CN112608876B

CN112608876B - 一种生物素化Curli蛋白的活细胞标记方法及其应用

Info

Publication number: CN112608876B
Application number: CN202011624004.9A
Authority: CN
Inventors: 雍阳春; 周到; 方真
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2024-02-09
Anticipated expiration: 2040-12-30
Also published as: CN112608876A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种生物素化Curli蛋白的活细胞标记方法及其应用。本发明成功构建出一种表达生物素化Curli蛋白的重组菌，其以大肠杆菌BL21（DE3）为宿主菌株将生物素受体肽（APtag）融合于大肠杆菌BL21（ED3）胞外淀粉样蛋白Curli的基因结构单元csgA中，通过构建共表达质粒pETDuet‑1‑CsgA‑APtag‑BirA，高效表达CsgA‑APtag及生物素连接酶BirA，实现活细胞CsgA的生物素化表达；在IPTG诱导下，偶联荧光团的链霉素探针可实现其与生物素化CsgA‑APtag特异性结合，可对表达Curli纤维的重组菌细胞进行荧光标记。其标记特异性强，可在一定程度上降低标记对细胞表达自身功能的潜在影响。

Description

一种生物素化Curli蛋白的活细胞标记方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种生物素化Curli蛋白的活细胞标记方法及其应用。

背景技术

在细菌等单细胞生物中，作为细胞与环境进行物质交换及反应的终端，具备各自特殊的生物学功能。为了更好的研究细菌等单细胞生物在环境中的作用及功能，具备更低的生物毒性、更小影响生物学功能的活细胞标记方法一直是科学家所不断追求的。常规标记方法中：抗原-抗体、基因融合荧光蛋白（FPs）标记方法生物相容性较好，但存在二抗体积大/基因融合片段较大（~238aa）的问题，改变活细胞蛋白空间结构及定位，影响细胞生物学功能；荧光染料、量子点探针等标记方法不改变细胞基因，但其与细胞接触具备一定的细胞毒性，生物相容性差，同样对活细胞生物学功能有较大影响。目前，缺乏一种更优异的标记方法，限制了活细胞功能的进一步研究发展，因此，开发一种生物学功能影响较小的活细胞标记方法迫在眉睫。

Curli是一种典型的功能淀粉样纤维，在大部分单细胞及组织细胞中，均存在Curli蛋白表达系统。Curli纤维参与细胞表面黏附、细胞聚集和生物膜形成，尤其是许多肠杆菌科产生的复杂细胞外基质的重要组成部分。Curli纤维是由基因单元csgA大量表达后于胞外自组装形成，表达的CsgA蛋白具备强大的胞外自组装能力，可定位于细胞表面进行逐一叠加连接，自组装形成典型的淀粉样Curli纤维。Curli纤维的表达普适性及其独特的“绒毛”式空间结构使其成为一种活细胞标记的优良载体，实现Curli荧光标记，不仅可以实现细胞荧光标记，同时大大降低荧光探针因接触细胞而产生的细胞毒性，是一种潜在的良好标记方法。但如何构建一种生物素化Curli蛋白的活细胞标记方法尚无相关报道。

发明内容

本发明旨在至少一定程度上解决上述技术问题之一或是至少提供一种技术选择。

在某一具体实施方案中，本发明提供了一种表达生物素化Curli蛋白的重组菌，所述的重组菌以大肠杆菌BL21（DE3）为宿主菌株，在IPTG诱导下能实现活细胞生物素化Curli纤维的表达。

在某一具体实施方案中，本发明还提供了一种表达生物素化Curli蛋白的重组菌的构建方法，包括如下步骤：

（1）将肽结构域GLNDIFEAQKIEWHE翻译成核苷酸序列，通过柔性序列 GS与csgA基因的C端融合连接，构建表达含生物素受体肽的蛋白基因片段CsgA-APtag，通过PCR扩增得到CsgA-APtag产物片段；

（2）将大肠杆菌BirA蛋白基因核苷酸序列为模板PCR扩增得到基因产物片段BirA，通过NdeI、XhoI双酶切后将酶切片段连接于共表达质载体粒pETDuet-1的多克隆位点2，重组质粒转化于大肠杆菌，构建pETDuet-1-BirA质粒载体；

（3）将步骤（1）中的CsgA-APtag产物片段通过XbaI、BamHI双酶切后连接于步骤（2）所构建的pETDuet-1-BirA质粒载体的多克隆位点1，构建共表达质粒pETDuet-1-CsgA-APtag-BirA；

（4）将步骤（3）所构建的共表达质粒导入宿主大肠杆菌中，即构成表达生物素化Curli蛋白的重组菌。

步骤（1）中所述的蛋白基因片段CsgA-APtag的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述。

步骤（1）中所述PCR扩增的上游引物如SEQ ID NO.3~4所示，下游引物序列如SEQID NO.5~7所示。

步骤（2）中所述的BirA蛋白基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所述，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所述。

步骤（2）中所述编码PCR扩增的上游引物如SEQ ID NO.3~4所示，下游引物序列如SEQ ID NO.10~11所示。

在某一具体实施方案中，本发明还提供了一种大肠杆菌胞外淀粉样纤维Curli的标记方法，所述方法包括如下步骤：

（1）将表达生物素化Curli蛋白的重组菌单菌落活化培养，按1%转接于含生物素的新鲜LB培养基，检测菌液OD₆₀₀为0.4~0.6时，加入IPTG诱导培养18-24h，刚果红染色验证Curli表达；

（2）将步骤（1）中菌液离心，菌泥重悬于PBS，清洗掉残留生物素后调整菌株的OD₆₀₀为1~2，加入FITC-链霉素蛋白，暗处孵育后进行荧光显微成像。

步骤（1）中所述的LB培养基中还含有40~50μg/mL氨苄，所述的活化培养为37℃环境中活化培养12~16h。

步骤（1）中所述IPTG的浓度为0.4~0.6mM。

步骤（2）中所述FITC-链霉素蛋白与OD600为1~2的菌株体积比为1:4~6。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明成功构建出一种表达生物素化Curli蛋白的重组菌，其以大肠杆菌BL21（DE3）为宿主菌株将生物素受体肽（APtag）融合于大肠杆菌BL21（ED3）胞外淀粉样蛋白Curli的基因结构单元csgA中，通过构建共表达质粒pETDuet-1-csgA-APtag-BirA，在IPTG诱导下，高效表达CsgA-APtag及生物素连接酶BirA，实现活细胞中Curli的生物素化表达；偶联荧光团的链霉素探针可实现其与生物素化CsgA-APtag特异性结合，可对表达Curli纤维的活细胞进行荧光标记。本标记方法特异性强，融合肽（APtag）仅15aa，通过探针标记细胞表面Curl纤维实现活细胞标记，较探针直接接触细胞标记方法，具备更低的生物毒性，并可在一定程度上降低标记对细胞表达自身功能的潜在影响。

附图说明

图1是pETDuet-1质粒及共表达质粒pETDuet-1-CsgA-APtag-BirA构建示意图；

图2共表达BL21(DE3)菌株中提取的共表达质粒pETDuet-1-CsgA-APtag-BirA的琼脂糖凝胶电泳图；

图3是各组菌株验证表达的Curli与刚果红染色结果图；

图4是各组菌株表达的Curli与刚果红结合量图；

图5是FITC-亲和素标记荧光成像对比图；图中，左图为明场下菌株成像图，右图为在488nm下相应的荧光成像图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行具体描述或作进一步说明，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。下例实施实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

生物素-链霉素亲和标记是一种特异性结合能力强（Kd~1015M），具备较好生物相容性的标记方法。生物素连接酶BirA特异性识别生物素受体肽（APtag），可实现融合APtag的目标蛋白体内/体外生物素化。生物素化蛋白体外特异性结合荧光链霉素探针，从而实现目标蛋白荧光标记。APtag仅15aa，可以更灵活的融合于目标基因中，对蛋白表达影响小。通过生物素化Curli蛋白开发一种活细胞的标记方法，适用于具备Curli蛋白表达系统细胞，具备一定普适性；相较于基因改造蛋白分布于细胞表面，表达基因融合APtag的CsgA蛋白胞外自组装为Curli纤维并延伸于环境中，对细胞自身功能表达影响更小；链霉素荧光探针生物相容性较好，体外特异性结合Curli纤维进行荧光标记，进一步降低细胞标记的生物毒性。因此，本发明提供的生物素化Curli蛋白的活细胞标记方法是一种兼具生物相容性、生物学功能影响小的良好方法，具备巨大的应用价值。

大肠杆菌BL21(DE3)购自于中国微生物菌种保藏管理中心，共表达质载体粒pETDuet-1购自于Novagen公司，T4 DNA连接酶连接购自于Takara公司，刚果红染色剂、FITC偶联的链霉素蛋白购自于生工生物工程（上海）有限公司。

实施例1：构建表达生物素化Curli蛋白的大肠杆菌

（1）csgA是胞外淀粉样Curli纤维的基因单元，以大肠杆菌BL21(DE3)的csgA基因为目标基因，将肽结构域GLNDIFEAQKIEWHE翻译成核苷酸序列，通过柔性序列 GS与csgA基因的C端融合连接，构建表达含生物素受体肽的基因片段CsgA-APtag；以大肠杆菌BL21(DE3)的csgA基因为模板，利用Primer Premier 5.0软件设计扩增引物，上游引物有两个，分别为SEQ ID NO.3所示，即：TAGCAGCAATTGCAGCAAT、SEQ ID NO.4所示，即：TATTTGCTCTAGAATGAAACTTTTAAAAGTAGCAGCAATTGCAGCAAT；下游引物有三个，分别如SEQ ID NO.5所示，即：CGACCGCTCATCAGTAC、如SEQ ID NO.6所示，即：CGACCGCTCATCAGTACGGCAGTGGCCTGAACGATATCTTTGAGGCACAAAAAATCGAGTGGCA及如SEQ ID NO.7所示，即：ATACGCGGATCCTTAACTGCCCTCGTGCCACTCGATTTTTTGTG。

通过上述引物分三步进行PCR扩增，具体PCR步骤均为：所需扩增酶选择PrimerStar HS DNA Polymerase (来源于Takara公司)高保真，按说明书补充模板、4mMdNTP、PCR Buffer、ddH₂O，条件均为预变性98℃，10s; 按照98℃，10s、55℃，5s、72℃，40s进行扩增30个循环；最终延伸72℃，10min，将得到的PCR产物纯化。扩增引物顺序依次为：第一步，以csgA基因为模板，选取上游引物SEQ ID NO.3与下游引物SEQ ID NO.5；以第一步产物为模板，选取上游引物SEQ ID NO.3与下游引物SEQ ID NO.6进行第二步PCR扩增；以第二步产物为模板，选取上游引物SEQ ID NO.4与下游引物SEQ ID NO.7进行第三步PCR扩增，最终得到含XbaI、BamHI双酶切位点的基因产物片段CsgA-APtag；

（2）以大肠杆菌BL21(DE3)的BirA蛋白核苷酸序列为模板，利用Primer Premier5.0软件设计扩增引物，上游引物序列为两个，分别为SEQ ID NO.10所示，即：AAGGATAACACCGTGCCAC，及如SEQ ID NO.11所示，即：ATACATATGATGAAGGATAACACCGTGCCAC；下游引物序列为两个，分别如SEQ ID NO.12所示，即：TTTTTCTGCACTACGCAGG及如SEQ IDNO.13所示，即：TATACCCTCGAGTTTCTCCTCTTTTTATTTTTCTGCACTACGCAGG。通过上述引物分两步进行PCR扩增得到BirA产物。具体PCR步骤为：扩增酶选择 PrimerStar HS DNAPolymerase (Takara公司)高保真，按说明书补充模板、4mM dNTP、PCR Buffer、ddH₂O，条件为预变性98℃，10s；按照98℃，10s、55℃，5s、72℃，1min10s进行扩增30个循环；最终延伸72℃，10min，将得到的PCR产物纯化。具体PCR引物顺序为：第一步以BirA基因为模板，上游引物SEQ ID NO.10与下游引物SEQ ID NO.12；以第一步产物为模板，上游引物SEQ ID NO.11与下游引物SEQ ID NO.13进行第二步扩增。最终得到含NdeI、XhoI双酶切位点的BirA基因产物；

（3）将步骤（2）中得到的基因产物片段BirA通过NdeI、XhoI双酶切连接于共表达质载体粒pETDuet-1的多克隆位点2，重组质粒化转于大肠杆菌，实现载体pETDuet-1-BirA构建；

（4）将步骤（1）中的基因片段csgA-APtag与步骤（3）所构建的pETDuet-1-BirA质粒载体通过XbaI、BamHI双酶切，进行T4 DNA连接酶连接，将基因片段csgA-APtag插入到pETDuet-1-BirA质粒载体的多克隆位点1，成功构建共表达质粒pETDuet-1-csgA-APtag-BirA；pETDuet-1质粒及构建的共表达质粒pETDuet-1-csgA-APtag-BirA图谱如图1所示。

（5）将步骤（4）所构建的环状共表达质粒pETDuet-1-csgA-APtag-BirA通过化学转化的方式导入宿主大肠杆菌中，得到共表达BL21(DE3)菌株。将菌株扩大培养提取质粒进行酶切验证，并送生工生物工程（上海）有限公司进一步基因测序。

图2是共表达BL21(DE3)菌株中提取的共表达质粒pETDuet-1-csgA-APtag-BirA的琼脂糖凝胶电泳图；如图2所示，通过电泳图显示提取的共表达环状质粒pETDuet-1-csgA-APtag-BirA约4000bp；通过NdeI、XhoI、XbaI、BamHI酶切共表达质粒，成功酶切出约500bp的线性csgA-APtag基因产物、约1000bp的线性BirA基因产物及约5200bp的线性质粒载体pETDuet-1。表明pETDuet-1质粒载体成功导入重组基因csgA-APtag、BirA，共表达载体构建成功。

实施例2: 共表达BL21（DE3）菌株生物素化Curli蛋白表达验证

在本实施例中以四组不同菌株对生物素化Curli蛋白的表达性能进行验证，分别为：大肠杆菌WM3064、野生大肠杆菌BL21(DE3)菌株、共表达BL21(DE3)菌株及IPTG诱导的共表达BL21(DE3)菌株；将大肠杆菌WM3064、野生大肠杆菌BL21(DE3)菌株及两组共表达BL21(DE3)菌株的单菌落分别放在37℃环境中活化培养12-16h，按1%比例转接于新鲜LB（含80uM生物素）培养基；其中大肠杆菌WM3064的培养基中须补充Dap，共表达BL21（DE3）菌株培养基中须补充40~50μg/mL氨苄抗性（Amp）。通过紫外分光光度计检测菌株OD₆₀₀为0.4~0.6时，随机选一组共表达BL21（DE3）中加入0.4~0.6mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），将各组转移于30℃环境下继续培养18~24h；各组取适量菌株5000 r.p.m. 离心10min后，菌泥重悬于1mL PBS，重复以上离心3次清洗掉残留生物素，最终重悬适量于PBS中，调整菌株OD₆₀₀为1~2；

根据刚果红与Curli蛋白特异性染色验证Curli表达，将以上菌液各取1mL于ep管5000r.p.m. 离心10min，取1mL刚果红染色剂（25μM）重悬菌泥，于30℃静置10min后5000r.p.m. 离心10min，取上清测量A₄₉₀吸光度计算刚果红结合量，根据直观观察菌泥红色深度判断Curli是否表达。

图3是各组菌株验证表达的Curli与刚果红染色结果图；如图3所示，大肠杆菌WM3064为米白色，未观察到与刚果红结合的Curli，表明几乎不表达形成Curli纤维；野生BL21（DE3）菌株显示土黄色，表明较少表达形成Curli纤维；未添加IPTG诱导的共表达BL21(DE3)菌株中未诱导质粒载体蛋白表达，显示土黄色，表明较少量表达形成Curli纤维；而IPTG诱导的共表达BL21(DE3)菌株显色为鲜红色，添加IPTG后可高效诱导质粒载体CsgA蛋白表达，形成大量Curli纤维。由此可见，在IPTG诱导下，提供的重组菌能在活细胞状态下对Curli纤维进行大量表达。

图4是各组菌株表达的Curli与刚果红结合量图；如图4所示，通过取染色验证的离心上清液测量A₄₉₀吸光度计算菌株表达的Curli与刚果红结合量，可以更直观判断Curli表达量。其中经IPTG诱导的共表达BL21（DE3）菌株Curli具备最大的表达量，具备明显优势。

实施例3: 共表达BL21（DE3）菌株生物素化Curli蛋白的荧光标记

将实施例2中的野生BL21(DE3)菌液及IPTG诱导的共表达BL21(DE3)菌液分别按体积比4~6：1与FITC偶联的链霉素蛋白混合，暗处孵育10min，取1-3μL菌液滴于载玻片，盖好盖玻片，用PBS清洗去除多余亲和素蛋白，进行荧光显微成像。

图5是FITC-亲和素标记荧光成像对比图；图中，左图为明场下菌株成像图，右图为在488nm下相应的荧光成像图。如图5可见，野生BL21(DE3) 无相应的荧光标记菌株，表明其表达的Curli未与荧光探针特异性结合，无生物素化Curli表达；而IPTG诱导的共表达BL21(DE3)菌经IPTG诱导后表达生物素化Curli，可以与FITC-链霉素特异性结合，显示出相应的绿色荧光菌株。

所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏大学

<120> 一种生物素化Curli蛋白的活细胞标记方法及其应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 170

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Leu Leu Lys Val Ala Ala Ile Ala Ala Ile Val Phe Ser Gly

1 5 10 15

Ser Ala Leu Ala Gly Val Val Pro Gln Tyr Gly Gly Gly Gly Asn His

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Asn Asn Ser Gly Pro Asn Ser Glu Leu Asn Ile Tyr

35 40 45

Gln Tyr Gly Gly Gly Asn Ser Ala Leu Ala Leu Gln Thr Asp Ala Arg

50 55 60

Asn Ser Asp Leu Thr Ile Thr Gln His Gly Gly Gly Asn Gly Ala Asp

65 70 75 80

Val Gly Gln Gly Ser Asp Asp Ser Ser Ile Asp Leu Thr Gln Arg Gly

85 90 95

Phe Gly Asn Ser Ala Thr Leu Asp Gln Trp Asn Gly Lys Asn Ser Glu

100 105 110

Met Thr Val Lys Gln Phe Gly Gly Gly Asn Gly Ala Ala Val Asp Gln

115 120 125

Thr Ala Ser Asn Ser Ser Val Asn Val Thr Gln Val Gly Phe Gly Asn

130 135 140

Asn Ala Thr Ala His Gln Tyr Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu

145 150 155 160

Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly Ser

165 170

<210> 2

<211> 513

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaacttt taaaagtagc agcaattgca gcaatcgtat tctccggtag cgctctggca 60

ggtgttgttc ctcagtacgg cggcggcggt aaccacggtg gtggcggtaa taatagcggc 120

ccaaattctg agctgaacat ttaccagtac ggtggcggta actctgcact tgctctgcaa 180

actgatgccc gtaactctga cttgactatt acccagcatg gcggcggtaa tggtgcagat 240

gttggtcagg gctcagatga cagctcaatc gatctgaccc aacgtggctt cggtaacagc 300

gctactcttg atcagtggaa cggcaaaaat tctgaaatga cggttaaaca gttcggtggt 360

ggcaacggtg ctgcagttga ccagactgca tctaactcct ccgtcaacgt gactcaggtt 420

ggctttggta acaacgcgac cgctcatcag tacggcagtg gcctgaacga tatctttgag 480

gcacaaaaaa tcgagtggca cgagggcagt taa 513

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tagcagcaat tgcagcaat 19

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tatttgctct agaatgaaac ttttaaaagt agcagcaatt gcagcaat 48

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgaccgctca tcagtac 17

<210> 6

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgaccgctca tcagtacggc agtggcctga acgatatctt tgaggcacaa aaaatcgagt 60

ggca 64

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atacgcggat ccttaactgc cctcgtgcca ctcgattttt tgtg 44

<210> 8

<211> 320

<212> PRT

<213> 大肠杆菌BL21(DE3Escherichia coli)

<400> 8

Lys Asp Asn Thr Val Pro Leu Lys Leu Ile Ala Leu Leu Ala Asn Gly

1 5 10 15

Glu Phe His Ser Gly Glu Gln Leu Gly Glu Thr Leu Gly Met Ser Arg

20 25 30

Ala Ala Ile Asn Lys His Ile Gln Thr Leu Arg Asp Trp Gly Val Asp

35 40 45

Val Phe Thr Val Pro Gly Lys Gly Tyr Ser Leu Pro Glu Pro Ile Gln

50 55 60

Leu Leu Asn Ala Glu Gln Ile Leu Gly Gln Leu Asp Gly Gly Ser Val

65 70 75 80

Ala Val Leu Pro Val Ile Asp Ser Thr Asn Gln Tyr Leu Leu Asp Arg

85 90 95

Ile Gly Glu Leu Lys Ser Gly Asp Ala Cys Val Ala Glu Tyr Gln Gln

100 105 110

Ala Gly Arg Gly Arg Arg Gly Arg Lys Trp Phe Ser Pro Phe Gly Ala

115 120 125

Asn Leu Tyr Leu Ser Met Phe Trp Arg Leu Glu Gln Gly Pro Ala Ala

130 135 140

Ala Ile Gly Leu Ser Leu Val Ile Gly Ile Val Met Ala Glu Val Leu

145 150 155 160

Arg Lys Leu Gly Ala Asp Lys Val Arg Val Lys Trp Pro Asn Asp Leu

165 170 175

Tyr Leu Gln Asp Arg Lys Leu Ala Gly Ile Leu Val Glu Leu Thr Gly

180 185 190

Lys Thr Gly Asp Ala Ala Gln Ile Val Ile Gly Ala Gly Ile Asn Met

195 200 205

Ala Met Arg Arg Val Glu Glu Ser Val Val Asn Gln Gly Trp Ile Thr

210 215 220

Leu Gln Glu Ala Gly Ile Asn Leu Asp Arg Asn Thr Leu Ala Ala Met

225 230 235 240

Leu Ile Arg Glu Leu Arg Ala Ala Leu Glu Leu Phe Glu Gln Glu Gly

245 250 255

Leu Ala Pro Tyr Leu Ser Arg Trp Glu Lys Leu Asp Asn Phe Ile Asn

260 265 270

Arg Pro Val Lys Leu Ile Ile Gly Asp Lys Glu Ile Phe Gly Ile Ser

275 280 285

Arg Gly Ile Asp Lys Gln Gly Ala Leu Leu Leu Glu Gln Asp Gly Ile

290 295 300

Ile Lys Pro Trp Met Gly Gly Glu Ile Ser Leu Arg Ser Ala Glu Lys

305 310 315 320

<210> 9

<211> 966

<212> DNA

<213> 大肠杆菌BL21(DE3Escherichia coli)

<400> 9

atgaaggata acaccgtgcc actgaaattg attgccctgt tagcgaacgg tgaatttcac 60

tctggcgagc agttgggtga aacgctggga atgagccggg cggctattaa taaacacatt 120

cagacactgc gtgactgggg cgttgatgtc tttaccgttc cgggtaaagg atacagcctg 180

cctgagccca tccagttact taatgctgaa cagatattgg gtcagctgga tggcggtagt 240

gtagccgtgc tgccagttat tgactccacg aatcagtacc ttcttgatcg tatcggagag 300

cttaaatcgg gcgatgcctg tgttgcagaa taccagcagg ctggccgtgg tcgccggggg 360

cggaaatggt tttcgccttt tggcgcaaac ttatatttgt cgatgttctg gcgtctggaa 420

caaggcccgg cggcggcgat tggtttaagt ctggttatcg gtatcgtgat ggcggaagta 480

ttacgcaagc tgggagcaga taaagttcgt gtcaaatggc ctaatgacct ctatctgcag 540

gatcgcaagc tggcaggcat tcttgtggag ctgactggca aaactggcga tgcggcgcaa 600

atagtcattg gagccgggat caacatggca atgcgccgtg ttgaagagag tgtcgttaat 660

caggggtgga tcacgctgca ggaagcgggg atcaatctcg atcgtaatac gttggcggcc 720

atgctaatac gtgaattacg tgctgcgttg gaactcttcg aacaagaagg attggcacct 780

tatctgtcgc gctgggaaaa gctggataat tttattaatc gcccagtgaa acttatcatt 840

ggtgataaag aaatatttgg catttcacgc ggaatagaca aacagggggc tttattactt 900

gagcaggatg gaataataaa accctggatg ggcggtgaaa tatccctgcg tagtgcagaa 960

aaataa 966

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaggataaca ccgtgccac 19

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atacatatga tgaaggataa caccgtgcca c 31

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tttttctgca ctacgcagg 19

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tataccctcg agtttctcct ctttttattt ttctgcacta cgcagg 46

Claims

1.一种表达生物素化Curli蛋白的重组菌，其特征在于，所述的重组菌以大肠杆菌BL21（DE3）为宿主菌株，能在活细胞状态下对生物素化Curli纤维进行标记；所述重组菌的构建方法包括如下步骤：

（4）将步骤（3）所构建的共表达质粒导入宿主大肠杆菌中，即构成表达生物素化Curli蛋白的重组菌；步骤（1）中所述的蛋白基因片段CsgA-APtag的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述；步骤（2）中所述的BirA蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所述。

2.一种表达生物素化Curli蛋白的重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

3. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中所述PCR扩增的上游引物如SEQ ID NO.3~4所示，下游引物序列如SEQ ID NO.5~7所示。

4. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中所述PCR扩增的上游引物如SEQ ID NO.10~11所示，下游引物序列如SEQ ID NO.12~13所示。

5.一种基于权利要求1所述的重组菌对胞外淀粉样纤维Curli标记的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）将表达生物素化Curli蛋白的重组菌的单菌落活化培养，按1%转接于含生物素的新鲜LB培养基，检测菌株OD₆₀₀为0.4~0.6时，加入IPTG诱导培养后刚果红染色；

（2）将步骤（1）中染色后的菌株离心，菌泥重悬于PBS，清洗掉残留生物素后调整菌株的OD₆₀₀为1~2，加入FITC-链霉素蛋白，暗处孵育后进行荧光显微成像。

6.根据权利要求5所述的标记方法，其特征在于，步骤（1）中所述的LB培养基中还含有40~50μg/mL氨苄，所述的活化培养为37℃环境中活化培养12~16h。

7.根据权利要求5所述的标记方法，其特征在于，步骤（1）中所述IPTG的浓度为0.4~0.6mM。

8.根据权利要求5所述的标记方法，其特征在于，步骤（2）中所述FITC-链霉素蛋白与OD₆₀₀为1~2的菌株体积比为1:4~6。