CN116042561A - 一种s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种S‑腺苷蛋氨酸合成酶突变体及其应用。本发明S‑腺苷蛋氨酸合成酶突变体的野生菌来源于Guyparkeria sp.XI15，经定点突变获得与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变的突变体；在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第1至390位中仅存在下述之一的突变：D22S；G123D；D244A；K251I；G266S；A307S；其氨基酸序列为SEQ ID NO:3‑8之一所示；本发明的S‑腺苷蛋氨酸合成酶突变体实现了在S‑腺苷蛋氨酸生物合成中的应用，使得S‑腺苷蛋氨酸的产率能够达到25.7g/L、过程产品纯度能够达到89.7%。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体，还涉及上述突变体的应用。
背景技术
S-腺苷蛋氨酸(SAM)，英文名为S-adenosyl-methionine，是动物、植物等生命体内重要的代谢中间物质，也是人体内一种重要的生理活性物质，参与多种生化反应，如作为胞内甲基供体，SAM在核酸、蛋白质以及脂类等分子的甲基化修饰中扮演重要角色。同时，SAM还参与胞内的转硫基反应以及聚胺的合成等重要生化反应。SAM也是一种非常有价值的医药分子，在治疗肝病、抑郁症和风湿性关节炎中发挥重要作用。
SAM是由底物L-甲硫氨酸和ATP经S-腺苷甲硫氨酸合成酶酶促合成，因此，S-腺苷蛋氨酸合成酶是合成SAM的关键酶。目前腺苷蛋氨酸工业化生产工艺主要有酵母发酵法和酶促转化法两种。国外多采用特殊培育的表达SAM的酿酒酵母菌株通过胞内表达制备SAM。国内有人研究出基因工程改构的酿酒酵母，发酵表达SAM，但目前表达最高的也只达到10g/L发酵液以内，且发酵液中腺苷蛋氨酸的纯度较低，造成整体收率偏低，生产成本仍然较高。酶促法多以从啤酒酵母或其他工程菌中提取纯化腺苷蛋氨酸合成酶，然后通过优化酶促反应条件来转化制备SAM，该法原料转化率高，SAM易于提取纯化，但是该法中仍然存在酶的催化效率低、整体生产成本高等问题。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体。本发明通过挖掘获得高效的S-腺苷蛋氨酸合成酶，并通过基因工程手段对其进行改造，获得S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体，该S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体合成S-腺苷蛋氨酸的活力和产率显著提高。
本发明S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体的野生菌来源于Guyparkeria sp.XI15，经定点突变获得与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变的突变体。
本发明提供的S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体，与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有80％以上的同源性(较佳地≥90％，更佳地≥95％)，且所述突变体具有合成S-腺苷蛋氨酸的能力，并且催化活性显著提高。
本发明提供一种S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体，在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第1至390位中仅存在第22，123，244，251，266，307内的单个位点突变。
优选的，上述突变体在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第1至390位中仅存在下述之一的突变：D22S；G123D；D244A；K251I；G266S；A307S；其氨基酸序列为SEQ ID NO:3-8之一所示。
所述的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
本发明还提供上述突变体的编码基因，其基因序列如NO:9-14所示；进一步提供含所述基因的表达载体、重组细胞。
本发明所述的S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体，其制备方法包括如下步骤：
(1)合成SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因，得到SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
(2)将SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列进行定点突变，得到SEQ IDNO:3-8的编码基因；
(3)将SEQ ID NO:3-8的编码基因中增加可溶性标签，其蛋白序列如下：
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPK，然后进行基因克隆，得到含有融合可溶性标签S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体编码基因的质粒；
(4)将含有增加可溶性标签后的S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体编码基因的质粒导入感受态细胞中，得到S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体的表达菌株；
(5)S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体的表达菌株进行诱导发酵，得到S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体。
本发明还提供了利用S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体制备的S-腺苷蛋氨酸。
上述S-腺苷蛋氨酸，是以表达所述S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体的编码基因的工程菌经发酵培养到一定程度，然后进行细胞破壁得到粗酶液，在粗酶液中添加蛋氨酸和ATP前体物质，在pH6.5-7.2，温度25-30℃条件下进行催化反应获得的。
优选的，上述粗酶液的浓度为20-30g/L。
优选的，上述的前体ATP添加浓度为80-110g/L，蛋氨酸的添加浓度为30-35g/L，总反应时间为5-10h。
本发明开发了能够高效催化S-腺苷蛋氨酸的S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体。本发明从一级结构至高级结构多角度多层系比较了GenBank中ID为WP_058573953.1的S-腺苷蛋氨酸合成酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)与同源酶蛋白的异同，确定了影响S-腺苷蛋氨酸合成酶酶学性质的关键氨基酸位点为第22，123，244，251，266，307位氨基酸，然后通过密码子替换将这些位点进行如下突变：D22S；G123D；D244A；K251I；G266S；A307S，得到S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体；通过构建突变体基因的6×His融合表达载体并导入基因工程菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达，获得了突变体酶蛋白。
本发明提供了一种S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体，其蛋白为非天然蛋白，并具有高效催化S-腺苷蛋氨酸合成的特点。本发明S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体是在GenBank ID:WP_058573953.1的S-腺苷蛋氨酸合成酶的第22，123，244，251，266，307位氨基酸发生突变得到的。
本发明的有益效果：
1.本发明制备的S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体较野生型具有高效催化S-腺苷蛋氨酸合成的特点，产率能够达到25.7g/L、过程产品纯度可达到89.7％；
2.本发明的S-腺苷蛋氨酸合成酶添加了可溶性标签，显著提高了酶的可溶性表达，与未加可溶性标签相比，获得可溶性表达明显提升的突变体基因，根据图2，可溶性表达提高了70％以上。
3.且与背景技术中提及的制备S-腺苷蛋氨酸的方法相比，成本大幅度降低，成本约降低30％以上。
附图说明
图1是S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体G266S主中表达的SDS-PAGE电泳图；其中，BL21-CodonPlus(DE3)、BL21(DE3)、Rosetta(DE3)和OverexpressC43(DE3)为四种E.coli蛋白表达宿主，Marker为蛋白质分子量标准；
图2是增加可溶性标签后的蛋白可溶性表达情况，GST-S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体G266S是增加可溶性标签后的突变体；
图3是利用S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体G266S催化合成产品的HPLC检测图；
图4是S-腺苷蛋氨酸标准品的HPLC检测图。
具体实施方式
为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
实施例1
一、S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体设计
通过基因挖掘，从NCBI数据库中筛选获得了Genbank ID为WP_058573953.1的S-腺苷蛋氨酸合成酶基因，该基因的开放阅读框全长1170bp，其编码的S-腺苷蛋氨酸合成酶由390个氨基酸组成，其氨基酸序列(390aa)为SEQ ID NO:1，编码该S-腺苷蛋氨酸合成酶的核苷酸序列为SEQ IDNO:2。
通过从一级结构至高级结构多角度多层系比较了Genbank中ID为WP_058573953.1的S-腺苷蛋氨酸合成酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)与同源酶蛋白的异同，确定了影响S-腺苷蛋氨酸合成酶酶学性质的关键氨基酸位点为第22，123，244，251，266，307位氨基酸，然后通过密码子替换将这些位点进行如下突变：D22S；G123D；D244A；K251I；G266S；A307S，得到S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体，其氨基酸序列依次如SEQ ID NO:3-8所示。
二、S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因的获得
S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因可以通过全基因合成方法或分子克隆方法获得。本实验采用全基因合成方法获得Genbank ID为WP_058573953.1的S-腺苷蛋氨酸合成酶基因，采用PCR法获得S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因。
1、WP_058573953.1的S-腺苷蛋氨酸合成酶全基因合成
对Genbank ID为WP_058573953.1的S-腺苷蛋氨酸合成酶进行全基因合成，合成后的基因片段连入pUC57质粒中，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述基因。
2、S-腺苷蛋氨酸合成酶基因定点突变
(1)定点突变引物设计
对S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因序列设计引物，引入定点突变。引物的核苷酸序列如表1。委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述引物。
表1引物的核苷酸序列
(2)定点突变
以含有PRQ77350.1的S-腺苷蛋氨酸合成酶基因的pUC57质粒为模板，采用步骤(1)获得的上游引物和下游引物，按照下列PCR体系和程序扩增S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因。PCR体系：KOD-Plus-0.5μL，质粒模板0.8μL，上游引物F5’(10μM)1μL，下游引物R5’(10μM)1μL，10×PCR Buffer2.5μL，dNTPs(2mM)3μL，MgSO4(25mM)1.5μL，ddH2O 14.7μL。PCR程序如下：a.94℃预变性4min；b.94℃变性40sec，68℃退火并延伸7.5min；18个循环；c.68℃延伸20min。使用DpnI酶消化含有WP_058573953.1的S-腺苷蛋氨酸合成酶基因的模板质粒，37℃，消化30min。
(3)DH5α感受态细胞转化
将步骤(2)获得的含有S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因的pUC57质粒转化到DH5α感受态细胞中。将DH5α感受态细胞放置于冰上，待细胞融化后加入10μL质粒溶液，冰上放置30min；42℃热激50s，然后冰上静置3min；加入600μL无菌LB液体培养基，37℃，200rpm摇床中培养1h；吸取200μL培养好的菌液，涂布于含有Amp抗性(100μg/mL)的LB平板培养基上，37℃倒置培养过夜。
(4)阳性克隆筛选
挑取LB平板上的单菌落，接种于含有Amp抗性(100μg/mL)LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床过夜培养，用于质粒提取。使用OMEGA Plasmid Mini Kit I(货号：D6943)按照说明书提取质粒，并将提取后的质粒送金唯智(中国，苏州)公司测序，鉴定WP_058573953.1的S-腺苷蛋氨酸合成酶是否突变成功。
3、S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因克隆
(1)基因克隆
对S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因序列设计引物，构建至pET28(a)质粒中，引物的核苷酸序列如表2。委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述引物。以含有S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因的pUC57质粒为模板，采用获得的上游引物和下游引物，按照下列PCR体系和程序扩增S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因。PCR体系：PrimeSTAR Max Premix(2×)25μL，质粒模板0.5μL，上游引物NcoI-F(10μM)2μL，下游引物XhoI-R(10μM)2μL，补ddH2O至总体积为50μL。PCR程序如下：a.98℃预变性2min；b.98℃变性10sec，65℃退火10sec，72℃延伸30sec；30个循环；c.72℃延伸3min。使用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，得到大小约为1600bp的目的条带。在紫外灯下切取目的条带，使用Omega Gel ExtractionKit(货号：D2500)，按照试剂盒说明书回收S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因片段。
表2引物的核苷酸序列
| 引物名称 | 引物序列 |
| NcoI-F | <![CDATA[TCATG<u>CCATGG</u>TCTCAGCTACAGATCCCAAAAG]]> |
| XhoI-R | <![CDATA[CCG<u>CTCGAG</u>CAACCCGGCGTCTGCGCGCAGAG]]> |
(2)表达载体构建
利用NcoI和Xho I限制性内切酶分别对S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因和pET28(a)载体进行双酶切。酶切体系(基因)：S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因25μL，NcoI酶2μL，Xho I酶2μL，10×Buffer 5μL，补无菌双蒸水至体系为50μL。酶切体系(载体)：pET28(a)载体2μL，NcoI酶0.5μL，XhoI酶0.5μL，10×Buffer 1μL，补无菌双蒸水至体系为10μL。酶切条件：37℃酶切30min。然后使用T4 DNA连接酶连接经过双酶切后的S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因和pET28(a)线性载体，16℃连接过夜，得到含有S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因的pET28(a)质粒。
(3)融合可溶性标签含有S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体表达载体构建
对可溶性标签序列设计引物，构建至含有S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因的pET28(a)质粒中，引物的核苷酸序列如表3。委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述引物。以pET-GST质粒为模板，采用获得的上游引物和下游引物，按照下列PCR体系和程序扩增可溶性标签片段。PCR体系：PrimeSTAR Max Premix(2×)25μL，pET-GST质粒模板0.5μL，上游引物XhoI-Tag-F(10μM)2μL，下游引物XhoI-Tag-R(10μM)2μL，补ddH2O至总体积为50μL。PCR程序如下：a.98℃预变性2min；b.98℃变性10sec，65℃退火10sec，72℃延伸30sec；30个循环；c.72℃延伸3min。使用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，得到大小约为650bp的目的条带。在紫外灯下切取目的条带，使用Omega Gel Extraction Kit(货号：D2500)，按照试剂盒说明书回收可溶性标签片段。
利用Xho I限制性内切酶分别对可溶性标签片段和含有S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因的pET28(a)质粒进行单酶切。酶切体系(可溶性标签)：可溶性标签片段25μL，Xho I酶2μL，10×Buffer 5μL，补无菌双蒸水至体系为50μL。酶切体系(载体)：含有S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因的pET28(a)质粒2μL，XhoI酶0.5μL，10×Buffer 1μL，补无菌双蒸水至体系为10μL。酶切条件：37℃酶切30min。对单酶切后的可溶性标签片段添加磷酸基团，反应体系：单酶切后的可溶性标签片段4μL，T4多核苷酸激酶0.5μL，10×T4连接酶Buffer 2μL，补无菌双蒸水至体系为20μL，37℃加热45min，70℃加热15min。对单酶切后的含有S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因的pET28(a)质粒片段去除磷酸基团，反应体系：单酶切后的含有S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因的pET28(a)质粒片段10μL，碱性磷酸酶1μL，10×碱性磷酸酶Buffer 2μL，补无菌双蒸水至体系为20μL，37℃加热1h，70℃加热15min。然后使用T4 DNA连接酶连接经过单酶切后添加磷酸基团的可溶性标签片段和经过单酶切后去除磷酸基团的含有S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因的pET28(a)质粒片段，16℃连接过夜，得到融合可溶性标签含有S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因的pET28(a)质粒。
所述的可溶性标签的蛋白序列如下：
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPK
该可溶性标签序列如SEQ ID NO:15所示。
表3引物的核苷酸序列
| 引物名称 | 引物序列 |
| XhoI-Tag-F | <![CDATA[CCG<u>CTCGAG</u>TCCCCTATACTAGGTTATTGGAAA]]> |
| XhoI-Tag-R | <![CDATA[CCG<u>CTCGAG</u>CAACCCGGCGTCTGCGCGCAGAG]]> |
(4)DH5α感受态细胞转化
将步骤(2)和(3)获得的含有S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因的pET28(a)质粒转化到DH5α感受态细胞中。将DH5α感受态细胞放置于冰上，待细胞融化后加入10μL质粒溶液，冰上放置30min；42℃热激50s，然后冰上静置3min；加入600μL无菌LB液体培养基，37℃，200rpm摇床中培养1h；吸取200μL培养好的菌液，涂布于含有Kana抗性(50μg/mL)的LB平板培养基上，37℃倒置培养过夜。
(5)阳性克隆筛选
挑取LB平板上的单菌落，接种于含有Kana抗性(50μg/mL)LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床过夜培养，用于质粒提取。使用OMEGA Plasmid Mini Kit I按照说明书提取质粒，并将提取后的质粒送金唯智(中国，苏州)公司测序，鉴定S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因表达载体是否构建成功。
4、S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体6×His融合蛋白的异源表达
(1)蛋白表达感受态细胞转化
从-80℃超低温冰箱中分别取出E.coli BL21(DE3)、E.coli Rosetta(DE3)和OverexpressC43(DE3)感受态细胞，冰上放置。待细胞融化后，分别向每种感受态细胞中加入1μL含有S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体基因的pET28-(a)质粒，冰上放置30min；42℃热激50s，然后冰上放置3min；加入600μL无菌LB液体培养基，37℃，200rpm摇床培养1h；吸取200μL培养好的菌液，涂布于含有Kana抗性(50μg/mL)的LB平板培养基上，37℃倒置培养过夜。
(2)S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体表达菌株保存
挑取LB平板上的单菌落，接种于含有Kana抗性(50μg/mL)LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床过夜培养，用作S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体的表达菌株。向菌液中加入终体积浓度为15％的无菌丙三醇，-80℃超低温冰箱中长期保存。
(3)蛋白表达
a.种子摇瓶培养：将100μL S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体的表达菌株接种入50mL无菌TB液体培养基中，卡那霉素终浓度为50μg/mL，37℃，200rpm培养8h，得到S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体的表达种子瓶菌液。b.发酵摇瓶培养：将10mL S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体的表达种子瓶菌液接种入350mL无菌TB液体培养基中，卡那霉素终浓度为50μg/mL，37℃，200rpm；待OD600＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.3mM的无菌IPTG，28℃，200rpm诱导培养12h，获得S-腺苷蛋氨酸合成酶的产酶菌体，然后进行高压均质破碎获得S-腺苷蛋氨酸合成酶的粗酶液。
(4)蛋白检测
a.蛋白样品制备：将未离心的S-腺苷蛋氨酸合成酶粗酶液作为全菌样品(全菌)。将1mL S-腺苷蛋氨酸合成酶粗酶液置于1.5mL离心管中，12000rpm下离心5min，取上清液作为可溶性S-腺苷蛋氨酸合成酶样品(上清)。将上清液完全吸出后，使用1mL蒸馏水重悬沉淀，作为不溶性S-腺苷蛋氨酸合成酶样品(沉淀)。取40μL S-腺苷蛋氨酸合成酶全菌样品、上清样品和沉淀样品，向其中分别加入10μL 5×Protein Loading Buffer后，在沸水中加热10min，使蛋白完全变性。b.SDS-PAGE凝胶制备：将SDS-PAGE凝胶配制玻璃板安装在凝胶配制架上。在50mL离心管中分别加入2.8mL蒸馏水、3.2mL30％丙烯酰胺溶液、2mL分离胶Buffer溶液(pH＝8.8)、80μL 10％过硫酸铵溶液和4μL TEMED。混合均匀后立即将7.5mL分离胶溶液加入到凝胶配制玻璃板凹槽中，使用0.5mL异丙醇将液面压平。待分离胶凝固后，弃去上层异丙醇，使用蒸馏水洗净后用吸水纸吸干。在50mL离心管中分别加入2.28mL蒸馏水、0.68mL 30％丙烯酰胺溶液、1mL浓缩胶Buffer溶液(pH＝6.8)、40μL 10％过硫酸铵溶液和4μL TEMED。混合均匀后立即将浓缩胶溶液加入到凝胶配制玻璃板凹槽中，使其充满整个凹槽。将凝胶配制梳子缓慢垂直插入到浓缩胶中。c.SDS-PAGE电泳：将SDS-PAGE凝胶与凝胶配制玻璃一同安装到垂直电泳架上，另一侧用专用的塑料板封闭。将1×SDS-PAGE电泳缓冲液倒满垂直电泳架中部凹槽；向垂直电泳槽中倒入1×SDS-PAGE电泳缓冲液，使其没过铂丝电极5cm左右。缓慢并垂直地将凝胶配制梳子取出，将10μL不同蛋白电泳样品分别加入到浓缩胶中，向样品邻近孔中加入5μL Protein Marker试剂。90V恒压电泳40min，150V恒压电泳55min。d.SDS-PAGE凝胶染色与脱色：将SDS-PAGE凝胶从玻璃板夹层中取出，使用考马斯亮蓝R-250染色液染色45min，然后使用考马斯亮蓝脱色液对其进行过夜脱色，期间更换马斯亮蓝脱色液3～4次。e.SDS-PAGE凝胶成像：在凝胶成像仪中对SDS-PAGE凝胶进行拍照。
实施例2
采用S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体G266S进行S-腺苷蛋氨酸合成。S-腺苷蛋氨酸合成酶粗酶液中添加前体物质，粗酶液浓度为25g/L，前体ATP添加浓度为100g/L，蛋氨酸的添加浓度为33g/L，发酵pH为7.0左右，反应温度维持28℃，反应6h后将反应液过滤，HPLC检测产品含量及纯度，检测结果见表4及图3。
实施例3
采用S-腺苷蛋氨酸合成酶其它突变体进行S-腺苷蛋氨酸合成。S-腺苷蛋氨酸合成酶粗酶液中添加前体物质，粗酶液浓度为25g/L，前体ATP添加浓度为100g/L，蛋氨酸的添加浓度为33g/L，发酵pH维持7.0左右，反应温度维持28℃，反应6h后将反应液过滤，HPLC检测产品含量及纯度，检测结果见表4。
对比例1
本试验采用S-腺苷蛋氨酸合成酶初始酶进行S-腺苷蛋氨酸的合成。
S-腺苷蛋氨酸合成酶粗酶液中添加前体物质，粗酶液浓度为25g/L，前体ATP添加浓度为100g/L，蛋氨酸的添加浓度为33g/L，发酵pH维持7.0左右，反应温度维持28℃，反应6h后将反应液过滤，HPLC检测产品含量及纯度，检测结果见表4。
对比例2
本试验采用S-腺苷蛋氨酸合成酶初始酶，将可溶性标签更改为MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLA进行S-腺苷蛋氨酸的合成。
S-腺苷蛋氨酸合成酶粗酶液中添加前体物质，粗酶液浓度为25g/L，前体ATP添加浓度为100g/L，蛋氨酸的添加浓度为33g/L，发酵pH维持7.0左右，反应温度维持28℃，反应6h后将反应液过滤，HPLC检测产品含量及纯度，检测结果见表4。
对比例3
本试验采用S-腺苷蛋氨酸合成酶初始酶，将可溶性标签更改为MSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG进行S-腺苷蛋氨酸的合成。
S-腺苷蛋氨酸合成酶粗酶液中添加前体物质，粗酶液浓度为25g/L，前体ATP添加浓度为100g/L，蛋氨酸的添加浓度为33g/L，发酵pH维持7.0左右，反应温度维持28℃，反应6h后将反应液过滤，HPLC检测产品含量及纯度，检测结果见表4。
表4不同突变体的催化效果对比
序列表
Claims (10)
1.一种S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体，其特征在于，所述突变体在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第1至390位中仅存在第22，123，244，251，266，307在内的单个位点突变。
2.如权利要求1所述的一种S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体，其特征在于，所述S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体的野生菌来源于Guyparkeria sp. XI15。
3.如权利要求1所述的一种S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体，其特征在于，所述突变体在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第1至390位中仅存在下述之一的突变：D22S；G123D；D244A；K251I；G266S；A307S；其氨基酸序列为SEQ ID NO: 3-8之一所示。
4.权利要求1或2所述的S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的序列如SEQ ID NO: 9-14所示。
5.如权利要求4所述的编码基因，其特征在于，在该编码基因中增加了可溶性标签，标签核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示，然后进行基因克隆，得到含有融合可溶性标签S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体编码基因的质粒。
6.权利要求5所述的S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体编码基因的表达载体。
7.权利要求5所述的S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体编码基因的重组细胞。
8.权利要求5所述的S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体在制备S-腺苷蛋氨酸中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，具体的应用方法为：是以表达所述S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体的编码基因的工程菌经破壁后的粗酶液添加蛋氨酸和ATP前体，得到S-腺苷蛋氨酸。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述粗酶液的浓度为20-30g/L，前体ATP的添加浓度为80-110g/L，蛋氨酸的添加浓度为30-35g/L，反应体系的pH为6.5-7.2，反应温度为25-30℃，总反应时间为5-10h。
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