CN111073871B - 热稳定性提高的dna聚合酶突变体及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种热稳定性提高的DNA聚合酶突变体及其构建方法和应用。本发明提供的DNA聚合酶突变体包括单点突变体和组合突变体,与野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)相比,其单点突变体和组合突变体在65℃下半衰期均更长;尤其是组合突变体,表现出单点突变体热稳定性的叠加效果,其半衰期大约是野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)的3倍。基于此,本发明所提供的DNA聚合酶突变体的热稳定性更好,适于在较高的温度下单分子核序中应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种热稳定性提高的DNA聚合酶突变体及其构建方法和应用。
背景技术
高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术("Next-generation"sequencing technology),以能够一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。单分子测序技术(Single-molecule sequencing)是高通量测序技术的主流发展方向,能够对单个DNA分子进行高通量、长度长的序列读取,并在短时间内获取大量序列信息,因而得到了广泛关注和研究。单分子测序技术的原理分为:边合成边测序方法和直接读取方法,其中,边合成边测序方法的技术成熟度最好、市场接受度最高,该方法利用DNA聚合酶合成与模板互补的DNA链,在核苷酸聚合过程中释放出特异性的荧光信号,从而在三维空间中记录模板位置和核苷酸序列信息,再通过数据处理反向构建DNA模板的序列。
DNA聚合酶(DNA polymerase)是边合成边读取单分子测序技术中的核心关键酶,是通过碱基互补配对原理催化底物dNTP(脱氧核苷酸)分子聚合形成子代DNA的一类酶。在单分子测序应用中,DNA聚合酶的稳定性是影响测序性能的关键参数:一方面,单分子测序用的DNA聚合酶蛋白需要完成几千甚至几万个碱基的精确聚合,且每步聚合都伴随着缓冲条件的变化、溶剂的改变、光照变性的影响等等,这需要DNA聚合酶分子在整个测序过程中都保持良好的活性;另一方面,单分子测序用的DNA聚合酶往往需要在测序仪上放置几天甚至几十天或者更久的时间,直到试剂用完,这也对DNA聚合酶试剂的稳定性提出了很高要求;此外,DNA聚合酶试剂在生产销售环节往往需要经历长时间、长距离的运输存储等操作,其稳定性直接影响了产品的货期、保质期等因素,甚至影响着客户对整个测序仪系统的市场认可度等重要商业指标。综上,DNA聚合酶的稳定性是影响整个单分子测序系统性能的重要酶学性质。
目前,市场上多种DNA聚合酶都是来源于嗜热微生物,其具有良好的热稳定性,但商品化的耐热DNA聚合酶都无法满足单分子测序要求(具有链置换活性等特殊性质);而能够满足单分子测序要求的DNA聚合酶大都来源于常温微生物(噬菌体等),其稳定性较差,难以保证单分子测序过程中良好的热稳定性,并影响其运输及投产使用,从而极大地限制了DNA聚合酶在单分子测序领域中的应用。上述天然的DNA聚合酶的序列、结构和功能都受到自然进化限制,难以直接应用于工业合成生产中,对天然酶的基因进行蛋白质工程手段改造,可以使天然酶打破自然进化对其的限制,从而得到有着工业用途优势的优良的改造后的人工酶基因。
发明内容
因此,本发明要解决的技术问题在于克服现有的DNA聚合酶热稳定性差的缺陷,从而提供一种热稳定性提高的DNA聚合酶突变体、DNA聚合酶突变体的构建方法及DNA聚合酶突变体在单分子测序中的应用。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:
本发明提供一种热稳定性提高的DNA聚合酶突变体,所述DNA聚合酶突变体为如下(a1)或(a2):
(a1)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与SEQ ID NO.2所示的蛋白具有相同功能的衍生蛋白;
(a2)通过一个或多个氨基酸残基取代SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的一个或多个位置且与SEQ ID NO.2所示的蛋白表现出至少95%同源性的衍生蛋白。
优选地,该热稳定性提高的DNA聚合酶突变体,SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的取代位点为第481位、第170位、第318位、第284位、第99位、第499位、第371位、第436位、第243位、第365位、第194位以及第214位。
优选地,该热稳定性提高的DNA聚合酶突变体,所述DNA聚合酶突变体包括在SEQID NO.2所示的氨基酸序列上A481K、I170L、V318A、R284F、M99E、Q499E、E371A、F436I、M243Y、T365Y、G194I、P214N中任一单点突变位点的单点突变体。
进一步优选地,该热稳定性提高的DNA聚合酶突变体,所述DNA聚合酶突变体包括在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列上V318A/M99E/Q499E/P214N、I170L/V318A/M99E/M243Y/T365Y中任一组合突变位点的组合突变体。
本发明还提供一种编码如上述热稳定性提高的DNA聚合酶突变体的基因。
本发明还提供一种包含如上述基因的重组质粒。
本发明还提供一种包含如上述热稳定性提高的DNA聚合酶突变体的可溶性蛋白、固定化酶或工程菌。
本发明还提供一种如上述热稳定性提高的DNA聚合酶突变体的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
通过在Pfam数据库及NCBI数据库中搜索SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列,去除重复出现的相同序列,选取与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列一致性大于30%的氨基酸序列,然后通过Clustalx1.83软件进行多序列比对,将剩余氨基酸质序列整理成fasta.文件上传到Consensus Maker v2.0.0服务器,根据需要修改设置参数后,该在线软件将生成可以后期编辑的consensus sequence,筛选出热稳定性相关的突变位点为:A481K、I170L、V318A、R284F、M99E、Q499E、E371A、F436I、M243Y、T365Y、G194I、P214N。
本发明还提供如上述热稳定性提高的DNA聚合酶突变体在单分子测序中的应用。
本发明技术方案,具有如下优点:
1.本发明提供的热稳定性提高的DNA聚合酶突变体,包括单点突变体和组合突变体,与野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)相比,其单点突变体和组合突变体在65℃下半衰期均更长;尤其是组合突变体,表现出单点突变体热稳定性的叠加效果,其半衰期大约是野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)的3倍。基于此,本发明所提供的DNA聚合酶突变体的热稳定性更好,适于在较高的温度下单分子测序。
2.本发明构建的DNA聚合酶(AAA32368.1)基因工程菌可以高效表达DNA聚合酶突变体,且培养条件简单,培养周期短,表达产物纯化方便等优点。
3.本发明提供的DNA聚合酶突变体的构建方法,与理性设计基于蛋白质精确结构-功能关系不同的是,本发明基于Consensus Concept理论,通过构建数据库,利用生物信息技术进行检索,筛选和比对同源性序列,从进化的角度分析能提高酶热稳定性的信息,对DNA聚合酶家族序列进行整合分析,并结合生物信息学及晶体学方法辅助,获得具高稳定性的新型DNA聚合酶突变体。
4.本发明提供的热稳定性提高的DNA聚合酶突变体在应用于单分子测序时具有优良的试剂稳定性和测序准确度,具有较好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例4提供的野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)蛋白模拟晶体结构示意图及突变位点在晶体结构上的分布示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明的目的、技术方案和要点,下面将对本发明的实施方式作进一步详细描述。本发明可以多种不同的形式实施,而不应该被理解为仅限于在此阐述的实施例。相反,提供此实施例,使得本发明将是彻底的和完整的,并且将把本发明的构思充分传达给本领域技术人员,本发明将仅由权利要求来限定。
本发明所涉及生物材料的来源的一般性说明:
1.基因来源:本发明中所使用的优化的野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)基因由生工生物技术公司合成;
2.引物合成:本发明中所使用的引物均由金唯智生物技术公司合成制备;
3.其它生物材料:
pET28a质粒载体购自Novagen公司;
KOD聚合酶购自Toyobo公司;
DpnI酶购自Thermo公司;
T4 DNA连接酶购自NewEngland Biolabs公司;
PrimeSTAR Max Premix高保真酶购自TakaRa公司;
DreamTaq DNA聚合酶以及所有限制性内切酶均购自Thermo公司;
DNA胶回收试剂盒及小质粒提试剂盒购自天根公司。
实施例1
本实施例提供一种热稳定性提高的DNA聚合酶突变体,该DNA聚合酶突变体是在野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)的氨基酸序列基础上经分子改造的衍生蛋白,其中,野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)由源于芽孢杆菌M2噬菌体(Bacillus phage M2)的野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)基因经过密码子优化后所表达得到的蛋白,编码该蛋白的核酸序列为SEQID NO.1,氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
本实施例提供的热稳定性提高的DNA聚合酶突变体包括:
(a1)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与SEQ ID NO.2所示的蛋白具有相同功能的衍生蛋白;或
(a2)通过一个或多个氨基酸残基取代SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的一个或多个位置且与SEQ ID NO.2所示的蛋白表现出至少95%同源性的衍生蛋白。
具体地,在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列选择某一个位点进行突变,得到多种单点突变体,依次进行活力测试,选出热稳定性高的单点突变体,其单点突变位点为:第481位、第170位、第318位、第284位、第99位、第499位、第371位、第436位、第243位、第365位、第194位以及第214位,分别得到12种DNA聚合酶单点突变体,具体如下:
(1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第481位丙氨酸被赖氨酸取代,记为A481K;
(2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第170位异亮氨酸被亮氨酸取代,记为I170L;
(3)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第318位缬氨酸被丙氨酸取代,记为V318A;
(4)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第284位精氨酸被苯丙氨酸取代,记为R284F;
(5)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第99位甲硫氨酸被谷氨酸取代,记为M99E;
(6)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第499位谷氨酰胺被谷氨酸取代,记为Q499E;
(7)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第371位谷氨酸被丙氨酸取代,记为E371A;
(8)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第436位苯丙氨酸被异亮氨酸取代,记为F436I;
(9)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第243位甲硫氨酸被酪氨酸取代,记为M243Y;
(10)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第365位苏氨酸被酪氨酸取代,记为T365Y;
(11)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第194位甘氨酸被异亮氨酸取代,记为G194I;
(12)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第214位脯氨酸被天冬酰胺取代,记为P214N。
或者,在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列选择多个突变位点进行组合,如从上述12个单点突变位点中选择2~12个突变位点分别进行组合,得到多种组合突变体,依次进行活力测试,选出热稳定性高的组合突变体,其组合突变位点为:第318位/第99位/第499位/第214位、第170位/第318位/第99位/第243位/第365位,分别得到2种DNA聚合酶组合突变体,如下:
(13)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第318位缬氨酸被丙氨酸取代、第99位甲硫氨酸被谷氨酸取代、第499位谷氨酰胺被谷氨酸取代、第214位脯氨酸被天冬酰胺取代,记为V318A/M99E/Q499E/P214N;
(14)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第170位异亮氨酸被亮氨酸取代、第318位缬氨酸被丙氨酸取代、第99位甲硫氨酸被谷氨酸取代、第243位甲硫氨酸被酪氨酸取代、第365位苏氨酸被酪氨酸取代,记为I170L/V318A/M99E/M243Y/T365Y。
实施例2
本实施例提供一种编码如实施例1所述的DNA聚合酶突变体的基因:
(1)编码突变位点为A481K的DNA聚合酶单点突变体的核酸序列为SEQ ID NO.3;
(2)编码突变位点为I170L的DNA聚合酶单点突变体的核酸序列为SEQ ID NO.4;
(3)编码突变位点为V318A的DNA聚合酶单点突变体的核酸序列为SEQ ID NO.5;
(4)编码突变位点为R284F的DNA聚合酶单点突变体的核酸序列为SEQ ID NO.6;
(5)编码突变位点为M99E的DNA聚合酶单点突变体的核酸序列为SEQ ID NO.7;
(6)编码突变位点为Q499E的DNA聚合酶单点突变体的核酸序列为SEQ ID NO.8;
(7)编码突变位点为E371A的DNA聚合酶单点突变体的核酸序列为SEQ ID NO.9;
(8)编码突变位点为F436I的DNA聚合酶单点突变体的核酸序列为SEQ ID NO.10;
(9)编码突变位点为M243Y的DNA聚合酶单点突变体的核酸序列为SEQ ID NO.11;
(10)编码突变位点为T365Y的DNA聚合酶单点突变体的核酸序列为SEQ ID NO.12;
(11)编码突变位点为G194I的DNA聚合酶单点突变体的核酸序列为SEQ ID NO.13;
(12)编码突变位点为P214N的DNA聚合酶单点突变体的核酸序列为SEQ ID NO.14;
(13)编码突变位点为V318A/M99E/Q499E/P214N的DNA聚合酶组合突变体的核酸序列为SEQ ID NO.15;
(14)编码突变位点为I170L/V318A/M99E/M243Y/T365Y的DNA聚合酶组合突变体的核酸序列为SEQ ID NO.16。
实施例3
本实施例提供一种包含实施例2提供的基因的重组质粒,为可以用于将DNA聚合酶单点突变体和组合突变体的基因整合到宿主细胞上进行稳定表达的质粒载体,如pET28a、pET20b、pET9a、pUC18、pUC19、pET15b、pET22a等,也可以用于将DNA聚合酶基因整合到宿主细胞上进行表达;宿主细胞可选择革兰氏阴性细菌(如大肠杆菌)、革兰氏阳性细菌(如枯草芽孢杆菌)、真菌(如曲霉菌)、酵母(如酿酒酵母)、放线菌(如链霉菌)等,均可以用来表达DNA聚合酶单点突变体和组合突变体蛋白。
实施例4
本实施例提供一种热稳定性提高的DNA聚合酶突变体的构建方法,包括以下步骤:
1.野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)基因的克隆
将野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)基因以大肠杆菌为感受态宿主细胞进行密码子优化,得到优化的野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)基因,其核酸序列为SEQ ID NO.1,所表达的氨基酸序列为SEQ ID NO.2;以SEQ ID NO.1作为目的基因,采用上游扩增引物SEQ IDNO.17和下游扩增引物SEQ ID NO.18扩增目的基因;
SEQ ID NO.17核酸序列为:
5’-TACCAGACGACGAcatATGAGCCGCAAAATGTTTAGC-3’(其中带下划线碱基为限制性内切酶NdeI识别位点);
SEQ ID NO.18核酸序列为:
5’-CTTCCATAGCCAAggatccCTATTTAATGGTAAACACG-3’(其中带下划线碱基为限制性内切酶BamHI识别位点)。
扩增条件为:使用KOD聚合酶,在98℃下扩增3min,然后在98℃下扩增10sec、在55℃下扩增10sec、在72℃下扩增15sec,共30个循环;最后在72℃下扩增5min。
待反应结束,采用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,得到1.0kb大小的条带,与预期结果相符。采用DpnI酶消化模板,回收、纯化该目的片段,使用限制性内切酶NdeI和BamHI对该目的片段以及pET28a质粒进行双酶切,然后采用T4 DNA连接酶进行连接,将得到的连接产物转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)电转化感受态细胞中,将转化细胞涂布于含有40μg/ml卡那霉素的固体培养基上,筛选出阳性克隆,提取质粒,对其进行测序,结果显示克隆的优化的野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)基因序列正确,且已正确接入pET28a质粒,得到重组质粒pET28a-AAA32368.1。
2.优化的野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)蛋白的表达和纯化
将甘油管中的工程菌按体积比1%接种到含100μg/mL卡那霉素(Kan+)的4mL LB培养基试管中,在37℃、230rpm条件下培养11h;取菌液4mL转接至含50μg/mL卡那霉素(Kan+)的1L LB培养基摇瓶中,在37℃、230rpm条件下培养2h,使OD600达到0.8左右,加入0.1mMIPTG诱导剂,在25℃、200rpm条件下诱导培养11~17h,本实施例中诱导培养14h。将发酵后收获的大肠杆菌菌体悬液离心,再经过一步Ni-NTA亲和层析处理,得到纯度>95%的优化的野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)蛋白,氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
3.优化的野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)同源蛋白的多序列比对及Consensus分析
(1)进入Pfam数据库主页(http://pfam.xfam.org/),在SEQUENCE SEARCH工具中输入优化的野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO.2进行搜索,服务器将直接反馈该蛋白整个家族的氨基酸序列的比对结果。本实施例为DNA聚合酶家族,得到各个突变位点的各类氨基酸丰度。同时,Pfam数据库主页也可以自动生成该酶蛋白家族的consensus sequence。
(2)进入NCBI protein数据库,输入优化的野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)的氨基酸序列SEQ ID NO.2,利用Blast工具,找出所有与该氨基酸序列SEQ ID NO.2一致性大于30%的蛋白序列,删除其中的重复出现的相同序列,将剩余氨基酸序列整理成fasta.格式,用Clustalx1.83软件实现多序列比对,比对结果以fasta.、aln.和dnd.格式输出。
将上述fasta.文件上传到Consensus Maker v2.0.0(http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html)服务器,根据需要修改设置参数后,该在线软件将生成可以后期编辑的consensus sequence。
(3)将氨基酸序列SEQ ID NO.2与该家族consensus sequence以及各位点氨基酸丰度图进行对照比较。
4.优化的野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)蛋白三维结构的模拟及突变热点的选择
(1)对获得的优化的野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)蛋白晶体通过X-ray衍射的方法对其结构进行解析。
(2)用PyMOL观测优化的野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)蛋白(氨基酸序列SEQ IDNO.2)晶体结构,根据结构信息复查上述待选突变位点及突变形式,筛选出最有可能提高优化的野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)蛋白热稳定性突变体的突变位点,筛选条件如下:
A.判断某一突变位点为待选突变位点的标准为:①在该突变位点处氨基酸丰度该酶家族大多数蛋白总体高度较高;②该突变位点氨基酸为保守型氨基酸;③该突变位点出现频率较高的氨基酸与优化的野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)该位点处的氨基酸有较大的理化性质差异,包括极性强弱、电荷差异及空间位阻大小等性质。
B.除去活性中心附近,除去处于包埋或半包埋状态的氨基酸残基。
经过上述两步筛选,此时共剩余58个差异位点,大多数位于优化的野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)蛋白分子的表面,如图1所示。
(3)根据优化的野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)蛋白晶体结构,逐个详细分析上述58种突变形式,筛选出可能提高优化的野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)蛋白热稳定性的突变体。
主要判断准则为:①在该突变位点的突变应消除原有的不利于热稳定的作用力形式,如静电排斥作用力等;②在该突变位点的突变不应破坏现有的稳定的蛋白结构;③在该突变位点的突变应引入新的有利于热稳定的作用力形式,如氢键的添加、盐桥的搭建、疏水基团相互作用等。
共设计单点突变体12种,其单点突变位点分别为:
A481K、I170L、V318A、R284F、M99E、Q499E、E371A、F436I、M243Y、T365Y、G194I和P214N,这12种突变体全部通过结构辅助的Consensus Concept方法设计获得。
使用与单点突变体相似的构建方法,将稳定性提高的单点突变体累加组合,在SEQID NO.2所示的氨基酸序列选择多个位点进行突变,如从上述12个突变位点中选择2~12个位点进行突变,分别得到不同的DNA聚合酶组合突变体,并进行活力测定,筛选出2种热稳定性提高的DNA聚合酶组合突变体,其组合突变位点为:V318A/M99E/Q499E/P214N、I170L/V318A/M99E/M243Y/T365Y。
测试例1
1.DNA聚合酶突变体的酶学性质表征
将优化的野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)蛋白以及实施例4提供的多种DNA聚合酶突变体进行热稳定性测试,按照DNA聚合酶活力测定方法,具体为:
将纯化后的DNA聚合酶蛋白浓度调整到1mg/mL,在65摄氏度水浴中孵育不同时间(0,5,10,15,20,25,30min);将热处理后的优化的野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)蛋白以及实施例4提供的多种DNA聚合酶突变体分别进行残余活力测定。
反应体系为:去离子水15μL,10倍浓缩PCR缓冲液2μL,25mM氯化镁溶液2μL,发夹型寡核苷酸模板100μM 0.1μL(序列为5-tagcgaaffatgtgaacctaatcccTGCTCCCGCGGCCGatctgccggccgcgggagca-3),dNTP混合液(12.5mM)0.4μL,PicoGreen染料0.5μL,热处理后的优化的野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)蛋白以及实施例4提供的多种DNA聚合酶突变体各1μL,在全自动医用PCR仪上进行反应。
反应条件为:95摄氏度,5min;74摄氏度,16s,荧光采集通道SYBR,120个循环。数据处理:根据不同量双链DNA的荧光强度制作标准曲线,根据标准曲线,测定酶在单位时间内消耗的dNTP的量,计算得到残留酶活性;将不同孵育时间的残留活性进行拟合,计算得到酶的半衰期(min)。
实验结果表明,以上多种DNA聚合酶突变体中,有12种单点突变体和2种组合突变体的热稳定性得到明显改善,如表1所示:
表1.野生型DNA聚合酶、单点突变体和组合突变体的酶学性质表征
由表1得知,本发明提供的DNA聚合酶突变体与野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)相比,其单点突变体和组合突变体在65℃下半衰期均更长;尤其是组合突变体,表现出单点突变体热稳定性的叠加效果,最优组合突变体半衰期大约是优化的野生型DNA聚合酶(AAA32368.1)的3倍。基于此,本发明所提供的DNA聚合酶突变体的热稳定性更好,适于在较高温度下的单分子测序。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
发明名称:热稳定性提高的DNA聚合酶突变体及其构建方法和应用
申请人:中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
SEQ ID NO.1
ATGAGCCGCAAAATGTTTAGCTGCGATTTTGAAACCACCACCAAACTGGATGATTGCCGCGTGTGGGCGTATGGCTATATGGAAATTG
GCAACCTGGATAACTATAAAATTGGCAACAGCCTGGATGAATTTATGCAGTGGGTGATGGAAATTCAGGCGGATCTGTATTTTCATAAC
CTGAAATTTGATGGCGCGTTTATTGTGAACTGGCTGGAACAGCATGGCTTTAAATGGAGCAACGAAGGCCTGCCGAACACCTATAACA
CCATTATTAGCAAAATGGGCCAGTGGTATATGATTGATATTTGCTTTGGCTATAAAGGCAAACGCAAACTGCATACCGTGATTTATGAT
AGCCTGAAAAAACTGCCGTTTCCGGTGAAAAAAATTGCGAAAGATTTTCAGCTGCCGCTGCTGAAAGGCGATATTGATTATCATACCG
AACGCCCGGTGGGCCATGAAATTACCCCGGAAGAATATGAATATATTAAAAACGATATTGAAATTATTGCGCGCGCGCTGGATATTCA
GTTTAAACAGGGCCTGGATCGCATGACCGCGGGCAGCGATAGCCTGAAAGGCTTTAAAGATATTCTGAGCACCAAAAAATTTAACAAA
GTGTTTCCGAAACTGAGCCTGCCGATGGATAAAGAAATTCGCAAAGCGTATCGCGGCGGCTTTACCTGGCTGAACGATAAATATAAAG
AAAAAGAAATTGGCGAAGGCATGGTGTTTGATGTGAACAGCCTGTATCCGAGCCAGATGTATAGCCGCCCGCTGCCGTATGGCGCGCC
GATTGTGTTTCAGGGCAAATATGAAAAAGATGAACAGTATCCGCTGTATATTCAGCGCATTCGCTTTGAATTTGAACTGAAAGAAGGCT
ATATTCCGACCATTCAGATTAAAAAAAACCCGTTTTTTAAAGGCAACGAATATCTGAAAAACAGCGGCGTGGAACCGGTGGAACTGTAT
CTGACCAACGTGGATCTGGAACTGATTCAGGAACATTATGAACTGTATAACGTGGAATATATTGATGGCTTTAAATTTCGCGAAAAAAC
CGGCCTGTTTAAAGATTTTATTGATAAATGGACCTATGTGAAAACCCATGAAGAAGGCGCGAAAAAACAGCTGGCGAAACTGATGCTG
AACAGCCTGTATGGCAAATTTGCGAGCAACCCGGATGTGACCGGCAAAGTGCCGTATCTGAAAGATGATGGCAGCCTGGGCTTTCGCG
TGGGCGATGAAGAATATAAAGATCCGGTGTATACCCCGATGGGCGTGTTTATTACCGCGTGGGCGCGCTTTACCACCATTACCGCGGC
GCAGGCGTGCTATGATCGCATTATTTATTGCGATACCGATAGCATTCATCTGACCGGCACCGAAGTGCCGGAAATTATTAAAGATATTGT
GGATCCGAAAAAACTGGGCTATTGGGCGCATGAAAGCACCTTTAAACGCGCGAAATATCTGCGCCAGAAAACCTATATTCAGGATATTT
ATGTGAAAGAAGTGGATGGCAAACTGAAAGAATGCAGCCCGGATGAAGCGACCACCACCAAATTTAGCGTGAAATGCGCGGGCATGA
CCGATACCATTAAAAAAAAAGTGACCTTTGATAACTTTGCGGTGGGCTTTAGCAGCATGGGCAAACCGAAACCGGTGCAGGTGAACGG
CGGCGTGGTGCTGGTGGATAGCGTGTTTACCATTAAATAG
SEQ ID NO.2
MSRKMFSCDFETTTKLDDCRVWAYGYMEIGNLDNYKIGNSLDEFMQWVMEIQADLYFHNLKFDGAFIVNWLEQHGFKWSNEGLPNTYNTII
SKMGQWYMIDICFGYKGKRKLHTVIYDSLKKLPFPVKKIAKDFQLPLLKGDIDYHTERPVGHEITPEEYEYIKNDIEIIARALDIQFKQGLDRMTAG
SDSLKGFKDILSTKKFNKVFPKLSLPMDKEIRKAYRGGFTWLNDKYKEKEIGEGMVFDVNSLYPSQMYSRPLPYGAPIVFQGKYEKDEQYPLYIQR
IRFEFELKEGYIPTIQIKKNPFFKGNEYLKNSGVEPVELYLTNVDLELIQEHYELYNVEYIDGFKFREKTGLFKDFIDKWTYVKTHEEGAKKQLAKLML
NSLYGKFASNPDVTGKVPYLKDDGSLGFRVGDEEYKDPVYTPMGVFITAWARFTTITAAQACYDRIIYCDTDSIHLTGTEVPEIIKDIVDPKKLGY
WAHESTFKRAKYLRQKTYIQDIYVKEVDGKLKECSPDEATTTKFSVKCAGMTDTIKKKVTFDNFAVGFSSMGKPKPVQVNGGVVLVDSVFTIK
SEQ ID NO.3
ATGAGCCGCAAAATGTTTAGCTGCGATTTTGAAACCACCACCAAACTGGATGATTGCCGCGTGTGGGCGTATGGCTATATGGAAATTGG
CAACCTGGATAACTATAAAATTGGCAACAGCCTGGATGAATTTATGCAGTGGGTGATGGAAATTCAGGCGGATCTGTATTTTCATAACCT
GAAATTTGATGGCGCGTTTATTGTGAACTGGCTGGAACAGCATGGCTTTAAATGGAGCAACGAAGGCCTGCCGAACACCTATAACACCA
TTATTAGCAAAATGGGCCAGTGGTATATGATTGATATTTGCTTTGGCTATAAAGGCAAACGCAAACTGCATACCGTGATTTATGATAGCC
TGAAAAAACTGCCGTTTCCGGTGAAAAAAATTGCGAAAGATTTTCAGCTGCCGCTGCTGAAAGGCGATATTGATTATCATACCGAACGC
CCGGTGGGCCATGAAATTACCCCGGAAGAATATGAATATATTAAAAACGATATTGAAATTATTGCGCGCGCGCTGGATATTCAGTTTAAA
CAGGGCCTGGATCGCATGACCGCGGGCAGCGATAGCCTGAAAGGCTTTAAAGATATTCTGAGCACCAAAAAATTTAACAAAGTGTTTC
CGAAACTGAGCCTGCCGATGGATAAAGAAATTCGCAAAGCGTATCGCGGCGGCTTTACCTGGCTGAACGATAAATATAAAGAAAAAGA
AATTGGCGAAGGCATGGTGTTTGATGTGAACAGCCTGTATCCGAGCCAGATGTATAGCCGCCCGCTGCCGTATGGCGCGCCGATTGTG
TTTCAGGGCAAATATGAAAAAGATGAACAGTATCCGCTGTATATTCAGCGCATTCGCTTTGAATTTGAACTGAAAGAAGGCTATATTCCG
ACCATTCAGATTAAAAAAAACCCGTTTTTTAAAGGCAACGAATATCTGAAAAACAGCGGCGTGGAACCGGTGGAACTGTATCTGACCAA
CGTGGATCTGGAACTGATTCAGGAACATTATGAACTGTATAACGTGGAATATATTGATGGCTTTAAATTTCGCGAAAAAACCGGCCTGTT
TAAAGATTTTATTGATAAATGGACCTATGTGAAAACCCATGAAGAAGGCGCGAAAAAACAGCTGGCGAAACTGATGCTGAACAGCCTGT
ATGGCAAATTTGCGAGCAACCCGGATGTGACCGGCAAAGTGCCGTATCTGAAAGATGATGGCAGCCTGGGCTTTCGCGTGGGCGATGA
AGAATATAAAGATCCGGTGTATACCCCGATGGGCGTGTTTATTACCGCGTGGGCGCGCTTTACCACCATTACCGCGGCGCAGGCGTGC
TATGATCGCATTATTTATTGCGATACCGATAGCATTCATCTGACCGGCACCGAAGTGCCGGAAATTATTAAAGATATTGTGGATCCGAAA
AAACTGGGCTATTGGaaaCATGAAAGCACCTTTAAACGCGCGAAATATCTGCGCCAGAAAACCTATATTCAGGATATTTATGTGAAAGAA
GTGGATGGCAAACTGAAAGAATGCAGCCCGGATGAAGCGACCACCACCAAATTTAGCGTGAAATGCGCGGGCATGACCGATACCATTA
AAAAAAAAGTGACCTTTGATAACTTTGCGGTGGGCTTTAGCAGCATGGGCAAACCGAAACCGGTGCAGGTGAACGGCGGCGTGGTGCT
GGTGGATAGCGTGTTTACCATTAAATAG
SEQ ID NO.4
ATGAGCCGCAAAATGTTTAGCTGCGATTTTGAAACCACCACCAAACTGGATGATTGCCGCGTGTGGGCGTATGGCTATATGGAAATTG
GCAACCTGGATAACTATAAAATTGGCAACAGCCTGGATGAATTTATGCAGTGGGTGATGGAAATTCAGGCGGATCTGTATTTTCATAA
CCTGAAATTTGATGGCGCGTTTATTGTGAACTGGCTGGAACAGCATGGCTTTAAATGGAGCAACGAAGGCCTGCCGAACACCTATAA
CACCATTATTAGCAAAATGGGCCAGTGGTATATGATTGATATTTGCTTTGGCTATAAAGGCAAACGCAAACTGCATACCGTGATTTAT
GATAGCCTGAAAAAACTGCCGTTTCCGGTGAAAAAAATTGCGAAAGATTTTCAGCTGCCGCTGCTGAAAGGCGATATTGATTATCAT
ACCGAACGCCCGGTGGGCCATGAAATTACCCCGGAAGAATATGAATATATTAAAAACGATATTGAAATTcttGCGCGCGCGCTGGAT
ATTCAGTTTAAACAGGGCCTGGATCGCATGACCGCGGGCAGCGATAGCCTGAAAGGCTTTAAAGATATTCTGAGCACCAAAAAATT
TAACAAAGTGTTTCCGAAACTGAGCCTGCCGATGGATAAAGAAATTCGCAAAGCGTATCGCGGCGGCTTTACCTGGCTGAACGATA
AATATAAAGAAAAAGAAATTGGCGAAGGCATGGTGTTTGATGTGAACAGCCTGTATCCGAGCCAGATGTATAGCCGCCCGCTGCCG
TATGGCGCGCCGATTGTGTTTCAGGGCAAATATGAAAAAGATGAACAGTATCCGCTGTATATTCAGCGCATTCGCTTTGAATTTGAAC
TGAAAGAAGGCTATATTCCGACCATTCAGATTAAAAAAAACCCGTTTTTTAAAGGCAACGAATATCTGAAAAACAGCGGCGTGGAAC
CGGTGGAACTGTATCTGACCAACGTGGATCTGGAACTGATTCAGGAACATTATGAACTGTATAACGTGGAATATATTGATGGCTTTAA
ATTTCGCGAAAAAACCGGCCTGTTTAAAGATTTTATTGATAAATGGACCTATGTGAAAACCCATGAAGAAGGCGCGAAAAAACAGCT
GGCGAAACTGATGCTGAACAGCCTGTATGGCAAATTTGCGAGCAACCCGGATGTGACCGGCAAAGTGCCGTATCTGAAAGATGATG
GCAGCCTGGGCTTTCGCGTGGGCGATGAAGAATATAAAGATCCGGTGTATACCCCGATGGGCGTGTTTATTACCGCGTGGGCGCGC
TTTACCACCATTACCGCGGCGCAGGCGTGCTATGATCGCATTATTTATTGCGATACCGATAGCATTCATCTGACCGGCACCGAAGTG
CCGGAAATTATTAAAGATATTGTGGATCCGAAAAAACTGGGCTATTGGGCGCATGAAAGCACCTTTAAACGCGCGAAATATCTGCG
CCAGAAAACCTATATTCAGGATATTTATGTGAAAGAAGTGGATGGCAAACTGAAAGAATGCAGCCCGGATGAAGCGACCACCACC
AAATTTAGCGTGAAATGCGCGGGCATGACCGATACCATTAAAAAAAAAGTGACCTTTGATAACTTTGCGGTGGGCTTTAGCAGCAT
GGGCAAACCGAAACCGGTGCAGGTGAACGGCGGCGTGGTGCTGGTGGATAGCGTGTTTACCATTAAATAG
SEQ ID NO.5
ATGAGCCGCAAAATGTTTAGCTGCGATTTTGAAACCACCACCAAACTGGATGATTGCCGCGTGTGGGCGTATGGCTATATGGAAA
TTGGCAACCTGGATAACTATAAAATTGGCAACAGCCTGGATGAATTTATGCAGTGGGTGATGGAAATTCAGGCGGATCTGTATTTT
CATAACCTGAAATTTGATGGCGCGTTTATTGTGAACTGGCTGGAACAGCATGGCTTTAAATGGAGCAACGAAGGCCTGCCGAACA
CCTATAACACCATTATTAGCAAAATGGGCCAGTGGTATATGATTGATATTTGCTTTGGCTATAAAGGCAAACGCAAACTGCATACC
GTGATTTATGATAGCCTGAAAAAACTGCCGTTTCCGGTGAAAAAAATTGCGAAAGATTTTCAGCTGCCGCTGCTGAAAGGCGATA
TTGATTATCATACCGAACGCCCGGTGGGCCATGAAATTACCCCGGAAGAATATGAATATATTAAAAACGATATTGAAATTATTGCG
CGCGCGCTGGATATTCAGTTTAAACAGGGCCTGGATCGCATGACCGCGGGCAGCGATAGCCTGAAAGGCTTTAAAGATATTCTGA
GCACCAAAAAATTTAACAAAGTGTTTCCGAAACTGAGCCTGCCGATGGATAAAGAAATTCGCAAAGCGTATCGCGGCGGCTTTAC
CTGGCTGAACGATAAATATAAAGAAAAAGAAATTGGCGAAGGCATGGTGTTTGATGTGAACAGCCTGTATCCGAGCCAGATGTAT
AGCCGCCCGCTGCCGTATGGCGCGCCGATTGTGTTTCAGGGCAAATATGAAAAAGATGAACAGTATCCGCTGTATATTCAGCGCA
TTCGCTTTGAATTTGAACTGAAAGAAGGCTATATTCCGACCATTCAGATTAAAAAAAACCCGTTTTTTAAAGGCAACGAATATCTGA
AAAACAGCGGCgctGAACCGGTGGAACTGTATCTGACCAACGTGGATCTGGAACTGATTCAGGAACATTATGAACTGTATAACGTG
GAATATATTGATGGCTTTAAATTTCGCGAAAAAACCGGCCTGTTTAAAGATTTTATTGATAAATGGACCTATGTGAAAACCCATGAA
GAAGGCGCGAAAAAACAGCTGGCGAAACTGATGCTGAACAGCCTGTATGGCAAATTTGCGAGCAACCCGGATGTGACCGGCAAA
GTGCCGTATCTGAAAGATGATGGCAGCCTGGGCTTTCGCGTGGGCGATGAAGAATATAAAGATCCGGTGTATACCCCGATGGGCG
TGTTTATTACCGCGTGGGCGCGCTTTACCACCATTACCGCGGCGCAGGCGTGCTATGATCGCATTATTTATTGCGATACCGATAGCA
TTCATCTGACCGGCACCGAAGTGCCGGAAATTATTAAAGATATTGTGGATCCGAAAAAACTGGGCTATTGGGCGCATGAAAGCACC
TTTAAACGCGCGAAATATCTGCGCCAGAAAACCTATATTCAGGATATTTATGTGAAAGAAGTGGATGGCAAACTGAAAGAATGCAGC
CCGGATGAAGCGACCACCACCAAATTTAGCGTGAAATGCGCGGGCATGACCGATACCATTAAAAAAAAAGTGACCTTTGATAACTTT
GCGGTGGGCTTTAGCAGCATGGGCAAACCGAAACCGGTGCAGGTGAACGGCGGCGTGGTGCTGGTGGATAGCGTGTTTACCATTAA
ATAG
SEQ ID NO.6
ATGAGCCGCAAAATGTTTAGCTGCGATTTTGAAACCACCACCAAACTGGATGATTGCCGCGTGTGGGCGTATGGCTATATGGAAATT
GGCAACCTGGATAACTATAAAATTGGCAACAGCCTGGATGAATTTATGCAGTGGGTGATGGAAATTCAGGCGGATCTGTATTTTCAT
AACCTGAAATTTGATGGCGCGTTTATTGTGAACTGGCTGGAACAGCATGGCTTTAAATGGAGCAACGAAGGCCTGCCGAACACCTAT
AACACCATTATTAGCAAAATGGGCCAGTGGTATATGATTGATATTTGCTTTGGCTATAAAGGCAAACGCAAACTGCATACCGTGATTT
ATGATAGCCTGAAAAAACTGCCGTTTCCGGTGAAAAAAATTGCGAAAGATTTTCAGCTGCCGCTGCTGAAAGGCGATATTGATTATC
ATACCGAACGCCCGGTGGGCCATGAAATTACCCCGGAAGAATATGAATATATTAAAAACGATATTGAAATTATTGCGCGCGCGCTGG
ATATTCAGTTTAAACAGGGCCTGGATCGCATGACCGCGGGCAGCGATAGCCTGAAAGGCTTTAAAGATATTCTGAGCACCAAAAAAT
TTAACAAAGTGTTTCCGAAACTGAGCCTGCCGATGGATAAAGAAATTCGCAAAGCGTATCGCGGCGGCTTTACCTGGCTGAACGATA
AATATAAAGAAAAAGAAATTGGCGAAGGCATGGTGTTTGATGTGtttAGCCTGTATCCGAGCCAGATGTATAGCCGCCCGCTGCCGTA
TGGCGCGCCGATTGTGTTTCAGGGCAAATATGAAAAAGATGAACAGTATCCGCTGTATATTCAGCGCATTCGCTTTGAATTTGAACTG
AAAGAAGGCTATATTCCGACCATTCAGATTAAAAAAAACCCGTTTTTTAAAGGCAACGAATATCTGAAAAACAGCGGCGTGGAACCG
GTGGAACTGTATCTGACCAACGTGGATCTGGAACTGATTCAGGAACATTATGAACTGTATAACGTGGAATATATTGATGGCTTTAAAT
TTCGCGAAAAAACCGGCCTGTTTAAAGATTTTATTGATAAATGGACCTATGTGAAAACCCATGAAGAAGGCGCGAAAAAACAGCTGG
CGAAACTGATGCTGAACAGCCTGTATGGCAAATTTGCGAGCAACCCGGATGTGACCGGCAAAGTGCCGTATCTGAAAGATGATGGC
AGCCTGGGCTTTCGCGTGGGCGATGAAGAATATAAAGATCCGGTGTATACCCCGATGGGCGTGTTTATTACCGCGTGGGCGCGCTTT
ACCACCATTACCGCGGCGCAGGCGTGCTATGATCGCATTATTTATTGCGATACCGATAGCATTCATCTGACCGGCACCGAAGTGCCG
GAAATTATTAAAGATATTGTGGATCCGAAAAAACTGGGCTATTGGGCGCATGAAAGCACCTTTAAACGCGCGAAATATCTGCGCCAG
AAAACCTATATTCAGGATATTTATGTGAAAGAAGTGGATGGCAAACTGAAAGAATGCAGCCCGGATGAAGCGACCACCACCAAATTT
AGCGTGAAATGCGCGGGCATGACCGATACCATTAAAAAAAAAGTGACCTTTGATAACTTTGCGGTGGGCTTTAGCAGCATGGGCAAA
CCGAAACCGGTGCAGGTGAACGGCGGCGTGGTGCTGGTGGATAGCGTGTTTACCATTAAATAG
SEQ ID NO.7
ATGAGCCGCAAAATGTTTAGCTGCGATTTTGAAACCACCACCAAACTGGATGATTGCCGCGTGTGGGCGTATGGCTATATGGAAATT
GGCAACCTGGATAACTATAAAATTGGCAACAGCCTGGATGAATTTATGCAGTGGGTGATGGAAATTCAGGCGGATCTGTATTTTCATA
ACCTGAAATTTGATGGCGCGTTTATTGTGAACTGGCTGGAACAGCATGGCTTTAAATGGAGCAACGAAGGCCTGCCGAACACCTATAA
CACCATTATTAGCAAAATGGGCCAGTGGTATgaaATTGATATTTGCTTTGGCTATAAAGGCAAACGCAAACTGCATACCGTGATTTATGA
TAGCCTGAAAAAACTGCCGTTTCCGGTGAAAAAAATTGCGAAAGATTTTCAGCTGCCGCTGCTGAAAGGCGATATTGATTATCATACCG
AACGCCCGGTGGGCCATGAAATTACCCCGGAAGAATATGAATATATTAAAAACGATATTGAAATTATTGCGCGCGCGCTGGATATTCAG
TTTAAACAGGGCCTGGATCGCATGACCGCGGGCAGCGATAGCCTGAAAGGCTTTAAAGATATTCTGAGCACCAAAAAATTTAACAAAG
TGTTTCCGAAACTGAGCCTGCCGATGGATAAAGAAATTCGCAAAGCGTATCGCGGCGGCTTTACCTGGCTGAACGATAAATATAAAGA
AAAAGAAATTGGCGAAGGCATGGTGTTTGATGTGAACAGCCTGTATCCGAGCCAGATGTATAGCCGCCCGCTGCCGTATGGCGCGCCG
ATTGTGTTTCAGGGCAAATATGAAAAAGATGAACAGTATCCGCTGTATATTCAGCGCATTCGCTTTGAATTTGAACTGAAAGAAGGCTAT
ATTCCGACCATTCAGATTAAAAAAAACCCGTTTTTTAAAGGCAACGAATATCTGAAAAACAGCGGCGTGGAACCGGTGGAACTGTATCT
GACCAACGTGGATCTGGAACTGATTCAGGAACATTATGAACTGTATAACGTGGAATATATTGATGGCTTTAAATTTCGCGAAAAAACCGG
CCTGTTTAAAGATTTTATTGATAAATGGACCTATGTGAAAACCCATGAAGAAGGCGCGAAAAAACAGCTGGCGAAACTGATGCTGAACA
GCCTGTATGGCAAATTTGCGAGCAACCCGGATGTGACCGGCAAAGTGCCGTATCTGAAAGATGATGGCAGCCTGGGCTTTCGCGTGGG
CGATGAAGAATATAAAGATCCGGTGTATACCCCGATGGGCGTGTTTATTACCGCGTGGGCGCGCTTTACCACCATTACCGCGGCGCAGG
CGTGCTATGATCGCATTATTTATTGCGATACCGATAGCATTCATCTGACCGGCACCGAAGTGCCGGAAATTATTAAAGATATTGTGGATC
CGAAAAAACTGGGCTATTGGGCGCATGAAAGCACCTTTAAACGCGCGAAATATCTGCGCCAGAAAACCTATATTCAGGATATTTATGTG
AAAGAAGTGGATGGCAAACTGAAAGAATGCAGCCCGGATGAAGCGACCACCACCAAATTTAGCGTGAAATGCGCGGGCATGACCGAT
ACCATTAAAAAAAAAGTGACCTTTGATAACTTTGCGGTGGGCTTTAGCAGCATGGGCAAACCGAAACCGGTGCAGGTGAACGGCGGCGT
GGTGCTGGTGGATAGCGTGTTTACCATTAAATAG
SEQ ID NO.8
ATGAGCCGCAAAATGTTTAGCTGCGATTTTGAAACCACCACCAAACTGGATGATTGCCGCGTGTGGGCGTATGGCTATATGGAAATT
GGCAACCTGGATAACTATAAAATTGGCAACAGCCTGGATGAATTTATGCAGTGGGTGATGGAAATTCAGGCGGATCTGTATTTTCAT
AACCTGAAATTTGATGGCGCGTTTATTGTGAACTGGCTGGAACAGCATGGCTTTAAATGGAGCAACGAAGGCCTGCCGAACACCTAT
AACACCATTATTAGCAAAATGGGCCAGTGGTATATGATTGATATTTGCTTTGGCTATAAAGGCAAACGCAAACTGCATACCGTGATTT
ATGATAGCCTGAAAAAACTGCCGTTTCCGGTGAAAAAAATTGCGAAAGATTTTCAGCTGCCGCTGCTGAAAGGCGATATTGATTATC
ATACCGAACGCCCGGTGGGCCATGAAATTACCCCGGAAGAATATGAATATATTAAAAACGATATTGAAATTATTGCGCGCGCGCTGG
ATATTCAGTTTAAACAGGGCCTGGATCGCATGACCGCGGGCAGCGATAGCCTGAAAGGCTTTAAAGATATTCTGAGCACCAAAAAAT
TTAACAAAGTGTTTCCGAAACTGAGCCTGCCGATGGATAAAGAAATTCGCAAAGCGTATCGCGGCGGCTTTACCTGGCTGAACGATA
AATATAAAGAAAAAGAAATTGGCGAAGGCATGGTGTTTGATGTGAACAGCCTGTATCCGAGCCAGATGTATAGCCGCCCGCTGCCGT
ATGGCGCGCCGATTGTGTTTCAGGGCAAATATGAAAAAGATGAACAGTATCCGCTGTATATTCAGCGCATTCGCTTTGAATTTGAACT
GAAAGAAGGCTATATTCCGACCATTCAGATTAAAAAAAACCCGTTTTTTAAAGGCAACGAATATCTGAAAAACAGCGGCGTGGAACC
GGTGGAACTGTATCTGACCAACGTGGATCTGGAACTGATTCAGGAACATTATGAACTGTATAACGTGGAATATATTGATGGCTTTAAA
TTTCGCGAAAAAACCGGCCTGTTTAAAGATTTTATTGATAAATGGACCTATGTGAAAACCCATGAAGAAGGCGCGAAAAAACAGCTG
GCGAAACTGATGCTGAACAGCCTGTATGGCAAATTTGCGAGCAACCCGGATGTGACCGGCAAAGTGCCGTATCTGAAAGATGATGG
CAGCCTGGGCTTTCGCGTGGGCGATGAAGAATATAAAGATCCGGTGTATACCCCGATGGGCGTGTTTATTACCGCGTGGGCGCGC
TTTACCACCATTACCGCGGCGCAGGCGTGCTATGATCGCATTATTTATTGCGATACCGATAGCATTCATCTGACCGGCACCGAAGTG
CCGGAAATTATTAAAGATATTGTGGATCCGAAAAAACTGGGCTATTGGGCGCATGAAAGCACCTTTAAACGCGCGAAATATCTGCGC
CAGAAAACCTATATTgaaGATATTTATGTGAAAGAAGTGGATGGCAAACTGAAAGAATGCAGCCCGGATGAAGCGACCACCACCAAA
TTTAGCGTGAAATGCGCGGGCATGACCGATACCATTAAAAAAAAAGTGACCTTTGATAACTTTGCGGTGGGCTTTAGCAGCATGGGCA
AACCGAAACCGGTGCAGGTGAACGGCGGCGTGGTGCTGGTGGATAGCGTGTTTACCATTAAATAG
SEQ ID NO.9
ATGAGCCGCAAAATGTTTAGCTGCGATTTTGAAACCACCACCAAACTGGATGATTGCCGCGTGTGGGCGTATGGCTATATGGAAATT
GGCAACCTGGATAACTATAAAATTGGCAACAGCCTGGATGAATTTATGCAGTGGGTGATGGAAATTCAGGCGGATCTGTATTTTCAT
AACCTGAAATTTGATGGCGCGTTTATTGTGAACTGGCTGGAACAGCATGGCTTTAAATGGAGCAACGAAGGCCTGCCGAACACCTAT
AACACCATTATTAGCAAAATGGGCCAGTGGTATATGATTGATATTTGCTTTGGCTATAAAGGCAAACGCAAACTGCATACCGTGATTT
ATGATAGCCTGAAAAAACTGCCGTTTCCGGTGAAAAAAATTGCGAAAGATTTTCAGCTGCCGCTGCTGAAAGGCGATATTGATTATC
ATACCGAACGCCCGGTGGGCCATGAAATTACCCCGGAAGAATATGAATATATTAAAAACGATATTGAAATTATTGCGCGCGCGCTGG
ATATTCAGTTTAAACAGGGCCTGGATCGCATGACCGCGGGCAGCGATAGCCTGAAAGGCTTTAAAGATATTCTGAGCACCAAAAAAT
TTAACAAAGTGTTTCCGAAACTGAGCCTGCCGATGGATAAAGAAATTCGCAAAGCGTATCGCGGCGGCTTTACCTGGCTGAACGATA
AATATAAAGAAAAAGAAATTGGCGAAGGCATGGTGTTTGATGTGAACAGCCTGTATCCGAGCCAGATGTATAGCCGCCCGCTGCCG
TATGGCGCGCCGATTGTGTTTCAGGGCAAATATGAAAAAGATGAACAGTATCCGCTGTATATTCAGCGCATTCGCTTTGAATTTGAA
CTGAAAGAAGGCTATATTCCGACCATTCAGATTAAAAAAAACCCGTTTTTTAAAGGCAACGAATATCTGAAAAACAGCGGCGTGGA
ACCGGTGGAACTGTATCTGACCAACGTGGATCTGGAACTGATTCAGGAACATTATGAACTGTATAACGTGGAATATATTGATGGCTT
TAAATTTCGCGAAAAAACCGGCCTGTTTAAAGATTTTATTGATAAATGGACCTATGTGAAAACCCATgctGAAGGCGCGAAAAAACAG
CTGGCGAAACTGATGCTGAACAGCCTGTATGGCAAATTTGCGAGCAACCCGGATGTGACCGGCAAAGTGCCGTATCTGAAAGATGA
TGGCAGCCTGGGCTTTCGCGTGGGCGATGAAGAATATAAAGATCCGGTGTATACCCCGATGGGCGTGTTTATTACCGCGTGGGCGCG
CTTTACCACCATTACCGCGGCGCAGGCGTGCTATGATCGCATTATTTATTGCGATACCGATAGCATTCATCTGACCGGCACCGAAGTG
CCGGAAATTATTAAAGATATTGTGGATCCGAAAAAACTGGGCTATTGGGCGCATGAAAGCACCTTTAAACGCGCGAAATATCTGCGCC
AGAAAACCTATATTCAGGATATTTATGTGAAAGAAGTGGATGGCAAACTGAAAGAATGCAGCCCGGATGAAGCGACCACCACCAAATT
TAGCGTGAAATGCGCGGGCATGACCGATACCATTAAAAAAAAAGTGACCTTTGATAACTTTGCGGTGGGCTTTAGCAGCATGGGCAAA
CCGAAACCGGTGCAGGTGAACGGCGGCGTGGTGCTGGTGGATAGCGTGTTTACCATTAAATAG
SEQ ID NO.10
ATGAGCCGCAAAATGTTTAGCTGCGATTTTGAAACCACCACCAAACTGGATGATTGCCGCGTGTGGGCGTATGGCTATATGGAAATTG
GCAACCTGGATAACTATAAAATTGGCAACAGCCTGGATGAATTTATGCAGTGGGTGATGGAAATTCAGGCGGATCTGTATTTTCATAAC
CTGAAATTTGATGGCGCGTTTATTGTGAACTGGCTGGAACAGCATGGCTTTAAATGGAGCAACGAAGGCCTGCCGAACACCTATAACA
CCATTATTAGCAAAATGGGCCAGTGGTATATGATTGATATTTGCTTTGGCTATAAAGGCAAACGCAAACTGCATACCGTGATTTATGAT
GCCTGAAAAAACTGCCGTTTCCGGTGAAAAAAATTGCGAAAGATTTTCAGCTGCCGCTGCTGAAAGGCGATATTGATTATCATACCGA
ACGCCCGGTGGGCCATGAAATTACCCCGGAAGAATATGAATATATTAAAAACGATATTGAAATTATTGCGCGCGCGCTGGATATTCAG
TTTAAACAGGGCCTGGATCGCATGACCGCGGGCAGCGATAGCCTGAAAGGCTTTAAAGATATTCTGAGCACCAAAAAATTTAACAAAG
TGTTTCCGAAACTGAGCCTGCCGATGGATAAAGAAATTCGCAAAGCGTATCGCGGCGGCTTTACCTGGCTGAACGATAAATATAAAGA
AAAAGAAATTGGCGAAGGCATGGTGTTTGATGTGAACAGCCTGTATCCGAGCCAGATGTATAGCCGCCCGCTGCCGTATGGCGCGCCG
ATTGTGTTTCAGGGCAAATATGAAAAAGATGAACAGTATCCGCTGTATATTCAGCGCATTCGCTTTGAATTTGAACTGAAAGAAGGCTAT
ATTCCGACCATTCAGATTAAAAAAAACCCGTTTTTTAAAGGCAACGAATATCTGAAAAACAGCGGCGTGGAACCGGTGGAACTGTATCT
GACCAACGTGGATCTGGAACTGATTCAGGAACATTATGAACTGTATAACGTGGAATATATTGATGGCTTTAAATTTCGCGAAAAAACCGG
CCTGTTTAAAGATTTTATTGATAAATGGACCTATGTGAAAACCCATGAAGAAGGCGCGAAAAAACAGCTGGCGAAACTGATGCTGAACA
GCCTGTATGGCAAATTTGCGAGCAACCCGGATGTGACCGGCAAAGTGCCGTATCTGAAAGATGATGGCAGCCTGGGCTTTCGCGTGGG
CGATGAAGAATATAAAGATCCGGTGTATACCCCGATGGGCGTGTTTATTACCGCGTGGGCGCGCattACCACCATTACCGCGGCGCAGG
CGTGCTATGATCGCATTATTTATTGCGATACCGATAGCATTCATCTGACCGGCACCGAAGTGCCGGAAATTATTAAAGATATTGTGGATC
CGAAAAAACTGGGCTATTGGGCGCATGAAAGCACCTTTAAACGCGCGAAATATCTGCGCCAGAAAACCTATATTCAGGATATTTATGTG
AAAGAAGTGGATGGCAAACTGAAAGAATGCAGCCCGGATGAAGCGACCACCACCAAATTTAGCGTGAAATGCGCGGGCATGACCGAT
ACCATTAAAAAAAAAGTGACCTTTGATAACTTTGCGGTGGGCTTTAGCAGCATGGGCAAACCGAAACCGGTGCAGGTGAACGGCGGCG
TGGTGCTGGTGGATAGCGTGTTTACCATTAAATAG
SEQ ID NO.11
ATGAGCCGCAAAATGTTTAGCTGCGATTTTGAAACCACCACCAAACTGGATGATTGCCGCGTGTGGGCGTATGGCTATATGGAAATTGG
CAACCTGGATAACTATAAAATTGGCAACAGCCTGGATGAATTTATGCAGTGGGTGATGGAAATTCAGGCGGATCTGTATTTTCATAACCT
GAAATTTGATGGCGCGTTTATTGTGAACTGGCTGGAACAGCATGGCTTTAAATGGAGCAACGAAGGCCTGCCGAACACCTATAACACCA
TTATTAGCAAAATGGGCCAGTGGTATATGATTGATATTTGCTTTGGCTATAAAGGCAAACGCAAACTGCATACCGTGATTTATGATAGCC
TGAAAAAACTGCCGTTTCCGGTGAAAAAAATTGCGAAAGATTTTCAGCTGCCGCTGCTGAAAGGCGATATTGATTATCATACCGAACGC
CCGGTGGGCCATGAAATTACCCCGGAAGAATATGAATATATTAAAAACGATATTGAAATTATTGCGCGCGCGCTGGATATTCAGTTTAA
ACAGGGCCTGGATCGCATGACCGCGGGCAGCGATAGCCTGAAAGGCTTTAAAGATATTCTGAGCACCAAAAAATTTAACAAAGTGTTT
CCGAAACTGAGCCTGCCGATGGATAAAGAAATTCGCAAAGCGTATCGCGGCGGCTTTACCTGGCTGAACGATAAATATAAAGAAAAAG
AAATTGGCGAAGGCTATGTGTTTGATGTGAACAGCCTGTATCCGAGCCAGATGTATAGCCGCCCGCTGCCGTATGGCGCGCCGATTGT
GTTTCAGGGCAAATATGAAAAAGATGAACAGTATCCGCTGTATATTCAGCGCATTCGCTTTGAATTTGAACTGAAAGAAGGCTATATTC
CGACCATTCAGATTAAAAAAAACCCGTTTTTTAAAGGCAACGAATATCTGAAAAACAGCGGCGTGGAACCGGTGGAACTGTATCTGAC
CAACGTGGATCTGGAACTGATTCAGGAACATTATGAACTGTATAACGTGGAATATATTGATGGCTTTAAATTTCGCGAAAAAACCGGCC
TGTTTAAAGATTTTATTGATAAATGGACCTATGTGAAAACCCATGAAGAAGGCGCGAAAAAACAGCTGGCGAAACTGATGCTGAACAG
CCTGTATGGCAAATTTGCGAGCAACCCGGATGTGACCGGCAAAGTGCCGTATCTGAAAGATGATGGCAGCCTGGGCTTTCGCGTGGG
CGATGAAGAATATAAAGATCCGGTGTATACCCCGATGGGCGTGTTTATTACCGCGTGGGCGCGCTTTACCACCATTACCGCGGCGCA
GGCGTGCTATGATCGCATTATTTATTGCGATACCGATAGCATTCATCTGACCGGCACCGAAGTGCCGGAAATTATTAAAGATATTGTG
GATCCGAAAAAACTGGGCTATTGGGCGCATGAAAGCACCTTTAAACGCGCGAAATATCTGCGCCAGAAAACCTATATTCAGGATATTT
ATGTGAAAGAAGTGGATGGCAAACTGAAAGAATGCAGCCCGGATGAAGCGACCACCACCAAATTTAGCGTGAAATGCGCGGGCATG
ACCGATACCATTAAAAAAAAAGTGACCTTTGATAACTTTGCGGTGGGCTTTAGCAGCATGGGCAAACCGAAACCGGTGCAGGTGAAC
GGCGGCGTGGTGCTGGTGGATAGCGTGTTTACCATTAAATAG
SEQ ID NO.12
ATGAGCCGCAAAATGTTTAGCTGCGATTTTGAAACCACCACCAAACTGGATGATTGCCGCGTGTGGGCGTATGGCTATATGGAAATT
GGCAACCTGGATAACTATAAAATTGGCAACAGCCTGGATGAATTTATGCAGTGGGTGATGGAAATTCAGGCGGATCTGTATTTTCAT
AACCTGAAATTTGATGGCGCGTTTATTGTGAACTGGCTGGAACAGCATGGCTTTAAATGGAGCAACGAAGGCCTGCCGAACACCTA
TAACACCATTATTAGCAAAATGGGCCAGTGGTATATGATTGATATTTGCTTTGGCTATAAAGGCAAACGCAAACTGCATACCGTGATT
TATGATAGCCTGAAAAAACTGCCGTTTCCGGTGAAAAAAATTGCGAAAGATTTTCAGCTGCCGCTGCTGAAAGGCGATATTGATTAT
CATACCGAACGCCCGGTGGGCCATGAAATTACCCCGGAAGAATATGAATATATTAAAAACGATATTGAAATTATTGCGCGCGCGCT
GGATATTCAGTTTAAACAGGGCCTGGATCGCATGACCGCGGGCAGCGATAGCCTGAAAGGCTTTAAAGATATTCTGAGCACCAAAA
AATTTAACAAAGTGTTTCCGAAACTGAGCCTGCCGATGGATAAAGAAATTCGCAAAGCGTATCGCGGCGGCTTTACCTGGCTGAAC
GATAAATATAAAGAAAAAGAAATTGGCGAAGGCATGGTGTTTGATGTGAACAGCCTGTATCCGAGCCAGATGTATAGCCGCCCGCT
GCCGTATGGCGCGCCGATTGTGTTTCAGGGCAAATATGAAAAAGATGAACAGTATCCGCTGTATATTCAGCGCATTCGCTTTGAATT
TGAACTGAAAGAAGGCTATATTCCGACCATTCAGATTAAAAAAAACCCGTTTTTTAAAGGCAACGAATATCTGAAAAACAGCGGCG
TGGAACCGGTGGAACTGTATCTGACCAACGTGGATCTGGAACTGATTCAGGAACATTATGAACTGTATAACGTGGAATATATTGAT
GGCTTTAAATTTCGCGAAAAAACCGGCCTGTTTAAAGATTTTATTGATAAATGGtatTATGTGAAAACCCATGAAGAAGGCGCGAAA
AAACAGCTGGCGAAACTGATGCTGAACAGCCTGTATGGCAAATTTGCGAGCAACCCGGATGTGACCGGCAAAGTGCCGTATCTGA
AAGATGATGGCAGCCTGGGCTTTCGCGTGGGCGATGAAGAATATAAAGATCCGGTGTATACCCCGATGGGCGTGTTTATTACCGCG
TGGGCGCGCTTTACCACCATTACCGCGGCGCAGGCGTGCTATGATCGCATTATTTATTGCGATACCGATAGCATTCATCTGACCGGC
ACCGAAGTGCCGGAAATTATTAAAGATATTGTGGATCCGAAAAAACTGGGCTATTGGGCGCATGAAAGCACCTTTAAACGCGCGAAA
TATCTGCGCCAGAAAACCTATATTCAGGATATTTATGTGAAAGAAGTGGATGGCAAACTGAAAGAATGCAGCCCGGATGAAGCGACC
ACCACCAAATTTAGCGTGAAATGCGCGGGCATGACCGATACCATTAAAAAAAAAGTGACCTTTGATAACTTTGCGGTGGGCTTTAGC
AGCATGGGCAAACCGAAACCGGTGCAGGTGAACGGCGGCGTGGTGCTGGTGGATAGCGTGTTTACCATTAAATAG
SEQ ID NO.13
ATGAGCCGCAAAATGTTTAGCTGCGATTTTGAAACCACCACCAAACTGGATGATTGCCGCGTGTGGGCGTATGGCTATATGGAAATT
GGCAACCTGGATAACTATAAAATTGGCAACAGCCTGGATGAATTTATGCAGTGGGTGATGGAAATTCAGGCGGATCTGTATTTTCAT
AACCTGAAATTTGATGGCGCGTTTATTGTGAACTGGCTGGAACAGCATGGCTTTAAATGGAGCAACGAAGGCCTGCCGAACACCTAT
AACACCATTATTAGCAAAATGGGCCAGTGGTATATGATTGATATTTGCTTTGGCTATAAAGGCAAACGCAAACTGCATACCGTGATTTA
TGATAGCCTGAAAAAACTGCCGTTTCCGGTGAAAAAAATTGCGAAAGATTTTCAGCTGCCGCTGCTGAAAGGCGATATTGATTATCATA
CCGAACGCCCGGTGGGCCATGAAATTACCCCGGAAGAATATGAATATATTAAAAACGATATTGAAATTATTGCGCGCGCGCTGGATAT
TCAGTTTAAACAGGGCCTGGATCGCATGACCGCGGGCAGCGATAGCCTGAAAattTTTAAAGATATTCTGAGCACCAAAAAATTTAACA
AAGTGTTTCCGAAACTGAGCCTGCCGATGGATAAAGAAATTCGCAAAGCGTATCGCGGCGGCTTTACCTGGCTGAACGATAAATATAA
AGAAAAAGAAATTGGCGAAGGCATGGTGTTTGATGTGAACAGCCTGTATCCGAGCCAGATGTATAGCCGCCCGCTGCCGTATGGCG
CGCCGATTGTGTTTCAGGGCAAATATGAAAAAGATGAACAGTATCCGCTGTATATTCAGCGCATTCGCTTTGAATTTGAACTGAAAGA
AGGCTATATTCCGACCATTCAGATTAAAAAAAACCCGTTTTTTAAAGGCAACGAATATCTGAAAAACAGCGGCGTGGAACCGGTGGA
ACTGTATCTGACCAACGTGGATCTGGAACTGATTCAGGAACATTATGAACTGTATAACGTGGAATATATTGATGGCTTTAAATTTCGCG
AAAAAACCGGCCTGTTTAAAGATTTTATTGATAAATGGACCTATGTGAAAACCCATGAAGAAGGCGCGAAAAAACAGCTGGCGAAACT
GATGCTGAACAGCCTGTATGGCAAATTTGCGAGCAACCCGGATGTGACCGGCAAAGTGCCGTATCTGAAAGATGATGGCAGCCTGGGC
TTTCGCGTGGGCGATGAAGAATATAAAGATCCGGTGTATACCCCGATGGGCGTGTTTATTACCGCGTGGGCGCGCTTTACCACCATTAC
CGCGGCGCAGGCGTGCTATGATCGCATTATTTATTGCGATACCGATAGCATTCATCTGACCGGCACCGAAGTGCCGGAAATTATTAAAG
ATATTGTGGATCCGAAAAAACTGGGCTATTGGGCGCATGAAAGCACCTTTAAACGCGCGAAATATCTGCGCCAGAAAACCTATATTCA
GGATATTTATGTGAAAGAAGTGGATGGCAAACTGAAAGAATGCAGCCCGGATGAAGCGACCACCACCAAATTTAGCGTGAAATGCGC
GGGCATGACCGATACCATTAAAAAAAAAGTGACCTTTGATAACTTTGCGGTGGGCTTTAGCAGCATGGGCAAACCGAAACCGGTGCA
GGTGAACGGCGGCGTGGTGCTGGTGGATAGCGTGTTTACCATTAAATAG
SEQ ID NO.14
ATGAGCCGCAAAATGTTTAGCTGCGATTTTGAAACCACCACCAAACTGGATGATTGCCGCGTGTGGGCGTATGGCTATATGGAAATT
GGCAACCTGGATAACTATAAAATTGGCAACAGCCTGGATGAATTTATGCAGTGGGTGATGGAAATTCAGGCGGATCTGTATTTTCAT
AACCTGAAATTTGATGGCGCGTTTATTGTGAACTGGCTGGAACAGCATGGCTTTAAATGGAGCAACGAAGGCCTGCCGAACACCTA
TAACACCATTATTAGCAAAATGGGCCAGTGGTATATGATTGATATTTGCTTTGGCTATAAAGGCAAACGCAAACTGCATACCGTGAT
TTATGATAGCCTGAAAAAACTGCCGTTTCCGGTGAAAAAAATTGCGAAAGATTTTCAGCTGCCGCTGCTGAAAGGCGATATTGATTA
TCATACCGAACGCCCGGTGGGCCATGAAATTACCCCGGAAGAATATGAATATATTAAAAACGATATTGAAATTATTGCGCGCGCGC
TGGATATTCAGTTTAAACAGGGCCTGGATCGCATGACCGCGGGCAGCGATAGCCTGAAAGGCTTTAAAGATATTCTGAGCACCAAA
AAATTTAACAAAGTGTTTCCGAAACTGAGCCTGaatATGGATAAAGAAATTCGCAAAGCGTATCGCGGCGGCTTTACCTGGCTGAAC
GATAAATATAAAGAAAAAGAAATTGGCGAAGGCATGGTGTTTGATGTGAACAGCCTGTATCCGAGCCAGATGTATAGCCGCCCGCT
GCCGTATGGCGCGCCGATTGTGTTTCAGGGCAAATATGAAAAAGATGAACAGTATCCGCTGTATATTCAGCGCATTCGCTTTGAATTT
GAACTGAAAGAAGGCTATATTCCGACCATTCAGATTAAAAAAAACCCGTTTTTTAAAGGCAACGAATATCTGAAAAACAGCGGCGT
GGAACCGGTGGAACTGTATCTGACCAACGTGGATCTGGAACTGATTCAGGAACATTATGAACTGTATAACGTGGAATATATTGATG
GCTTTAAATTTCGCGAAAAAACCGGCCTGTTTAAAGATTTTATTGATAAATGGACCTATGTGAAAACCCATGAAGAAGGCGCGAAA
AAACAGCTGGCGAAACTGATGCTGAACAGCCTGTATGGCAAATTTGCGAGCAACCCGGATGTGACCGGCAAAGTGCCGTATCTGA
AAGATGATGGCAGCCTGGGCTTTCGCGTGGGCGATGAAGAATATAAAGATCCGGTGTATACCCCGATGGGCGTGTTTATTACCGC
GTGGGCGCGCTTTACCACCATTACCGCGGCGCAGGCGTGCTATGATCGCATTATTTATTGCGATACCGATAGCATTCATCTGACCG
GCACCGAAGTGCCGGAAATTATTAAAGATATTGTGGATCCGAAAAAACTGGGCTATTGGGCGCATGAAAGCACCTTTAAACGCGC
GAAATATCTGCGCCAGAAAACCTATATTCAGGATATTTATGTGAAAGAAGTGGATGGCAAACTGAAAGAATGCAGCCCGGATGAA
GCGACCACCACCAAATTTAGCGTGAAATGCGCGGGCATGACCGATACCATTAAAAAAAAAGTGACCTTTGATAACTTTGCGGTGG
GCTTTAGCAGCATGGGCAAACCGAAACCGGTGCAGGTGAACGGCGGCGTGGTGCTGGTGGATAGCGTGTTTACCATTAAATAG
SEQ ID NO.15
ATGAGCCGCAAAATGTTTAGCTGCGATTTTGAAACCACCACCAAACTGGATGATTGCCGCGTGTGGGCGTATGGCTATATGGAAA
TTGGCAACCTGGATAACTATAAAATTGGCAACAGCCTGGATGAATTTATGCAGTGGGTGATGGAAATTCAGGCGGATCTGTATTTT
CATAACCTGAAATTTGATGGCGCGTTTATTGTGAACTGGCTGGAACAGCATGGCTTTAAATGGAGCAACGAAGGCCTGCCGAACA
CCTATAACACCATTATTAGCAAAATGGGCCAGTGGTATgaaATTGATATTTGCTTTGGCTATAAAGGCAAACGCAAACTGCATACC
GTGATTTATGATAGCCTGAAAAAACTGCCGTTTCCGGTGAAAAAAATTGCGAAAGATTTTCAGCTGCCGCTGCTGAAAGGCGATA
TTGATTATCATACCGAACGCCCGGTGGGCCATGAAATTACCCCGGAAGAATATGAATATATTAAAAACGATATTGAAATTATTGCG
CGCGCGCTGGATATTCAGTTTAAACAGGGCCTGGATCGCATGACCGCGGGCAGCGATAGCCTGAAAGGCTTTAAAGATATTCTGA
GCACCAAAAAATTTAACAAAGTGTTTCCGAAACTGAGCCTGaatATGGATAAAGAAATTCGCAAAGCGTATCGCGGCGGCTTTACC
TGGCTGAACGATAAATATAAAGAAAAAGAAATTGGCGAAGGCATGGTGTTTGATGTGAACAGCCTGTATCCGAGCCAGATGTATAG
CCGCCCGCTGCCGTATGGCGCGCCGATTGTGTTTCAGGGCAAATATGAAAAAGATGAACAGTATCCGCTGTATATTCAGCGCATT
CGCTTTGAATTTGAACTGAAAGAAGGCTATATTCCGACCATTCAGATTAAAAAAAACCCGTTTTTTAAAGGCAACGAATATCTGAA
AAACAGCGGCgctGAACCGGTGGAACTGTATCTGACCAACGTGGATCTGGAACTGATTCAGGAACATTATGAACTGTATAACGTG
GAATATATTGATGGCTTTAAATTTCGCGAAAAAACCGGCCTGTTTAAAGATTTTATTGATAAATGGACCTATGTGAAAACCCATGA
AGAAGGCGCGAAAAAACAGCTGGCGAAACTGATGCTGAACAGCCTGTATGGCAAATTTGCGAGCAACCCGGATGTGACCGGC
AAAGTGCCGTATCTGAAAGATGATGGCAGCCTGGGCTTTCGCGTGGGCGATGAAGAATATAAAGATCCGGTGTATACCCCGATG
GGCGTGTTTATTACCGCGTGGGCGCGCTTTACCACCATTACCGCGGCGCAGGCGTGCTATGATCGCATTATTTATTGCGATACCG
ATAGCATTCATCTGACCGGCACCGAAGTGCCGGAAATTATTAAAGATATTGTGGATCCGAAAAAACTGGGCTATTGGGCGCATG
AAAGCACCTTTAAACGCGCGAAATATCTGCGCCAGAAAACCTAgaaTCAGGATATTTATGTGAAAGAAGTGGATGGCAAACTGAA
AGAATGCAGCCCGGATGAAGCGACCACCACCAAATTTAGCGTGAAATGCGCGGGCATGACCGATACCATTAAAAAAAAAGTGAC
CTTTGATAACTTTGCGGTGGGCTTTAGCAGCATGGGCAAACCGAAACCGGTGCAGGTGAACGGCGGCGTGGTGCTGGTGGATAG
CGTGTTTACCATTAAATAG
SEQ ID NO.16
ATGAGCCGCAAAATGTTTAGCTGCGATTTTGAAACCACCACCAAACTGGATGATTGCCGCGTGTGGGCGTATGGCTATATGGAAA
TTGGCAACCTGGATAACTATAAAATTGGCAACAGCCTGGATGAATTTATGCAGTGGGTGATGGAAATTCAGGCGGATCTGTATTTT
CATAACCTGAAATTTGATGGCGCGTTTATTGTGAACTGGCTGGAACAGCATGGCTTTAAATGGAGCAACGAAGGCCTGCCGAACA
CCTATAACACCATTATTAGCAAAATGGGCCAGTGGTATgaaATTGATATTTGCTTTGGCTATAAAGGCAAACGCAAACTGCATACC
GTGATTTATGATAGCCTGAAAAAACTGCCGTTTCCGGTGAAAAAAATTGCGAAAGATTTTCAGCTGCCGCTGCTGAAAGGCGATAT
TGATTATCATACCGAACGCCCGGTGGGCCATGAAATTACCCCGGAAGAATATGAATATATTAAAAACGATATTGAAATTcttGCGC
GCGCGCTGGATATTCAGTTTAAACAGGGCCTGGATCGCATGACCGCGGGCAGCGATAGCCTGAAAGGCTTTAAAGATATTCTGA
GCACCAAAAAATTTAACAAAGTGTTTCCGAAACTGAGCCTGCCGATGGATAAAGAAATTCGCAAAGCGTATCGCGGCGGCTTTA
CCTGGCTGAACGATAAATATAAAGAAAAAGAAATTGGCGAAGGCtatGTGTTTGATGTGAACAGCCTGTATCCGAGCCAGATGTA
TAGCCGCCCGCTGCCGTATGGCGCGCCGATTGTGTTTCAGGGCAAATATGAAAAAGATGAACAGTATCCGCTGTATATTCAGCG
CATTCGCTTTGAATTTGAACTGAAAGAAGGCTATATTCCGACCATTCAGATTAAAAAAAACCCGTTTTTTAAAGGCAACGAATATC
TGAAAAACAGCGGCgctGAACCGGTGGAACTGTATCTGACCAACGTGGATCTGGAACTGATTCAGGAACATTATGAACTGTATAA
CGTGGAATATATTGATGGCTTTAAATTTCGCGAAAAAACCGGCCTGTTTAAAGATTTTATTGATAAATGGtatTATGTGAAAACCCA
TGAAGAAGGCGCGAAAAAACAGCTGGCGAAACTGATGCTGAACAGCCTGTATGGCAAATTTGCGAGCAACCCGGATGTGACCG
GCAAAGTGCCGTATCTGAAAGATGATGGCAGCCTGGGCTTTCGCGTGGGCGATGAAGAATATAAAGATCCGGTGTATACCCCGA
TGGGCGTGTTTATTACCGCGTGGGCGCGCTTTACCACCATTACCGCGGCGCAGGCGTGCTATGATCGCATTATTTATTGCGATAC
CGATAGCATTCATCTGACCGGCACCGAAGTGCCGGAAATTATTAAAGATATTGTGGATCCGAAAAAACTGGGCTATTGGGCGCAT
GAAAGCACCTTTAAACGCGCGAAATATCTGCGCCAGAAAACCTATATTCAGGATATTTATGTGAAAGAAGTGGATGGCAAACTGA
AAGAATGCAGCCCGGATGAAGCGACCACCACCAAATTTAGCGTGAAATGCGCGGGCATGACCGATACCATTAAAAAAAAAGTGA
CCTTTGATAACTTTGCGGTGGGCTTTAGCAGCATGGGCAAACCGAAACCGGTGCAGGTGAACGGCGGCGTGGTGCTGGTGGATA
GCGTGTTTACCATTAAATAG
SEQ ID NO.17
5’-TACCAGACGACGAcatATGAGCCGCAAAATGTTTAGC-3’
SEQ ID NO.18
5’-CTTCCATAGCCAAggatccCTATTTAATGGTAAACACG-3’
Claims (5)
1.一种热稳定性提高的 DNA 聚合酶突变体,其特征在于,所述 DNA 聚合酶突变体是在 SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列上进行突变,所述突变位点为I170L-V318A-M99E-M243Y-T365Y。
2.一种编码如权利要求1所述的热稳定性提高的DNA聚合酶突变体的基因。
3.一种包含如权利要求 2 所述的基因的重组质粒。
4.一种包含如权利要求1所述的热稳定性提高的DNA聚合酶突变体的可溶性蛋白、固定化酶或工程菌。
5.如权利要求1所述的热稳定性提高的DNA聚合酶突变体在单分子测序中的应用。
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