JP7256280B2 - 熱安定性が向上したPhi29 DNAポリメラーゼ突然変異体及びそのシーケンシングにおける応用 - Google Patents
熱安定性が向上したPhi29 DNAポリメラーゼ突然変異体及びそのシーケンシングにおける応用 Download PDFInfo
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Description
97位のメチオニンをアラニン又はヒスチジン又はリジン又はトレオニンに置換し、
123位のロイシンをリジン又はフェニルアラニン又はイソロイシン又はヒスチジンに置換し、
217位のグリシンをグルタミン酸に置換し、
224位のチロシンをリジンに置換し、
474位のイソロイシンをリジンに置換し、
515位のグルタミン酸をプロリン又はグリシンに置換することである。
(II)配列表の配列2で示されるタンパク質と90%以上の同一性を有する枯草菌由来のタンパク質のアミノ酸残基配列、
(III)配列表の配列2で示されるタンパク質と95%以上の同一性を有する枯草菌由来のタンパク質のアミノ酸残基配列。
1)DNAポリメラーゼとする。
2)DNA複製を触媒するか、及び/又はDNA増幅を触媒する。
3)ローリングサークル増幅を触媒するか、及び/又は多重鎖置換増幅を触媒する。
4)DNAシーケンシング又はRNAシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行う。
5)RCAによりライブラリを構築する(DNAナノボール搭載)。
6)ゲノム増幅の網羅率を検出する。
7)DNA複製を触媒するか、及び/又はDNA増幅を触媒するためのキット製品を調製する。
8)ローリングサークル増幅を触媒するか、及び/又は多重鎖置換増幅を触媒するための製品を調製する。
9)DNAシーケンシング又はRNAシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行うための製品を調製する。
10)RCAによりライブラリを構築するための製品を調製する。
11)ゲノム増幅の網羅率を検出するための製品を調製する。
1)DNA複製を触媒するか、及び/又はDNA増幅を触媒する。
2)ローリングサークル増幅を触媒するか、及び/又は多重鎖置換増幅を触媒する。
3)DNAシーケンシング又はRNAシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行う。
4)RCAによりライブラリを構築する。
5)ゲノム増幅の網羅率を検出する。
6)DNA複製を触媒するか、及び/又はDNA増幅を触媒するための製品を調製する。
7)ローリングサークル増幅を触媒するか、及び/又は多重鎖置換増幅を触媒するための製品を調製する。
8)DNAシーケンシング又はRNAシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行うための製品を調製する。
9)RCAによりライブラリを構築するための製品を調製する。
10)ゲノム増幅の網羅率を検出するための製品を調製する。
本発明のもう1つの目的は、phi29 DNAポリメラーゼの安定性向上方法を提供することである。
(I)配列表の配列2で示されるタンパク質、
(II)配列表の配列2で示されるタンパク質と90%以上の同一性を有する枯草菌由来のタンパク質、
(III)配列表の配列2で示されるタンパク質と95%以上の同一性を有する枯草菌由来のタンパク質。
大腸菌BL21(DE3):TIANGEN、CB105-02。
保存緩衝液:10mMのTris-HCl、100mMのKCl、1mMのDTT、0.1mMのEDTA、0.5%(v/v)のTween (登録商標) 20、0.5%(v/v)のNP-40、50%(v/v)のグリセリン、25℃でのpH 7.4。
Phi29 DNAポリメラーゼ突然変異体は、野生型Phi29 DNAポリメラーゼのアミノ酸配列の97位、123位、217位、224位、474位及び515位のうちの少なくとも1つを突然変異させたものであり、具体的な単一点突然変異の形は、表1に示され、多点組み合わせ突然変異の形は、表2に示される。
1、Phi29 DNAポリメラーゼ単一点突然変異体を発現する組み換えベクター
配列表の配列2で示されるDNA分子をpET28a(+)ベクター(図1)のNdeIとBamHI酵素切断サイトの間に挿入し、野生型Phi29 DNAポリメラーゼを発現する組み換えベクターWTが得られる。
組み換えベクターWTを出発ベクターとし、表1に示す各プライマー対を用いて点突然変異を順に導入し、Phi29 DNAポリメラーゼ突然変異体を発現する各組み換えベクターが得られる。具体的な突然変異の形は、表2に示す通りである。
それぞれステップ一で構築した組み換えベクターWTとPhi29 DNAポリメラーゼ突然変異体を発現する各組み換えベクターを大腸菌BL21(DE3)に導入し、野生型Phi29 DNAポリメラーゼを発現する組み換え菌とPhi29 DNAポリメラーゼ突然変異体を発現する各組み換え菌が得られる。
ステップ二で得られた野生型Phi29 DNAポリメラーゼを発現する組み換え菌とPhi29 DNAポリメラーゼ突然変異体を発現する各組み換え菌を取り、誘導と純化を順に行い、N末端にHis6タグを融合した野生型Phi29 DNAポリメラーゼとN末端にHis6タグを融合した各Phi29 DNAポリメラーゼ突然変異体を獲得する。
(1)生菌
組み換え菌を3mlのKana耐性を有する液体LB培地に接種し、一晩培養する。
(2)接種
ステップ(1)を完成した後、1/100体積で以上の菌液を2mlのKana耐性を有する液体LB培地に接種し、37℃で、220rpmで振動しながら、OD600nm=0.6になるまで(実際の応用では、OD600nm=0.4~0.8であってもよい)培養する。
(3)誘導
ステップ(2)を完成した後、システムに最終濃度0.5mMのIPTGを加え、16℃で、220rpmで振動しながら、12h培養する。
(4)菌体の収集
ステップ(3)を完成した後、4℃で、8000rpmで5分間遠心分離し、菌体を収集する。
(2)ステップ(1)で得た上澄み液を取り、ニッケルカラムアフィニティークロマトグラフィー(HisTrap FF 5mlプレパックカラム)で純化を行う。具体的なステップとしては、まず、10カラム容量のBuffer Aで平衡させ、続いて、サンプルローディングを行い、続いて、20カラム容量のBuffer Aで洗い流し、続いて、15カラム容量の溶出液で溶出し、目的タンパク質を有するポストカラム溶液を収集する(溶出液はBuffer AとBuffer Bからなり、溶出過程でBuffer Bの体積分率は0%から100%に線形上昇し、それに応じて、Buffer Aの体積分率は100%から0%に線形降下する)。
Buffer A:20mMのTris-HCl、500mMのNaCl、20mMのイミダゾール、5%(v/v)のグリセリン、25℃でのpH 7.9。
Buffer B:20mMのTris-HCl、500mMのNaCl、500mMのイミダゾール、5%(v/v)のグリセリン、25℃でのpH 7.9。
(3)ステップ(2)で得たポストカラム溶液を取り、強陰イオンカラムクロマトグラフィー(HiTrap Q HP 5mlプレパックカラム)で純化を行う。具体的なステップとしては、まず、10カラム容量の体積分率59%のBuffer Aと体積分率41%のBuffer Bからなる混合緩衝液で平衡させ、続いて、サンプルローディングを行い、タンパク質ピックが現れた後に、素通り画分を収集する(UV検出値が20mAuまで上昇すると収集し、UV検出値が50mAuまで低下した後に収集を中止する)。
Buffer A:20mMのTris-HCl、150mMのNaCl、5%(v/v)のグリセリン、25℃でのpH7.5。
Buffer B:20mMのTris-HCl、1MのNaCl、5%(v/v)のグリセリン、25℃でのpH7.5。
(4)ステップ(3)で得た素通り画分を取り、陽イオン交換クロマトグラフィー(HiTrap SP HPプレパックカラム)で純化を行い、純度が95%より大きいタンパク質サンプル溶液が得られる。具体的なステップとしては、まず、10カラム容量のBuffer Aで平衡させ、続いて、サンプルローディングを行い、15カラム容量のBuffer Aで洗い流し、続いて、10カラム容量の溶出液で溶出し(溶出液はBuffer AとBuffer Bからなり、溶出過程でBuffer Bの体積分率は0%から50%に線形上昇し、それに応じて、Buffer Aの体積分率は100%から50%に線形下降する)、目的タンパク質を有するポストカラム溶液を収集する(UV検出値が50mAuまで上昇すると収集し、UV検出値が100mAuまで低下した後に収集を中止する)。
Buffer A:20mMのTris-HCl、150mMのNaCl、5%(v/v)のグリセリン、25℃でのpH7.5。
Buffer B:20mMのTris-HCl、1MのNaCl、5%(v/v)のグリセリン、25℃でのpH7.5。
(5)ステップ(4)で収集した目的タンパク質を透析バッグに移し、透析緩衝液で一晩透析した後に、透析バッグ内のタンパク質溶液を収集し、他の試薬を加え、タンパク質濃度が1mg/mlの目的タンパク質溶液が得られる。目的タンパク質溶液における他の成分の濃度は、10mMのTris-HCl(25℃でのpH 7.4)、100mMのKCl、1mMのDTT、0.1mMのEDTA、0.5%(v/v)のNP-40、0.5%(v/v)のTween20、50%(v/v)のグリセリンである。
透析緩衝液:23.75mMのTris-HCl(25℃でのpH 7.4)、237.5mMのKCl、2.375mMのDTT、0.2375mMのEDTA、5%(v/v)のグリセリン。
実施例1で調製したHis6タグを有する野生型Phi29 DNAポリメラーゼ溶液及びHis6タグを有するPhi29 DNAポリメラーゼ突然変異体溶液を取って、被検酵素液とする。
予備反応系をPCRチューブで均一に混合し、PCR装置に置き、95℃ 1min、65℃ 1min、40℃ 1minのプロセスを行い、ヒートリッド温度を102℃に設定する。
予備反応系(80.8μl):50mMのTris-HCl(pH7.5)、4mMのDTT、10mMの(NH4)2SO4、10mMのMgCl2、50nMのdNTP混合物、2pMの141 RCAプライマー及び18ngの一本鎖環状DNA鋳型141 Ad ssDNA。
被検酵素液の酵素活性=ΔDNB×5000÷37.38。
37℃ 10min実験:
実施例1で調製した目的タンパク質溶液(His6タグを有する野生型Phi29 DNAポリメラーゼ溶液及びHis6タグを有するPhi29 DNAポリメラーゼ突然変異体溶液)を取って、2つに分けて、それぞれ以下のように処理する。
-20℃実験:37℃ 10min実験との違いは、37℃の金属浴で10min置くことを-20℃の冷蔵庫で10min置くことに置き換えるだけである。
オンマシンシーケンシングの前に、サンプルによって広げた網羅率を検出するために、多重PCR法を用いてMDA生成物の中の複数のハウスキーピング遺伝子を増幅する。
PCRプロセス:95℃ 5min、35cycles x[94℃ 30s、60℃ 50s、72℃ 1min]、72℃ 5min、12℃ holder。
Phi29 DNAポリメラーゼの野生型と突然変異体の単細胞ゲノムシーケンシングにおける効果を検出するために、NA12878微量gDNA(200pg)をそれぞれ実施例1で調製した野生型Phi29 DNAポリメラーゼとPhi29 DNAポリメラーゼ突然変異体で増幅し、得られた生成物に対してライブラリを構築し、その後に、高深度シーケンシングを行うとともに、商品化されたQiagen単細胞増幅キットで同じNA12878微量gDNA(200pg)を増幅したものを対照とする。
表4の熱安定性結果を総合し、本実施例は複数の熱安定性が向上した突然変異体を選び、BGISEQ-500シーケンサーによりオンマシン測定を行い、異なる突然変異体のDNAシーケンシングにおける応用効果を検出し、BGISEQ-500シーケンサーの標準を参照する。測定全体に使用される試薬はBGI製のPE50 V2.0キットセットの全体とBGI製のE.coil Ad153スタンダードライブラリとInvitrogen製のQubit ssDNA Assay試薬である。以下に使用される試薬は、ライブラリ及びQubit ssDNA Assayを除き、全てPE50 V2.0キットに含まれているが、以下に記載されるPE50 V2.0試薬リザーバーはオンマシン測定に使用される試薬のみを指す。
-20℃の冷蔵庫からDNB調製緩衝液、スタンダードライブラリ、DNBポリメラーゼ混合液とDNBポリメラーゼ混合液IIを取り出し、アイスボックスで溶解させ、完全に溶解した後に、渦発振器に置いて5s持続的に振動して均一に混合し、且つハンドヘルド遠心機で3sしばらく遠心分離し、アイスボックスに置いて使用に備える。4℃の冷蔵庫から分子レベル水とDNB中止緩衝液を取り出し、アイスボックスに置いて使用に備える。マークされた8連チューブに順に20ulのDNB調製緩衝液と6ngのssDNA(E.coliスタンダードライブラリ)を加え、Nuclease Free Waterで40ulまで補足する。8連チューブを渦発振器に置いて5s持続的に振動して均一に混合し、且つハンドヘルド遠心機で3sしばらく遠心分離する。上記8連チューブをPCR装置に置き、95℃ 1min、65℃ 1min、40℃ 1min、4℃で保持する(ヒートリッド温度を103℃に設定)という反応条件を設定又は点検する。反応が完了した後に、PCR 8連チューブを取り出し、アイスボックスに置き、8連チューブのリッド温度が室温まで下った後に、それをハンドヘルド遠心機で3sしばらく遠心分離してから、直ちにアイスボックスに置く。8連チューブに、順に40ulの変性後の8連チューブ内の反応液、40ulのDNBポリメラーゼ混合液、4ulのDNBポリメラーゼ混合液IIを加える。8連チューブを渦発振器に置いて5s持続的に振動して均一に混合し、且つハンドヘルド遠心機で3sしばらく遠心分離する。直ちにPCR装置又は水浴に置いて反応し始める。30℃ 20min、4℃で保持する(ヒートリッドの設置は不要である)という反応条件を設定又は点検する。上記RCA反応が終了した後に、8連チューブを取り外してアイスボックスに置き、直ちに20μlのDNB中止緩衝液を加える。100μl広口ピペットチップ付きのピペットを用い、ゆっくり5~8回(1吸入と1吹きは1回とする)均一に吹き付け、均一に混合した後に、4℃に置いて保存して使用に備える。Qubit(登録商標) ssDNA Assay KitとQubit(登録商標) Fluorometer装置を用い、上記DNB調製生成物に濃度測定を行い、濃度が8ng/ul~40ng/ulの場合に、合格であると判定し、後続の実験での使用に備える。
DNBを調製した後、DNBをチップ(chip)にロードする必要があり、即ち、DNBロードである。
被検phi29ポリメラーゼ突然変異体又は野生型に対して、一枚のチップ(chip)と1つのBGISEQ‐500RSハイスループットシーケンシング試薬リザーバー(PE50V2.0)を用い、BGISEQ‐500シーケンサーでオンマシンシーケンシングを行う。オンマシン測定前に、まずシーケンシング試薬リザーバーII、dNTPs混合液(V3.0)、dNTPs混合液II(V2.0)を解凍して融けさせ、続いて4℃の冷蔵庫又はアイスボックスに置いて使用に備え、且つ振動してシーケンシング酵素を均一に混合し、アイスボックスに置いて使用に備える。まず、5番目のウェルの試薬を配置し、即ち、1mlのピペットを用いて1150μlのDNAポリメラーゼ混合液を取って、5番目のウェルに移し、かつ、1150μlのdNTPs混合液(V3.0)を5番目のウェルに移し、ピペットを用いて10~15回吹き付けて均一にする。次に、6番目のウェルの試薬を配置し、即ち、1mlのピペットを用いて890μlのDNAポリメラーゼ混合液を6番目のウェルに移し、かつ、890μlのdNTPs混合液II(V2.0)を6番目のウェルに移し、ピペットを用いて10~15回吹き付けて均一にする。続いて、14番目の試薬を配置し、即ち、5mlのピペットを用いて14番目のウェルのための全ての試薬を移し、そのうちの2.8mlの14番目のウェルの試薬を取って、400μlのphi29ポリメラーゼ突然変異体と均一に混合してから、14番目のウェルに加える。そして配置した試薬リザーバーを組み立てる。最後に、オンマシン測定を行い、即ち、シーケンサーを起動して洗浄し、試薬リザーバーをシーケンサーの指定場所に入れ、操作プロセスに従って実際のプリロードを行い、プリロードが終了した後に、上記ステップ(2)で調製したチップ(chip)を取り付け、関連するシーケンシング情報を記入し、シーケンシングを開始し、終了後にチップと試薬リザーバーと洗浄機器を取り出す。この実施例では、1つのループだけ測定する。
シーケンシング終了後、分析報告書をダウンロードし、従来指定した基準と照合し、phi29 DNAポリメラーゼ突然変異体の性能を判断する。
その結果は図3に示す通りであり(図Aは各突然変異体のBIC、FIT、ESRパラメータの比較であり、図Bは各突然変異体のSNRパラメータの比較であり、図Cは各突然変異体のRHOパラメータの比較である)、上記各パラメータメトリクス分析をまとめてみれば、測定した突然変異体の中で、最も優れたのは464であり、その次ぎは463であることが分かる。
Claims (9)
- 以下のA)又はB)であるタンパク質。
A)で示されるタンパク質は、
phi29 DNAポリメラーゼのアミノ酸配列における97位のアミノ酸残基をMからKに突然変異させ、123位をLからHに突然変異させ、515位をEからPに突然変異させ、224位をYからKに突然変異させ、217位をGからEに突然変異させ、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたDNAポリメラーゼ活性を有するタンパク質であるか、又は、
phi29 DNAポリメラーゼのアミノ酸配列における224位のアミノ酸残基をYからKに突然変異させ、474位をIからKに突然変異させ、515位をEからPに突然変異させ、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたDNAポリメラーゼ活性を有するタンパク質であるか、又は、
phi29 DNAポリメラーゼのアミノ酸配列における97位のアミノ酸残基をMからKに突然変異させ、123位をLからHに突然変異させ、515位をEからPに突然変異させ、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたDNAポリメラーゼ活性を有するタンパク質であるか、又は、
phi29 DNAポリメラーゼのアミノ酸配列における97位のアミノ酸残基をMからTに突然変異させ、123位をLからKに突然変異させ、515位をEからPに突然変異させ、残りのアミノ酸残基が変わらないようにすることで、得られたDNAポリメラーゼ活性を有するタンパク質であり、
前記phi29 DNAポリメラーゼのアミノ酸配列は、
(I)配列表の配列2で示されるタンパク質、又は、
(II)配列表の配列2で示されるタンパク質と99%以上の同一性を有する枯草菌のPhi29ファージ由来のタンパク質であって、A)で示されるタンパク質以外のタンパク質である。
B)で示されるタンパク質は、A)で示されるタンパク質のアミノ酸配列の末端にタグ配列を付加するとともに、DNAポリメラーゼ活性を有するタンパク質である。 - 前記タンパク質の安定性は前記phi29 DNAポリメラーゼより高い、ことを特徴とする請求項1に記載のタンパク質。
- 前記安定性は熱安定性である、ことを特徴とする請求項2に記載のタンパク質。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載のタンパク質をコーディングする核酸分子。
- 請求項4に記載の核酸分子を含む発現カセット、組み換えベクター、組み換え菌又はトランスジェニック細胞系。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載のタンパク質の下記1)~10)のうちの少なくとも1つにおける使用。
1)DNA複製を触媒するか、及び/又はDNA増幅を触媒する。
2)ローリングサークル増幅を触媒するか、及び/又は多重鎖置換増幅を触媒する。
3)DNAシーケンシング又はRNAシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行う。
4)RCAによりライブラリを構築する。
5)ゲノム増幅の網羅率を検出する。
6)DNA複製を触媒するか、及び/又はDNA増幅を触媒するためのキット製品を調製する。
7)ローリングサークル増幅を触媒するか、及び/又は多重鎖置換増幅を触媒するための製品を調製する。
8)DNAシーケンシング又はRNAシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行うための製品を調製する。
9)RCAによりライブラリを構築するための製品を調製する。
10)ゲノム増幅の網羅率を検出するための製品を調製する。 - 請求項1~3のいずれか一項に記載のタンパク質をコーディングする核酸分子、前記核酸分子を含む発現カセット、前記核酸分子を含む組み換えベクター、前記核酸分子を含む組み換え菌又は前記核酸分子を含むトランスジェニック細胞系の下記1)~10)のうちの少なくとも1つにおける使用。
1)DNA複製を触媒するか、及び/又はDNA増幅を触媒する。
2)ローリングサークル増幅を触媒するか、及び/又は多重鎖置換増幅を触媒する。
3)DNAシーケンシング又はRNAシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行う。
4)RCAによりライブラリを構築する。
5)ゲノム増幅の網羅率を検出する。
6)DNA複製を触媒するか、及び/又はDNA増幅を触媒するための製品を調製する。
7)ローリングサークル増幅を触媒するか、及び/又は多重鎖置換増幅を触媒するための製品を調製する。
8)DNAシーケンシング又はRNAシーケンシング又は全ゲノムシーケンシングを行うための製品を調製する。
9)RCAによりライブラリを構築するための製品を調製する。
10)ゲノム増幅の網羅率を検出するための製品を調製する。 - phi29 DNAポリメラーゼのアミノ酸配列を、請求項1に記載の修飾方法により修飾することで、DNAポリメラーゼ活性を有するタンパク質を得るステップを含むphi29 DNAポリメラーゼの安定性向上方法。
- 前記安定性は熱安定性である、ことを特徴とする請求項8に記載の方法。
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