CN101392230A - 一株表达腺苷蛋氨酸合成酶的重组大肠埃希氏菌 - Google Patents
一株表达腺苷蛋氨酸合成酶的重组大肠埃希氏菌 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一株表达腺苷蛋氨酸合成酶的重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.2299以及该重组大肠埃希氏菌的构建方法。本发明还提供了一种腺苷蛋氨酸合成酶的重组表达载体pMETK。本发明提供的表达腺苷蛋氨酸合成酶的重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.2299，其腺苷蛋氨酸合成酶的表达量占菌体可溶性蛋白的31.36％，表达的腺苷蛋氨酸合成酶活性高达7.38U/ml，远高于野生型菌株。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一株表达腺苷蛋氨酸合成酶的重组大肠埃希氏菌及其应用。
背景技术
中国是人口大国，同时也是“肝炎大国”。据1992年全国病毒性肝炎流行病学调查，全国约有1.2亿人携带乙型肝炎病毒，丙型肝炎在一般人群中感染率为3.1％。我国现有2000万例慢性乙型肝炎患者，其中部分有可能转化为肝硬化，甚至肝癌。
腺苷蛋氨酸(SAM)是人体内一种极为重要的中间代谢产物。它可以通过转硫途径生成体内关键的抗氧化及解毒物质——半胱氨酸，再生成另一种关键的抗氧化和解毒物质——谷胱甘肽，解除肝内的氧化物应激状态，从而达到防治肝病的目的。另外SAM还可以促进依赖性脂磷脂的合成，降低胆固醇和磷脂的比例，恢复细胞膜的流动性，促进胆汁的主动转运和甘油酸三脂的分泌。因此SAM对肝内胆汁郁积、各种急、慢性肝炎以及脂肪肝、肝硬化等肝脏疾病有很好的疗效。SAM于20世纪80年代出现在欧洲医药市场上，1999年美国FDA正式批准SAM上市，使其迅速成为畅销的营养保健品之一，年销售额超过10亿美元。由于其疗机理清楚、效显著、起效快、副作用小，近年来在国内的需求量也越来越大，有广阔的市场前景。
目前，SAM的生产方法主要有化学合成法、发酵法和酶促转化法3种。
化学合成法采用S一腺苷同型半胱氨酸(S-adenosythomocysteine)和甲基供体(CH3I)合成，腺苷蛋氨酸有(+)和(一)两种构型，只有(一)构型才有生物活性，但合成产物中含有大量(+)腺昔蛋氨酸，且难以分离。发酵法采用在培养基中添加L-甲硫氨酸，用酵母发酵生产(一)型腺苷蛋氨酸，是60年代至80年代生产腺普蛋氨酸的主要方法。酶促转化法主要利用腺苷蛋氨酸合成酶催化底物L一甲硫氨酸和ATP生成(一)型腺昔蛋氨酸。酶作为生物催化剂具有快速、专一的特点，因此酶促转化法生产腺苷蛋氨酸具有高效、工艺简单、产品生物活性高且无污染的优势。
要将酶促合成法应用于工业化生产，大量获得催化用的腺苷蛋氨酸合成酶成为关键，规模化生产腺苷蛋氨酸合成酶的难题一直困扰着酶促转化法的工业化应用。本发明采用基因工程重组技术，获得了高效表达腺苷蛋氨酸合成酶的工程菌，对酶促催化腺苷蛋氨酸的工业化生产具有重要意义。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一株表达腺苷蛋氨酸合成酶的重组大肠埃希氏菌及其应用，本发明的又一目的是提供一种腺苷蛋氨酸合成酶的重组表达载体及其应用。
(二)技术方案
本发明提供了一株表达腺苷蛋氨酸合成酶的重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.2299。该菌株已于2007年12月26日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.2299。
该重组大肠埃希氏菌的构建方法包括如下步骤：
(1)用PCR法扩增编码大肠埃希氏菌腺苷蛋氨酸合成酶的metK基因；
(2)将得到的PCR产物克隆到连接载体pBR322上，得到重组表达载体pMETK；
(3)将重组表达载体pMETK转化大肠埃希氏菌DH5α，筛选阳性转化子，得到表达腺苷蛋氨酸合成酶的重组大肠埃希氏菌。
本发明还提供了一种腺苷蛋氨酸合成酶的重组表达载体pMETK，它是将编码大肠埃希氏菌腺苷蛋氨酸合成酶的metK基因克隆到连接载体pBR322上得到的。
本发明所述的重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.2299能高效表达腺苷蛋氨酸合成酶，可应用于工业化合成腺苷蛋氨酸。
本发明所述的重组表达载体pMETK也可应用于工业化合成腺苷蛋氨酸。
(三)有益效果
本发明提供的表达腺苷蛋氨酸合成酶的重组大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)CGMCC No.2299，其腺苷蛋氨酸合成酶的表达量占菌体可溶性蛋白的31.36％，比野生菌高16倍；表达的腺苷蛋氨酸合成酶活性高达7.38U/ml，比野生菌高22倍。
本发明所述的菌株已于2007年12月26日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.2299。
附图说明
图1是重组表达载体pMETK的结构图；
图2是Pst I和EcoR I双酶切重组表达载体pMETK的电泳图，其中1表示样品；
图3SDS-PAGE检测蛋白表达量的电泳图，其中，1和3表示样品，2表示SDS-PAGE低分子量蛋白Marker。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实验中所用到的主要试剂及设备
1、主要材料
DNA抽提试剂盒购于QIAGEN公司(DNeasy Tissue Kit，产品目录号69504)；克隆载体pBR322、大肠埃希氏菌DH5α购于Xenogen公司；限制性内切酶Pst I、EcoR I，Taq DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，溶菌酶及相关缓冲液购于Promega公司；LB培养基所用蛋白胨、酵母粉购于OXOID公司；其余试剂市购，均为分析纯。
2、主要设备
台式离心机：Sigma公司；恒温摇床：Infors公司；电泳仪：Bio-Rad公司；紫外投射仪及其成像装置：法玛西亚公司；PCR扩增仪：美国应用生物系统公司。
实施例1 表达腺苷蛋氨酸合成酶的重组大肠埃希氏菌的构建
一、重组表达载体pMETK的构建：
metK基因在文献中已公开(J.Biol.Chem.259(23)，14505-14507(1984))
(1)将E.coli DH5α接种到LB固体培养基上，37℃培养18小时，然后用灭菌的牙签挑取单菌落接种到50ml LB液体培养基中，37℃、180rpm摇床培养过夜，然后用DNA抽提试剂盒提取其基因组DNA。
(2)委托上海生工生物工程有限公司合成以下引物：
正向引物序列：
5’-AACTGCAGAGTCGTGGTAGGATCCGCTACCACA-3’，
反向引物序列：
5’-GGAATTCATCTGCAATAAACGGCAGTGCGC-3’；
(3)取DNA模版1μg，分别加入步骤(2)中的引物各2μmol/L，Taq DNA聚合酶5IU，dNTPs 200μmol/L，1×PCR缓冲液20μL，混合均匀，按以下方法进行PCR扩增：94℃变性1min，循环30次(94℃ 30s，55℃ 30s，72℃2.5min)，然后延伸10min。按《分子克隆》的常规方法回收目的基因metK。
(4)取含有1μg上述目的基因的溶液，依次加入10×Pst I酶切缓冲液2μl，EcoR I酶切缓冲液2μl，用无菌水定容至18μl，再分别加入Pst I限制性内切酶(5U/μl)1μl，EcoR I限制性内切酶(5U/μl)1μl，混合均匀，置于37℃水浴中保温3小时；
(5)电泳回收步骤(4)的反应液中的metK基因片段；
(6)取1μg质粒pBR322，依次加入10×PstI酶切缓冲液2μl，EcoR I酶切缓冲液2μl，用无菌水定容至18μl，再分别加入Pst I限制性内切酶(5U/μl)1μl，EcoR I限制性内切酶(5U/μl)1μl，混合均匀，置于37℃水浴中保温3小时；
(7)电泳回收酶切后的pBR322质粒；
(8)取0.1μg经过上述双酶切的质粒pBR322与0.12μg步骤(4)回收的metK基因均匀混合，加入无菌水8μL，45℃保温5min，然后加入10×T4DNA连接酶缓冲液1μL、T4 DNA连接酶(5U/μl)0.5μL，混合均匀后于16℃保温24小时，得到重组表达载体pMETK，其结构图如附图1所示；
二、重组大肠埃希氏菌的构建
(1)从LB固体培养基平板上挑取E.coli DH5α单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃摇床培养12小时，然后以1:50接种于100ml LB液体培养基中，37℃摇床培养3小时，至OD600＝0.5左右；
(2)将培养液置于冰浴中冷却10min，3000rpm离心收集菌体，用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮菌体，再置于冰浴中冷却30min，3000rpm收集菌体，然后用4ml含有15％ 0.05mol/LCaCl2溶液悬浮细胞，置于冰浴中待用；
(3)取上述重组表达载体pMETK2μL与200μL步骤(2)得到的感受态细胞混悬液均匀混合，冰浴30min，然后转移到37℃水浴中加热5min，再置于冰浴中冷却5min；
(4)取100μL转化反应原液，用无菌玻璃棒涂布在含有200μg/ml氧化四环素的LB固体培养基上，37℃培养半小时，直至液体完全吸收；
(5)倒置平板，37℃恒温培养16小时，待出现明显而又未互相重叠的单菌落时取出平板，挑取平板上的单菌落，筛选腺苷蛋氨酸合成酶表达量最高的阳性转化子(酶表达量的测定方法见实施例2)，最后筛得本发明所述的表达腺苷蛋氨酸合成酶的重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCCNo.2299。
其中，阳性转化子的鉴定方法如下：
①双酶切鉴定：
a.取步骤(5)中挑取的转化子，用LB液体培养，得到的菌液1.5ml，12000rpm离心30秒，弃去上清，用120ml STET缓冲液(0.1mol/L NaCl；10mmol/L Tris·Cl，PH8.0；10mmol/L EDTA，PH8.0；5％ Triton X-100)重悬菌体；
b.在菌体混悬液中加入10mg/ml的溶菌酶溶液10ml，振荡3秒后置于沸水中加热50秒，12000rpm离心，弃去上清和菌体碎片；
c.在上述沉淀中依次加入10×Pst I酶切缓冲液2μl，，EcoR I酶切缓冲液2μl，，用无菌水定容至18μl，再分别加入Pst I限制性内切酶(5U/μl)1μl，EcoR I限制性内切酶(5U/μl)1μl，混合均匀，置于37℃水浴中保温3小时；
d.将以上酶切反应液进行电泳检测，得到大小约为1.8kb和3.6kb的两条带(见附图2)，与预期结果完全一致。
②基因测序鉴定：
按《分子克隆》所述的经典方法提取中转化子中的重组表达质粒pMETK，送人类基因组北方中心进行全序列分析，测得总长5407bp，与预期结果完全一致。具体结果如下：
1 TCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTG
61 CTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCAC
121 CGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCG
181 GGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGC
241 GTTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCG
301 CCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCAC
361 ACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGG
421 TGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTT
481 CGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGAGGCCGGGGGACT
541 GTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAA
601 CCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCC
661 CTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGC
721 CGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTG
781 GGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGC
841 GGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACG
901 TTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTT
961 GCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGG
1021 CGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATCA
1081 GGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCATTGGACCGCT
1141 GATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGT
1201 AGGCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGC
1261 CACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCAAGAATT
1321 GGAGCCAATCAATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAACATA
1381 TCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCATCTCGGGCAGCGTTGGGTCC
1441 TGGCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGT
1501 TGCCTTACTGGTTAGCAGAATGAATCACCGATTCGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGC
1561 TGCAAAACGTCTGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAA
1621 AGTCTGGAAACGCGGAAGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGA
1681 TGCTGCTGGCTACCCTGTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTGACCC
1741 TGAGTGATTTTTCTCTGGTCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAACGT
1801 TCCAGTAACCGGGCATGTTCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTTC
1861 ATCGGTATCATTACCCCCATGAACAGAAATCCCCCTTACACGGAGGCATCAGTGACCAAA
1921 CAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTG
1981 GAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGAC
2041 CACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTC
2101 TGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGA
2161 CAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAG
2221 TCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTAC
2281 TGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCA
2341 TCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGC
2401 GAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACG
2461 CAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGT
2521 TGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAA
2581 GTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCT
2641 CCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCC
2701 CTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGG
2761 TCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCT
2821 TATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAG
2881 CAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGA
2941 AGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGA
3001 AGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTG
3061 GTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAG
3121 AAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAG
3181 GGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAAT
3241 GAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCT
3301 TAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGAC
3361 TCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAA
3421 TGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCG
3481 GAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATT
3901 CACCGTTCGCGAAATTGGCTATGTGCATTCCGACATGGGCTTTGACGCTAACTCCTGTGC
3961 GGTTCTGAGCGCTATCGGCAAACAGTCTCCTGACATCAACCAGGGCGTTGACCGTGCCGA
4021 TCCGCTGGAACAGGGCGCGGGTGACCAGGGTCTGATGTTTGGCTACGCAACTAATGAAAC
4081 CGACGTGCTGATGCCAGCACCTATCACCTATGCACACCGTCTGGTACAGCGTCAGGCTGA
4141 AGTGCGTAAAAACGGCACTCTGCCGTGGCTGCGCCCGGACGCGAAAAGCCAGGTGACTTT
4201 TCAGTATGACGACGGCAAAATCGTTGGTATCGATGCTGTCGTGCTTTCCACTCAGCACTC
4261 TGAAGAGATCGACCAGAAATCGCTGCAAGAAGCGGTAATGGAAGAGATCATCAAGCCAAT
4321 TCTGCCCGCTGAATGGCTGACTTCTGCCACCAAATTCTTCATCAACCCGACCGGTCGTTT
4381 CGTTATCGGTGGCCCAATGGGTGACTGCGGTCTGACTGGTCGTAAAATTATCGTTGATAC
4441 CTACGGCGGCATGGCGCGTCACGGTGGCGGTGCATTCTCTGGTAAAGATCCATCAAAAGT
4501 GGACCGTTCCGCAGCCTACGCAGCACGTTATGTCGCGAAAAACATCGTTGCTGCTGGCCT
4561 GGCCGATCGTTGTGAAATTCAGGTTTCCTACGCAATCGGCGTGGCTGAACCGACCTCCAT
4621 CATGGTAGAAACTTTCGGTACTGAGAAAGTGCCTTCTGAACAACTGACCCTGCTGGTACG
4681 TGAGTTCTTCGACCTGCGCCCATACGGTCTGATTCAGATGCTGGATCTGCTGCACCCGAT
4741 CTACAAAGAAACCGCAGCATACGGTCACTTTGGTCGTGAACATTTCCCGTGGGAAAAAAC
4801 CGACAAAGCGCAGCTGCTGCGCGATGCTGCCGGTCTGAAGTAATCTTTCTTCACCTGCGT
4861 TCAAAGGCCAGCCTCGCGCTGGCCTTTTTCTTTTGGATAGGCGTTCACGCCGCATCCGGC
4921 AAAAAAACCGCCCGCACAATAACATCATTCTTCCTGATCACGTTTCACCGCAGATTATCA
4981 TCACAACTGAAACCGATTACACCAACCACAACAGACAAAGATTTGTAATATTTTCATATT
5041 ATTATTCGGTTTTCACAGTTGTTACATTTCTTTTCAGTAAAGTCTTAATTGCAGATAACA
5101 GCGTTTAATCTATGATGATATAACTCAATTATTTTCATGCACTTAAATCATAACTAAGAT
5161 AAATGTTAGTGTAAGCGATTACACTGATGTGATTTGCTTCACATCTTTTTACGTCGTACT
5221 CACCTATCTTAATTCACAATAAAAAATAACCATATTGGAGGGCATCATGCCTGACGCTAA
5281 AAAACAGGGGCGGTCAAACAAGGCAATGACGTTTTTCGTCTGCTTCCTTGCCGCTCTGGC
5341 GGGATTACTCTTTGGCCTGGATATCGGTGTAATTGCTGGCGCACTGCCGTTTATTGCAGA
5401 TGAATT
实施例2构建的重组大肠埃希氏菌腺苷蛋氨酸合成酶的表达量及活性测定
实验
(1)腺苷蛋氨酸合成酶表达量的测定
挑取实施例1得到的重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCCNo.2299的单菌落，接种到10ml液体LB培养基(含25μg/ml的氧化四环素)，摇床培养6小时，取样用SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳测定其中腺苷蛋氨酸合成酶的表达量，电泳结果如附图3所示，SAM合成酶的表达量占菌体可溶性蛋白的31.36％。
(2)腺苷蛋氨酸合成酶的活性测定
配制反应液：由75mmol Tris-HCl(PH8.0)、250mmol KCl、9mmol MgCl2、60μmol蛋氨酸、5mmol ATP和1ml粗酶液组成100ml的反应体系，37℃反应30min后，加入高氯酸至终浓度为0.3％使反应中止，用HPLC外标法测定反应液中腺苷蛋氨酸的量。酶的活力单位定义为：在以上反应条件下，30min催化形成1μmol腺苷蛋氨酸所需要的酶量为一个活力单位。
经测量，重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.2299表达的腺苷蛋氨酸合成酶的活性为7.38U/ml。
序列表
<110> 北京凯因生物技术有限公司
<120> 一株表达腺苷蛋氨酸合成酶的重组大肠埃希氏菌
<130> K0801
<160> 1
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 5046
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 1
Claims (5)
1、一株表达腺苷蛋氨酸合成酶的重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.2299。
2、一种腺苷蛋氨酸合成酶的重组表达载体pMETK，其特征在于它是将编码大肠埃希氏菌腺苷蛋氨酸合成酶的metK基因克隆到连接载体pBR322上得到的。
3、根据权利要求1所述的重组大肠埃希氏菌的构建方法，其特征在于它包括如下步骤：
(1)用PCR法扩增编码大肠埃希氏菌腺苷蛋氨酸合成酶的metK基因；
(2)将得到的PCR产物克隆到连接载体pBR322上，得到权利要求2所述的重组表达载体pMETK；
(3)将重组表达载体pMETK转化大肠埃希氏菌DH5α，筛选阳性转化子，得到表达腺苷蛋氨酸合成酶的重组大肠埃希氏菌。
4、根据权利要求1所述的重组大肠埃希氏菌在合成腺苷蛋氨酸中的应用。
5、根据权利要求2所述的重组表达载体在合成腺苷蛋氨酸中的应用。
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| DE10309856A1 (de) * | 2003-03-06 | 2004-09-23 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von S-Adenosylmethionin |
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2008
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