CN116355875B - 甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体及其在生产s-腺苷甲硫氨酸中的应用 - Google Patents
甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体及其在生产s-腺苷甲硫氨酸中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体及其在生产S‑腺苷甲硫氨酸中的应用。本发明通过对野生型甲硫氨酸腺苷基转移酶进行突变，获得了具有更高酶活性的突变体，且突变体能够减小产物抑制并提高SAM生成量。本发明有效解决了酶促合成法生产SAM过程中甲硫氨酸腺苷基转移酶酶活低、受产物抑制等问题，对SAM的规模化高产生产具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及酶催化技术领域，具体地说，涉及甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体及其在生产S-腺苷甲硫氨酸中的应用。
背景技术
S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是一种天然代谢产物，其在细胞代谢中起着至关重要的作用。SAM不仅是DNA、RNA、蛋白质、磷脂和脂肪酸合成的甲基供体，同时在转硫和多胺合成中发挥重要作用。临床上已成功应用于治疗肝病、骨关节炎和抑郁症等。近年来，有文献报道SAM还可以用于胰腺炎、阿尔兹海默症、偏头痛、肿瘤等多种疾病的治疗。
然而，由于SAM的产量远无法满足市场需求，导致了其价格居高不下，限制了其在医学领域的广泛应用。因此，开发一种高效、低成本的SAM生产方法至关重要。目前SAM的主要生产方法包括发酵法和酶促合成法。
发酵法是利用微生物发酵直接在细胞内合成SAM，该方法操作简单、易于控制、安全无污染，但存在着周期长、转化率低、副产物高等问题。
酶促合成法是在细胞外将底物L-甲硫氨酸和ATP通过甲硫氨酸腺苷基转移酶的催化直接生成SAM，具有周期短、成本低、转化率高、易于提纯等优势。同时，该方法所生成的产物大多数是具有生物活性的（S,S）-SAM，逐渐成为商业化生产的研究重点。
酶促合成法中SAM的生产主要受到甲硫氨酸腺苷基转移酶酶活力以及产物抑制的限制。研究表明，SAM可与甲硫氨酸腺苷基转移酶形成惰性的酶复合物，从而影响底物Ｌ⁃甲硫氨酸与ATP之间的相互作用（F. Takusagawa, S. Kamitori, S. Misaki, et al.,Crystal structure of S-adenosylmethionine synthetase, J. Biol. Chem. 271(1996) 136–147）。对甲苯磺酸钠的添加可改善甲硫氨酸腺苷基转移酶在产物积累过程中的反馈抑制（J. Park, J. Tai, C.A. Roessner, et al., Overcoming productinhibition of S-Adenosyl-Lmethionine (SAM) synthetase: preparation of SAM onthe 30 mM scale, Bioorg. Med. Chem. 5 (1995) 2203–2206）。但该方法需要添加高浓度的对甲苯磺酸钠（800 mM）以及过量的底物ATP。此外，可以通过酶固定化方法来提高SAM转化率。Niu等采用氨基树脂对大肠杆菌来源的甲硫氨酸腺苷基转移酶MetK进行固定化后，使得SAM的转化率可以达到95%（Niu, W.; Cao, S.; Yang, M.; Xu, L. EnzymaticSynthesis of S-Adenosylmethionine Using Immobilized MethionineAdenosyltransferase Variants on the 50-mM Scale. Catalysts 2017, 7, 238.https://doi.org/10.3390/catal7080238）。然而，酶固定化时所采用的固定化制剂多为有毒的化学试剂，这些试剂残留对人类健康有很大的影响。同时，固定化的酶必须经过酶的分离纯化步骤，操作繁琐。通过对SAM合成的关键酶，如甲硫氨酸腺苷基转移酶进行分子改造，提高酶活性、降低产物抑制，对提高SAM的产量具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体及其在生产S-腺苷甲硫氨酸中的应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体，所述突变体包含如下的氨基酸序列或由其组成：
1）来自大肠杆菌（Escherichia coli）甲硫氨酸腺苷基转移酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第67位氨基酸由E到A的突变（MetKE67A）；
2）来自大肠杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第80位氨基酸由H到A的突变（MetKH80A）；
3）来自大肠杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第98位氨基酸由K到A的突变（MetKK98A）；
4）来自大肠杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第257位氨基酸由R到A的突变（MetKR257A）；
5）来自大肠杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中包含上述1）-4）中的两种或两种以上突变；或
6）在1）-5）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列。
进一步地，所述突变体包含如下的氨基酸序列或由其组成：
a）来自大肠杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第67位氨基酸由E到A以及第80位氨基酸由H到A的突变（MetKE67A,H80A）；或在a）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；
b）来自大肠杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第67位氨基酸由E到A以及第98位氨基酸由K到A的突变（MetKE67A,K98A）；或在b）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；
c）来自大肠杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第67位氨基酸由E到A以及第257位氨基酸由R到A的突变（MetKE67A,R257A）；或在c）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；
d）来自大肠杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第80位氨基酸由H到A以及第98位氨基酸由K到A的突变（MetKH80A,K98A）；或在d）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；
e）来自大肠杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第80位氨基酸由H到A以及第257位氨基酸由R到A的突变（MetKH80A,R257A）；或在e）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；
f）来自大肠杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第98位氨基酸由K到A以及第257位氨基酸由R到A的突变（MetKK98A,R257A）；或在f）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；
g）来自大肠杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第67位氨基酸由E到A、第80位氨基酸由H到A以及第98位氨基酸由K到A的突变（MetKE67A,H80A,K98A）；或在g）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；
h）来自大肠杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第67位氨基酸由E到A、第80位氨基酸由H到A以及第257位氨基酸由R到A的突变（MetKE67A,H80A,R257A）；或在h）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；
i）来自大肠杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第67位氨基酸由E到A、第98位氨基酸由K到A以及第257位氨基酸由R到A的突变（MetKE67A,K98A,R257A）；或在i）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；
j）来自大肠杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第80位氨基酸由H到A、第98位氨基酸由K到A以及第257位氨基酸由R到A的突变（MetKH80A,K98A,R257A）；或在j）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；
k）来自大肠杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第67位氨基酸由E到A、第80位氨基酸由H到A、第98位氨基酸由K到A以及第257位氨基酸由R到A的突变（MetKE67A,H80A,K98A,R257A）；或在k）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供编码所述甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体的核酸分子。
第三方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
第四方面，本发明提供一种重组微生物，所述重组微生物是将编码所述甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体的核酸分子通过质粒导入大肠杆菌中或通过基因工程手段整合到大肠杆菌染色体上构建得到的。
第五方面，本发明提供所述甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体或所述生物材料或所述重组微生物在S-腺苷甲硫氨酸生产中的应用。
第六方面，本发明提供一种S-腺苷甲硫氨酸的合成方法，以ATP和L-甲硫氨酸为底物，使底物与所述突变体接触，酶促合成S-腺苷甲硫氨酸。
前述的方法，酶促反应体系中，所述ATP的浓度为20-30 mM，所述L-甲硫氨酸的浓度为20-30 mM，所述突变体采用表达所述甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体的重组大肠杆菌的细胞破碎液进行添加，添加量为每1L酶促反应体系中添加相当于10-40g湿菌体的量。
进一步地，所述酶促反应体系中还加入添加剂，所述添加剂可选自镁盐、钾盐、磺酸盐等中的至少一种。
在本发明的一个具体实施方式中，酶促反应体系如下：磷酸氢二钠50 mM、ATP25mM、L-甲硫氨酸25 mM、硫酸钾75 mM、氯化镁100 mM、对甲苯磺酸钠400 mM和表达所述甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体的重组大肠杆菌的细胞破碎液，所述细胞破碎液的添加量为每1L酶促反应体系中添加相当于10-40g湿菌体的量。
前述的方法，酶促反应条件为：30-37℃（优选35℃）、pH7.5-8.0。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明通过对野生型甲硫氨酸腺苷基转移酶进行突变并筛选，获得具有高酶活性的突变体MetKE67A、MetKK98A、MetKR257A、MetKE67A,H80A、MetKE67A,K98A、MetKE67A,R257A、MetKH80A,R257A、MetKK98A,R257A、MetKE67A,H80A,R257A、MetKE67A,K98A,R257A、MetKH80A,K98A,R257A，特别是突变体MetKE67A ,K98A,R257A酶活性是野生型甲硫氨酸腺苷基转移酶的7.7倍，上述突变体均能减小产物抑制并提高SAM生成量。本发明有效解决了酶促合成法生产SAM过程中甲硫氨酸腺苷基转移酶酶活低、受产物抑制等问题，对SAM的规模化高产生产具有重要意义。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体相对酶活比较。
图2为本发明较佳实施例中利用表达甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体的重组大肠杆菌粗酶液生产S-腺苷甲硫氨酸产量结果。
具体实施方式
为了解决现有的甲硫氨酸腺苷基转移酶酶活低，受产物抑制，不适用于SAM生产等缺陷，本发明提供一种甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体，在SEQ ID NO:1所示大肠杆菌野生型甲硫氨酸腺苷基转移酶的基础上，将第67位谷氨酸、第80位组氨酸、第98位赖氨酸和第257位精氨酸的任一种氨基酸进行取代得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO:1所示的甲硫氨酸腺苷基转移酶的基础上，进行了如下氨基酸位点的突变：
第67位谷氨酸突变为丙氨酸；
第80位组氨酸突变为丙氨酸；
第98位赖氨酸突变为丙氨酸；
第257位精氨酸突变为丙氨酸。
在本发明的另一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO:1的基础上，进行了如下氨基酸位点的多点突变：
第67位谷氨酸突变为丙氨酸，并将第80位组氨酸突变为丙氨酸；
第67位谷氨酸突变为丙氨酸，并将第98位赖氨酸突变为丙氨酸；
第67位谷氨酸突变为丙氨酸，并将第257位精氨酸突变为丙氨酸；
第80位组氨酸突变为丙氨酸，并将第98位赖氨酸突变为丙氨酸；
第80位色氨酸突变为丙氨酸，并将第257位精氨酸突变为丙氨酸；
第98位赖氨酸突变为丙氨酸，并将第257位精氨酸突变为丙氨酸；
第67位谷氨酸突变为丙氨酸，并将第80位组氨酸突变为丙氨酸，第98位赖氨酸突变为丙氨酸；
第67位谷氨酸突变为丙氨酸，并将第80位组氨酸突变为丙氨酸，第257位精氨酸突变为丙氨酸；
第67位谷氨酸突变为丙氨酸，并将第98位赖氨酸突变为丙氨酸，第257位精氨酸突变为丙氨酸；
第80位组氨酸突变为丙氨酸，并将第98位赖氨酸突变为丙氨酸，第257位精氨酸突变为丙氨酸；
第67位谷氨酸突变为丙氨酸，并将第80位组氨酸突变为丙氨酸，第98位赖氨酸突变为丙氨酸，第257位精氨酸突变为丙氨酸。
本发明还提供编码所述突变体的基因。
本发明还提供含有编码所属突变体基因的载体。
本发明还提供表达所述甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体的重组微生物。
本发明还提供利用所述甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体生产SAM的方法。
在本发明的一种实施方式中，所述重组微生物细胞以大肠杆菌为宿主细胞，在该重组细胞中表达了甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体。
在本发明的一种实施方式中，培养表达甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体的重组大肠杆菌，高压破碎重组细胞后获得反应酶液，加入反应液中进行反应。所述反应液组成为：磷酸氢二钠50 mM、ATP 25mM、L-甲硫氨酸25 mM、硫酸钾75 mM、氯化镁100 mM、对甲苯磺酸钠400 mM和表达所述甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体的重组大肠杆菌的细胞破碎液，所述细胞破碎液的添加量为每1L酶促反应体系中添加相当于10-40g湿菌体的量。反应条件为：35℃、pH7.5-8.0。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1 甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体的构建
以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，上游引物为：5’- CAGGAGGAATTAACCATGGCAAAACACCTTTTTACGTC -3'，下游引物为：5’- GTGGTGGTGGTGGTGCTTCAGACCGGCAGCATCGCGCAG-3'，进行PCR扩增，得到MetK基因，序列如SEQ ID NO:2所示，将其连接到pET28b载体上，获得载体pET28b-MetK。
以载体pET28b-MetK为模板，使用突变引物对（表1）对MetK基因进行相应位点突变，PCR扩增产物用Dpn I酶切2h后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行测序鉴定。将含有突变体基因的质粒转入大肠杆菌BL21（DE3），获得突变体重组菌株MetKE67A、MetKH80A、MetKK98A、MetKR257A、MetKE67A,H80A、MetKE67A,K98A、MetKE67A,R257A、MetKH80A,K98A、MetKH80A ,R257A、MetKK98A,R257A、MetKE67A,H80A,K98A、MetKE67A,H80A,R257A、MetKE67A,K98A,R257A、MetKH80A,K98A,R257A、MetKE67A,H80A,K98A,R257A。
表1 MetK基因定点突变引物
实施例2 甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体酶活及产物抑制的测试
1、重组蛋白诱导表达
将实施例1构建的突变体重组菌株，在LB培养基中，于37℃下振荡培养,当菌液浓度达到OD600为1.0时，加入终浓度为0.4 mM的IPTG进行诱导，25℃培养20h后收集菌体。
2、重组蛋白Ni-NTA纯化
加入无菌水重悬离心收集到的菌体并于4℃离心除去上清，重复2次。加入裂解缓冲液（50mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH8.0）充分悬浮菌体。低温超高压破碎菌体细胞，4℃离心收集上清。采用HisTrap镍柱通过AKTA蛋白纯化仪进行蛋白纯化。将样品加载到HisTrap镍柱中，用缓冲液A（20 mM Tris-HCl pH8.0，500 mM NaCl，5%甘油，30 mM咪唑）进行平衡，再用缓冲液B（20 mM Tris-HCl pH8.0，500 mM NaCl，5%甘油，600 mM咪唑）进行梯度洗脱，并通过检测UV 280nm收集洗脱浓度为40-100%缓冲液B的洗脱峰。纯化后的蛋白用转移至截留分子量为10kDa的超滤管中浓缩并将缓冲液置换为缓冲液C（20 mM Tris-HCl pH8.0，500mM NaCl，10%甘油，1 mM DTT）。
3、甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体酶活测试
突变体蛋白用Ni-NTA纯化后测定酶活。反应液组成为：Tris-HCl 100 mM、ATP 25mM、L-甲硫氨酸35 mM、硫酸钾75 mM、氯化镁50 mM、对甲苯磺酸钠400 mM，pH 7.5。将75 μg纯化后的突变体蛋白加入到200 μL上述反应液中，于35℃反应10 min，用100 μL 1M HCl终止反应。样品用HPLC检测并测定突变体酶活。
结果如图1所示，与野生型甲硫氨酸腺苷基转移酶相比，突变体MetKE67A、MetKK98A、MetKR257A、MetKE67A,H80A、MetKE67A,K98A、MetKE67A,R257A、MetKH80A,R257A、MetKK98A,R257A、MetKE67A ,H80A,R257A、MetKE67A,K98A,R257A、MetKH80A,K98A,R257A，在该条件下具有较高酶活，其中，MetKE67A ,K98A,R257A是野生型的7.7倍，是突变体MetKI303V（即SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第303位氨基酸由异亮氨酸到缬氨酸的突变）的3.1倍。
4、甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体产物抑制测试
突变体蛋白用Ni-NTA纯化后测定酶活。反应液组成为：Tris-HCl 100 mM、ATP 25mM、L-甲硫氨酸0-25mM、硫酸钾75 mM、氯化镁50 mM、对甲苯磺酸钠400 mM，pH 7.5。其中L-甲硫氨酸浓度为0、1、5、10、20、25mM，将300 μg纯化后的突变体蛋白分别加入到200 μL上述反应液中，于35℃、1000 rpm反应4 h，用100 μL 1M HCl终止反应。样品用HPLC检测SAM生成量。
结果如表2所示，野生型在生成SAM 达到5mM左右时会出现产物抑制，不再随着底物L-甲硫氨酸浓度的增加而增加。与野生型甲硫氨酸腺苷基转移酶相比，突变体MetKE67A、MetKK98A、MetKE67A,K98A、MetKE67A,R257A、MetKK98A,R257A、MetKE67A,H80A,R257A、MetKE67A,K98A,R257A、MetKH80A,K98A,R257A，均能减小产物抑制并提高SAM生成量。其中，MetKE67A,K98A,R257A在生成SAM的含量达20mM以上时，才会出现产物抑制。而突变体MetKI303V产物抑制浓度为12 mM左右。
表2 不同L-甲硫氨酸添加量下SAM转化情况（mM）
实施例3 利用表达甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体的重组大肠杆菌粗酶液生产S-腺苷甲硫氨酸
将突变体菌株MetKK98A、MetKE67A,K98A、MetKE67A,K98A,R257A在LB培养基中，于37℃下振荡培养，当菌液浓度达到OD600为1.0时，加入终浓度为0.4 mM的IPTG进行诱导。25℃培养20h后，高压破碎重组细胞培养物后获得含有所述甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体的细胞破碎液（粗酶液），加入到反应液中。所述反应液组成为：磷酸氢二钠50 mM、ATP25mM、L-甲硫氨酸25mM、硫酸钾75 mM、氯化镁100 mM、对甲苯磺酸钠400 mM、表达上述甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体的重组大肠杆菌的细胞破碎液，所述细胞破碎液的添加量为每1L酶促反应体系中添加相当于25g湿菌体的量，总反应体积为2L，于5L生物反应器进行，35℃反应，用10 M NaOH调节pH维持在7.5。检测4h内SAM生成情况，分别取30 min，60 min，120 min，180 min，240 min反应液，用1 M盐酸终止反应。结果如图2所示，反应3h，采用突变体MetKE67A,K98A,R257A的反应，SAM产量最高可达23 mM，转化率为92%。采用突变体MetKK98A以及MetKE67A,K98A的反应，SAM产量最高分别可达14 mM和16mM。
本发明通过对野生型甲硫氨酸腺苷基转移酶进行突变并筛选，获得具有高酶活性的突变体MetKE67A、MetKK98A、MetKR257A、MetKE67A,H80A、MetKE67A,K98A、MetKE67A,R257A、MetKH80A,R257A、MetKK98A,R257A、MetKE67A,H80A,R257A、MetKE67A,K98A,R257A、MetKH80A,K98A,R257A，特别是突变体MetKE67A ,K98A,R257A酶活性是野生型甲硫氨酸腺苷基转移酶的7.7倍。
进一步地，为解决现有甲硫氨酸腺苷基转移酶在实际生产中受产物抑制而导致的产量低的问题，对上述获得的高酶活性的突变体进行进一步产物抑制筛测试，筛选出突变体MetKE67A、MetKK98A、MetKE67A,K98A、MetKE67A,R257A、MetKK98A,R257A、MetKE67A,H80A,R257A、MetKE67A ,K98A,R257A、MetKH80A,K98A,R257A，均能减小产物抑制并提高SAM生成量。其中，MetKE67A,K98A,R257A在生成SAM的含量达20mM以上时，才会出现产物抑制。
本发明有效解决了酶促合成法生产SAM过程中甲硫氨酸腺苷基转移酶酶活低、受产物抑制等问题，对SAM的规模化高产生产具有重要意义。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如下：
1）将来自大肠杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第98位氨基酸由K突变到A得到的氨基酸序列；或在1）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；
2）将来自大肠杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第67位氨基酸由E突变到A以及第98位氨基酸由K突变到A得到的氨基酸序列；或在2）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；
3）将来自大肠杆菌甲硫氨酸腺苷基转移酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第67位氨基酸由E突变到A、第98位氨基酸由K突变到A以及第257位氨基酸由R突变到A得到的氨基酸序列；或在3）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述突变体的核酸分子。
3.含有权利要求2所述核酸分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
4.重组微生物，其特征在于，所述重组微生物是将权利要求2所述核酸分子通过质粒导入大肠杆菌中或通过基因工程手段整合到大肠杆菌染色体上构建得到的。
5.权利要求1所述突变体或权利要求3所述生物材料或权利要求4所述重组微生物在S-腺苷甲硫氨酸生产中的应用。
6.S-腺苷甲硫氨酸的合成方法，其特征在于，以ATP和L-甲硫氨酸为底物，使底物与权利要求1所述突变体接触，酶促合成S-腺苷甲硫氨酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，酶促反应体系中，所述ATP的浓度为20-30mM，所述L-甲硫氨酸的浓度为20-30 mM，所述突变体采用表达所述甲硫氨酸腺苷基转移酶突变体的重组大肠杆菌的细胞破碎液进行添加，添加量为每1L酶促反应体系中添加10-40g湿菌体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述酶促反应体系中还加入添加剂，所述添加剂选自镁盐、钾盐、磺酸盐中的至少一种。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，酶促反应条件为：30-37℃、pH7.5-8.0。
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
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