CN110144336A

CN110144336A - 一种s-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体及其制备方法

Info

Publication number: CN110144336A
Application number: CN201910436026.3A
Authority: CN
Inventors: 林建平; 王秀; 朱力; 蒋亦琪; 孙志娇; 吴绵斌; 杨立荣
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-05-23
Filing date: 2019-05-23
Publication date: 2019-08-20
Anticipated expiration: 2039-05-23
Also published as: CN110144336B

Abstract

本发明公开了一种S‑腺苷甲硫氨酸合成酶突变体及其制备方法，该突变体是将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第65位、第104位、第186位进行单点、双点或三点突变而获得。与野生型S‑腺苷甲硫氨酸合成酶相比，该突变体在10mM底物反应体系中SAM最终积累量增加1.06mM。同时，该突变体比酶活相比于野生型eMAT增加3.3倍，为6.02±0.22U/mg。这进一步为SAM的酶法制备提供了可能性，也为分子改造改善酶的产物抑制现象提供了思路。

Description

一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种催化活性提高且产物抑制降低的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体及其制备方法，属于基因工程领域。

背景技术

S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是一种重要的生理活性物质，参与生物体内转甲基、转硫基、转氨丙基等多种生化反应。临床上，SAM对治疗肝炎、抑郁症、关节炎等具有显著的治疗效果，因此市场需求量巨大。

目前，SAM主要通过微生物发酵法生产，但该法存在生产周期长、底物转化率低、提取过程复杂、产物易发生自消旋等问题。相比较而言，酶催化法具有反应时间短、立体选择性高、提纯过程较简单等特点。

S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethioninesynthetase，简称MAT，EC2.5.6.1)，催化ATP和L-甲硫氨酸生成SAM，同时生成副产物正磷酸和焦磷酸。通过比较不同来源MAT的酶学性质，我们发现来源于大肠杆菌的MAT(eMAT)具有蛋白表达量较高、比酶活较高、K_m较小等优势。但该酶也存在严重的产物抑制现象，导致酶催化效率低，SAM无法有效积累。虽然加入高浓度对甲苯磺酸钠能够克服产物抑制，但SAM对甲苯磺酸钠成品作为药物时存在生物利用率低的问题。因此，通过酶的分子改造而非加入对甲苯磺酸钠来降低eMAT的产物抑制现象在酶法制备SAM中具有重要意义。

目前，已有一些通过分子改造改善MAT催化性能的报道。Dippe等对来源于枯草芽孢杆菌的MAT进行理性设计时发现，将317位异亮氨酸突变为缬氨酸时能增加MAT的催化活性，同时降低产物抑制现象(Chem.Commum(Camb).51(2015)3637-3640)(USPatent20160264945A1)。以此为基础，Yin等对来源于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的MAT进行同源序列对比后，将eMAT的303位异亮氨酸突变为缬氨酸，eMAT的酶活和产物抑制现象均有所改善(Molecules 22(2017)1365-1377)。另外，Hu等人利用DNA shuffling技术对来源于大肠杆菌、酿酒酵母和壮观链霉菌的MAT基因进行重组，获得两株酶活提高、SAM积累量也增加的菌株GS115/DS56和GS115/DS16，并对突变株进行了序列分析(表1)(J.Biotechnol.141(2009)97-103)。其中，GS115/DS56 MAT氨基酸序列与酿酒酵母SAM2(酿酒酵母MAT的特称)氨基酸序列同源率为99％，GS115/DS16 MAT氨基酸序列与壮观链霉菌MAT(sMAT)序列同源率为98％。将原核生物和真核生物的MAT氨基酸序列进行比对发现，MAT属于高保守型蛋白家族，尤其是活性中心的位点。因此，可以通过定点突变和半理性设计对eMAT进行分子改造。

表1 pDS56和pDS16的突变位点

发明内容

本发明的目的是提供一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体、编码基因、重组载体、重组菌以及其在酶法制备SAM中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第65位、第104位、第186位进行突变获得。

进一步，先将303位异亮氨酸突变为缬氨酸(I303V),再在单点突变的基础上将65位异亮氨酸突变为缬氨酸(I303V/I65V),接着在两点突变的基础上将186位亮氨酸突变为缬氨酸(I303V/I65V/L186V),最后在三点突变的基础上将104位天冬酰胺突变为赖氨酸(I303V/I65V/L186V/N104K)。

更进一步，所述突变体氨基酸序列为下列之一：SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQID NO.4。

本发明还涉及一种编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的基因。

本发明还涉及一种携带所述基因的重组载体。

本发明还涉及一种由重组载体转化制备的重组菌。

本发明提供一种所述S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体在酶法合成SAM中的应用。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

本发明构建了一种高效表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的重组大肠杆菌；该重组大肠杆菌表达的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体比酶活比野生型eMAT提高3.31倍，为6.02±0.22U/mg；在10mM底物反应体系中，该突变体可以使SAM最终积累量为2.68mM，而野生型eMATSAM积累量仅为1.62mM。

附图说明

图1metK基因片段核酸电泳图，1泳道为DNA Maker，2泳道为metK基因PCR扩增产物。

图2 E.coli K12来源MAT与文献报道MAT氨基酸序列比对结果。

图3野生型重组菌SDS-PAGE电泳图，泳道1为蛋白Maker，泳道2为全细胞破胞蛋白，泳道3为破胞液上清蛋白，泳道4为破胞液沉淀蛋白。

图4 S-腺苷甲硫氨酸合成酶eMAT野生型与突变体在不同底物浓度下SAM积累量变化曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行描述，但本发明的保护范围并非仅限于此：

实施例1：S-腺苷甲硫氨酸合成酶重组菌的构建

选取Escherichia coli K12来源的S-腺苷甲硫氨酸合成酶，利用PCR技术，以E.coli K12基因组为模板，以metK-F:5’-GATCCGAATTCATGGCAAAACACCTTTTTACG-3’(SEQ IDNO.5)和metK-R:5’-GTGCTCGAGTTACTTCAGACCGGCAGCAT(SEQ ID NO.6)为引物，对metK基因进行扩增，并在其5’端和3’端分别引入EcoR I和Xho I限制性内切酶酶切位点(下划线标出)。PCR反应体系(50μL)为：2×PrimeSTAR Max Premix 25μL，模板DNA1μL，上下游引物各1μL，无菌水22μL。PCR反应条件为：98℃预变性5min；98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸10s，循环30次；72℃延伸5min。以1％琼脂糖凝胶电泳验证PCR扩增产物，当目的条带大小符合编码SEQ ID NO.1大小时(图1)，用PCR产物回收试剂和进行产物回收。将纯化后的PCR产物和质粒pET-28a(+)分别同时用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行双酶切反应。酶切结束后，将酶切产物进行大孔琼脂糖凝胶电泳，并从核酸胶上切下正确的条带用于DNA胶回收。回收后的片段测定浓度后按照摩尔比3：1(目的基因：质粒)进行酶连反应。接着，通过热激法将酶连产物转入到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-metK。

实施例2：S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的单点突变

将实施例1中的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-metK培养过夜后提取重组质粒pET-28a(+)-metK，并以其为模板，对303位进行定点突变。定点突变用FastMutagenesis system试剂盒，以I303V-F:5’-TCAGGTTTCCTACGCAGTCGGCGTGGC-3’(SEQ IDNO.7)和I303V-R:5’-CCAGAAGGCACTTTCTCAGTACCGAAAG-3’(SEQ ID NO.8)为引物，进行全质粒PCR扩增(94℃ 5min；94℃20s，60℃20s，72℃60s，循环30次；72℃ 10min)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证后用限制酶DpnI对模板进行消化，再通过热激法将消化后的产物转入到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，获得单点突变重组菌。单点突变氨基酸序列为SEQ IDNO.1。

实施例3：S-腺苷甲硫氨酸合成酶两点突变的构建

将eMAT与SAM2、sMAT氨基酸序列进行同源比对，找到eMAT与pDS16和pDS56中对应的突变位点，确定可以突变的点有：K18R，L31P，I65V，E324G，L329V(图2，三角形标出)。以突变体I303V编码基因为模板，以K18R-F:5’-TCTGAAGGGCATCCTGACAGAATTGCTGAC-3’(SEQ IDNO.9)和K18R-R:5’-CTGTCAGGATGCCCTTCAGAGACGGAC-3’(SEQ ID NO.10)；I31P-F:5’-TGATGCCGTTTTAGACGCGCCCCTCGAACAG-3’(SEQ ID NO.11)和I31P-R:5’-GGCGCGTCTAAAACGGCATCAGAAATTTGG-3’(SEQ ID NO.12)；I65V-F:5’-ACCAGCGCCTGGGTAGACGTCGAAGAGATC-3’(SEQ ID NO.13)和I65V-R:5’-CGTCTACCCAGGCGCTGGTGGTGATTTCG-3’(SEQ ID NO.14)；E324G-F:5’-TACTGAGAAAGTGCCTTCTGGACAACTGACC-3’(SEQ ID NO.15)和E324G-R:5’-CCAGAAGGCACTTTCTCAGTACCGAAAG-3’(SEQ ID NO.16)；L329V-F:5’-TTCTGAACAACTGACCCTGGTGGTACGTGAG-3’(SEQ ID NO.17)和L329V-R:5’-CCAGGGTCAGTTGTTCAGAAGGCACTTT-3’(SEQ ID NO.18)为引物，用FAST MUTAGENESIS system试剂盒对这些位点进行全质粒PCR。PCR产物经限制酶DpnI消化后，再通过热激法将产物转入到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，获得两点突变重组菌。将所有两点突变重组菌诱导表达、纯化后，测定比酶活和不同浓度L-甲硫氨酸下SAM积累量，发现只有突变体I303V/I65V SAM积累量增加。突变体I303V/I65V氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

实施例3：S-腺苷甲硫氨酸合成酶三点突变的构建

MAT属于氨基酸序列高度保守的蛋白家族，尤其是对于活性中心的位点。在实施例2中进行氨基酸序列比对时，发现不仅活性中心的位点高度保守，与活性中心相邻的位点也具有较高的保守性，除了第104位，第165位，第186位，第188位和第240位(图2，圆形标出)。据报道，SAM2在低底物浓度下没有产物抑制。因此，我们推测这些位点可能与产物抑制现象的改善有关，并以突变体I303V/I65V编码基因为模板通过定点突变将它们对应突变为：104A，165T，186I/V，188A和240A。通过检测突变后的比酶活和不同底物浓度下SAM的积累量发现，只有突变体I303V/I65V/L186V能够使酶活和SAM积累量同时提高。突变体I303V/I65V/L186V氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

实施例4：S-腺苷甲硫氨酸合成酶四点突变的构建

在对实施例3中的突变体进行酶活和不同底物浓度下SAM的积累量时发现，突变体I303V/I65V/N104A比酶活相比于突变体I303V/I65V提高1.3倍，但SAM积累量严重下降。考虑到该位点位于与产物和底物进出相关的柔性Loop上，可能与SAM的释放相关，因此以突变体I303V/I65V/L186V编码基因为模板对104位进行饱和突变。定点饱和突变以N104-F:5’-CAAACAGTCTCCTGACATCNNKCAGGGCGTTG-3’(SEQ ID NO.19)和N104-R:5’-MNNGATGTCAGGAGACTGTTTGCCGATAGCGC-3’(SEQ ID NO.20)为引物，用Fast Mutagenesis system试剂盒。

构建突变体库后，从突变体库随机挑选单菌落进行高通量筛选。即将突变体库(重组菌转化平板)的单菌落挑入到含有300μL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)的96孔浅孔板中，37℃、220rpm培养8h。用移液器吸取50μL浅孔板中的菌液到对应的装有600μL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)的96孔深孔板中，37℃、220rpm培养2h，向每个孔中加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃、220rpm诱导培养12h。室温下4000×g离心10min，去培养基。用100mMTris-HCl(pH 8.0)重悬菌体，静置5-10min后，再次重悬3-5次，取最后一次重悬的菌液2μL加入装有98μL预混液(100mMTris-HCl，1mM ATP，1mM L-甲硫氨酸，1mM SAM，20mMMgCl₂，150mMKCl，pH 8.0)的96孔酶标板中，混匀，37℃反应5min。反应结束后，向酶标板中加入100μL显色液(将用5M盐酸配制的34mM(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O和2.16mM草酸孔雀绿以体积比3：1的比例混匀、过滤而来)，静置3min后，于620nm处测量吸光值。通过对比突变子与野生型重组菌反应后吸光值的大小，从酶标板上挑选出吸光值明显增加的2-3个位点，从浅孔板中找到对应的菌进行复筛，最终得到1个酶活明显提高、SAM积累量略有下降的突变体I303V/I65V/L186V/N104K。突变体I303V/I65V/L186V/N10K氨基酸序列为SEQ ID NO.4。

实施例5：S-腺苷甲硫氨酸合成酶野生型和突变体的诱导表达

将野生型重组菌和突变体重组菌分别加入到5mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基(1％蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母提取物，pH 7.0)中，37℃、220rpm培养8-12h。再按2％的接种量，转接1mL至50mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中。待菌体浓度(OD₆₀₀)达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃、220rpm培养12h。4℃、6000×g离心10min收集菌体，100mMTris-HCl离心重悬3次后，用裂解液(100mMTris-HCl，300mMNaCl，10mM咪唑，5％甘油，pH 8.0)将菌体重悬，使OD₆₀₀浓缩为8。接着，将重悬的菌体置于冰水浴中超声破胞，4℃、12000×g离心10min，分别取全细胞破胞液、破胞上清液和破胞沉淀重悬液进行SDS-PAGE电泳分析(图3)。

取破胞液上清上样至Ni-NTA亲和柱(购于上海生工生物工程技术服务有限公司)，用裂解液平衡柱成分，用洗杂液(100mMTris-HCl，300mMNaCl，50mM咪唑，5％甘油，pH 8.0)洗去杂质，用洗脱液(100mMTris-HCl，300mMNaCl，250mM咪唑，5％甘油，pH 8.0)洗脱目的蛋白，获得纯酶液。

实施例6：S-腺苷甲硫氨酸合成酶野生型和突变体不同底物浓度下SAM积累量的测定

产物抑制现象具体可表现为在一定底物浓度下，即使延长反应时间，底物也不能完全转化，因此测定不同浓度L-甲硫氨酸情况下SAM的积累量变化。

SAM积累量的反应体系为：总体积为0.4mL的预混液含有100mMTris-HCl(pH 8.0)、10mM ATP、0.2-10mM L-甲硫氨酸、20mMMgCl₂和150mMKCl，加入0.1mL纯酶液。为了使反应充分进行，于37℃、200rpm恒温反应4h。反应结束后，用0.25mL 20％的高氯酸溶液终止酶反应。4℃、13000rpm离心10min后，用高效液相色谱法测SAM浓度(图4)。

实施例7：S-腺苷甲硫氨酸合成酶野生型和突变体的比酶活测定

酶活的测定方法：总体积为480μL的预混液中含有100mMTris-HCl(pH 8.0)、5mMATP、5mM L-甲硫氨酸、20mM MgCl₂，150mMKCl，加入20μL纯酶液，37℃、400rpm金属浴反应5min。用0.25mL 20％的高氯酸溶液终止酶反应。4℃、13000rpm离心10min后，用高效液相色谱法测SAM浓度。1个单位酶活(1U)被定义为每分钟转化生成1μmol SAM的酶量。

高效液相色谱法：采用Hypersil BDS C18(250×4.6mm,5μm)色谱柱，以40mM磷酸二氢铵、2mM庚烷磺酸钠和18％(v/v)甲醇水溶液(pH 3.0)为流动相，流动相流速为0.8mL/min，进样量为10μL，在254nm波长下检测SAM出峰面积。

用Pierce^TM BCA Protein Assay Kit微孔板法测量蛋白质浓度后，计算野生型和突变体S-腺苷甲硫氨酸合成酶的比酶活，结果见表2。比酶活＝酶活/蛋白含量(U/mg)。突变体I303V/I65V/L186V/N104K相比于野生型eMAT比酶活提高3.3倍。

表2 S-腺苷甲硫氨酸合成酶野生型及其突变体酶活力

实施例8：S-腺苷甲硫氨酸合成酶野生型和突变体的动力学参数测定

eMAT催化ATP和L-甲硫氨酸转化生成SAM是按照双底物反应机制中的序列机制进行。序列机制的动力学方程为：

在测量K_m过程，首先将L-甲硫氨酸浓度固定在0.15-0.6mM范围下的某一浓度，测定0-0.2mM ATP的反应速率。再将ATP浓度固定在0.15-0.6mM范围下的某一浓度，测定0-0.2mM L-甲硫氨酸的反应速率。最后根据序列机制Lineweaver-Burk作图法求出K_m。

于eMAT而言，SAM是底物ATP的竞争性抑制剂，竞争性抑制的方程为：

SAM是底物L-甲硫氨酸的非竞争性抑制剂，非竞争性抑制的方程为：

在测量K_i过程中，先固定SAM和L-甲硫氨酸的浓度，测量0-0.2mM ATP的反应速率。再固定SAM和ATP的浓度，测量0-0.2mM ATP的反应速率。最后根据双倒数作图法得到竞争性抑制曲线和非竞争性抑制曲线，从而获得K_i。动力学参数见表3。

表3 S-腺苷甲硫氨酸合成酶野生型和突变体的动力学参数

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体及其制备方法

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 384

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Lys His Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Ser Glu Gly His Pro

1 5 10 15

Asp Lys Ile Ala Asp Gln Ile Ser Asp Ala Val Leu Asp Ala Ile Leu

20 25 30

Glu Gln Asp Pro Lys Ala Arg Val Ala Cys Glu Thr Tyr Val Lys Thr

35 40 45

Gly Met Val Leu Val Gly Gly Glu Ile Thr Thr Ser Ala Trp Val Asp

50 55 60

Ile Glu Glu Ile Thr Arg Asn Thr Val Arg Glu Ile Gly Tyr Val His

65 70 75 80

Ser Asp Met Gly Phe Asp Ala Asn Ser Cys Ala Val Leu Ser Ala Ile

85 90 95

Gly Lys Gln Ser Pro Asp Ile Asn Gln Gly Val Asp Arg Ala Asp Pro

100 105 110

Leu Glu Gln Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr

115 120 125

Asn Glu Thr Asp Val Leu Met Pro Ala Pro Ile Thr Tyr Ala His Arg

130 135 140

Leu Val Gln Arg Gln Ala Glu Val Arg Lys Asn Gly Thr Leu Pro Trp

145 150 155 160

Leu Arg Pro Asp Ala Lys Ser Gln Val Thr Phe Gln Tyr Asp Asp Gly

165 170 175

Lys Ile Val Gly Ile Asp Ala Val Val Leu Ser Thr Gln His Ser Glu

180 185 190

Glu Ile Asp Gln Lys Ser Leu Gln Glu Ala Val Met Glu Glu Ile Ile

195 200 205

Lys Pro Ile Leu Pro Ala Glu Trp Leu Thr Ser Ala Thr Lys Phe Phe

210 215 220

Ile Asn Pro Thr Gly Arg Phe Val Ile Gly Gly Pro Met Gly Asp Cys

225 230 235 240

Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr Gly Gly Met Ala

245 250 255

Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser Lys Val Asp

260 265 270

Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Tyr Val Ala Lys Asn Ile Val Ala

275 280 285

Ala Gly Leu Ala Asp Arg Cys Glu Ile Gln Val Ser Tyr Ala Val Gly

290 295 300

Val Ala Glu Pro Thr Ser Ile Met Val Glu Thr Phe Gly Thr Glu Lys

305 310 315 320

Val Pro Ser Glu Gln Leu Thr Leu Leu Val Arg Glu Phe Phe Asp Leu

325 330 335

Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Gln Met Leu Asp Leu Leu His Pro Ile Tyr

340 345 350

Lys Glu Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg Glu His Phe Pro Trp

355 360 365

Glu Lys Thr Asp Lys Ala Gln Leu Leu Arg Asp Ala Ala Gly Leu Lys

370 375 380

<210> 2

<211> 384

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<211> 384

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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1 5 10 15

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Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser Lys Val Asp

260 265 270

Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Tyr Val Ala Lys Asn Ile Val Ala

275 280 285

Ala Gly Leu Ala Asp Arg Cys Glu Ile Gln Val Ser Tyr Ala Val Gly

290 295 300

Val Ala Glu Pro Thr Ser Ile Met Val Glu Thr Phe Gly Thr Glu Lys

305 310 315 320

Val Pro Ser Glu Gln Leu Thr Leu Leu Val Arg Glu Phe Phe Asp Leu

325 330 335

Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Gln Met Leu Asp Leu Leu His Pro Ile Tyr

340 345 350

Lys Glu Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg Glu His Phe Pro Trp

355 360 365

Glu Lys Thr Asp Lys Ala Gln Leu Leu Arg Asp Ala Ala Gly Leu Lys

370 375 380

<210> 4

<211> 384

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Lys His Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Ser Glu Gly His Pro

1 5 10 15

Asp Lys Ile Ala Asp Gln Ile Ser Asp Ala Val Leu Asp Ala Ile Leu

20 25 30

Glu Gln Asp Pro Lys Ala Arg Val Ala Cys Glu Thr Tyr Val Lys Thr

35 40 45

Gly Met Val Leu Val Gly Gly Glu Ile Thr Thr Ser Ala Trp Val Asp

50 55 60

Val Glu Glu Ile Thr Arg Asn Thr Val Arg Glu Ile Gly Tyr Val His

65 70 75 80

Ser Asp Met Gly Phe Asp Ala Asn Ser Cys Ala Val Leu Ser Ala Ile

85 90 95

Gly Lys Gln Ser Pro Asp Ile Lys Gln Gly Val Asp Arg Ala Asp Pro

100 105 110

Leu Glu Gln Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr

115 120 125

Asn Glu Thr Asp Val Leu Met Pro Ala Pro Ile Thr Tyr Ala His Arg

130 135 140

Leu Val Gln Arg Gln Ala Glu Val Arg Lys Asn Gly Thr Leu Pro Trp

145 150 155 160

Leu Arg Pro Asp Ala Lys Ser Gln Val Thr Phe Gln Tyr Asp Asp Gly

165 170 175

Lys Ile Val Gly Ile Asp Ala Val Val Val Ser Thr Gln His Ser Glu

180 185 190

Glu Ile Asp Gln Lys Ser Leu Gln Glu Ala Val Met Glu Glu Ile Ile

195 200 205

Lys Pro Ile Leu Pro Ala Glu Trp Leu Thr Ser Ala Thr Lys Phe Phe

210 215 220

Ile Asn Pro Thr Gly Arg Phe Val Ile Gly Gly Pro Met Gly Asp Cys

225 230 235 240

Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr Gly Gly Met Ala

245 250 255

Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser Lys Val Asp

260 265 270

Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Tyr Val Ala Lys Asn Ile Val Ala

275 280 285

Ala Gly Leu Ala Asp Arg Cys Glu Ile Gln Val Ser Tyr Ala Val Gly

290 295 300

Val Ala Glu Pro Thr Ser Ile Met Val Glu Thr Phe Gly Thr Glu Lys

305 310 315 320

Val Pro Ser Glu Gln Leu Thr Leu Leu Val Arg Glu Phe Phe Asp Leu

325 330 335

Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Gln Met Leu Asp Leu Leu His Pro Ile Tyr

340 345 350

Lys Glu Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg Glu His Phe Pro Trp

355 360 365

Glu Lys Thr Asp Lys Ala Gln Leu Leu Arg Asp Ala Ala Gly Leu Lys

370 375 380

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatccgaatt catggcaaaa caccttttta cg 32

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtgctcgagt tacttcagac cggcagcat 29

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcaggtttcc tacgcagtcg gcgtggc 27

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccagaaggca ctttctcagt accgaaag 28

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tctgaagggc atcctgacag aattgctgac 30

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctgtcaggat gcccttcaga gacggac 27

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgatgccgtt ttagacgcgc ccctcgaaca g 31

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggcgcgtcta aaacggcatc agaaatttgg 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

accagcgcct gggtagacgt cgaagagatc 30

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgtctaccca ggcgctggtg gtgatttcg 29

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tactgagaaa gtgccttctg gacaactgac c 31

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccagaaggca ctttctcagt accgaaag 28

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttctgaacaa ctgaccctgg tggtacgtga g 31

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ccagggtcag ttgttcagaa ggcacttt 28

<210> 19

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

caaacagtct cctgacatcn nkcagggcgt tg 32

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

mnngatgtca ggagactgtt tgccgatagc gc 32

Claims

1.一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，其特征在于，所述S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体是将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第65位进行突变获得；或者将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第65位、第186位同时进行突变获得；或者将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第65位、第104位、第186位同时进行突变获得。

2.根据权利要求1所述S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，其特征在于所述氨基酸序列的第65位异亮氨酸突变为缬氨酸；第104位天冬酰胺突变为赖氨酸；第186位亮氨酸突变为缬氨酸。

3.如权利要求1所述S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列为下列之一：SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4。

4.一种编码如权利要求1所述S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体的基因。

5.一种如权利要求4所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶突变体编码基因构建的重组载体。

6.一种如权利要求5所述重组载体转化制备的重组菌。