CN109880840B

CN109880840B - 一种重组蛋白大肠杆菌体内生物素化标记系统

Info

Publication number: CN109880840B
Application number: CN201910203784.0A
Authority: CN
Inventors: 聂鑫怡; 李博文
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2019-03-18
Filing date: 2019-03-18
Publication date: 2023-01-10
Anticipated expiration: 2039-03-18
Also published as: CN109880840A

Abstract

本发明公开了一种重组蛋白大肠杆菌体内生物素化标记系统及方法，属于生物技术领域。该系统使用一种伴侣质粒，可通过阿拉伯糖诱导表达去除DNA结合区的大肠杆菌生物素连接酶催化结构域，与目的蛋白大肠杆菌表达载体及相应的工程菌株配合，可在获得重组目的蛋白的同时，对表达出的目的蛋白进行特异性、高效的生物素标记。同时，本发明在此系统的基础上，提供了一种可与乳糖操纵子系统的载体配合，适用于高密度自动诱导，可实现大规模重组蛋白的批量生物素化标记方法。本发明将极大提高蛋白质生物素化标记的效率和操作便利性，进而推动其在生物活性分子（DNA/RNA/蛋白质）标记、检测、纯化以及固定化等众多过程的应用。

Description

一种重组蛋白大肠杆菌体内生物素化标记系统

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组蛋白大肠杆菌体内生物素化标记系统及应用。

背景技术

生物素（biotin）作为一种小分子的有机化合物，能够非常特异和稳定的结合亲和素/链霉亲和素（avidin/streptavidin）蛋白分子，其解离参数（dissociation constant）可达到10^-15M。作为目前自然界发现的最强的非共价结合，生物素/亲和素系统也成为生物、医药以及化工等相关研究和生产领域中最为重要的工具之一，广泛的应用于生物活性分子（DNA/RNA/蛋白质）标记、检测、纯化以及固定化等众多过程。

生物活性分子的生物素特异标记是生物素/亲和素系统应用的前提基础，而与DNA和RNA分子的生物素标记相比，蛋白质的生物素标记目前仍是其应用的主要难题之一。蛋白质的生物素标记目前可以通过化学法和酶促法两类方法实现，其中化学标记的方法需要在较为极端的溶液体系环境中进行，这往往造成多数蛋白质活性的不可逆失活，而且化学标记位点特异性低，一些对蛋白质活性中心位点的标记有可能会影响蛋白质功能的实现，这应是蛋白质活性标记应极力避免的，同时化学标记的成本和效率也都不能满足实际应用的需要。因此目前蛋白质的酶促生物素化标记主要是利用大肠杆菌来源的生物素连接酶（Biotin protein ligase [EC 6.3.4.15],BirA)来进行。大肠杆菌BirA能够在其胞内催化生物素特异标记在生物素羧基载体蛋白（Biotin carboxyl carrier protein，BCCP）或人工进化来的15-23个氨基酸的生物素结合肽（biotin acceptor peptides，BAP）的特异位点赖氨酸的侧链上，这个反应同时能够离体进行，因此可以将BCCP或BAP与待标记的蛋白质进行融合表达，利用BirA在体内（表达过程中）或体外（纯化后）对其进行特异性的生物素化标记。与体外的BirA酶促生物素化相比，大肠杆菌胞内BirA酶促生物素化标记具有不用严格的体外酶促反应条件，同时反应环境更温和，更有利于待标记蛋白活性的保存的特点；而且大肠杆菌胞内BirA酶促生物素化标记具备成本更低，规模可控，环境友好，更有利于规模化和自动化生产的优势。因此大肠杆菌胞内BirA酶促生物素化标记是目前蛋白质活性标记最有应用潜力的方向之一。

目前大肠杆菌胞内BirA酶促生物素化标记已有商业化的产品，然而其在实际应用中仍有许多亟待解决的问题。目前商业化的大肠杆菌胞内BirA酶促生物素化产品，即Avidity公司的AVB99、AVB100及AVB101三株大肠杆菌，其共同特点在于具有BirA表达框，可与具有lac启动子的目的蛋白表达载体（带有BAP标签）共表达，在表达目的蛋白的同时，超水平表达BirA，从而高效的对目的蛋白进行生物素化标记。然而该系统仍存在以下问题：（1）这三株大肠杆菌都不融合有T7 RNA聚合酶基因，因此不能与目前应用最为广泛的T7表达系统（即pET系列表达载体）兼容；（2）虽然可将AVB99和AVB101中的伴侣质粒pBirAcM转入T7系统表达菌株，实现其与T7表达系统的兼容，但由于pBirAcM伴侣质粒使用的也是lac启动子，与T7表达系统都需要乳糖或IPTG诱导，而目的蛋白活性诱导的条件往往与诱导剂浓度直接相关，这就无法兼顾目的蛋白与共表达的BirA的表达水平，从而造成目的蛋白产量或标记效率上的损失，其他几种应用最为广泛的商业化载体，如pQE系列，和pGEX系列载体也都存在类似的问题；（3）大肠杆菌的BirA是其体内生物素操纵子的阻遏蛋白，可通过其DNA结合结构域与大肠杆菌基因组相关基因结合，降低生物素操纵子的活性，对其生物素的利用。在对目的蛋白进行胞内生物素标记时，超水平的BirA会对大肠杆菌的生长产生十分严重的抑制，影响菌体的高密度培养，进而影响目的蛋白的产量。

针对上述问题，本发明人经过广泛调研研究，并通过大量实验进行相关条件摸索，首次开发出一种重组蛋白大肠杆菌体内生物素化标记系统，该系统使用一种生物素标记伴侣质粒，其带有来源于沙门氏菌的阿拉伯糖操纵子系统，可诱导表达去除DNA结合区的大肠杆菌生物素连接酶催化结构域，将标记伴侣质粒与目的蛋白大肠杆菌表达载体及相应的工程菌株配合，实现大肠杆菌生物素连接酶和带有生物素连接酶底物标签的目的蛋白共表达，在获得目的蛋白的同时，对表达出的目的蛋白进行特异性、高效的生物素标记。其主要特点在于：（1）生物素连接酶的诱导与目前最常用的表达系统的诱导剂不冲突，可单独调整生物素连接酶和目的蛋白的诱导水平，从而兼顾活性目的蛋白产量和生物素化的标记效率；（2）该系统中共表达的BirA为去除其DNA结合区的截短蛋白，截短的BirA不再抑制大肠杆菌的生长而其酶活却没有受到影响，因此能够实现高密度发酵，提高目的蛋白的产量和生物素化的标记效率；（3）可与T7表达系统（pET系列载体）、T5表达系统（pQE系列载体）、Tac表达系统（pGEX系列以及pMAL系列载体）、pCold表达系统等目前工业和实验室常用的商业化原核表达系统兼容，可稳定共存于大肠杆菌中，实现BirA和目的蛋白的共表达；同时，本发明在此系统的基础上，提供了一种可与乳糖操纵子系统的载体（T7表达系统、T5表达系统、Lac、Tac表达系统等）配合，适用于高密度自动诱导，能实现自动化规模操作，可实现大规模重组蛋白的生物素化标记的方法，诱导剂环境友好、对人体无毒，更好的满足工业化生产以及实验室高通量标记实验的实际需要。本发明将极大提高蛋白质生物素化标记的效率和操作便利性，进而推动其在生物活性分子（DNA/RNA/蛋白质）标记、检测、纯化以及固定化等众多过程的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与目前工业上和实验室中常用的原核蛋白表达系统兼容性更好，标记的效率和稳定性更好的重组蛋白大肠杆菌体内生物素化标记系统，以解决前述的目前大肠杆菌胞内BirA酶促生物素化产品兼容性、标记的效率和稳定性上的不足。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

本发明提供的重组蛋白大肠杆菌体内生物素化标记系统，使用一种生物素标记伴侣质粒，其带有来源于沙门氏菌的阿拉伯糖操纵子系统，可诱导表达去除DNA结合区的大肠杆菌生物素连接酶催化结构域。该伴侣质粒可与目前工业上以及实验室常用的原核表达载体稳定共存于工程大肠杆菌中，将标记伴侣质粒与目的蛋白的大肠杆菌重组表达载体及相应的工程菌株配合，实现大肠杆菌生物素连接酶和带有生物素连接酶底物标签的目的蛋白共表达，在获得目的蛋白的同时，对表达出的目的蛋白进行特异性、高效的生物素标记。

所述的生物素标记伴侣质粒，以带有p15复制起点和筛选标记氯霉素抗性基因（编码氯霉素乙酰转移酶CAT）为质粒骨架，插入了来源于沙门氏菌的阿拉伯糖操纵子包含阿拉伯糖诱导启动子araBAD Promoter以及其阻遏蛋白编码基因araC，在araBAD Promoter下游插入了去除了N端63个氨基酸编码区的截短型的大肠杆菌生物素连接酶（Truncated BirA，tBirA）基因，具体质粒图谱如附图1所示。

所述的tBirA的编码序列选自：

（1）核酸序列SEQ ID No. 1，编码蛋白序列SEQ ID No. 2；或

（2）在上述（1）限定的序列中通过密码子简并取代，或一个或几个氨基酸取代、缺失或插入，且具有其对应体内功能的由（1）限定序列所衍生的蛋白或多肽。

所述的沙门氏菌的阿拉伯糖操纵子包含阿拉伯糖诱导启动子araBAD Promoter以及其阻遏蛋白编码基因araC，两者的编码序列选自：核苷酸编码序列SEQ ID No. 3。

所述的生物素连接酶底物标签，标签可以被BirA催化在特定位点（赖氨酸的侧链）连接一个生物素分子，从而实现对与其融合表达的目的蛋白的特异性生物素标记，包括但不限于以下几种蛋白标签：生物素羧基载体蛋白（biotin carboxyl carrier protein，BCCP)、15-23个氨基酸的生物素受体肽（biotin acceptor peptide, BAP tag)或称Avi-Tag等。

所述的重组蛋白大肠杆菌体内生物素化标记系统，可与主要的目前商业化的原核表达载体以及相应的工程大肠杆菌配合使用，对目的蛋白进行生物素标记，包括但不限于以下系列载体：T7表达系统（以T7启动子例如Novagen和invitrogen的pET系列载体）、T5表达系统（例如Qiagen的pQE系列载体）、Lac、Tac、Pac表达系统（例如GE Healthcare的pGST系列载体，NEB的pMAL系列载体）、低温诱导表达系统(例如TaKaRa的pCold系列载体）等，以及相应的K12或B系来源的大肠杆菌工程菌株，如JM109, JM109(DE3), BL21, BL21(DE3),ER2566,Shuffle Express, Shuffle T7 Express等。

所述的重组蛋白大肠杆菌体内生物素化标记系统，其表达并生物素标记重组蛋白的具体步骤和条件如下：

（1）目的蛋白编码基因与生物素连接酶底物标签融合克隆，连入表达载体中；

（2）目的蛋白表达载体与生物素标记伴侣质粒共同转化大肠杆菌工程菌株，利用氯霉素和表达载体所需的抗生素联合筛选阳性菌株；

（3）阳性菌株单克隆接入常用大肠杆菌培养基（LB/SOB/SOC/2×YT等）中，加入10-40 μg/mL氯霉素和50-200 μg/mL氨苄青霉素或25-100μg/mL硫酸卡那霉素，以及0.001-0.5%(m/v)L-阿拉伯糖，37℃ 200-300rpm摇床预培养2-6hr，至菌体密度达到目的蛋白诱导密度；

（4）加入目的蛋白的诱导剂以及50μM d-生物素，诱导培养即可；或在12-25℃下低温冷激直接进行诱导培养；所述诱导剂含0.1-1mM IPTG或0.05wt.%-0.5wt.%乳糖。

本发明的另一个目的在于提供一种适用于高密度自动诱导，能实现自动化规模操作，可实现规模化的重组蛋白生物素化标记的重组蛋白大肠杆菌体内自动诱导+生物素化标记方法，以更好的满足工业化生产以及实验室高通量标记实验的实际需要。

所述的重组蛋白大肠杆菌体内自动诱导+生物素化标记方法，该系统可与乳糖操纵子系统的载体（T7表达系统、T5表达系统、Lac、Tac表达系统等）配合，在培养基中填入不同比例的葡萄糖、阿拉伯糖和乳糖等碳源（自动诱导标记培养基），利用大肠杆菌对碳源利用的顺序，可实现目的蛋白的自动诱导和生物素化标记，进而可实现大规模蛋白生物素化标记的自动化规模操作。

所述的重组蛋白大肠杆菌体内自动诱导及生物素化使用的自动诱导标记培养基，在常用的大肠杆菌培养基基础上添加0.25%-2.5%(m/v)甘油、0.01-0.1%(m/v)D-葡萄糖、0.1-0.5%(m/v)α-D-乳糖以及0.01-0.5%(m/v)L-阿拉伯糖的组合碳源，同时加入维持培养基pH中性的缓冲盐，如25-50mM磷酸盐，25-100mM三羟甲基氨基乙烷-盐酸盐（Tris-HCl），10-50mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES)或哌嗪-1,4-二乙磺酸-盐酸盐(PIPES)等。

所述的重组蛋白大肠杆菌体内自动诱导及生物素化标记方法，其具体步骤和条件如下：

（3）阳性菌株单克隆接入自动诱导标记培养基中，加入10-40 μg/mL氯霉素和表达载体所需的抗生素(50-200 μg/mL氨苄青霉素或25-100μg/mL硫酸卡那霉素）以及0.001-0.5%(m/v)L-阿拉伯糖、50μM d-生物素，37℃ 200-300rpm摇床预培养2-6hr，至菌体密度达到目的蛋白的诱导密度，继续培养或转入目的蛋白10-30℃诱导温度下培养直至收菌。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

与目前已有的大肠杆菌胞内BirA酶促生物素化系统相比，本发明的优点在于：

（1）本发明提供的生物素标记伴侣质粒可与前期已建立的目的蛋白原核表达体系直接兼容，不需要转入特殊的表达菌株，可直接转入前期已构建的表达工程菌株中或与目的蛋白原核表达载体共转化入合适的表达菌株即可，因此不需要重新摸索建立目的蛋白的重组表达条件（如助溶的融合标签，诱导剂类型等），体现出与目前工业上以及实验室常用的原核表达载体和工程菌株较好的兼容性；

（2）本发明提供的生物素标记伴侣质粒可通过阿拉伯糖操纵子系统诱导调控大肠杆菌生物素连接酶，独立于目的蛋白的诱导调控系统，也减少了BirA与目的蛋白表达之间的竞争/干扰，可在确保目的蛋白产量和活性的同时，单独调整BirA的表达水平/催化活性，既保证了标记的效率和稳定性，也避免了重新摸索优化目的蛋白的诱导表达条件。

（3）本发明提供的生物素标记伴侣质粒诱导表达的是去除DNA结合区的大肠杆菌生物素连接酶的催化结构域，一方面去除了野生型BirA对表达菌株的抑制作用，极大的提高菌体生长的密度进而提高目的蛋白的产量，另一方面也完整保留了野生型BirA的生物素标记酶活，进一步兼顾了目的蛋白产量和活性，以及生物素标记的效率和稳定性。

（4）本发明利用所述的生物素标记伴侣质粒建立的重组蛋白大肠杆菌体内自动诱导及生物素化标记方法，适用于高密度自动诱导，能实现自动化规模操作，可实现大规模重组蛋白的生物素化标记，诱导剂环境友好、对人体无毒，更好的满足工业化生产以及实验室高通量标记实验的实际需要。

可见本发明针对性的克服了现有技术的缺陷，将极大提高蛋白质生物素化标记的效率和操作便利性，进而推动其在生物活性分子（DNA/RNA/蛋白质）标记、检测、纯化以及固定化等众多过程的应用。

附图说明

图1为本发明提供的重组蛋白大肠杆菌体内生物素化标记伴侣质粒pBADcM-tBirA的质粒图谱。

图2为实施例1中重组表达的全长BirA与截短的BirA（tBirA）的体外生物素化标记活性结果。

图3为实施例2中四环素诱导的全长BirA与截短的BirA（tBirA）对大肠杆菌生长的影响，其中A和B分别是带有pZt1cM-BirA和pZt1cM-tBirA的BL21(DE3)在不同浓度的诱导剂四环素条件下的生长曲线。

图4为实施例2中带有pZt1cM-BirA和pZt1cM-tBirA的BL21(DE3)在不同浓度的诱导剂四环素条件下的全蛋白SDS-PAGE电泳图，M是蛋白电泳Marker。

图5为实施例2中pZt1cM-BirA和pZt1cM-tBirA伴侣质粒对共表达的重组蛋白VHH-BAP的生物素化标记活性比较。

图6为实施例3中不同启动子调控调控的tBirA的生物素化标记活性的ELISA检测结果。

图7为实施例4中不同启动子调控调控的tBirA对共表达的重组蛋白VHH-BAP表达量和标记效率的影响。

图8为展示了本发明实施例5中自动诱导标记体系中VHH-BAP标记效率。

具体实施方式

如本文所用，基因用斜体表示，蛋白用正体表示。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

本发明涉及的蛋白应理解为包含与天然来源的黄曲霉蛋白一级序列一致的蛋白及其衍生形式。本发明涉及蛋白的衍生形式包括（但并不限于）：一个或多个（通常为1-50个）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个（通常为1-600个）氨基酸。例如，在本领域中，用性质相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又例如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，通常也不会改变原本蛋白的性质，例如本发明的蛋白可在N端和C端融合各种亲和标签，但并未改变蛋白本体的催化和结合活性。

可采用辐射或化学诱变技术来产生随机突变，也可通过定点诱变或其他已知分子生物学手段获得上述蛋白衍生形式。

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如Sambrook等人编著的《分子克隆：实验室手册》（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的条件，或试剂生产商推荐的条件进行。

以下实施例使用材料来源如下：

High Pure PCR Template Preparation Kit，Phusion DNA polymerase，rTaqDNA polymerase，Restriction endonuclease，Ni-NTA agarose购自Invitrogen；

pColdI、Pg-tf2为Takara公司产品，pET28a为Novagen公司产品。

大肠杆菌JM109、XL1-blue购自TaKaRa，BL21(DE3)购自Lucigen，Shuffle T7Express购自NEB；

Mouse anti-His6 Monoclonal antibody和HRP-conjugated Goat anti MouseIgG (H+L)购自Sigma- aldrich；

Peroxidase-conjugated Streptavidin购自上海翊圣；

其他常规化学试剂购自上海生工。

实施例1：不同长度的BirA的原核表达以及其体外催化活性的比较

首先发明人通过PCR技术从大肠杆菌基因组DNA中扩增出完整的BirA和截去N端63个氨基酸的tBirA的编码区片段（SEQ ID No. 1），将两种编码片段克隆入原核表达载体pCold I中，对两种长度的BirA进行了重组表达和纯化，并以带有15氨基酸的BAP标签的重组蛋白为底物（本实施例选用的是驼源重链单域抗体VHH 7C12克隆，在本发明中简称VHH-BAP），比较两种长度的BirA对底物蛋白的生物素标记活性，考察不同长度BirA体外催化活性的差异。具体步骤和条件如下：

1、大肠杆菌基因组DNA提取：接种大肠杆菌XL1-blue单克隆于SOC液体培养基，220rpm，37℃培养过夜，离心收集菌体，并参照Roche公司的High Pure PCR TemplatePreparation Kit说明书操作，并用琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA的质量和浓度。

2、不同长度BirA基因编码区和VHH-BAP的扩增及原核表达载体的构建：

引物设计:

BirA Forward: 5’-ata CATATg AAggATAACACCgTgCCACT-3’;

tBirA Forward: 5’-ata CATATg ATCCAgTTACTTAATgCTAAACAg-3’;

BirA Reverse: 5’-tat gTCgAC TATTTTTCTgCACTACgCAgggAT-3’;

VHH-BAP Forward: 5’-ata CATATg GCTGTTCAGCTGGTTGAAT-3’;

VHH-BAP Reverse: 5’-tat gTCgAC TATTCgTgCCATTCgATTTTCTgAgCTTCgAAgATgTCgTTCAgACCAgAAgAAACggTAACCTgg-3’;

PCR扩增编码区序列：BirA和tBirA以上述大肠杆菌基因组DNA为模板，VHH-BAP以本实验室保存的VHH7C12质粒克隆为模板（VHH7C12基因编码序列为NCBI公开数据，Int JCancer. 2011, 129(8): 2013–2024. doi:10.1002/ijc.26145.），利用Phanta DNApolymerase和相应引物PCR扩增基因编码序列，具体程序参照试剂说明书；

将上述基因扩增片段、pCold I载体和pET28a载体同时进行Nde I和Sal I双酶切，37℃反应2hr；分别切胶回收BirA、tBirA编码区、VHH-BAP、pColdI载体和pET28a的双酶切产物，BirA、tBirA与pCold I连接，VHH-BAP与pET28a连接，利用T4连接酶16℃连接1hr后，转化大肠杆菌JM109；菌落PCR鉴定阳性克隆，进一步测序鉴定，最终获得原核表达载体pCold-BirA、pCold-tBirA和pET28a-VHH-BAP。

3、不同长度BirA基因编码区和VHH-BAP的原核表达及纯化：

将上述原核表达载体转化入大肠杆菌Shuffle T7 Express中，获得相应基因的原核表达菌株，之后分别接种至LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.4-0.5，15℃冷激30min，加入IPTG至终浓度0.3mM，15℃诱导表达12-24hr。重组亲和纯化参照Ni-NTAagarose说明书进行，最终获得重组蛋白带有N端His标签的BirA、tBirA和VHH-BAP。

4、不同长度BirA体外催化活性的比较：

使用获得的BirA、tBirA和VHH-BAP重组蛋白，进行体外生物素标记反应，10μL体外生物素标记反应体系为如下成分的混合液：50mM bicine, pH8.3, 10mM ATP, 10mMMgOAc, 50μM d-biotin, 75μg VHH-BAP, 2.5μg BirA或2μg tBirA（两者等摩尔数）。30℃下反应15min。取1μL反应产物与99μL ELISA碱性包被液（0.29%NaHCO₃, 0.16%Na₂CO₃.12H₂O, pH9.6, 0.02% NaN₃）混匀，37℃孵育2hr，4℃包被过夜。之后利用辣根过氧化物酶标记链霉亲和素进行直接ELISA检测。结果如附图2所示，截短的tBirA的体外催化活性与全长的BirA无统计学意义的差异，截去其DNA结合区对BirA的催化活性无影响。

实施例2：不同长度的BirA对大肠杆菌生长的影响以及体内标记活性的比较

发明人通过Overlap-PCR技术构建tBirA和BirA两种编码片段的两种表达框接在大肠杆菌组成型启动子PN25和T0终止子中间，利用Exo III介导的LIC技术与pACYC载体框架拼装，分别构建组成型表达的不同长度BirA表达载体。同时发明人还将上述两种编码片段克隆入带有四环素诱导启动子的载体（也是pACYC质粒骨架）中，构建了诱导型表达的不同长度BirA表达载体。

之后将上述表达载体转化入BL21(DE3)中，挑单克隆进行培养，通过测定生长曲线考察不同长度的BirA对大肠杆菌生长影响，检测BirA的表达量，同时以实施例1中的VHH-BAP为底物，比较上述菌体裂解上清液对底物蛋白的生物素标记活性，考察不同长度BirA催化活性的差异。

具体步骤和条件如下：

1、PN25-BirA-T0、PN25-tBirA-T0和pACYC质粒框架的扩增和拼装：

引物设计:

PN25 Forward: 5’-TCATAAAAAATTTATTTgCTTTCAggAAAATTTTTCTgTATAATAgATTCATAAATTTgAgAgAggAgTTTCACACAgAATTCATTAAAgAggAgAAA-3’;

PN25-BirA Forward: 5’-CAgAATTCATTAAAgAggAgAAATTAACATgAAggATAACACCgTgCC-3’;

PN25-tBirA Forward: 5’-CAgAATTCATTAAAgAggAgAAATTAACATgATCCAgTTACTTAATgCTAAACAg-3’;

T0-BirA Reverse: 5’-ACTGGATCTATCAACAGGAGTCTTATTTTTCTgCACTACgCAgggAT-3’;

T0 Reverse: 5’-ATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCTATCAACAGGAGTC-3’;

pACYC Forward: 5’-TTTATTggTgAgAATGACGACCGGGTCGAAT-3’;

pACYC Reverse: 5’-ATAAATTTTTTATGATTTGAAGAGATAAATTGCACT-3’;

以实施例1中的BirA的原核表达载体为模板，利用引物组合(PN25 Forward和T0Reverse引物浓度为0.2μM，PN25-BirA Forward和T0-BirA Reverse引物浓度为0.04μM)进行Over-Lap PCR扩增PN25-BirA-T0片段，以实施例1中的tBirA的原核表达载体为模板，利用引物组合(PN25 Forward和T0 Reverse引物浓度为0.2μM，PN25-tBirA Forward和T0-BirA Reverse引物浓度为0.04μM)进行Over-Lap PCR扩增PN25-tBirA-T0片段，同时以pACYC-184为模板，pACYC Forward和pACYC Reverse引物扩增pACYC质粒框架，操作参照Phusion DNA polymerase试剂说明书，琼脂糖凝胶分离并切胶回收相应扩增片段。

使用获得的PN25-BirA-T0、PN25-tBirA-T0和pACYC质粒框架进行拼装，10μLExoIII介导的拼装体系为如下成分的混合液：1×ExoIII buffer, 200ngPN25-BirA-T0/PN25-tBirA-T0, 100ng pACYC质粒框架。体系冰浴5min后，加入20U ExoIII，冰浴中继续反应60min。加入1μL 0.5M EDTA（pH8.0）混匀后65℃水浴5min。之后马上转化大肠杆菌JM109；菌落PCR鉴定阳性克隆，进一步测序鉴定，最终我们顺利获得组成型表达载体pPN25cM-tBirA，而同样条件的pPN25cM-BirA一直没有克隆长出，判断是组成型超水平表达全长的BirA对大肠杆菌是有毒性的，因此我们接下来又构建了诱导型表达的载体进一步证明我们的判断。

2、四环素诱导的BirA、tBirA表达载体的构建：

引物设计:

tBirA_Pzt1 F:5’-TAAAGAGGAGAAAGTAACATGATCCAGTTACTTAATGCTGAA-3’

BirA_Pzt1 F:5’-TAAAGAGGAGAAAGTAACATGAAGGATAACACCGTGCC-3’

BirA_Pzt1 R:5’-TGCGTAAATTACTTCTCTGCACTACGCA-3’

Pzt1 R:5’-CTTTCTCCTCTTTAATGAATTC-3’

Pzt1 F:5’-GAAGTAATTTACGCAGCATAACGC-3’

以实施例1中的tBirA和BirA的原核表达载体为模板，利用相应引物进行PCR扩增，同时以TaKaRa公司的pG-Tf2质粒为模板，Pzt1 F和Pzt1 R引物扩增带有四环素诱导元件的pACYC质粒框架，操作参照Phusion DNA polymerase试剂说明书，琼脂糖凝胶分离并切胶回收相应扩增片段。片段拼装操作同上，最终我们顺利获得四环素诱导型的表达载体pZt1cM-BirA和pZt1cM-tBirA。

3、tBirA和BirA对大肠杆菌生长的影响

将pZt1cM-BirA和pZt1cM-tBirA转化入BL21(DE3)中，挑单克隆至加入氯霉素的SOB培养基种中培养，同时分别加入0、2.5、5、10ng/mL的四环素，用以梯度诱导BirA和tBirA，每隔2hr测定菌体的OD₆₀₀，绘制各组大肠杆菌的生长曲线，考察不同长度的BirA对大肠杆菌生长影响，结果如附图3所示。同时收集8hr培养的菌体，裂解后通过SDS-PAGE检测各组大肠杆菌中BirA/tBirA的表达，结果如附图4所示。结果显示，全长的BirA对大肠杆菌的生长有明显的浓度依赖的抑制作用（在10ng/mL四环素诱导下的pZt1cM-BirA转化组基本不生长），而tBirA则未表现出类似的抑制作用，这也进一步证明了我们在构建组成型表达载体时未能得到PN25-BirA的原因在于组成型表达的BirA对大肠杆菌是有毒性的。而SDS-PAGE分析表明截去DNA结合区未影响BirA在大肠杆菌体内的表达。

4、tBirA和BirA体内标记活性的比较

将pET28a-VHH-BAP质粒分别与pZt1cM-BirA和pZt1cM-tBirA共转化入BL21(DE3)，在氯霉素与卡那霉素双抗LB平板上筛选阳性克隆。挑取相应转化组的单克隆至含有氯霉素和卡那霉素以及5ng/mL四环素的LB培养基中进行培养，收集诱导培养8hr的菌体，以1mg湿重~15μL裂解液(112mM Tris-Acetate, pH7.0, 0.5mg/mL Lysozyme)比例重悬菌体，超声破碎上清，取0.5μL反应液与50μL 碱性抗原包被液混合包被于96孔板, 之后的ELISA检测同实施例1中相应操作。结果如附图5所示，结果显示截短的tBirA的体内催化活性与全长的BirA无统计学意义的差异，截去其DNA结合区对BirA的大肠杆菌体内催化活性无影响。

实施例3：不同启动子的tBirA对重组蛋白生物素标记效率的影响

在上述实验的基础上，发明人进一步构建了阿拉伯糖操纵子系统和乳糖操纵子系统的tBirA诱导表达载体，将上述表达载体与pPN25cM-tBirA和pZt1cM-tBirA分别转化入BL21(DE3)中，挑单克隆进行培养，以实施例1中的VHH-BAP为底物，比较上述菌体裂解上清液对底物蛋白的生物素标记活性，考察不同启动子对大肠杆菌体内tBirA表达量和催化活性的影响。

具体步骤和条件如下：

1、阿拉伯糖以及乳糖诱导的tBirA表达载体的构建：

引物设计:

tBirA_BAD F:5’-ATGGAGCATTAAAGAGGAGAAAGTAACAT-3’

tBirA_BAD R:5’-CTGAAAATTACTTCTCTGCACTACGCA-3’

pBAD promoter F：5’-TgAAgCACTTCACTgACACCCTCATCA-3’

pBAD promoter R: 5’-TCTTTAATGCTCCATCCAGAAAAACAGG-3’

pBAD terminator F:5’-AGAAGTAATTTTCAGCCTGATACAGATT-3’

pBAD terminator R: 5’-CAgTgAAgTgCTTCATgTggCAggAgA-3’

tBirA_TAC F::5’-CTAAAGAGGAGAAAGTAACATGATCC-3’

tBirA_TAC R:5’-AACGGATCTTCGAATTTCTGCCATTCATC-3’

pTac promoter F:5’-TTCgAAgATCCgACACCATCgAATggTgC-3’

pTac promoter R:5’-TCTCCTCTTTAgTgCTCgTgAAAACACCT-3’

以实施例2中的pZt1cM-tBirA为模板，利用tBirA_BAD F和tBirA_BAD R为引物扩增tBirA，同时以TaKaRa公司的pG-KLE8质粒为模板，pBAD promoter F和pBAD promoter R为引物扩增阿拉伯糖启动子及其阻遏蛋白表达框和部分pACYC质粒框架，以pBADterminator 和pBAD terminator R引物扩增rrnBT1T2终止子和部分pACYC质粒框架，操作参照Phusion DNA polymerase试剂说明书，琼脂糖凝胶分离并切胶回收相应扩增片段。片段拼装操作同上，最终我们顺利获得阿拉伯糖诱导型的表达载体pBADcM-tBirA。

再以pBADcM-tBirA为模板，tBirA_TAC F和tBirA_TAC R为引物扩增tBirA和pACYC质粒框架，以pMAL-c2x为模板，pTac promoter F和pTac promoter R为引物扩增Tac启动子及其阻遏蛋白LacI表达框，操作参照Phusion DNA polymerase试剂说明书，琼脂糖凝胶分离并切胶回收相应扩增片段。片段拼装操作同上，最终我们顺利获得阿拉伯糖诱导型的表达载体pTACcM-tBirA。

2、不同启动子调控下大肠杆菌体内tBirA标记活性的比较

发明人将已构建的tBirA组成型表达载体pPN25cM-tBirA和三种不同的诱导型表达载体pZt1cM-tBirA、pBADcM-tBirA以及pTACcM-tBirA转化BL21(DE3)，进行体内标记活性的比较（以pACYC-184转化组作为背景对照）。挑取相应转化组的单克隆至含有氯霉素的LB培养基中进行培养，诱导型表达载体转化组进行梯度浓度诱导剂诱导tBirA的表达，诱导剂浓度梯度分别为：pZt1cM-tBirA组为0、0.5、1.0、2.0、4.0ng/mL四环素；pBADcM-tBirA组为0、0.02%、0.05%、0.1%、0.2%（m/V)L-阿拉伯糖；pTACcM-tBirA组为0、0.1、0.2、0.4、0.8mMIPTG。收集培养4hr的菌体，以1mg湿重~15μL裂解液(112mM Tris-Acetate, pH7.0, 0.5mg/mL Lysozyme)比例重悬菌体，超声破碎上清原液梯度稀释，取4μL加入终体积10μL的生物素标记反应体系（50mM bicine, pH8.3, 10mM ATP, 10mM MgOAc, 50μM d-biotin, 75μgVHH-BAP），37℃反应2hr。梯度稀释反应液后，取0.5μL与50μL 碱性抗原包被液混合包被于96孔板, 之后的ELISA检测同实施例1中相应操作，以标准重组BirA酶标记体系和无酶标记体系为阳性和阴性对照。结果如附图6所示，结果显示各转化组都显示出超越本底（Pacyc-184转化组)的生物素标记活性，各诱导型表达载体转化组的标记活性也展现出与诱导剂浓度效应关系，而其中pBADcM-tBirA组诱导后表现出的标记活性显著的高于其他启动子实验组。

实施例4：不同启动子调控下tBirA伴侣质粒对目的蛋白表达的影响和标记效率的比较

在本实施例中，为了进一步考察tBirA伴侣质粒与目的蛋白表达载体共存时，其对目的蛋白表达的影响，发明人将上述不同启动子调控的tBirA表达伴侣载体与pET28a-VHH-BAP共转化入BL21(DE3)中，挑单克隆进行培养，比较上述菌体裂解上清液中VHH-BAP底物蛋白的表达量和生物素标记效率。

具体步骤和条件如下：

将已构建的tBirA组成型表达载体pPN25cM-tBirA和三种不同的诱导型表达载体pZt1cM-tBirA、pBADcM-tBirA以及pTACcM-tBirA分别与pET28a-VHH-BAP共转化BL21(DE3)（以pACYC-184转化组作为阴性对照），在氯霉素与卡那霉素双抗LB平板上筛选阳性克隆。挑取相应转化组的单克隆至含有氯霉素和卡那霉素的LB培养基中进行培养，诱导型伴侣质粒转化组进行梯度浓度诱导剂诱导tBirA的表达，诱导剂浓度梯度分别为：pZt1cM-tBirA组为0、0.5、1.0、2.0、4.0ng/mL四环素；pBADcM-tBirA组为0、0.02%、0.05%、0.1%、0.2%（m/V)L-阿拉伯糖；pTACcM-tBirA组为0、0.1、0.2、0.4、0.8mM IPTG。37℃培养2hr后，加入0.5mM IPTG（pTACcM-tBirA组不再加IPTG），继续培养6hr，收集菌体，以1mg湿重~20μL裂解液(PBS,0.1mg/mL Lysozyme),超声破碎取上清, 取0.5μL+50μL 碱性抗原包被液混合包被于96孔板, 检测c-avi-tag的生物素化（HRP标链亲合素）, 取10μL+90μL 碱性抗原包被液混合包被于96孔板His6 Tag（鼠抗His6单抗+HRP标羊抗鼠二抗）。同时分别取0.5μL和10μL裂解上清进行SDS-PAGE分离后转印PVDF膜，用HRP标链亲合素和鼠抗His6单抗+HRP标羊抗鼠二抗进行免疫印迹分析。

结果如附图7所示，不同的伴侣质粒存在的情况下，VHH-BAP的表达量虽然未受到明显的影响，但生物素标记的效率则有较为显著的差异，阿拉伯糖诱导系统的pBADcM-tBirA伴侣质粒其生物素标记的效率更高，且呈现出与L-阿拉伯糖良好的剂量效应关系。

实施例5：重组蛋白大肠杆菌体内自动诱导+生物素化标记

本实施例利用自动诱导+生物素化标记方法对目的蛋白进行诱导和标记，其具体条件和步骤如下：

1、将pBADcM-tBirA与pET28a-VHH-BAP共转化入大肠杆菌BL21(DE3)，在氯霉素与卡那霉素双抗LB平板上筛选阳性克隆。

2、挑取相应转化组的单克隆至自动诱导标记培养基中(1% Trptone, 0.5% YeastExtract, 0.5% 甘油, 0.05% D-葡萄糖, 0.2% α-D-乳糖, 0.2% L-阿拉伯糖, 20mMHEPES, pH 7.2)，37℃ 200-300rpm摇床培养10hr，从1.5hr后每隔0.5hr取样；

3、以1mg湿重菌体~20μL裂解液(PBS, 0.1mg/mL Lysozyme),超声破碎取上清,取0.5μL裂解上清进行SDS-PAGE分离后转印PVDF膜，用HRP标链亲合素和鼠抗His6单抗进行免疫印迹分析，分析VHH-BAP的产量和标记效率。

结果如附图8所示，pBADcM-tBirA伴侣质粒与混合碳源的自动诱导标记培养基配合，能够对目的蛋白进行自动诱导和生物素化标记。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种重组蛋白大肠杆菌体内生物素化标记系统

<130> 30

<160> 30

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 780

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgatccagt tacttaatgc tgaagagata ttgagtcagc tggatggcgg tagtgtagcc 60

gtgctgccag tgattgactc cacgaatcag taccttcttg atcgtatcgg agagcttaaa 120

tcgggcgatg cctgcgttgc agaataccag caggctggcc gtggtcgccg gggtcggaaa 180

tggttttcgc cttttggcgc aaacttatat ttgtcgatgt tctggcgttt ggaacaaggc 240

ccggcggcgg ctattggttt aagtctggtt atcggtatcg tgatggcgga agtattacgc 300

aagctgggtg cagataaagt tcgtgttaaa tggcctaatg acctctatct gcaggatcgc 360

aagctggcag gcattcttgt ggagctgact ggcaaaaccg gcgatgcggc gcaaatagtc 420

attggagccg ggatcaacat ggcaatgcgt cgtgttgaag agagtgtcgt taatcagggg 480

tggatcacgc tgcaggaagc ggggatcaat ctcgatcgta atacgttggc ggccatgcta 540

atacgtgaat tacgcgcggc gctggaactc ttcgaacaag aaggattggc accttatctt 600

tcgcgctggg aaaagctgga taattttatt aatcgcccag tgaaacttat cattggtgat 660

aaagaaatat ttggcatttc acgcggaata gacaaacagg gcgctttatt gcttgagcag 720

gatggaataa taaaaccctg gatgggcggt gaaatatccc tgcgtagtgc agagaagtaa 780

<210> 2

<211> 259

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ile Gln Leu Leu Asn Ala Glu Glu Ile Leu Ser Gln Leu Asp Gly

1 5 10 15

Gly Ser Val Ala Val Leu Pro Val Ile Asp Ser Thr Asn Gln Tyr Leu

20 25 30

Leu Asp Arg Ile Gly Glu Leu Lys Ser Gly Asp Ala Cys Val Ala Glu

35 40 45

Tyr Gln Gln Ala Gly Arg Gly Arg Arg Gly Arg Lys Trp Phe Ser Pro

50 55 60

Phe Gly Ala Asn Leu Tyr Leu Ser Met Phe Trp Arg Leu Glu Gln Gly

65 70 75 80

Pro Ala Ala Ala Ile Gly Leu Ser Leu Val Ile Gly Ile Val Met Ala

85 90 95

Glu Val Leu Arg Lys Leu Gly Ala Asp Lys Val Arg Val Lys Trp Pro

100 105 110

Asn Asp Leu Tyr Leu Gln Asp Arg Lys Leu Ala Gly Ile Leu Val Glu

115 120 125

Leu Thr Gly Lys Thr Gly Asp Ala Ala Gln Ile Val Ile Gly Ala Gly

130 135 140

Ile Asn Met Ala Met Arg Arg Val Glu Glu Ser Val Val Asn Gln Gly

145 150 155 160

Trp Ile Thr Leu Gln Glu Ala Gly Ile Asn Leu Asp Arg Asn Thr Leu

165 170 175

Ala Ala Met Leu Ile Arg Glu Leu Arg Ala Ala Leu Glu Leu Phe Glu

180 185 190

Gln Glu Gly Leu Ala Pro Tyr Leu Ser Arg Trp Glu Lys Leu Asp Asn

195 200 205

Phe Ile Asn Arg Pro Val Lys Leu Ile Ile Gly Asp Lys Glu Ile Phe

210 215 220

Gly Ile Ser Arg Gly Ile Asp Lys Gln Gly Ala Leu Leu Leu Glu Gln

225 230 235 240

Asp Gly Ile Ile Lys Pro Trp Met Gly Gly Glu Ile Ser Leu Arg Ser

245 250 255

Ala Glu Lys

<210> 3

<211> 1179

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttattcacat ccggccctga actcgctagg acttgccccg gtgcattttt taaatacccg 60

cgaaaaatag agctgatcgt caaatccaac attgcgccca acggtcgcta tcggcattcg 120

cgtagtgcta agcagaagtt tcgcctggct gatacgctga tcttcgcgcc agctcaatac 180

gctaatgcct aactgctggc ggaacagatg tgataaccgg gagggcgaca ggcagacatg 240

ctgggcgacg ctggcgatat caaaatggct gtccgccaga tggtcgctga tatactggca 300

ggcatcgcgc acacggctat ccatcggcgg gtgcaacgac tcattaatta ccgccatacg 360

tctgagcaac aactgctcca gcagattgat cgccagtagc tcagaatagc gaccttcccc 420

ttgcccggcg ctgatgatct gcccgaacag ttcgctgaaa tgcggctggc gcgcctcgtc 480

cgggcggaaa aatcctgtct gggcaaagat tgtcggccag gtcagccact cctgccagta 540

ggcgcgaggc cggaaataaa cccactggtg ataccactcg ctggcgtccg gatgccgtcc 600

atagtgatga atctcgcccg gcggaaacaa taatatatcg ccaggccgac agacaaactg 660

ctcgccatta ttattaatga cgccctctcc gcggatggtc aggttaagaa tatatccctt 720

catgcccaac ggacgatcga taaaaaaatc cagatatcca ttcgcttcaa ttggcgtcag 780

cccggcgacc agatgggcat taaatgaata tcccggcaat agcggatcat tttgcgtttc 840

agccatgatt tctctacccc ccgatgttca gagaagaaac aaattgtcca tatcgaccag 900

gacgacagag cttccgtctc cgcaagactt tgcgcttgat gaaagcacgt atcaaccccg 960

cttgtgaaaa gcgctttgta acaaaagcgt acagttcagg cgataaaatt aagtaacaga 1020

agtgtctata actatggctg gaatgtccac attgaatatt tgcacagcgt cacactttgc 1080

aaagcattag catttttgtc cataagatta gcggatcctg cctgacggtt tttgccgcga 1140

ctctctataa tttctccata cctgtttttc tggatggag 1179

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atacatatga aggataacac cgtgccact 29

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atacatatga tccagttact taatgctaaa cag 33

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tatgtcgact atttttctgc actacgcagg gat 33

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atacatatgg ctgttcagct ggttgaat 28

<210> 8

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tatgtcgact attcgtgcca ttcgattttc tgagcttcga agatgtcgtt cagaccagaa 60

gaaacggtaa cctgg 75

<210> 9

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tcataaaaaa tttatttgct ttcaggaaaa tttttctgta taatagattc ataaatttga 60

gagaggagtt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaa 98

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cagaattcat taaagaggag aaattaacat gaaggataac accgtgcc 48

<210> 11

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cagaattcat taaagaggag aaattaacat gatccagtta cttaatgcta aacag 55

<210> 12

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

actggatcta tcaacaggag tcttattttt ctgcactacg cagggat 47

<210> 13

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

attctcacca ataaaaaacg cccggcggca accgagcgtt ctgaacaaat ccagatggag 60

ttctgaggtc attactggat ctatcaacag gagtc 95

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tttattggtg agaatgacga ccgggtcgaa t 31

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ataaattttt tatgatttga agagataaat tgcact 36

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

taaagaggag aaagtaacat gatccagtta cttaatgctg aa 42

<210> 17

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

taaagaggag aaagtaacat gaaggataac accgtgcc 38

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tgcgtaaatt acttctctgc actacgca 28

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ctttctcctc tttaatgaat tc 22

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gaagtaattt acgcagcata acgc 24

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

atggagcatt aaagaggaga aagtaacat 29

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ctgaaaatta cttctctgca ctacgca 27

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tgaagcactt cactgacacc ctcatca 27

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tctttaatgc tccatccaga aaaacagg 28

<210> 25

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

agaagtaatt ttcagcctga tacagatt 28

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cagtgaagtg cttcatgtgg caggaga 27

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ctaaagagga gaaagtaaca tgatcc 26

<210> 28

<211> 29

<212> DNA

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<400> 28

aacggatctt cgaatttctg ccattcatc 29

<210> 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ttcgaagatc cgacaccatc gaatggtgc 29

<210> 30

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

tctcctcttt agtgctcgtg aaaacacct 29

Claims

1.一种生物素标记伴侣质粒，其特征在于：以带有p15复制起点和筛选标记氯霉素抗性基因为质粒骨架，插入了来源于沙门氏菌的阿拉伯糖操纵子包含阿拉伯糖诱导启动子araBAD Promoter以及其阻遏蛋白编码基因araC，在araBAD Promoter下游插入了去除了N端63个氨基酸编码区的截短型的生物素连接酶tBirA基因；

所述截短型的生物素连接酶tBirA，具体为删除大肠杆菌BirA蛋白N端63个氨基酸的截短蛋白，其编码序列选自：核酸序列SEQ ID No.1，编码蛋白序列SEQ ID No.2；

所述沙门氏菌的阿拉伯糖操纵子包含阿拉伯糖诱导启动子araBAD Promoter以及其阻遏蛋白编码基因araC，两者的编码序列选自：核苷酸编码序列SEQ ID No.3。

2.一种重组蛋白大肠杆菌体内生物素化标记系统，其特征在于：包含权利要求1所述的生物素标记伴侣质粒。

3.如权利要求2所述的一种重组蛋白大肠杆菌体内生物素化标记系统在生物活性分子标记、检测、纯化以及固定化中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：表达并生物素标记重组蛋白的步骤和条件如下：

（3）阳性菌株单克隆接入常用大肠杆菌培养基中，加入10-40 μg/mL氯霉素和50-200 μg/mL氨苄青霉素或25-100μg/mL硫酸卡那霉素，以及0.001-0.5%(m/v)L-阿拉伯糖，37℃200-300rpm摇床预培养2-6hr，至菌体密度达到目的蛋白诱导密度；

（4）加入目的蛋白的诱导剂以及50μM d-生物素，诱导培养；或在12-25℃下低温冷激直接进行诱导；所述诱导剂为0.1-1mM IPTG或0.05wt.%-0.5wt.%乳糖。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：重组蛋白大肠杆菌体内自动诱导及生物素化标记方法，其步骤和条件如下：

（3）阳性菌株单克隆接入自动诱导标记培养基中，加入10-40 μg/mL氯霉素和50-200 μg/mL氨苄青霉素或25-100μg/mL硫酸卡那霉素以及0.001-0.5%(m/v)L-阿拉伯糖、50μM d-生物素，37℃ 200-300rpm摇床预培养2-6hr，至菌体密度达到目的蛋白的诱导密度，继续培养或转入目的蛋白10-30℃诱导温度下培养直至收菌。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述自动诱导标记培养基为在大肠杆菌培养基基础上添加0.25%-2.5%(m/v)甘油、0.01-0.1%(m/v)D-葡萄糖、0.1-0.5%(m/v)α-D-乳糖以及0.01-0.5%(m/v)L-阿拉伯糖的组合碳源，同时加入维持培养基pH中性的缓冲盐。