에서 발현을 유도한 후, 상기 융합 과정을 통하여 제조된 융합단백질로부터 상기 아미노산 치환으로 변형된 인간 락토페리신만을 분리하는 과정을 통하여 항균성 펩타이드를 제조함으로써, 항균성 펩타이드가 대장균의 성장을 저해하여 펩타이드의 생산 수율이 낮아지는 문제를 해결함으로써, 간단하고 경제적으로 항균성 펩타이드를 대량 제조하는 방법에 관한 발명을 완성하였다.

관련 종래기술로는 대한민국 공개특허 제10-2002-0080731호(락토페리신 유전자 및 이를 도입한 락토페리신 발현용 형질전환체) 및 대한민국 등록특허 제10-0975350호(사람 락토페리신을 생산하는 형질전환 복제 소 및 이것의 생산방법) 등이 있다.

본 발명의 목적은 인테인(intein)을 이용하고, 또한 대장균 발현 시스템을 활용하여 매우 높은 항균 활성을 가지는 변형된 인간 락토페리신 펩타이드를 제조함으로써, 제조공정이 간단하고 경제적이며 높은 생산 수율과 항균 활성을 가지는 항균성 펩타이드 및 그 제조방법을 제공함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 락토페리신(lactoferricin) 펩타이드와 인테인(intein)이 융합된 융합단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 변형된 락토페리신(lactoferricin) 펩타이드와 인테인(intein)이 융합된 융합단백질을 제공한다.

상기 인테인은 마이코박테리움 제노피 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 인테인(Mycobacterium xenopi DNA gyrase subunit A intein, Mxe gyrA intein)인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 변형된 락토페리신 펩타이드와 마이코박테리움 제노피 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 인테인(Mycobacterium xenopi DNA gyrase subunit A intein, Mxe gyrA intein)이 융합된 융합단백질을 코딩하는 서열번호 7의 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 7의 유전자가 포함된 재조합 플라스미드 벡터로 형질전환된 대장균 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 인테인이 포함된 플라스미드 벡터에 락토페리신 유전자를 삽입시키는 단계; (2) 상기 (1)단계에서 재조합된 플라스미드 벡터를 대장균에 도입하여 대장균 형질전환체를 제조하는 단계; (3) 상기 (2)단계에서 제조된 대장균 형질전환체를 배양하여 인테인과 락토페리신이 융합된 융합단백질의 발현을 유도하는 단계; (4) 상기 (3)단계에서 발현이 유도된 융합단백질을 분리하는 단계; 및 (5) 상기 (4)단계에서 분리된 융합단백질에서 락토페리신 펩타이드를 분리 및 정제하는 단계; 를 포함하는 항균성 펩타이드의 제조방법을 제공한다.

상기 (1)단계에서 락토페리신 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.

상기와 같은 본 발명에 따르면, 융합단백질로부터 항균성 펩타이드의 분리 및 정제를 단일스텝으로 수행할 수 있어 매우 간단하고 경제적이며 생산 수율이 높은 항균성 펩타이드의 대량 제조방법을 제공함으로써, 다중약물내성 미생물의 급증으로 인하여 새로운 항생제의 개발이 시급한 현 시점에서, 천연에 존재하는 항균성 펩타이드를 제약산업, 식품산업, 사료 산업 등에 폭넓게 이용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에서 사용된 변형된 인간 락토페리신(HLSA)의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 Mxe gyrA intein 을 이용한 변형된 인간 락토페리신(HLSA)의 제조과정을 나타낸 흐름도이다.
도 3은 본 발명에서 재조합된 플라스미드 벡터 pTXB I - HLSA 의 개열지도이다.
도 4는 본 발명에서 사용한 Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag system(IMPACT system)의 흐름도이다.
도 5a 는 본 발명의 변형된 인간 락토페리신(HLSA)의 PCR 증폭 결과이고, 도 5b는 상기 HLSA를 pTXB I 벡터에 삽입 후 colony PCR을 수행한 결과이다(SM: DNA size marker, Lane1: PCR product)
도 6a는 HLSA-Mxe gyrA intein 융합단백질의 SDS-PAGE 결과이고, 도 6b는 HLSA-Mxe gyrA intein 융합단백질의 Western blotting 결과이다(arrow: E.coli 내에서 발현된 HLSA-Mxe gyrA intein 융합단백질의 사이즈(28kDa), SM: protein size marker, Lane 1: HLSA-Mxe gyrA intein 융합단백질).
도 7은 본 발명에서 분리 및 정제된 변형된 인간 락토페리신(iHLSA)의 HPLC 분석을 수행한 결과이다.
도 8a는 본 발명에서 분리 및 정제된 변형된 인간 락토페리신(iHLSA)의 항균 활성을 측정한 결과이고(NC: negative control, fraction 1-4: iHLSA sample), 도 8b는 iHLSA 의 농도를 측정하기 위하여 ELISA assay를 수행한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 대장균 발현 시스템을 이용하여 항균성 펩타이드를 대량으로 제조하는 과정에 있어서, 대장균 내에서 항균성 펩타이드가 독성으로 작용하여 대장균의 성장을 저해하거나 대장균을 사멸에 이르게 하여 항균성 펩타이드의 생산 수율이 낮아지는 문제를 해결하기 위하여 cytotoxic protein을 단백질의 스플라이싱(splicing)과정에서 잘려져 나가는 영역인 인테인(intein) 과 융합하여 발현시킬 경우 타깃 단백질의 활성을 잃게 한다는 점을 착안하여 Mycobacterium xenopi strain의 DNA gyrase로부터 유래된 단백질 스플라이싱 분절인 Mxe gyrA intein 과 항균성 펩타이드를 융합하여 단백질 발현을 유도함으로써 상기 문제를 해결하였다.

인테인(intein)은 단백질이 완성된 형태의 모습으로 접히기(folding)전에 단백질 전구체의 일부가 제거되는 해독 후 과정인 단백질 스플라이싱(splicing) 과정에서 잘려져 나가는 영역으로, 일부 단백질에서는 번역 후 전구체 단백질이 자기촉매반응에 의해 그 일부가 잘려지고 나머지 부분이 재결합하여 성숙단백질이 되는 것으로 알려져 있다. 이 때 잘려지는 영역을 인테인(intein), 성숙단백질로 남는 영역을 엑스테인(extein)이라고 한다. 인테인 자체의 단백질 구조에 근거하고 자기 촉매적으로 인테인 잘라내기(self-splicing)와 엑스테인의 재결합 과정이 몇개의 인테인을 함유한 유전자에서 증명되었다.

상기 상술한 바와 같이 항균성 펩타이드 대량 제조를 위해 대장균 발현 시스템을 사용하는 데 있어, 인테인과 항균성 펩타이드를 융합하여 발현시킬 경우 대장균 내에서 독성으로 작용하는 항균성 펩타이드의 활성을 잃게 하여 생산 수율이 낮아지는 문제점을 해결할 수 있고, 또한, 인테인을 사용할 경우 융합단백질에서 항균성 펩타이드만을 분리하는 과정에서 매우 강한 환원조건(25mM 이상의 DTT)을 주었을 경우 자가분해 활성을 띠는 인테인의 특성을 이용한 Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag system(IMPACT system)을 이용하여 매우 간단한 과정을 통하여 순도 높은 항균성 펩타이드를 분리 및 정제할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명에서 사용된 인테인은 마이코박테리움 제노피 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 인테인(Mycobacterium xenopi DNA Gyrase subunit A intein, Mxe gyrA intein)이나 이에 한정되지 아니한다.

상기 인테인을 활용한 항균성 펩타이드의 제조과정을 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

본 발명에서 대량 제조하고자 목적한 항균성 펩타이드는 인간 락토페린을 펩신(pepsin)으로 분해하여 발견된 인간 락토페리신의 아미노산 서열에서 항균 활성이 더욱 높아지도록 아미노산 서열 일부분을 변형시킨 것이다. 구체적으로, 락토페리신의 아미노산 서열에서 20번 내지 31번의 특정 residues를 positively charged amino acids로 치환할 경우 더 높은 항균 활성을 나타내는 것으로 밝혀져, 상기 아미노산 서열 20번 내지 31번 중 24번 글루타민을 라이신으로(Gln24 → Lys24), 26번 아스파라긴을 알라닌으로(Asn26 → Ala26)으로, 27번 메티오닌을 알라닌으로(Met27 → Ala27) 으로 치환하였고, 상기 변형된 인간 락토페리신을 "HLSA" 라 명명 하였다.

인간 락토페린과 인간 락토페리신은 특히 N-terminal의 α-helix structure와 cationic한 성질에 의해 항균 활성을 나타낸다. 이러한 성질은 박테이아 멤브레인(bacteria membrane)의 LPS(Lipopolysaccharide)를 인식하여 결합함으로써 pore를 형성하고, 삼투압 충격(osmotic shock)을 유도하거나 박테리아 내부에 침투하여 세포내 분자들에 결합함으로써 생장을 억제한다. 또한, Lipid A와 porin에 결합하여 박테리아의 멤브레인을 약화시킴으로써 항균활성을 나타내기도 하며, 박테리아의 생장에 필수적인 철(iron)을 고갈(depletion)시킴으로써 박테리아의 생장을 억제하는 것으로 알려져 있다.

상기 변형된 인간 락토페리신(HLSA)을 코딩하는 유전자를 PCR을 이용하여 증폭한 후, 상기 증폭된 DNA 단편을 Mxe gyrA intein이 포함된 pTXB I 벡터의 MCS(multiple cloning site)로 삽입하기 위하여 5' 말단에는 NdeI 제한효소 인식서열을 추가하고, 3' 말단에는 SapI 제한효소 인식서열을 추가하였다. recombinant pTXB I-HLSA 를 제작하기 위하여 제한효소 Nde I 및 Sap I 을 이용하여 HLSA gene 을 절단 후, pTXB I 벡터에 라이게이션(ligation) 시켰다. pTXB I 벡터로 HLSA 유전자의 도입 여부를 확인하기 위하여 콜로니 PCR을 수행하였다.

다음으로, 상기 재조합된 플라스미드 벡터 pTXB I-HLSA를 CaCl₂ 를 이용한 competent cell method를 통하여 E.coli에 도입하여 대장균 형질전환체를 제조하였다. 그리고 제조된 대장균 형질전환체를 "HR-HLSA" 라 명명하였다. 상기 형질전환체 HR-HLSA 는 37℃의 1L LB 배지(Luria-Bertani broth)에서 하룻밤동안 배양되었고, 0.4mM IPTG(Isopropyl β-D thiogalactoside)를 투입하여 4시간 동안 배양함으로써 단백질의 발현이 유도되었다.

이후 원심분리기를 이용하여 세포를 수거하였고, 0.5mm glass beads와 용해버퍼(lysis buffer)를 넣고, vortex로 세포를 용해(lysis) 하였다. 원심분리한 상층액의 가용성 분획물에 샘플버퍼를 첨가하여 boiling 한 후, SDS-PAGE를 수행하고, 변형된 락토페리신 펩타이드 HLSA 와 Mxe gyrA intein 의 융합단백질의 발현 여부를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯(western blot)을 수행하였다.

다음으로, Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag system(IMPACT system)을 이용하여 HLSA와 Mxe gyrA intein의 융합단백질로부터 HLSA만을 분리 및 정제하였다.

상기 IMPACT system은 인테인에 키틴-결합 도메인(chitin-binding domain, CBD)이 포함되어 있어 키틴 레진(chitin resin)에 흘려보내면 HLSA-Mxe gyrA intein-CBD의 융합단백질만이 chitin bead에 결합하게 되어 분리 및 정제가 가능하다. 더욱이, 목적단백질을 회수할 때 해당 태그(tag)에 붙을 수 있는 리간드를 과량으로 넣어주어서 흘려내는 것이 보통이지만, 상기 시스템에서는 목적단백질을 회수할 때 매우 강한 환원조건(25mM 이상의 dithiothreitol(DTT))에서 인테인이 자가분해 활성을 띠는 특성을 이용한다는 점에서 큰 장점을 갖는다. 즉, 워싱이 끝난 후에 DTT가 함유된 버퍼로 교체해 준 후 일정시간 이상 인큐베이션(incubation)만 시켜주면 인테인의 자가분해 활성에 의해서 목적단백질과 분리되고, 목적단백질은 비드(bead)에 더 이상 붙어있지 않으므로 레진(resin)에서 나오는 목적단백질을 회수하기만 하면 되므도 별도의 프로테아제(protease)를 이용한 절단(cleavage)과정 및 절단 후 목적한 단백질만 용출시키는 정제의 과정이 필요없는 매우 간단한 단백질 정제시스템이다. 산출물 또한 높은 순도를 갖는 장점이 있다.

매우 높은 활성을 갖는 항균성 펩타이드인 인간 락토페리신을 대량 제조하는 과정에 인테인을 이용한 상기 IMPACT system을 활용한 것은 본 발명자들에 의해 최초로 시도된 것으로서 기존의 불용성 단백질과 융합하는 방식에 비하여 목적 단백질의 분리 및 정제를 단일스텝(one-step)으로 수행할 수 있는 즉, 매우 간단한 공정만으로도 높은 수율로 항균성 펩타이드를 생산할 수 있다는 점에서 큰 의의를 가진다.

상기 목적단백질의 분리 및 정제 과정을 통하여 수득된 항균성 펩타이드를 "iHLSA" 라 명명하였고, 이를 확인하기 위하여 고압액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하였다. 또한, 최종적으로 iHLSA의 항균 활성을 확인하기 위하여 지시균으로 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 사용하여 antibacterial activity assay를 수행하였고, 그 결과 최대 93% 이상의 높은 항균 활성을 띠는 것으로 확인되었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 타깃 유전자의 PCR 증폭

본 발명에서 대량으로 제조하고자 하는 항균성 펩타이드는 인간 락토페리신의 아미노산 서열에서 20번 내지 31번 중 24번 글루타민을 라이신으로(Gln24 → Lys24), 26번 아스파라긴을 알라닌으로(Asn26 → Ala26)으로, 27번 메티오닌을 알라닌으로(Met27 → Ala27) 으로 치환시킨 것으로 기존의 인간 락토페리신의 cDNA의 염기서열을 기초로 하여 point mutation 통하여 치환되었다. 그리고 상기 변형된 인간 락토페리신을 "HLSA" 라 명명 하였다.

다음으로, 상기 HLSA를 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머를 이용하여 PCR 을 수행하여 증폭시켰다.

본 발명에서 사용한 인간 락토페리신의 아미노산 서열 20번 내지 31번 사이 및 상기 HLSA의 아미노산 서열은 [표 1]과 같고, 상기 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머의 PCR 증폭을 위한 프라이머 세트는 [표 2]와 같다.

[표 1] 아미노산 서열

[표 2] PCR 증폭을 위한 프라이머

실시예 2. 클로닝(cloning)

본 발명에서는 대장균 발현 시스템을 이용하여 항균성 펩타이드를 대량으로 제조하는 과정에 있어서, 대장균 내에서 항균성 펩타이드가 독성으로 작용하여 대장균의 성장을 저해하거나 대장균을 사멸에 이르게 하여 항균성 펩타이드의 생산 수율이 낮아지는 문제를 해결하기 위하여 Mycobacterium xenopi strain의 DNA gyrase로부터 유래된 단백질 스플라이싱 분절인 Mxe gyrA intein 과 본 발명의 항균성 펩타이드 HLSA 가 융합된 융합단백질의 형태로 대장균 내에서의 발현을 유도하였다.

Mxe gyrA intein과 HLSA의 융합을 위하여 본 발명에서는 Mxe gyrA intein이 포함된 pTXB I 벡터를 사용하였는데, 상기 벡터에는 최종적으로 Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag system(IMPACT system)을 이용한 항균성 펩타이드 HLSA만의 분리를 가능하게 하는 chitin binding domain(CBD)이 Mxe gyrA intein 에 태깅(tagging)되어 있다. 상기 벡터에 실시예 1 에서 증폭된 HLSA 유전자 단편을 삽입시켰다. 상기 HLSA 유전자는 하기 서열번호 5의 염기서열을 갖는다.

서열번호 5 (5' -> 3');

TGCTTCCAATGGAAACGTGCCGCCCGTAAAGTGCGTTGC

증폭된 HLSA 유전자를 pTXBⅠ 벡터(New England BioLabs, Inc)의 MCS(multiple cloning site)로 삽입하기 위하여 5' 말단에는 NdeⅠ site를 추가하였고, 3' 말단에는 SapⅠ site를 추가하였다. Recombinant pTXB I-HLSA를 제작하기 위하여 제한효소 NdeⅠ과 SapⅠ에 의해 절단된 HLSA 유전자와 pTXBⅠ vector를 22℃에서 라이게이션(ligation) 시켰다. 상기 재조합된 플라스미드 벡터 pTXB I-HLSA 는 도 3 의 개열지도를 갖고, Mxe gyrA intein의 염기서열은 서열번호 6과 같고, HLSA-Mxe gyrA intein의 융합단백질을 코딩하는 유전자의 염기서열은 하기 서열번호 7과 같다.

서열번호 6(5' -> 3');

ATCACGGGAGATGCACTAGTTGCCCTACCCGAGGGCGAGTCGGTACGCATCGCCGACATCGTGCCGGGT

서열번호 7(5' -> 3');

TGCTTCCAATGGAAACGTGCCGCCCGTAAAGTGCGTTGCATCACGGGAGATGCACTAGTTGCCCTACCCGAGGGCGAGTCGGTACGCATCGCCGACATCGTGCCGGGT

상기 pTXBⅠ 벡터로 HLSA 유전자의 도입 여부를 확인하기 위하여 colony PCR을 수행하였으며 이때 사용한 primer는 HLSA 유전자를 증폭시킬 때 사용한 프라이머와 동일한 프라이머로 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머이다.

실시예 3. 대장균 형질전환체의 제조

상기 실시예 2에서 제조된 재조합 플라스미드 벡터인 pTXB I-HLSA 벡터를 E.coli에 도입시키기 위하여 CaCl₂를 이용한 competent cell method를 이용하여 수행하였다. E. coli TOP10F’을 Luria-Bertani(LB) broth media에서 완전히 생장시킨 후 100 ㎖ LB broth media에 1% fresh culture하여 37℃, 220 rpm 조건 하에 배양하였다. OD₆₀₀에서 0.6의 값이 나올 때까지 배양하였고, 배양된 균을 원심분리(4℃, 311 x g, 10 min)한 후, 1/2 volume의 ice cold 100 mM CaCl₂로 재부유(resuspension)하여 15분 동안 ice에 방치하였다. 원심 분리하여 상층액을 제거하고 1/10 volume의 ice cold 100 mM CaCl₂로 재부유(resuspension)하여 30분 간 ice에 방치한 후 competent한 상태가 된 E. coli에 재조합 DNA를 넣어 15분 동안 ice에 방치하였다. 다음으로, 42℃에서 1분 30초 동안 열충격(heat shock)을 가하고 1 ㎖의 LB media를 첨가하여 37℃에서 1시간 배양한 뒤 50 ㎍/㎖의 앰피실린(ampicillin)이 첨가된 한천 배지에 도말하여 37℃ incubator에서 overnight culture하였다.

최종적으로 확인된 재조합 DNA를 발현 균주인 E. coli ER2566에 transformation 하였고 recombinant pTXBⅠ-HLSA로 형질전환된 형질전환체(transformant)를 "HR-HLSA" 라 명명하였다.

상기 E. coli TOP10F’는 유전자 흡수율이 좋아 competent cell로 많이 사용된다. 그러나 pTXB I-HLSA의 경우 T7 promoter의 조절하에 IPTG induction system을 목표로 단백질이 과발현 되도록 설계되어 있어, 이러한 induction system을 이용할 경우 E. coli TOP10F’는 발현 균주로 적합하지 않으며, E.coli BL21 또는 E.coli ER2566 과 같은 발현 균주를 사용하는 것이 바람직한 바, 본 발명에서는 E.coli ER2566을 사용하였다. 본 발명에서 E. coli TOP10F’으로 형질전환시 도입되는 재조합 유전자는 pTXB I 벡터와 HLSA유전자가 라이게이션된 직후이기 때문에 이 때 형성된 colony 들 중에서 정확히 pTXB I-HLSA를 지니는 형질전환체를 선별해내는 과정이 필요하다.

본 발명에서와 같이 E. coli TOP10F’로 1차적으로 형질전환하는 과정을 거치지 않고 바로 E.coli ER2566을 형질전환을 시도하여도 되나, 본 발명에서는 중간 과정에서 시퀀스를 확인 후 정확한 재조합 유전자만을 증폭하여 얻기 위해 E. coli TOP10F’를 사용하여 1차적으로 형질전환을 수행한 후, 여기서 선별된 형질전환체를 배양하여 정확한 재조합 유전자(pTXB I-HLSA)를 정제하고, 발현 균주인 E.coli ER2566 으로 최종 형질전환을 수행하였다.

본 발명에서 사용한 균주 및 플라스미드는 하기 [표 3]과 같다.

[표 3] 본 발명에서 사용한 균주 및 플라스미드

실시예 4. 융합단백질의 발현 유도

HLSA 와 Mxe gyrA intein 이 융합된 융합단백질의 발현을 유도하기 위하여 LB broth media(0.1 g tryptone, 0.05 g yeast extract, 0.05 g sodium chloride in 10 ㎖ of distilled water)를 사용하여 37℃, 220 rpm 조건에서 overnight culture를 수행하였고, 1 ℓ의 LB broth media에 fresh culture하여 OD₆₀₀에서 0.6이 될 때까지 배양한 후, 0.4 mM IPTG(Isoprophyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가한 후, 4시간 배양함으로써 발현이 유도되었다.

이후, 융합단백질의 발현을 확인하기 위하여 SDS-PAGE 및 western blotting을 수행하였다(실험예 2 참조).

실시예 5. 항균성 펩타이드 분리

발현된 HLSA-Mxe gyrA intein 융합단백질로부터 HLSA 만을 분리 및 정제하기 위하여 IMPACT(Intein Mediated Purification an Affinity Chitin-binding Tag) system(New England Biolabs, Inc.)을 이용하였다. 왜냐하면 Mxe gyrA intein 에는 Chitin binding domain(CBD)이 존재하여 E.coli 내에서 발현된 HLSA-Mxe gyrA intein 융합단백질과 IMPACT system 에 사용되는 키틴 레진(chitin resin)은 친화성(affinity)이 있기 때문이다.

구체적으로 살펴보면, 원심 분리로 회수된 균을 200 ㎖의 용해버퍼(lysis buffer)(500 mM NaCl, 20 mM Tris-Cl pH 8.5)로 재부유(resuspension) 하고 ultrasonication을 이용하여 세포 용해(cell lysis)를 수행하였다.

원심 분리한 상층액은 chitin resin(New England Biolabs, Inc.)이 packing된 column에 flow시켜 HLSA-Mxe gyr A intein 융합단백질과 chitin resin의 결합이 이루어지도록 하였다. 결합을 마친 후 사용한 resin의 20배 volume의 column buffer(500 mM NaCl, 20 mM Tris-Cl pH 8.5)로 resin 내 nonspecific protein들을 wash out 하고, 상온에서 cleavage buffer(50 mM DTT, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-Cl pH 8.5)에 푹 담근 상태로 40시간 동안 incubation함으로써 HLSA와 Mxe gyrA intein의 절단(cleavage)을 유도하였다. 절단 반응(cleavage reaction)이 끝난 후에는 컬럼버퍼(column buffer)를 이용하여 HLSA를 용출시켰고, Mxe gyrA intein으로부터 최종적으로 분리된 HLSA를 "iHLSA"라고 명명하였다.

실험예 1. PCR 증폭 결과 확인

상기 실시예 1에서 PCR을 수행하여 증폭된 HLSA 유전자를 확인하기 위하여 1.5% agarose gel에서 전기영동한 후, EtBr로 염색하고, UV로 가시화하여 확인하였다(도 5a). 또한, 상기 실시예 2에서 pTXB I 벡터에 삽입된 HLSA 유전자의 삽입여부를 확인하기 위하여 colony PCR을 수행한 후, 상기와 같이 1.5% agarose gel에서 전기영동한 후, EtBr로 염색하고, UV로 가시화하여 확인하였다(도 5b).

그 결과, 도 5a 및 도 5b에서 보는 바와 같이 66bp 의 PCR product가 확인되었다.

실험예 2. 융합단백질의 발현 확인

상기 실시예 4에서 IPTG 의 첨가를 통한 단백질 발현유도를 완료한 후, 1 ㎖의 균을 원심 분리(18407 x g, 5 min)하여 회수하고 0.5 mm glass beads와 lysis buffer(500 mM NaCl, 20 mM Tris-Cl pH 8.5)를 넣어 vortex로 세포를 용해(lysis)하였다. 원심 분리한 상층액의 soluble condition fraction을 샘플버퍼(sample buffer)와 함께 10분간 boiling하였고, 12% Tris-glycine SDS-PAGE를 수행한 후, staining solution으로 염색하여 단백질의 발현 여부를 확인하였다(도 6a).

또한, HLSA 와 Mxe gyrA intein 융합단백질의 발현 여부를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 수행하였다. Polyvinylidene difluoride(PVDF) membrane으로 electrophoretic transfer하고 primary antibody로 anti-Lactoferrin antibody produced in rabbit(Sigma-aldrich Co.), secondary antibody로 anti-rabbit IgG AP antibody(Enzo life sciences, Inc.)를 사용하였다. Substrate로 4-nitroblue tetrazolium chloride/5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate(NBT/BCIP; Thermo Scientific Inc.)를 사용하여 발현된 HLSA와 Mxe gyrA intein 융합단백질을 detection하였다(도 6b).

그 결과, 도 6a 및 도 6b 에서 보는 바와 같이 28kDa의 HLSA-Mxe gyrA intein 융합단백질이 확인되었다.

실험예 3. HPLC analysis 를 이용한 iHLSA의 확인

상기 실시예 6 에서 IMPACT system으로 분리 및 정제된 iHLSA를 확인하기 위하여 HPLC analysis를 수행하였다. 사용한 column은 Agilent C18(4.6 X 150 mm, particle size 5 um)이며 synthetic HLSA(sHLSA)를 standard로 사용하여 iHLSA의 peak와 비교 확인하였다. 이동상(mobile phase)으로는 0.1% TFA(Trifluoroacetic acid)가 포함된 HPLC grade water와 ATN(Acetonitrile)을 이용하여 20:80(v/v)의 농도 구배로써 시료 내 펩타이드들을 분석하였다. Flow rate는 1 ㎖/min으로 20 ㎕씩 주입 하였고 220nm의 wavelengh에서 detection하였다.

그 결과, 도 7 에서 보는 바와 같이 standard로 사용한 synthetic HLSA(sHLSA)와 iHLSA 모두 4분대에 target으로 추정되는 major peak가 확인되었다. iHLSA를 규명하기 위하여 두 펩타이드에 대한 band spiking을 수행하였고, 동일한 시간대에 하나로 일치하는 major peak가 detection 된 것으로 보아 Mxe gyrA intein으로부터 iHLSA가 성공적으로 분리되고 정제되었음을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 본 발명에서 제조된 항균성 펩타이드(iHLSA)의 항균 활성 확인

최종적으로 정제된 iHLSA의 항균 활성을 확인하기 위하여 antibacterial activity assay를 수행하였다. Positive control로 synthetic HLSA(sHLSA)를 사용하였다. 지시균으로 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 사용하였으며 LB broth media(0.1 g tryptone, 0.05 g yeast extract, 0.05 g sodium chloride in 10 ㎖ of distilled water)에 full growth한 S. aureus를 1% fresh culture하여 37℃, 220 rpm 조건하에 OD₆₀₀에서 0.8의 값이 되도록 배양하였다. 배양액을 멸균한 D.W를 사용하여 10^-4 fold로 희석하였고, 하기 [표 4]와 같이 상기 실시예 5에서 용출(elution)된 iHLSA는 fraction 별로 지시균과 함께 37℃에서 2시간 동안 incubation 되었다. 상기 fraction은 iHLSA의 용출과정에서 용출버퍼를 넣은 후 순차적으로 100 ㎕의 일정한 양을 취한 후, fraction #1 내지 #4로 지정하여 샘플을 만든 것이다.

sHLSA, iHLSA 및 지시균의 incubation을 마친 후 펩톤 아가 플레이트(peptone agar plate(1% peptone, 1.5% agar))에 도말하였고, 37℃에서 overnight culture하여 형성된 콜로니로 colony counting assay를 수행하였고, human lactoferrin ELISA kit(Bethyl laboratory. Inc)를 사용하여 ELISA assay를 수행하여 각 fraction 내 elution된 iHLSA의 농도를 측정하였다.

상기 결과를 기초로 하여 지시균과 incubation시 사용된 iHLSA의 농도를 계산하였고 그 결과 도 8a 에서 보는 바와 같이 fraction #1 은 7.5 ㎍/㎖ 의 iHLSA로 93% 이상의 항균 활성을 나타내며, fraction #2-4 는 2.1 내지 6.4 ㎍/㎖ 의 iHLSA 로 약 86~89% 의 항균 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

상기와 같이 항균활성 측정 결과가 도출된 과정을 보다 상세히 기술하면, 도 8a의 Relative viability(%)는 용출된 iHLSA 대신 D.W.를 사용한 negative control(NC)에서 형성된 콜로니 수를 100% 로 하였을 때, 각각의 iHLSA fraction 샘플에서 형성된 콜로니의 수를 퍼센트(%)로 나타낸 것이다. 여기서 각각의 fraction별 샘플을 지시균과 incubation하였을 때 생존능력(viability)은 각각 7.55%, 13.78%, 10.99%, 14.89% 로 측정되었다. 이때 항균 활성 결과는 역으로 100% 에서 iHLSA fraction 별 viability(%)값을 뺀 것으로 fraction별로 92.5%, 86.2%, 89%, 85.11% 로 계산되는 바, 이것은 결국 negative control과 비교하였을 때, 항균성 펩타이드 iHLSA에 의해 죽은 균의 %를 나타내는 것이다.

또한, 항균활성 측정에 사용된 각각의 fraction 내에 존재하는 iHLSA를 정량하기위하여 ELISA를 수행하였다. synthetic HLSA 를 사용하여 standard curve를 잡고, fraction별로 샘플을 취하여 각 fraction 내에 존재하는 iHLSA의 양을 측정하였고, 그 결과는 도 8b와 같다. 상기 항균활성을 측정하는데 사용된 iHLSA의 양은, ELISA를 통해 계산된 fraction 내 iHLSA의 농도의 값을 바탕으로 하여, 지시균과incubation시 tube내에 존재하는 iHLSA의 양을 역추정하여 계산한 것이다.

[표 4]colony counting assay

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> Hankuk University of Foreign Studies Research and Industry-University Cooperation foundation <120> METHOD FOR PRODUCING ANTIMICROBIAL PEPTIDE USING INTEIN <130> P14-E908 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Human lactoferricin 20-31 amino acid sequence <400> 1 Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 24, 26, 27 residues substituted human lactoferricin 20-31 amino acid sequence <400> 2 Cys Phe Gln Trp Lys Arg Ala Ala Arg Lys Val Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggtggtcata tgtgcttcca atggaaacg 29 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggtggttgct cttccgcaac gcactttacg ggcg 34 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coding sequence of modified human lactoferricin peptide <400> 5 tgcttccaat ggaaacgtgc cgcccgtaaa gtgcgttgc 39 <210> 6 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene encoding Mxe GyrA intein <400> 6 atcacgggag atgcactagt tgccctaccc gagggcgagt cggtacgcat cgccgacatc 60 gtgccgggt 69 <210> 7 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene encoding modified human lactoferricin-Mxe GyrA intein fusion protein <400> 7 tgcttccaat ggaaacgtgc cgcccgtaaa gtgcgttgca tcacgggaga tgcactagtt 60 gccctacccg agggcgagtc ggtacgcatc gccgacatcg tgccgggt 108

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 락토페리신(lactoferricin) 펩타이드와 인테인(intein)이 융합된 융합단백질.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 변형된 락토페리신(lactoferricin) 펩타이드와 인테인(intein)이 융합된 융합단백질.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 인테인(intein)은 마이코박테리움 제노피 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 인테인(Mycobacterium xenopi DNA gyrase subunit A intein, Mxe gyrA intein)인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
변형된 락토페리신(lactoferricin) 펩타이드와 마이코박테리움 제노피 DNA 자이레이즈 서브유닛 A 인테인(Mycobacterium xenopi DNA gyrase subunit A intein, Mxe gyrA intein)이 융합된 융합단백질을 코딩하는 서열번호 7의 유전자.
제 4항의 유전자가 포함된 재조합 플라스미드 벡터로 형질전환된 대장균 형질전환체.
(1) 인테인(intein)이 포함된 플라스미드 벡터에 락토페리신(lactoferricin) 유전자를 삽입시키는 단계;
(2) 상기 (1)단계에서 재조합된 플라스미드 벡터를 대장균에 도입하여 대장균 형질전환체를 제조하는 단계;
(3) 상기 (2)단계에서 제조된 대장균 형질전환체를 배양하여 인테인과 락토페리신이 융합된 융합단백질의 발현을 유도하는 단계;
(4) 상기 (3)단계에서 발현이 유도된 융합단백질을 분리하는 단계; 및
(5) 상기 (4)단계에서 분리된 융합단백질에서 락토페리신 펩타이드를 분리 및 정제하는 단계; 를 포함하는 항균성 펩타이드의 제조방법.
제 6항에 있어서,
상기 (1)단계에서 락토페리신(lactoferricin) 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 항균성 펩타이드의 제조방법.