KR20150007393A

KR20150007393A - 숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제의 변이형 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 핵산분자, 재조합 벡터, 형질전환체 및 이를 사용한 변이형 폴리펩타이드 또는 3-히드록시프로피온산의 제조방법

Info

Publication number: KR20150007393A
Application number: KR1020130080914A
Authority: KR
Inventors: 추헌수; 이찬무; 최인석
Original assignee: 삼성종합화학주식회사
Priority date: 2013-07-10
Filing date: 2013-07-10
Publication date: 2015-01-21

Abstract

본 발명은 숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제의 변이형 폴리펩타이드, 발현 핵산분자, 재조합 벡터, 형질전환체 및 이를 사용한 변이형 폴리펩타이드 또는 3-히드록시프로피온산의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 기본서열에서 201 내지 210, 266 내지 272, 및 332 내지 340 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산에 변이를 일으킨 변이형 숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제 및 이를 이용하여 3-히드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic acid)을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 기존에 알려진 쿠프리아비두스 네카터(Cupriavidus necator) 유래의 숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase) 보다 점 돌연변이가 유도된 데하이드로게나제가 재조합 대장균에서 더 높은 3-HP 활성을 보여 3-HP 생산성이 증가한다.

Description

숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제의 변이형 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 핵산분자, 재조합 벡터, 형질전환체 및 이를 사용한 변이형 폴리펩타이드 또는 3-히드록시프로피온산의 제조방법{Mutant polypepetide, nucleic acid molecule encoding the same, recombinant vector, transformant and production method of 3-hydroxypropionate by using the same}

본 발명은 숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제의 변이형 폴리펩타이드, 발현 핵산분자, 재조합 벡터, 형질전환체 및 이를 사용한 변이형 폴리펩타이드 또는 3-히드록시프로피온산의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 기본서열에서 201 내지 210, 266 내지 272, 및 332 내지 340 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산에 변이를 일으킨 변이형 숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제 및 이를 이용하여 3-히드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic acid)을 생산하는 방법에 관한 것이다.

글리세롤은 유채, 콩 등의 유지작물을 이용해 바이오디젤을 생산하는 경우 생겨나는 부산물인데 최근 전세계적으로 바이오디젤의 생산이 증가함에 따라 글리세롤의 가격이 급격히 하락하고 있다. 이에 따라 글리세롤을 다양한 응용분야를 가진 고부가가치 생물화학소재로 전환할 필요성이 대두되었으며 이 중의 하나가 3-히드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid: 3-HP)이다.

3-히드록시프로피온산(3-HP)은 젖산, 숙신산과 더불어 바이오매스 유래의 3대 플랫폼 화학원료로 주목을 받고 있는 물질로서, 각종 화학 분야에서 전구체로 이용될 수 있어 1,3-프로판디올(1,3-propanediol), 아크릴산(acrylic acid), 아크릴아미드(acrylamide), 말론산(malonic acid)의 제조를 위한 원료로 활용이 가능하다(도 1 참조).

상업적 규모에서 3-히드록시프로피온산을 생산하는 공정은 도 1에서와 같이 두 종의 효소가 촉매하는 탈수 및 산화 공정을 통해 이루어진다. 탈수효소는 클랩시엘라 속(Klebsiella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 클로스트리디움 속(Clostridium sp.), 일리오박터 속(Ilyobacter sp.) 균주 등으로부터 얻을 수 있으나, 중간 생성물인 3-히드록시프로피온알데히드(3-Hydroxypropionaldehyde; 3-HPA)가 세포의 성장 및 대사를 저해하여 3-히드록시프로피온산의 생산성을 감소시키는 것으로 보고되고 있다.

따라서 중간체로 생성되는 3-히드록시프로피온알데히드(3-HPA)를 기질로 하여 이를 빠른 속도로 3-히드록시프로피온산(3-HP)으로 전환시킬 수 있는 고유 활성도(specific activity)가 높은 산화효소를 개발하는 것이 상업적으로 매우 중요하다.

1. 한국공개특허 제2013-0001509호 2. 한국등록특허 제1028039호 3. 한국등록특허 제1114912호

1. Biotechnol. J, 2, p 736-742 (2007) 2. PNAS, 100: pp 5010-5015 (2003)

본 발명의 목적은 3-히드록시프로피온알데히드(3-Hydroxypropionaldehyde; 3-HPA)를 3-히드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid: 3-HP)으로 빠르게 전환시키는 높은 활성의 산화효소를 개발하여 이를 재조합미생물에 적용시킴으로써 3-HP의 생산성 및 생산량을 높이는 데 있다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 기본서열에서 201 내지 210, 266 내지 272, 및 332 내지 340 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 변이되고, 3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환하는 활성을 가지는 변이형 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 서열번호 1의 아미노산 기본서열에서209, 269, 및 335 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 변이된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상술한 변이는 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판, 글루타민, 히스티딘, 라이신 및 아르기닌 중에서 기본서열의 아미노산과 상이한 것으로 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, (a) 상술한 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는 염기 서열; (b) 상기 (a)에 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 염기 서열 중에서 선택된 어느 하나로 이루어진 핵산분자를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상술한 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 재조합 벡터는 글리세롤 데히드라타제(glycerol dehydratase) 또는 디올 데히드라타제(thiol dehydratase)를 암호화하는 핵산분자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 글리세롤 데히드라타제 또는 디올 데히드라타제를 암호화하는 핵산분자는 dhaB1, dhaB2 및 dhaB3을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 재조합 벡터는 글리세롤 데히드라타제 재활성화 인자 또는 디올 데히드라타제 재활성화 인자를 암호화하는 핵산분자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 글리세롤 데히드라타제 재활성화 인자 또는 디올 데히드라타제 재활성화 인자를 암호화하는 핵산분자는 dhaFG, gdrAB 및 ddrAB를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상술한 재조합 벡터 중 어느 하나를 숙주 세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 재조합 벡터가 도입되는 숙주 세포는 박테리아, 효모 및 곰팡이로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 기본서열에서 201 내지 210, 266 내지 272, 및 332 내지 340 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산을 변이하는 단계를 포함하는 3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환하는 활성을 가지는 변이형 폴리펩타이드 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 변이형 폴리펩타이드 제조방법은 서열번호 1의 아미노산 기본서열에서 209, 269 및 335 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산을 변이하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 아미노산의 변이는 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판, 글루타민, 히스티딘, 라이신 및 아르기닌 중에서 선택된 아미노산으로 치환되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 상술한 형질전환체 중 어느 하나를 배양하는 단계 및 상기 배양에서 제조된 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환하는 활성을 가지는 변이형 폴리펩타이드 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 3-히드록시프로피온알데히드(3-Hydroxypropionaldehyde)가 존재하거나 3-히드록시프로피온알데히드가 생산되는 조건에서, 상술한 형질전환체 중 어느 하나를 배양하는 단계를 포함하는 3-히드록시프로피온산의 생산방법을 제공한다.

본 발명에 따른 변이형 폴리펩타이드는 기존의 야생형 숙신산 세미알데히드 데히드로게나제에 비해 산화활성이 우수하여 중간체인 3-히드록시프로피온알데히드를 빠른 속도로 3-히드록시프로피온산으로 전환시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 3-히드록시프로피온산 합성능력이 우수한 폴리펩타이를 제공하고, 이를 사용하여 3-HP를 경제적으로 대량 수득할 수 있다.

도 1은 글리세롤로부터 3-히드록시프로피온산을 생성하는 경로와 이를 전구체로 하여 합성되는 핵심 화합물들을 보여주는 개략적인 모식도이다.
도 2는 대장균 유래 숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제(3JZ4.pdb)를 주형으로 이용한 단백질 상동성 모델링을 통해 구현한 쿠프리아비두스 네카터(Cupriavidus necator) 유래의 숙신산 세미알데히드 데히드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase)의 3차원 구조에 관한 모델링 그림이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 재조합 벡터의 개략적인 개열지도이다. (a)는 pTH-Cn-gabD4, (b)는 pTH-Cn-mutgabD4, (c)는 ET-iBAB-gabD4, (d)는 ET-iBAB-mutgabD4.
도 4는 283번째 아미노산을 치환한 변이형 숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase)가 도입된 재조합 대장균(C283A)의 배양 시간에 따른 성장(OD)과 3-HP 생산량을 보여준다.
도 5는 본 발명의 실시예 7에 따른 변이형 폴리펩타이드(209번, 269번 및 335번째 중 어느 하나 이상의 아미노산(글루탐산, Glu, E)이 글루타민(Gln, Q)으로 치환된 변이형)를 발현하는 형질전환체의 배양 시간에 따른 (A) 균체 성장 및 (B) 3-HP 합성량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예 8에 따른 변이형 폴리펩타이드(209 및 269번째 아미노산(글루탐산, Glu, E)이 글루타민(Gln, Q)으로 치환된 변이형)를 발현하는 형질전환체의 배양 시간에 따른 균체 성장 및 3-HP 합성량을 나타낸 그래프이다.

본 발명의 구체적인 내용을 기술하기에 앞서 본 명세서에 사용된 용어에 대하여 의미를 서술한다

본 명세서에서 사용되는 '폴리펩타이드'는 일련의 잔기, 인접한 아미노산들의 α-아미노기와 카르복실기 사이에서 전형적인 펩타이드 결합에 의해 서로 연결되어 있는 L-아미노산들을 전형적으로 지칭하도록 사용되고, 용어 "올리고펩타이드", "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 상호 교차 사용될 수도 있다.

본 발명은 상기 기재된 특정의 아미노산 서열(폴리펩타이드)에 제한되지 않고, 해당 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 90%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.

예를 들어, 상기 폴리펩타이드는 기재된 특정의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며 글리세롤 대사에 관련하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 동일성 % 는 높을수록 바람직하다.

또한 상기 동일성을 가지는 폴리펩타이드는 기재된 특정 아미노산 서열의 폴리펩타이드에서 1 내지 100, 1 내지 90, 1 내지 80, 1 내지 70, 1 내지 60, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 39, 1 내지 38, 1 내지 37, 1 내지 36, 1 내지 35, 1 내지 34, 1 내지 33, 1 내지 32, 1 내지 31, 1 내지 30, 1 내지 29, 1 내지 28, 1 내지 27, 1 내지 26, 1 내지 25, 1 내지 24, 1 내지 23, 1 내지 22, 1 내지 21, 1 내지 20, 1 내지 19, 1 내지 18, 1 내지 17, 1 내지 16, 1 내지 15, 1 내지 14, 1 내지 13, 1 내지 12, 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1 개의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하면서 글리세롤 대사와 관련되는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가의 수는 적을수록 바람직하다.

본 명세서에 사용되는 '핵산분자' 또는 '폴리뉴클레오타이드'는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지고, 핵산분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기부위가 변형된 유사체(analogues)도 포함하며, "뉴클레오티드 서열", "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 상호 교차 사용될 수 있고, 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA 또는 상기 DNA들의 전사 산물(예를 들어, RNA 분자) 중 어느 하나를 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명은 상기 기재된 특정의 아미노산 서열(폴리펩타이드)을 암호화하는 핵산분자에 제한되지 않고, 상기에서 서술한 것처럼 특정 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열 또는 그에 상응하는 기능을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산분자를 포함하는 것으로 해석된다.

상기의 실질적인 동일성은 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 90%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.

상기 상응하는 기능을 가진 폴리펩타이드는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가되는 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 포함한다. 그러한 폴리펩타이드는 상기 상술한 것처럼 1 개 이상의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 이루어지며 3-히드록시프로피온산 합성 관련되는 폴리펩타이드를 포함하며, 아미노산 잔기의 소실,치환,삽입,및/또는 첨가의 수가 적은 것이 바람직하다. 또한, 상기 폴리펩타이드는 상기 상술한 것처럼 기재된 특정의 아미노산 서열과 약 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산서열을 가지며 글리세롤 대사에 관련하는 폴리펩타이드를 포함하며, 동일성이 높을수록 바람직하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "상보적" 또는 "상보성"은 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드가 수소 결합을 통해 결합하여 더블 스트랜드 핵산분자를 형성하는 능력을 의미하며, 부분적으로 상보적인 경우도 포함한다. 하기 염기쌍이 상보성과관련된다: 구아닌 및 시토신; 아데닌 및 티민; 및 아데닌 및 우라실. "상보적"은 상기 언급된 관계가 전장의 상기 분자에 걸쳐 2개의 싱글-스트랜드 핵산분자를 포 함하는 모든 염기쌍에 실질적으로 적용된다. "부분적으로 상보적"은 2개의 싱글-스트랜드 핵산분자 중 하나의 길이 짧기 때문에 그 분자들 중 하나의 일부가 싱글스트랜드로 남아있는 것 관계를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "혼성화"는 싱글 스트랜드 핵산분자가 뉴클레오티드 염기 쌍을 통해 상보적인 스트랜드와 결합하는 과정을 언급한다. 따라서, 본 명세서에서 '서열번호 제1서열과 엄격한 조건에서 혼성화 되는 염기 서열을 포함하는 핵산분자"는 서열번호 제1서열에 기재된 염기 서열의 전부 또는 일부를 사용하여 콜로니 혼성화 기술, 플라크 혼성화 기술, 서던 혼성화 기술 등에 의해 수득된, DNA 와 같은 핵산분자를 말한다. 혼성화 방법은 당업자에게 알려진 다양한 방법이 사용가능하며, 예를 들어, Wood W. I. 등(Wood W. L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci., vol.82, pp.1585-1588, 1985.)에 기술된 방법일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "엄격"은 혼성화 조건을 언급한다. 고도로 엄격한 조건은 비상동성인 염기 쌍에 바람직하지 못하다. 낮은 엄격성은 반대 작용을 갖고 있다. 엄격성은 예를 들면, 온도, 염 농도에 의해 변경될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "엄격한 조건" 은 낮은 엄격한 조건, 중간 엄격한 조건, 또는 높은 엄격한 조건 중 임의일 수 있다. "낮은 엄격한 조건" 은, 예를 들어, 32? 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% Sodium Dodecyl Sulfate(SDS), 50% 포름아미드(formamide)이다. "중간 엄격한 조건" 은 예를 들어, 42? 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "높은 엄격한 조건" 은 예를 들어, 50? 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. 상기 조건 하에, 더 높은 상동성을 가진 DNA와 같은 폴리뉴클레오티드가 더 높은 온도에서 효율적으로 수득될 것으로 예상되며, 그럼에도 불구하고, 다수의 요소가 온도, 프로브 농도, 프로브 길이, 이온 세기, 시간, 염 농도 및 기타를 포함하여 혼성화 엄격성에 관여하고, 당업자는 이러한 요소를 적절하게 선택하여, 유사한 엄격성을 실현시킬 수 있다. 시판의 키트가 혼성화에 사용되는 경우, 예를 들어, Alkphos Direct Labeling Reagents (Amersham Pharmacia, 영국)가 사용될 수 있다. 이 경우, 첨부된 프로토콜에 따르면, 표지된 프로브로 밤새 인큐베이션시킨 후, 55℃에서 0.1% (w/v) SDS 를 함유하는 1차 세정 완충액으로 막을 세정하여, DNA 와 같은 혼성화 된 핵산분자를 검출한다.

한편, 혼성화될 수 있는 기타 핵산분자는 디폴트 변수를 사용하는 FASTA 및 BLAST 와 같은 상동성 연구 소프트웨어에 의해 계산된 바와 같이, 기재된 특정 아미노산 서열을 암호화하는 핵산분자에 약 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상의 동일성을 가진 핵산분자를 포함한다.

아미노산 서열 또는 염기 서열 사이의 동일성은 Karlin 및 Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST를 사용해 측정될 수 있으며, BLAST 알고리즘을 바탕으로 한 BLASTN 및 BLASTX 라고 하는 프로그램에 의할 수 있다. 염기 서열이 BLASTN 을 사용하여 서열화되는 경우, 변수는 예를 들어, 스코어 = 100 이고, 워드길이 = 12 이다. 아미노산 서열이 BLASTX 를 사용하여 서열화되는 경우, 변수는 예를 들어, 스코어 = 50 이고 워드 길이 = 3 이다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램이 사용되는 경우, 각각의 프로그램에 대해 디폴트 변수가 적용된다.

상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 기본서열에서 201 내지 210, 266 내지 272, 및 332 내지 340 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 변이되고, 3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환하는 활성을 가지는 변이형 폴리펩타이드를 특징으로 한다. 이하 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명에서 아미노산 '기본서열'이라는 것은 자연적으로 존재하는 야생형 폴리펩타이드 또는 적정한 방법으로 제조된 유사체 폴리펩타이드의 서열을 의미한다. 예를 들어, 유사체 폴리펩타이드는 야생형 폴리펩타이드 중 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 치환, 화학적 변이, 결실된 자연적으로 존재하는 폴리펩타이드일 수 있다.

본 발명의 '서열번호 1에 기재된 아미노산'은 숙신산 세미알데히드 데히드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase)로서, 쿠프리아비두스 네카터(Cupriavidus necator)에서 유래한 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는 서열번호 1에 기재된 폴리펩타이드이다(GenBank: AEI80961.1).

본 발명의 '변이형 폴리펩타이드'는 상기 서열번호 1에 기재된 폴리펩타이드에서 201 내지 210, 266 내지 272, 및 332 내지 340 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 변이되고, 3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환하는 활성을 갖는다.

따라서, 본 발명은 야생형(natural form) 폴리펩타이드에 관한 것이 아니라는 점을 이해해야 한다. 즉, 상기 폴리펩타이드는 자연 환경에 있는 것이 아니라, 자연 소스로부터 정제에 의해 분리 또는 획득되거나, 또는 유전자 조작(genetic manipulation)에 의해 제조된 숙주 세포로부터 획득될 수 있다(예를 들어, 폴리펩타이드, 또는 그것의 절편이 숙주 세포에 의해 재조합적으로 제조되거나 화학적으로 합성된다).

본 발명의 변이란 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 유전적 조작 또는 화학적 방법에 의한 변경을 포함하는 것으로서, 상기 변이는 야생형 폴리펩타이드에서 적어도 하나의 아미노산의 삭제, 부가, 또는 치환, 절단(truncation), 신장(extension), 키메릭 융합(융합 단백질), 돌연변이, 또는 번역후 변형(post-translational modification)을 포함할 수 있다.

본 발명의 '변이형 폴리펩타이드'(또는 폴리펩타이드 변이체)는 천연 폴리펩타이드와 비교할 때, 특이한 변형(modification)을 나타내는 폴리펩타이드를 지칭하는 것으로 이해될 수 있다. 이들 상동성 변이 폴리펩타이드들 중에서, 천연 또는 자연적으로 발생한 폴리펩타이드의 총 길이에 대하여 적어도(또는 적어도 약) 20.00% 내지 99.99% (포함)사이의 일치성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 것들이 본 발명의 또 다른 측면이다. 상기 언급한 일치성의 백분율 범위는, 0.01%의 간격으로, 20.00% 와 99.99%(포함)까지 사이의 임의의 백분율에 대해서 서술식 설명 및 지지를 제공하는 것으로서 받아들여진다. 이러한 백분율은 순수하게 통계학적이고 두 개의 폴리펩타이드 서열들 사이의 차이는 임의적이고 전체 서열 길이를 넘어서 나뉘어질 수 있다.

본 발명에 따르면 숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제의 3차원 구조를 바탕으로 활성화 위치 및 이를 바탕으로 변이시킬 위치 정보를 얻을 수 있다. 상기 효소의 구조는 통상의 기술자에게 알려진 방법에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, x-ray 결정화그래피법의 원리에 따를 수 있거나(X-Ray Structure Determination, Stout, G. K. and Jensen, L. H., John Wiley & Sons, Inc. NY, 1989) 또는 유사한 데히드로게나제의 알려진 구조 및 일반적 모델링 기법을 사용하여 모델링할 수 있다. 실질적인 3차원 모델을 얻기 위해서는 구조가 알려진 단백질의 서열과 50%, 바람직하게는 55%, 더욱 바람직하게는 60%이상으로 서열 상동성이 있는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 변이형 폴리펩타이드의 변이 정보를 얻기 위하여, 야생형의 대장균 유래 숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제(3JZ4.pdb)를 주형으로 이용한 단백질 상동성 모델링을 통해 쿠프리아비두스 네카터(Cupriavidus necator) 유래의 숙신산 세미알데히드 데히드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase)의 3차원 구조에 관한 모델링을 하였다(도 2 참조).

서열번호 1의 아미노산 서열 중 106, 117, 144, 169 및 283번째에 위치한 시스테인(Cys, C)중 모델링에 의해 활성화 위치로 파악된 283번째 시스테인을 알라닌(Ala, A)으로 치환한 후 효소 활성을 측정한 결과 효소 활성이 소실되는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).

따라서, 본 발명에 따른 변이형 폴리펩타이드는 283번째 활성화 위치 주변의 아미노산 중 201 내지 210, 266 내지 272, 332 내지 340번 residue 중 하나 이상이 변이, 구체적으로는 치환된 것을 특징으로 한다. 구체적으로는, 201Asn, 202Ile, 203Val, 204Trp, 205Gly, 206Val, 207Pro, 208Ser, 209Glu, 210Val, 266Pro, 267Ala, 268Ala, 269Glu, 270Met, 271Leu, 272Ala, 331Val, 332Leu, 333Ser, 334Met, 335Glu, 336Gln, 337Phe, 338Leu, 339Asp, 340Asp 이다.

그 중에서 치환의 대상이 되는 아미노산은 글루탐산이 선택될 수 있으며, 209번째, 269번째 및 335번째의 글루탐산에서 선택된 하나 이상의 글루탐산일 수 있다. 상기 글루탐산이 변이 대상 아미노산으로 선택되는 이유는 알데히드 데히드로게나제의 기질인 3-HPA와의 반응성을 향상시킬 수 있기 때문이다.

상기 지정된 위치는 기질인 3-HPA가 데히드로게나제와 반응을 하는 부분으로 이 부분의 아미노산이 곁사슬로 기질을 보다 용이하게 잡아주는 아스파라진(Asn, N), 글루타민(Gln, Q), 라이신(Lys, K)등으로 바뀌게 되면 효소의 활성화 위치와 기질의 거리가 가까워져 반응성이 더욱 증가하게 되기 때문이다. 이들은 또한 주변에 기질들이 존재할 경우 기질을 보다 강한 결합력으로 붙잡아주어 효소의 활성화 위치에 기질이 보다 정확하고 안정적으로 결합할 수 있도록 도움을 주는 것으로 예상된다.

본 발명에 따른 상술한 아미노산 변이는 원칙적으로 기본서열에 존재하는 적어도 하나의 아미노산의 삭제, 부가, 또는 치환, 절단(truncation), 신장(extension), 키메릭 융합(융합 단백질), 돌연변이, 또는 번역후 변형(post-translational modification)을 나타내는 폴리펩타이드를 포함하며, 모든 예들에서 변이형 폴리펩타이드는 숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제의 활성을 유지한다.

상기 치환에서 치환된 아미노산은 치환의 대상이 되는 기본서열의 아미노산과 상이한 아미노산이면 제한되지 않으나, 본 분야의 통상의 기술자에게 특정 위치에 존재하는 아미노산 잔기를 화학적으로 동등한 아미노산으로 치환하여 전체 폴리펩타이드가 갖는 활성은 유지하는 것은 잘 알려져 있다. 따라서, 하기 표 1에 기재된 것과 같이 다섯 그룹으로 나누어진 그룹 내에서 변이를 형성할 수 있다.

1	소형 지방족, 비극성 또는 약한 극성 잔기	Ala, Ser, Thr, Pro, Gly
2	극성, 음성 전하 잔기	Asp, Asn, Glu, Gln
3	극성, 양성 전하 잔기	His, Arg, Lys
4	대형 지방족, 비극성 잔기	Met, Leu, Ile, Val, Cys
5	대형 방향족 잔기	Phe, Tyr, Trp

따라서, 본 발명의 변이형 폴리펩타이드는 상술한 기본서열의 특정 위치의 아미노산은 하나 이상이 방향족 고리를 포함하는 아미노산이나 질소기가 함유된 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 보다 구체적으로 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판, 글루타민, 히스티딘, 라이신 및 아르기닌 중에서 기본서열의 아미노산과 상이한 것으로 선택된 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.

방향족 고리를 포함하는 아미노산에는 페닐알라닌(Phe, F), 타이로신(Tyr, Y), 트립토판(Trp, W)이, 질소기를 함유하는 아미노산에는 글루타민(Gln, Q), 히스티딘(His, H), 라이신(Lsy, K), 아르기닌(Arg, R)이 포함된다. 바람직하게는 글루타민이다.

본 발명에 따른 변이형 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 기본서열에서 209, 269 및 335 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산에서 변이된 것, 보다 구체적으로는 해당 위치의 아미노산인 글루탐산이 글루타민으로 치환된 것일 수 있다.

이를 간략하게 표시하면, 209번째 위치인 글루탐산이 글루타민으로 치환된 것은 'E209Q', 269번째 위치인 글루탐산이 글루타민으로 치환된 것은 'E269Q', 209 및 269번째 위치인 글루탐산이 글루타민으로 모두 치환(복합변이)된 것은 'E209,269Q'같은 방식으로 나타낼 수 있고, 이하 동일한 방식으로 표현한다.

본 발명의 일례로 상기 서열번호 1에 기재된 폴리펩타이드에서 209, 269 및 335 위치의 아미노산인 글루탐산이 글루타민으로 변이되어 서열번호 2에 기재된 폴리펩타이드 서열로 표기될 수 있고, 3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환하는 활성을 갖는다.

또한, 상술한 변이형 폴리펩타이드에 대응하는 아미노산 서열 중 하나 이상의 위치에서 아미노산이 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의한 변이되어 실질적으로 동일성을 갖는 폴리펩타이드도 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명에 따르면,

(a) (1) 서열번호 1의 아미노산 기본서열에서 201 내지 210, 266 내지 272, 및 332 내지 340 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 변이; (2) 서열번호 1의 아미노산 기본서열에서 201 내지 210, 266 내지 272, 및 332 내지 340 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판, 글루타민, 히스티딘, 라이신 및 아르기닌 중에서 기본서열의 아미노산과 상이한 것으로 선택된 아미노산으로 치환되는 변이; (3) 서열번호 1의 아미노산 기본서열에서 209, 269 및 335 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 변이; (4) 서열번호 1의 아미노산 기본서열에서 209, 269 및 335 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판, 글루타민, 히스티딘, 라이신 및 아르기닌 중에서 기본서열의 아미노산과 상이한 것으로 선택된 아미노산으로 치환되는 변이 선택된 하나의 변이를 갖고, 3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환하는 활성을 가지는 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열;

(b) 상기 (a)에 상보적 서열; 및

(c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 염기서열 중에서 선택된 어느 하나로 이루어진 핵산분자를 제공한다.

유전자 코드의 축중성(degenerate nature)으로 인하여, 염기 서열에서 상이한 다양한 DNA화합물이 본 발명의 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는데 이용될 수 있음은 통상의 기술자에게 자명하다.

또한, 상술한 변이형 폴리펩타이드 중 하나 이상의 위치에서 아미노산이 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의한 변이되어 실질적으로 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열로 이루어진 핵산분자도 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명은 자연 환경 또는 자연 상태에 있는 게놈 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 것이 아니라는 점을 이해해야 한다. 본 발명의 핵산, 폴리뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 서열은, 이온교환 크로마토그래피, 분자크기분리(molecular size exclusion) 크로마토그래피 등을 포함하지만 이들에만 한정되지 않는 분리 방법, 또는 증폭(amplification), 감쇄 혼성결합법(subtractive hybridization), 클로닝, 서브클로닝(subcloning) 또는 화학 합성과 같은 유전공학 방법 또는 이들 유전공학 방법들의 결합에 의해 분리, 정제(부분적 정제)될 수 있다.

본 발명은 상술한 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 핵산분자들은 하나의 발현벡터에 삽입되거나 별도의 발현벡터에 삽입될 수 있다.

상기 발현벡터는 상술한 핵산분자를 발현할 수 있는 것이면 제한되지 않고 통상적인 발현벡터가 사용될 수 있으나, 그것이 도입될 숙주 세포에 따라 적절한 것으로 선택될 수 있다. 예컨데 선형 또는 폐쇄형 환형 플라즈미드나 바이러스 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 벡터는 플라즈미드, 염색체외 요소, 미니 염색체, 인공 염색체 등과 같이 염색체 외에 존재하여 염색체 복제와는 무관하게 독립적으로 자가 복제능을 갖는 벡터가 사용될 수 있다. 상기 자가 복제능을 갖는 박테리아의 복제 원점으로는 pBR322, pUC19, pACYC177, pACYC184, pUB110, pE194, pTA1060, and pAMβ1이 사용될 수 있다. 효모 숙주 세포에서의 복제 원점 예로는 CEN6 and ARS4의 조합이나 CEN3 and ARS1의 조합이 있다. 상기 복제 원점에 대한 돌연변이는 온도에 민감한 숙주 세포로 기능할 수 있도록 할 수 있다(Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1433).

또 다른 방법으로 본 발명에 따른 재조합 벡터는 숙주 세포의 게놈으로 도입되어 그 결합된 염색체와 함께 복제될 수도 있다. 상기 재조합 벡터는 게놈으로 도입을 촉진하는, 특히 상동 재조합 또는 비상동 재조합에 의해 게놈으로의 도입을 촉진하는 염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 단일 벡터이거나, 숙주 세포나 트랜스포손(transposon)에 도입될 전체 유전자를 함께 포함하고 있는 두 개 이상의 벡터일 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 벡터는 3-HP 생합성에 관여하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산분자를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 벡터는 글리세롤 데히드라타제(glycerol dehydratase) 또는 디올 데히드라타제 (diol dehydratase)(이하, 간단히 '글리세롤 데히드라타제'라 칭함) 를 암호화하는 핵산분자를 추가로 포함할 수 있다.

상기 글리세롤 데히드라타제는 미생물 배양시 탄소원(carbon source)으로 사용된 글리세롤을 3-HPA로 전환할 수 있는 임의의 글리세롤 데히드라타제 효소가 이용될 수 있다. 상기 글리세롤 탈수효소는 비타민 B₁₂ 의존성과 비의존성 모두가 사용될 수 있다.

구체적으로는 클랩시엘라 속(Klebsiella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 클로스트리디움 속(Clostridium sp.), 살로넬라 속(Salmonella sp.) 균주 등에서 유래한 글리세롤 데히드라타제를 예로 들 수 있다. 보다 구체적으로는 클렙시엘라 뉴모니아 유래의 DhaB1, DhaB2 및 DhaB3 또는 클로스트리디움 부티리쿰 유래의 DhaB1을 들 수 있다. 일례로, 클랩시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae) 유래 글리세롤 데히드라타제이며, 서열번호 3, 4 및 5로 각각 표시되는 폴리펩타이드(각각 DhaB1, DhaB2, DhaB3)를 포함할 수 있다.

상기 글리세롤 데히드라타제를 암호화하는 염기 서열은, 상기 서열번호 3, 4 및 5로 표현되는 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열 또는 서열번호 8, 9 및 10으로 표현된 염기서열(각각 dhaB1, dhaB2, dhaB3)을 포함할 수 있다.

상기 염기서열에 혼성화되는 서열, 상보적인 서열 또는 상보적인 서열에 혼성화되는 서열일 수 있으며, 또한 상술한 변이형 폴리펩타이드 중 하나 이상의 위치에서 아미노산이 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의한 변이되어 실질적으로 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열로 이루어진 핵산분자도 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명에 따른 재조합 벡터는 글리세롤 데히드라타제를 재활성화시키기 위한 글리세롤 데히드라타제 재활성화 인자를 암호화하는 염기서열을 추가로 포함할 수도 있다. 본 발명의 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자는, 글리세롤 데하이드라타제가 작용하는 동안 비가역적으로 불활성화되는 것을 다시 활성화시켜주는 폴리펩타이드이다.

글리세롤 데히드라타제 재활성화 인자로 일반적으로 알려진 어느 것이라도 사용할 수 있으나, 클랩시엘라 속(Klebsiella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 살모넬라 속(Salmonella sp.) 균주 등에서 유래한 글리세롤 데히드라타제 재활성화 인자가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 글리세롤 데히드라타제를 제공하는 미생물과 동종의 미생물이다. 구체적으로는 상기 데하이드라타제 재활성화 인자는 DhaFG, GdrAB, DdrAB 등일 수 있으며, 이를 암호화하는 염기서열은 dhaFG(ABI36568.1), gdrAB(EF077655.1), ddrAB(AAC15871) 등으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일례에서, 상기 글리세롤 데히드라타제 재활성화 인자는 클렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae) 유래 글리세롤 데히드라타제 재활성화 인자로서(각각 GdrA 및 GdrB), 서열번호 6 및 7로 표현되는 폴리펩타이드를 포함하는 것이며, 상기 재활성화 인자를 암호화하는 염기서열은 서열번호 6 및 7로 표현되는 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열, 또는 서열번호 11 및 12로 표현된 염기서열(각각 gdrA, gdrB)을 포함하는 서열이 사용될 수 있다.

상기 재조합 벡터는 유전자의 발현에 요구되는 추가적인 유전자 부위(segment) 또는 조절 서열(control sequence)와 작동가능 하도록 연결되어 발현될 수 있다. '작동가능 하도록 연결'된다는 의미는 예를 들어 프로모터 부위에서 전사가 개시되어 본 발명의 변이형 폴리펩타이드를 암호화 하는 염기 서열로 진행하여 본 발명의 목적인 변이형 폴리텝타이드를 합성하도록 핵산분자 부위들이 정렬된 것을 의미한다. 상기 추가적인 유전자 부위(segment) 또는 조절 서열(control sequence)는 예를 들어 프로모터, 폴리아데닐화 서열, 프로펩타이드 서열, 신호 서열 및 전사 종결 부위 등이 있다. 최소한 프로모터 및 전사 또는 번역 종결부를 포함한다.

본 발명의 재조합 벡터에 사용될 수 있는 프로모터는 상기 벡터가 도입된 숙주세포 내에서 활성을 갖는 것이면 제한되지 않으며, 선택된 숙주세포와 동형 또는 이형의 단백질을 암호화하는 유전자로부터 분리될 수 있다.

본 발명에 적용될 수 있는 박테리아 숙주세포에 적절한 프로모터의 예로는, 바실러스 서브틸리스 레반수크라제(Bacillus subtilis levansucrase) 유전자(sacB), 바실러스 스테아로써모필러스 말토제닉 아밀라제(Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase) 유전자(amyM), 바실러스 리체니포르미스 알파-아밀라제(Bacillus licheniformis alpha-amylase) 유전자(amyL), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 알파-아밀라제(Bacillus amyloliquefaciens alpha-amylase) 유전자(amyQ), 바실러스 서브틸리스 알카린 프로타제(Bacillus subtilis alkaline protease) 유전자, 바실러스 푸밀러스 자일로시다제(Bacillus pumilus xylosidase) 유전자, 바실러스 아밀로퀘파시엔스 BAN 아밀라제(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase) 유전자, 바실러스 리체니포르미스 페니실리나제(Bacillus licheniformis penicillinase) 유전자(penP), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) xylA와 xylB 유전자, 원핵세포(prokaryotic)의 베타-락타마제(beta-lactamase) 유전자 (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727-3731) 등으로부터 유래된 것이 있으며, 또 다른 예로는 파지 람다(phage Lambda) PR 또는 PL 프로모터, 대장균의 lac, trp 또는 tac 프로모터, 또는 스트렙토마이세스 코엘리칼라 아가라제(Streptomyces coelicolor agarase) 유전자(dagA) 등도 있다.

본 발명에 적용될 수 있는 곰팡이 숙주세포에 적절한 프로모터의 예로는, 아스퍼질러스 오리제 TAKA 아밀라제(pergillus oryzae TAKA amylase), 리조뮤코 마이헤이 아스파틱 프로테나아제(izomucor miehei aspartic proteinase), 아스퍼질러스 나이거 중성 알파-아밀라제(Aspergillus niger neutral alpha-amylase), 아스퍼질러스 나이거 내산성 알파-아밀라제(Aspergillus niger acid stable alpha-amylase), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 또는 아스퍼질러스 아와모리 글루코아밀라제(Aspergillus awamori glucoamylase, glaA), 리조뮤코 마이헤이 리파제(Rhizomucor miehei lipase), 아스퍼질러스 오리제 알카린 프로테아제(Aspergillus oryzae alkaline protease), 아스퍼질러스 오리제 트리오스 포스페이트 아이소머라아제(Aspergillus oryzae triose phosphate isomerase), 아스퍼질러스 나이둘란스 아세타미다제(Aspergillus nidulans acetamidase), 후자리움 옥시스포럼 트립신 유사 프로타제(Fusarium oxysporum trypsin-like protease, 미국등록특허 4,288,627 참조) 등을 암호화하는 유전자로부터 유래된 것이 있으며, 또한 ADH3 프로모터 (McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093-2099) 또는 tpiA 프로모터 등도 있다.

본 발명에 적용될 수 있는 효모 숙주세포에 적절한 프로모터의 예로는, 효모의 당분해 관련 유전자(Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073-12080; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434), 알코올 데히드로게나제(alcohol dehydrogenase) 유전자(Hollaender et al, eds., Plenum Press, New York, 1982)로부터 유래된 프로모터 또는 TPI1(미국등록특허 제4,599,311호) 또는 ADH2-4-c (Russell et al., Nature 304 (1983), 652-654) 프로모터 등이 있다.

본 발명에 따른 재조합 벡터는 상술한 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 필요한 경우 적절한 종결부위를 연결할 수도 있다.

또한, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 숙주세포의 복제를 가능하게 하거나 향상시키기 위하여 필요한 유전자 또는 선별마커 등을 더 포함할 수 있다.

상기 사용될 수 있는 선별마커로는 암피실린(ampicillin), 가나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 에리스토마이신(erythromycin), 테트라사이클린(tetracycline), 스펙티노마이신(spectinomycine), 네오마이신(neomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 메토트랙세이트(methotrexate)와 같은 항생제에 대한 내성 유전자이거나, 또는 중금속, 바이러스 등에 내성을 나타내는 유전자 등이 있다.

예를 들어 박테리아 선별마커로는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)로부터 유래한 dal 유전자가 있으며, 효모 선별마커로는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, 및 URA3 등이 있으며, 곰팡이 선별마커로는 amdS(아세타미다제, acetamidase), argB(오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제, ornithine carbamoyltransferase), bar(포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제, phosphinothricin acetyltransferase), hygB(히그로마이신 포스포트랜스퍼라제, hygromycin phosphotransferase), niaD(나이트레이트 리덕타제, nitrate reductase), pyrG(오로티딘-5'-포스페이트 디카르복실라제, orotidine-5'-phosphate decarboxylase), sC(설페이트 아데닐트랜스퍼라제, sulfate adenyltransferase), trpC(안트라닐레이트 신테이즈, anthranilate synthase) 및 글로포시네이트 저항성(glufosinate resistance) 마커 등이 있다.

본 발명은 상술한 재조합 벡터 중 하나 이상을 숙주 세포에 도입한 형질전환체를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 알려진 방법으로 숙주 세포 내 도입될 수 있다.

본 발명의 형질전환체는 재조합 벡터와 같은 발현카세트로 숙주 세포에 도입하는 형질전환 방법에 의하여 만들어질 수 있으며, 상기 도입 방법 역시 공지의 기술, 예컨데 염화칼슘법, 열 충격법, 전기충격법 등의 형질전환방법이나 재조합 파지 바이러스를 통한 형질주입을 통해 도입할 수 있다. 상기의 숙주 세포 이외에도 발현의 목적에 따라 달라지는 벡터에 의존하여 다양한 균주를 용이하게 이용할 수 있음은 당업자에게 명백한 일이다.

상기 각 폴리뉴클레오타이드는 동일 또는 상이한 프로모터에 각각 작동되도록 연결될 수 있다. 일례로 글리세롤 데하이라타제 및 그 활성화 인자는 동일 프로모터에 작동되도록 연결될 수 있다.

본 발명에 따른 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산분자를 두 카피 이상 숙주 세포에 도입하여 발현을 증폭시킬 수 있다. 이 경우 최소한 한 카피의 추가적인 핵산분자를 숙주세포의 게놈과 연결하여 안정적으로 유전자를 증폭할 수 있다.

본 발명의 형질전환체의 제조에 사용 가능한 숙주세포는 본 발명의 변이형 폴리펩타이를 발현할 수 있는 것이면 모두 가능하고, 박테리아, 효모, 곰팡이 등이고 이에 제한되지 않는다.

일례로 에스케리키아(Escherichia) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 엔테로박테리아(Enterobacteria) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 클렙시엘라(Klebsiella) 속, 시트로박터(Citrobacter) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 사카로마이세스(Saccharomyces)속 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 미생물 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 대장균, 클렙시엘라, 락토바실러스 등과 같은 박테리아일 수 있다. 가장 바람직하게는 대장균이다.

보다 구체적으로 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 렌투스(Bacillus lentus), 바실러스 브레비스(Bacillus brevis), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus), 바실러스 알킬로필러스(Bacillus alkalophilus), 바실러스 아미노퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans), 바실러스 라우투스(Bacillus lautus), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 또는 바실러스 서린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 등과 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 또는 스트렙토마이세스 뮤리너스(Streptomyces murinus)와 같은 스트렙토마이세스 속 균주, 대장균(Escherichia coli) 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 속과 같은 그램 음성균이 있다.

또한, 효모 숙주세포의 구체적인 예로는, 사카로마이세스 칼스베르지네시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 디아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 도우글라시이(Saccharomyces douglasii), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 사카로마이세스 오비포르미스(Saccharomyces oviformis), 클루이버마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이버마이세스 프라질리스(Kluyveromyces fragilis), 한세훌라 폴리모파(Hansehula polymorpha), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 우스틸고 메일리스(Ustilgo maylis), 칸디다 말토스(Candida maltose), 피키아 구일레르몬디이(Pichia guillermondii), 피키아 메타놀리오(Pichia methanolio) 등이 있다.

또한, 곰팡이 숙주세포의 구체적인 예로는, 아크레모니움 크리소지넘(Acremonium chrysogenum)과 같은 아크레모니움(Acremonium), 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 포에티더스(Aspergillus foetidus), 아스퍼질러스 자포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 니덜란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 후자리움 박트리디오이데스(Fusarium bactridioides), 후자리움 세레알리즈(Fusarium cerealis), 후자리움 크룩웰렌스(Fusarium crookwellense), 후자리움 쿨모럼(Fusarium culmorum), 후자리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 후자리움 그라미넘(Fusarium graminum), 후자리움 헤테로스포럼(Fusarium heterosporum), 후자리움 네건디(Fusarium negundi), 후자리움 레티쿨라텀(Fusarium reticulatum), 후자리움 로세움(Fusarium roseum), 후자리움 삼부시넘(Fusarium sambucinum), 후자리움 사코크로움(Fusarium sarcochroum), 후자리움 설푸레움(Fusarium sulphureum), 후자리움 트리코테시오이즈(Fusarium trichothecioides), 후자리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 후미콜라 인솔렌즈(Humicola insolens), 후미콜라 라너기노즈(Humicola lanuginose), 뮤코 마이헤이(Mucor miehei), 마이셀리오프토라 써모필리움(Myceliophthora thermophilum), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 페니실리움 퓨퍼로지눔(Penicillium purpurogenum), 씨엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 트리코더마 하지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코더마 코닌지이(Trichoderma koningii), 트리코더마 롱지브라치아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트리코더마 리쎄이(Trichoderma reesei), 트리코더마 비리데(Trichoderma viride), 또는 그의 완전세대형(telemorph) 또는 동의어 등이 모두 포함된다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 기본서열에서 201 내지 210, 266 내지 272, 및 332 내지 340 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산을 변이하는 단계를 포함하는 변이형 폴리펩타이드 제조방법을 제공한다.

그 중에서 상기 서열번호 1의 아미노산 기본서열에서 209, 269 및 335 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산을 변이할 수 있다.

상기 아미노산에 대한 변이는 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판, 글루타민, 히스티딘, 라이신 및 아르기닌 중에서 기본서열의 아미노산과 상이한 것으로 선택된 아미노산으로 치환하는 것일 수 있다.

상기 아미노산의 변이 위치 및 변이 종류에 대한 구체적인 내용은 상술한 바와 같다.

본 발명의 변이형 폴리펩타이드는 야생형 폴리페타이드를 암호화하는 핵산분자에 상술한 특정 위치에 통상의 기술자가 적용할 수 있는 점 돌연변이를 일으켜서 변이 유전자를 얻고, 이를 발현 벡터에 도입하고 숙주 세포를 배양하여 얻을 수 있다. 야생형 단백질을 암호화하는 유전자는 그 단백질을 생산하는 미생물로부터 클로닝하여 얻을 수 있다(발현 라이브러리나 게놈 DNA, cDNA 등을 통해). 또는 유전자를 합성하여 얻을 수도 있다. 본 발명의 변이형 폴리펩타이드를 얻기 위하여 유전자를 클로닝하고 변이를 도입하는 방법은 일반적으로 알려진 방법을 사용할 수 있다((Sambrook et al. (1989), Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, N. Y.; Ausubel, F. M. et al. (eds.)); Current protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.))등 참조).

본 발명은 상술한 형질전환체를 배양하는 단계 및 상기 배양에서 제조된 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환하는 활성을 가지는 변이형 폴리펩타이드 제조방법을 제공한다.

본 발명에 사용될 수 있는 형질전환체에 대한 구체적인 내용은 상술한 바와 같다.

본 발명의 변이형 폴리펩타이드를 발현하기 위하여 본 발명의 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산서열을 포함하는 벡터를 숙주세포에 도입하여 제조한 형질전환체를 적절한 배지에서 배양시킬 수 있다.

상기 형질전환체의 배양을 위한 배지는 그를 생장시키기에 적절한 배지이며 되고, 적절한 보충성분이 들어간 최소 배지 또는 복합배지일 수 있으며, 배지는 당업계에 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다(Bennett, J. W. and LaSure, L., editors, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991 참조).

본 발명의 변이형 폴리펩타이드는 항체, 생성물의 생성 여부 측정, 기질의 소모 등 알려진 방법을 통해 발현여부를 확인할 수 있다. 또한 본 발명의 효소는 크로마토그래피(예를 들면, 이온교환, 친화도, 소수성, 크로마토포커싱 및 사이즈배제 크로마토그래피 등), 전기영동(예를 들면, preparative isoelectric focusing (IEF)), 추출(예를 들면, 단백질 정제, J-C Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 참조) 등 공지의 방법에 따라 정제할 수 있다.

본 발명의 변이형 폴리펩타이드 제조방법은 3-히드록시프로피온알데히드(3-Hydroxypropionaldehyde)가 존재하거나 3-히드록시프로피온알데히드가 생산되는 조건에서, 상술한 형질전환체를 배양하는 단계를 포함한다.

상기 변이형 폴리펩타이드, 형질전환체 및 그 배양방법의 구체적인 내용은 상술한 바와 같다.

본 발명은 또한 3-히드록시프로피온알데히드(3-HPA)가 존재하거나 3-HPA가 생산되는 조건에서 상술한 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 3-히드록시프로피온산(3-HP)의 생산방법을 제공한다.

상기 형질전환체의 구체적인 내용은 상술한 바와 같으며, 3-히드록시프로피온알데히드(3-HPA)의 생산을 위해 탄소원(carbon source)으로 글리세롤, 글루코스 또는 이들의 혼합물, 구체적으로는 글리세롤을 포함하는 배지가 사용될 수 있으며, 배지가 글루코스를 포함하는 경우 글루코스를 글리세롤로 전환하지 못하는 미생물의 경우에는 공지의 방법으로 전환에 필요한 외래 유전자를 도입시켜 글루코스로부터 글리세롤이 생산되도록 할 수 있다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

[ 실시예 1] : 쿠프리아비두스 네카터(Cupriavidus necator) 유래의 숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작

쿠프리아비두스 네카터(Cupriavidus necator) ATCC 17699로부터 게놈 DNA를 추출하고, 정방향 프라이머(서열번호 13: AAAGCTAGCATGTACCAGGATCTCGCCC) 및 역방향 프라이머(서열번호 14: AATGGTACCTCAGGCCTGGGTGATGAACTT)를 이용하여 gabD4 유전자를 증폭한 후, NheI과 KpnI으로 절단하였다.

상기 PCR은 CycleⅠ (95℃, 5분), CycleⅡ(30 cycles/ 95℃, 30초 / 55℃, 30초 / 72℃, 2분), CycleⅢ (72℃, 5분)의 과정으로 수행되었다. 증폭된 DNA를 동일 효소로 처리한 pTrcHisC 벡터(Invitrogen)에 도입하여 pTH-Cn-gabD4 벡터를 제작하였다(도 3 참조).

[ 실시예 2] : 쿠프리아비두스 네카터(Cupriavidus necator) 유래의 숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase)의 활성화 위치 파악

1. 돌연변이 균주의 제작

<단계 1>

실시예 1의 쿠프리아비두스 네카터 ATCC 17699로부터 얻은 게놈 DNA를 주형으로 정방향 프라이머(서열번호 13: AAAGCTAGCATGTACCAGGATCTCGCCC)와 역방향 프라이머(서열번호 27: CGGCGACACTCGTACCTGGC)를 이용하여 1^st-PCR을 수행해 돌연변이 데하이드로게나제의 일부를 만들었다.

동일한 게놈 DNA를 주형으로 정방향 프라이머(서열번호 28: GCCAGGTACGAGTGTCGCCG)와 역방향 프라이머(서열번호 14: AATGGTACCTCAGGCCTGGGTGATGAACTT)를 이용하여 2^nd-PCR을 수행해 돌연변이 데하이드로게나제의 나머지 일부를 제작했다.

상기 1^st-PCR와 2^nd-PCR로 얻어진 각각의 생산물들을 이어지는 중복 PCR(overlap PCR)의 주형으로 이용하고, 정방향 프라이머(서열번호 13: AAAGCTAGCATGTACCAGGATCTCGCCC)와 역방향 프라이머(서열번호 14: AATGGTACCTCAGGCCTGGGTGATGAACTT)를 첨가하여 PCR을 수행하여 283번째 아미노산인 시스테인이 알라닌으로 변환(Cys283Ala, C283A)된 완전한 형태의 돌연변이 데하이드로게나제 유전자를 얻었다.

상기 모든 PCR은 CycleⅠ (95℃, 5분), CycleⅡ (30 cycles / 95℃, 30초 / 55℃, 30초 / 72℃, 2분), CycleⅢ (72℃, 5분)의 과정으로 수행되었다.

<단계 2>

일리오박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus, DSM 2926)로부터 게놈 DNA를 추출하고, 글리세롤 데히드라타제(dhaB1, dhaB2, dhaB3)를 암호화하는 유전자를 얻기 위하여 상기 게놈에 대해 정방향 프라이머(서열번호 23: TCATGAAATCAAAAAGATTTGAAGTATTGAAG)와 역방향 프라이머(서열번호 24: GGATCCCTAATCTTTTCTAAGTTGACCTCTTTGTTC)를 이용해 증폭하여 2.6 kbp 크기의 단편을 얻었다.

또한 글리세롤 데히드라타네의 재활성화인자인 gdrA, gdrB 유전자를 얻기 위하여 정방향 프라이머(서열번호 25: GGATCCAAAGGTTCGGGGATAGTTATGAAG)와 역방향 프라이머(서열번호 26: GAGCTCTTATCTAAGTGGCAGACCCTTTACAAG)를 이용해 각각 증폭하여 2.1 kbp 크기의 단편을 얻었다.

상기 PCR은 CycleⅠ (98℃, 30초), CycleⅡ (30 cycles / 98℃, 10초 / 55℃, 1분 / 72℃, 2분), CycleⅢ (72℃, 5분)의 과정으로 수행되었다.

상기에서 증폭된 각각의 유전자들 중, dhaB1, dhaB2 및 dhaB3를 포함하는 2.6 kbp 단편은 제한효소 BspHI과 BamHI으로 처리하고, gdrA 및 gdrB를 포함하는 2.1 kbp 단편은 제한효소 BamHI과 SacI으로 처리한 후, pET-Duet(Novagen) 벡터의 NcoI-EcoRI 및 EcoRI-SacI 위치에 각각 삽입하여 ET-iBAB벡터를 제조하였다.

<단계 3>

상기 단계 2에서 제작된 ET-iBAB를 제한효소 SalI-HF와 AvrII로 처리한 후, 상기 단계 1에서 만들어진 Cys283Ala 돌연변이(C283A) 데하이드로게나제 유전자도 동일한 제한효소로 처리하여 ET-iBAB-Cys283Ala gabD4 벡터를 완성하였으며, 이를 대장균에 도입하여 형질전환시켜 재조합 균주를 제작하였다.

2. 균주의 배양

37℃에서 250 mL 플라스크를 사용하여 50 mL 배지(12.8 g/L 인산수소이나트륨(Na₂HPO₄-7H₂O), 3 g/L 인산이수소칼륨(KH₂PO₄), 1.5 g/L 염화나트륨(NaCl), 2 g/L 염화암모늄(NH₄Cl), 17.4 g/L 인산수소이칼륨(K₂HPO₄), 0.5 g/L 효모 추출물(yeast extract), 3 mL 1M 황산마그네슘(MgSO₄), 0.1 mL 1M 염화칼슘(CaCl₂), 40 g/L 글리세롤(Glycerol), pH 7.8)에서 배양한 다음, 600nm에서 측정한 흡광도가 0.6~0.8일 때, 0.01 mM IPTG 및 48μM 비타민 B₁₂를 첨가함으로써 단백질의 발현 및 3-HP 생산을 유도하였다.

배양 후 24, 48시간째에 배양액 중 일부를 추출하여 흡광도(OD) 및 pH를 측정하고 HPLC(high performance liquid chromatography)를 이용하여 3-HP 생산을 확인하였다.

3. 3-HP 분석

3-HP 분석시 Aminex HPX-87H (300mm*7.8mm) 컬럼을 사용하였고, 이동상은 0.5mM 황산용액에 9% 아세토나이트릴(acetonitrile)이 함유된 용액을 사용하여 유속 0.4 ml/min으로 흘려주었다. 컬럼의 온도는 35℃였으며, 검출기는 RI 및 UV/VIS (210 nm) 듀얼모드를 이용하였다.

상술한 방법으로 제작된 재조합 균주에 의한 3-HP 생산량은 도 4에 도시하였다. Cys283Ala 돌연변이(C283A) 데하이드로게나제에 의한 3-HP생산량(1.7 g/L)이 대조군(야생형, GabD)의 3-HP 생산량(13.1 g/L)에 비해 87 % 가량 낮았다.

또한 C283A 돌연변이 데하이드로게나제를 포함하는 균주는 대조군(GabD)에 비하여 균주의 생장도 느려짐을 알 수 있다.

상기 결과로부터 283번째 아미노산인 시스테인의 위치가 쿠프리아비두스 네카터(Cupriavidus necator) 유래의 숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase)의 활성화 위치임을 알 수 있다.

[ 실시예 3] : 점돌연변이 유도된 쿠프리아비두스 네카터(Cupriavidus necator) 유래의 숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase) 유전자의 제조와 이를 포함하는 재조합 벡터의 제작

<1> E209Q 변이형 데하이드로게나제 제작

실시예 1에서 추출된 숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase)의 게놈 DNA를 주형으로 정방향 프라이머(서열번호 13: AAAGCTAGCATGTACCAGGATCTCGCCC)와 역방향 프라이머(서열번호 17: GTCGAGACCTGGCTGGG)로 1^st-PCR을 수행해 돌연변이 데하이드로게나제의 일부를 만들었다.

동일한 게놈 DNA를 주형으로 정방향 프라이머(서열번호 18: CCCAGCCAGGTCTCGAC)와 역방향 프라이머(서열번호 14: AATGGTACCTCAGGCCTGGGTGATGAACTT)로 2^nd-PCR을 수행해 돌연변이 데하이드로게나제의 나머지 일부를 제작했다.

1^st-PCR와 2^nd-PCR로 얻어진 각각의 생산물들을 이어지는 중복 PCR(overlap PCR)의 주형으로 이용하고 정방향 프라이머(서열번호 13: AAAGCTAGCATGTACCAGGATCTCGCCC)와 역방향 프라이머(서열번호 14: AATGGTACCTCAGGCCTGGGTGATGAACTT)를 첨가하여 PCR을 수행하여 209번째 아미노산이 글루타민으로 변환(E209Q)된 완전한 형태의 돌연변이 데하이드로게나제 유전자를 얻고 DNA 서열분석법으로 서열을 확인하였다.

상기 모든 PCR은 CycleⅠ (95℃, 5분), CycleⅡ (30 cycles/ 95℃, 30초 / 55℃, 30초 / 72℃, 2분), CycleⅢ (72℃, 5분)의 과정으로 수행되었다.

<2> E269Q 변이형 데하이드로게나제 제작

실시예 1에서 추출된 숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase)의 게놈 DNA를 주형으로 정방향 프라이머(서열번호 13: AAAGCTAGCATGTACCAGGATCTCGCCC)와 역방향 프라이머(서열번호 19: CCAGCATCTGGGCGG)로 1^st-PCR을 수행해 돌연변이 데하이드로게나제의 일부를 만들었다.

동일한 게놈 DNA를 주형으로 정방향 프라이머(서열번호 20: CCGCCCAGATGCTGG)와 역방향 프라이머(서열번호 14: AATGGTACCTCAGGCCTGGGTGATGAACTT)로 2^nd-PCR을 수행해 돌연변이 데하이드로게나제의 나머지 일부를 제작했다.

1^st-PCR와 2^nd-PCR로 얻어진 각각의 생산물들을 이어지는 중복 PCR(overlap-PCR)의 주형으로 이용하고 정방향 프라이머(서열번호 13: AAAGCTAGCATGTACCAGGATCTCGCCC)와 역방향 프라이머(서열번호 14: AATGGTACCTCAGGCCTGGGTGATGAACTT)를 첨가하여 PCR을 수행하여 269번째 아미노산이 글루타민으로 변환(E269Q)된 완전한 형태의 돌연변이 데하이드로게나제 유전자를 얻고, DNA 서열분석법으로 서열을 확인하였다.

<3> E335Q 변이형 데하이드로게나제 제작

실시예 1에서 추출된 숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase)의 게놈 DNA를 주형으로 정방향 프라이머(서열번호 13: AAAGCTAGCATGTACCAGGATCTCGCCC)와 역방향 프라이머(서열번호 21: CCAGGAACTGCTGCATTGAC)로 1^st-PCR을 수행해 돌연변이 데하이드로게나제의 일부를 만들었다.

동일한 게놈 DNA를 주형으로 정방향 프라이머(서열번호 22: GTCAATGCAGCAGTTCCTGG)와 역방향 프라이머(서열번호 14: AATGGTACCTCAGGCCTGGGTGATGAACTT)로 2^nd-PCR을 수행해 돌연변이 데하이드로게나제의 나머지 일부를 제작했다.

1^st-PCR와 2^nd-PCR로 얻어진 각각의 생산물들을 이어지는 중복 PCR(overlap-PCR)의 주형으로 이용하고 정방향 프라이머(서열번호 13: AAAGCTAGCATGTACCAGGATCTCGCCC)와 역방향 프라이머(서열번호 14: AATGGTACCTCAGGCCTGGGTGATGAACTT)를 첨가하여 PCR을 수행하여 335번째 아미노산이 글루타민으로 변환(E335Q)된 완전한 형태의 돌연변이 데하이드로게나제 유전자를 얻고, DNA 서열분석법으로 서열을 확인하였다.

<4> 복합돌연변이 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작

상술한 과정과 동일한 프라이머, 제한효소 및 벡터를 사용하되, 단일돌연변이 과정을 수행한 후 하나의 돌연변이가 확인이 되면 이 결과물을 가지고 다시 상술한 과정을 수행하여 다른 위치에서의 돌연변이를 유도해 두 개 이상의 위치에서 돌연변이를 유도하여, 두 개 이상의 위치에서 돌연변이가 유도된 pTH-Cn-mutgabD4 벡터들을 제작하였다.

<5> 각각의 돌연변이 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작

상기 <1>,<2>,<3>의 결과 증폭된 각 돌연변이 유전자들을 NheI과 KpnI으로 각각 절단하였다. 마지막으로 증폭된 DNA를 동일 효소로 처리한 pTrcHisC 벡터(Invitrogen)에 도입하여 pTH-Cn-mutgabD4 벡터들을 제작하였다(도 3 참조).

<6> 대장균(Escherichia coli) 유래의 알데히드 데히드로게나제 발현 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작

대장균 K12 MG1655로부터 게놈 DNA를 추출하고 정방향 프라이머(서열번호 29 : ATTGCTAGCATGAATTTTCATCATCTGGCTTAC) 및 역방향 프라이머(서열번호 30: AAAGGTACCTTCGGTCATTTCAGGCCTCCA)를 이용하여 PCR을 수행하여 aldH 유전자를 증폭하고, NheI과 KpnI으로 절단하였다.

상기 PCR은 Cycle Ⅰ (95℃, 5분), Cycle Ⅱ (30 cycles/ 95℃, 30초 / 55℃, 30초 / 72℃, 1분 45초), Cycle Ⅲ (72 ℃, 5분)의 과정으로 수행되었다.

증폭된 DNA를 동일 효소로 절단한 pTrcHisC 벡터(Invitrogen)에 도입하여 pTH-Ec-aldH 벡터를 제작하였다.

본 발명의 제조에서 사용된 프라이머를 정리하면 다음 표 2와 같다.

서열번호	프라이머(5'to 3')
13	AAAGCTAGCATGTACCAGGATCTCGCCC
14	AATGGTACCTCAGGCCTGGGTGATGAACTT
15	AACATATGGAGAAAAAAATCTACCAGG
16	AAAGATCTTCAGGCCTGGGTGATG
17	GTCGAGACCTGGCTGGG
18	CCCAGCCAGGTCTCGAC
19	CCAGCATCTGGGCGG
20	CCGCCCAGATGCTGG
21	CCAGGAACTGCTGCATTGAC
22	GTCAATGCAGCAGTTCCTGG
23	TCATGAAATCAAAAAGATTTGAAGTATTGAAG
24	GGATCCCTAATCTTTTCTAAGTTGACCTCTTTGTTC
25	GGATCCAAAGGTTCGGGGATAGTTATGAAG
26	GAGCTCTTATCTAAGTGGCAGACCCTTTACAAG
27	CGGCGACACTCGTACCTGGC
28	GCCAGGTACGAGTGTCGCCG
29	ATTGCTAGCATGAATTTTCATCATCTGGCTTAC
30	AAAGGTACCTTCGGTCATTTCAGGCCTCCA

상기에서 제조된 재조합 벡터 및 상기 재조합벡터에 의하여 발현된 변이형 폴리펩타이드들의 구분은 하기 표 3과 같다.

벡터 구분	돌연변이 위치 및 내용	재조합 효소
pTH-Ec-aldH	-	AldH
pTH-Cn-gabD4	-	GabD4
pTH-Cn-mutgabD4_1	E209Q	mutGabD4_1
pTH-Cn-mutgabD4_2	E269Q	mutGabD4_2
pTH-Cn-mutgabD4_3	E335Q	mutGabD4_3
pTH-Cn-mutgabD4_4	E209,269Q	mutGabD4_4
pTH-Cn-mutgabD4_5	E209,335Q	mutGabD4_5
pTH-Cn-mutgabD4_6	E269,335Q	mutGabD4_6
pTH-Cn-mutgabD4_7	E209,269,335Q	mutGabD4_7

[ 실시예 4] : 변이형 데히드로게나제의 발현 및 분리정제

실시예 1 및 실시예 3에서 제작한 재조합 벡터 pTH-Ec-aldH, pTH-Cn-gabD4 및 pTH-Cn-mutgabD4(총 7종)을 대장균 BL21 균주에 도입하여 형질전환한 후, 수득한 재조합 균주의 배양 및 발현유도를 통해 알데히드 데하이드로게나제(GabD4, mutGabD4 단백질)를 분리 및 정제하였다.

구체적으로, 배양은 250 mL 플라스크에 50 ㎍/mL의 암피실린(ampicillin)이 포함된 50 mL LB(Luria Bertani) 배지를 이용하여 25℃에서 진행되었으며, 배양 3시간 후 600nm에서 측정한 흡광도가 0.6일 때 1mM 이소프릴 1-티오-베타-디-갈락토시드(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG)로 발현을 유도하였다.

12시간 동안 배양한 후, 원심분리(4,000 rpm, 15분)를 통해 세포를 분리한 뒤, 용액 1(50mM 제1인산나트륨(NaH₂PO₄), 0.5M 염화나트륨(NaCl), pH 8)하에 얼음 속에서 초음파로 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 혼합물을 대상으로 원심분리(4,000 rpm, 30분)를 수행하여 상층액을 얻고, IMAC(Immobilized Metal Affinity Chromatography) Ni Sepharose High Performance 레진(GE Healthcare Bio-Sciences AB)을 이용하여(이미다졸(imidazole) 농도는 250mM) 야생형 aldH(AldH), gabD4 단백질(GabD4)과 돌연변이 유도된 gabD4 단백질(mutGabD4)을 각각 분리했다.

[ 실시예 5] : 야생형 데히드로게나제와 변이형 데히드로게나제의 활성 평가

실시예 4에서 분리 및 정제된 AldH, GabD4 및 mutgabD4 효소를 각각 분획분자량(MWCO) 30 튜브를 이용해 7,000 rpm에서 30분 동안 원심분리한 후, 50mM 인산칼륨 용액(potassium phosphate), 1mM 2-머캅토에탄올(2-merchaptoethanol, pH 5~9)으로 세척 및 농축하였다.

다음으로 AldH, GabD4 및 mutGabD4 효소 용액을 37℃에서 5분동안 가온한 후, 2mM 3-HPA 및 4mM NAD⁺를 첨가하여 알데히드 데히드로게나제에 의한 산화 반응을 진행하였다.

효소 활성은 NanoVue Plus(Healthcare Bio-Science AB)를 사용하여 450 nm에서 생성된 NADH의 양을 통해 평가하였다. 이때 1 유닛(unit)은 1분 동안 1 mmole의 NAD를 NADH 로 전환시키는 효소의 양으로 정의하였다.

상기에 의한 효소 활성 평가 결과는 하기 표 4에 도시하였다.

돌연변이 위치 및 내용	효소	효소 활성 (U/mg protein, 37℃)
-	AldH	38.1±2.13
-	GabD4	55.1±1.32
E209Q	mutGabD4_1	60.4±1.41
E269Q	mutGabD4_2	74.2±2.90
E335Q	mutGabD4_3	57.8±1.48
E209,269Q	mutGabD4_4	78.7±1.70
E209,335Q	mutGabD4_5	69.7±1.98
E269,335Q	mutGabD4_6	72.6±2.40
E209,269,335Q	mutGabD4_7	63.7±2.26

상기 결과에 따르면, 돌연변이 유도된 mutGabD4의 활성이 야생형 GabD4에 비하여 약 42%까지 향상되었다. 여러 돌연변이형 중 209 및 269번째 아미노산을 변이(E209,269Q)한 mutGabD4_4의 활성이 가장 높았다.

[ 실시예 6] : 본 발명에 따른 형질전환체의 제조

<단계 1>

실시예 3에서 만들어진 각각의 돌연변이 유전자들을 주형으로 정방향 프라이머(서열번호 15: AACATATGGAGAAAAAAATCTACCAGG)와 역방향 프라이머(서열번호 16: AAAGATCTTCAGGCCTGGGTGATG)를 이용해 각각의 돌연변이 유전자를 증폭하였다.

증폭된 각각의 유전자는 NdeI와 BglII로 제한효소 처리되었다. 제한효소 처리된 유전자들을 SalI-HF와 AvrII 효소로 처리된 ET-duet 벡터로 각각 클로닝한 후, 다시 실시예 2의 단계 2에서 완성된 ET-iBAB에 상기와 같은 효소인 SalI-HF와 AvrII를 처리함으로써 만들어진 오픈 벡터에 도입하여 총 7종류의 ET-iBAB-mutgabD4를 완성하였다.

또한 동일한 방법을 이용해 ET-iBAB-gabD4 및 ET-iBAB-aldH도 제작하였다.

<단계 2>

단계 1에서 완성한 재조합 벡터 ET-iBAB-mutgabD4 7종, ET-iBAB-gabD4, ET-iBAB-aldH을 대장균 BL21에 형질전환시켜 재조합 균주를 제작하였다(도 3 참조).

[ 실시예 7] : 3-HP의 발효 및 생산 (1)

실시예 6에서 제조한 각각의 재조합 균주를 37℃에서 250 mL 플라스크를 사용하여 50 mL 배지(12.8 g/L 인산수소이나트륨(Na₂HPO₄-7H₂O), 3 g/L 인산이수소칼륨(KH₂PO₄), 1.5 g/L 염화나트륨(NaCl), 2 g/L 염화암모늄(NH₄Cl), 17.4 g/L 인산수소이칼륨(K₂HPO₄), 0.5 g/L 효모 추출물(yeast extract), 3 mL 1M 황산마그네슘(MgSO₄), 0.1 mL 1M 염화칼슘(CaCl₂), 40 g/L 글리세롤(Glycerol), pH 7.8)에서 배양한 다음, 600nm에서 측정한 흡광도가 0.6~0.8일 때 0.01 mM IPTG 및 48μM 비타민 B₁₂를 첨가함으로써 단백질의 발현 및 3-HP 생산을 유도하였다.

배양후 24, 48시간째에 배양액 중 일부를 추출하여 흡광도(OD) 및 pH를 측정하고 HPLC(high performance liquid chromatography)를 이용하여 3-HP 생산을 확인하였다.

상기 결과는 도 6에 도시하였다. mutGabD4에 의해서도 3-HP가 정상적으로 생산됨을 확인하였으며, mutGabD4를 사용한 경우가 GabD4를 사용한 경우보다 3-HP 생산량이 증가하였음을 알 수 있다.

특히, mutGabD4의 여러 돌연변이형 중 206 및 269번째 아미노산을 변이한 mutGabD4_4을 사용한 경우가 야생형 GabD4를 사용한 경우에 비하여 3-HP 생산량이 40% 증가하였음을 확인할 수 있었다(GabD4 : 13.4g, mutGabD4_4: 18.7g)

[ 실시예 8] : 3-HP의 발효 및 생산 (2)

실시예 6에서 제조한 재조합 균주 중 ET-iBAB-mutgabD4_4(E209,269Q)를 도입한 균주를 500 mL 플라스크에 50 ㎍/mL의 암피실린(ampicillin)이 포함된 100ml LB(Luria Bertani) 배지를 이용하여 37℃에서 전배양한 후, 동일한 온도에서 5L 발효조를 사용하여 2L 배지(12.8 g/L 인산수소이나트륨(Na₂HPO₄-7H₂O), 3g/L 인산이수소칼륨(KH₂PO₄), 1.5g/L 염화나트륨(NaCl), 2g/L 염화암모늄(NH₄Cl), 17.4g/L 인산수소이칼륨(K₂HPO₄), 0.5g/L 효모 추출물(yeast extract), 120mL 1M 황산마그네슘(MgSO₄), 4mL 1M 염화칼슘(CaCl₂), 80 g/L 글리세롤(glycerol), pH 7.8)에서 배양하였다. 이후, 600nm에서 측정한 흡광도가 0.6~0.8일 때, 0.03 mM IPTG 및 48μM 비타민 B₁₂를 첨가하여 단백질의 발현 및 3-히드록시프로피온산 생산을 유도하고 3-HP의 함량을 실시예 6과 같이 측정하였다.

발현유도 후 40시간 동안 배양한 결과, 206 및 269번째 아미노산을 변이한 mutGabD(E209,269Q)를 사용한 경우 3-HP가 100g/L 생산함을 확인할 수 있었다(도 6). 이는 야생형 GabD4를 이용한 3-HP 생산량인 84g/L와 비교시 약 20%까지 생산량이 증가한 것으로, 도 5에서와 마찬가지로 본 발명에 따른 변이형 폴리펩타이드 및 형질전환체를 사용하여 3-HP를 대량으로 생산할 수 있음을 보여준다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Samsung Petrochemical Co., Ltd. <120> Mutant polypepetide, nucleic acid molecule encoding the same, recombinant vector, transformant and production method of 3-hydroxypropionate by using the same <130> DP130174 <160> 30 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 475 <212> PRT <213> Cupriavidus necator <400> 1 Met Tyr Gln Asp Leu Ala Leu Tyr Ile Asp Gly Glu Phe Ile Lys Gly 1 5 10 15 Gly Asp Arg Arg Glu Gln Asp Val Ile Asn Pro Ala Thr Gln Glu Val 20 25 30 Leu Gly Lys Leu Pro His Ala Ser Arg Ala Asp Leu Asp Arg Ala Leu 35 40 45 Ala Ala Ala Gln Arg Ala Phe Glu Thr Trp Lys Lys Thr Ser Pro Leu 50 55 60 Glu Arg Ala Arg Ile Leu Arg Arg Val Gly Glu Leu Thr Arg Glu Arg 65 70 75 80 Ala Lys Glu Ile Gly Arg Asn Ile Thr Leu Asp Gln Gly Lys Pro Leu 85 90 95 Ala Glu Ala Val Gly Glu Val Met Val Cys Ala Glu His Ala Asp Trp 100 105 110 His Ala Glu Glu Cys Arg Arg Ile Tyr Gly Arg Val Ile Pro Pro Arg 115 120 125 Gln Pro Asn Val Arg Gln Ile Val Val Arg Glu Pro Ile Gly Val Cys 130 135 140 Ala Ala Phe Thr Pro Trp Asn Phe Pro Phe Asn Gln Ala Ile Arg Lys 145 150 155 160 Ile Val Ser Ala Leu Gly Ala Gly Cys Thr Leu Ile Leu Lys Gly Pro 165 170 175 Glu Asp Ser Pro Ser Ala Val Val Ala Leu Ala Gln Leu Phe His Asp 180 185 190 Ala Gly Leu Pro Pro Gly Val Leu Asn Ile Val Trp Gly Val Pro Ser 195 200 205 Glu Val Ser Thr Tyr Leu Ile Glu Ser Pro Ile Val Arg Lys Ile Ser 210 215 220 Phe Thr Gly Ser Val Pro Val Gly Lys Gln Leu Ala Ala Leu Ala Gly 225 230 235 240 Ala His Met Lys Arg Val Thr Met Glu Leu Gly Gly His Ser Pro Val 245 250 255 Leu Val Phe Asp Asp Ala Asp Ile Asp Pro Ala Ala Glu Met Leu Ala 260 265 270 Arg Phe Lys Leu Arg Asn Ala Gly Gln Val Cys Val Ser Pro Thr Arg 275 280 285 Phe Tyr Val Gln Glu Lys Ala Tyr Asp Arg Phe Leu Ala Arg Phe Thr 290 295 300 Glu Val Ile Gly Ser Ile Lys Val Gly Asn Gly Leu Glu Asp Gly Thr 305 310 315 320 Gln Met Gly Pro Leu Ala His Glu Arg Arg Val Leu Ser Met Glu Gln 325 330 335 Phe Leu Asp Asp Ala Ser Gln Arg Gly Gly Lys Val Val Ala Gly Gly 340 345 350 Ser Arg Leu Gly Asp Lys Gly Tyr Phe Phe Ala Pro Thr Val Val Thr 355 360 365 Asp Leu Pro Asp Asp Ser Arg Leu Met Thr Asp Glu Pro Phe Gly Pro 370 375 380 Val Ala Pro Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Ala Glu Val Leu Arg Arg 385 390 395 400 Ala Asn Ser Leu Pro Phe Gly Leu Ala Ser Tyr Val Phe Thr Asn Ser 405 410 415 Leu Lys Thr Ala Thr Glu Val Ser Asn Gly Leu Glu Ala Gly Met Val 420 425 430 Asn Ile Asn His Phe Gly Met Ala Leu Ala Glu Thr Pro Phe Gly Gly 435 440 445 Ile Lys Asp Ser Gly Ile Gly Ser Glu Gly Gly Gln Glu Thr Phe Asp 450 455 460 Gly Tyr Leu Val Thr Lys Phe Ile Thr Gln Ala 465 470 475 <210> 2 <211> 475 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant of GabD4, succinate semialdehyde dehydrogenase <400> 2 Met Tyr Gln Asp Leu Ala Leu Tyr Ile Asp Gly Glu Phe Ile Lys Gly 1 5 10 15 Gly Asp Arg Arg Glu Gln Asp Val Ile Asn Pro Ala Thr Gln Glu Val 20 25 30 Leu Gly Lys Leu Pro His Ala Ser Arg Ala Asp Leu Asp Arg Ala Leu 35 40 45 Ala Ala Ala Gln Arg Ala Phe Glu Thr Trp Lys Lys Thr Ser Pro Leu 50 55 60 Glu Arg Ala Arg Ile Leu Arg Arg Val Gly Glu Leu Thr Arg Glu Arg 65 70 75 80 Ala Lys Glu Ile Gly Arg Asn Ile Thr Leu Asp Gln Gly Lys Pro Leu 85 90 95 Ala Glu Ala Val Gly Glu Val Met Val Cys Ala Glu His Ala Asp Trp 100 105 110 His Ala Glu Glu Cys Arg Arg Ile Tyr Gly Arg Val Ile Pro Pro Arg 115 120 125 Gln Pro Asn Val Arg Gln Ile Val Val Arg Glu Pro Ile Gly Val Cys 130 135 140 Ala Ala Phe Thr Pro Trp Asn Phe Pro Phe Asn Gln Ala Ile Arg Lys 145 150 155 160 Ile Val Ser Ala Leu Gly Ala Gly Cys Thr Leu Ile Leu Lys Gly Pro 165 170 175 Glu Asp Ser Pro Ser Ala Val Val Ala Leu Ala Gln Leu Phe His Asp 180 185 190 Ala Gly Leu Pro Pro Gly Val Leu Asn Ile Val Trp Gly Val Pro Ser 195 200 205 Gln Val Ser Thr Tyr Leu Ile Glu Ser Pro Ile Val Arg Lys Ile Ser 210 215 220 Phe Thr Gly Ser Val Pro Val Gly Lys Gln Leu Ala Ala Leu Ala Gly 225 230 235 240 Ala His Met Lys Arg Val Thr Met Glu Leu Gly Gly His Ser Pro Val 245 250 255 Leu Val Phe Asp Asp Ala Asp Ile Asp Pro Ala Ala Gln Met Leu Ala 260 265 270 Arg Phe Lys Leu Arg Asn Ala Gly Gln Val Cys Val Ser Pro Thr Arg 275 280 285 Phe Tyr Val Gln Glu Lys Ala Tyr Asp Arg Phe Leu Ala Arg Phe Thr 290 295 300 Glu Val Ile Gly Ser Ile Lys Val Gly Asn Gly Leu Glu Asp Gly Thr 305 310 315 320 Gln Met Gly Pro Leu Ala His Glu Arg Arg Val Leu Ser Met Gln Gln 325 330 335 Phe Leu Asp Asp Ala Ser Gln Arg Gly Gly Lys Val Val Ala Gly Gly 340 345 350 Ser Arg Leu Gly Asp Lys Gly Tyr Phe Phe Ala Pro Thr Val Val Thr 355 360 365 Asp Leu Pro Asp Asp Ser Arg Leu Met Thr Asp Glu Pro Phe Gly Pro 370 375 380 Val Ala Pro Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Ala Glu Val Leu Arg Arg 385 390 395 400 Ala Asn Ser Leu Pro Phe Gly Leu Ala Ser Tyr Val Phe Thr Asn Ser 405 410 415 Leu Lys Thr Ala Thr Glu Val Ser Asn Gly Leu Glu Ala Gly Met Val 420 425 430 Asn Ile Asn His Phe Gly Met Ala Leu Ala Glu Thr Pro Phe Gly Gly 435 440 445 Ile Lys Asp Ser Gly Ile Gly Ser Glu Gly Gly Gln Glu Thr Phe Asp 450 455 460 Gly Tyr Leu Val Thr Lys Phe Ile Thr Gln Ala 465 470 475 <210> 3 <211> 555 <212> PRT <213> Klebsiella pneumoniae <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(555) <223> glycerol dehydratase, DhaB1 <400> 3 Met Lys Arg Ser Lys Arg Phe Ala Val Leu Ala Gln Arg Pro Val Asn 1 5 10 15 Gln Asp Gly Leu Ile Gly Glu Trp Pro Glu Glu Gly Leu Ile Ala Met 20 25 30 Asp Ser Pro Phe Asp Pro Val Ser Ser Val Lys Val Asp Asn Gly Leu 35 40 45 Ile Val Glu Leu Asp Gly Lys Arg Arg Asp Gln Phe Asp Met Ile Asp 50 55 60 Arg Phe Ile Ala Asp Tyr Ala Ile Asn Val Glu Arg Thr Glu Gln Ala 65 70 75 80 Met Arg Leu Glu Ala Val Glu Ile Ala Arg Met Leu Val Asp Ile His 85 90 95 Val Ser Arg Glu Glu Ile Ile Ala Ile Thr Thr Ala Ile Thr Pro Ala 100 105 110 Lys Ala Val Glu Val Met Ala Gln Met Asn Val Val Glu Met Met Met 115 120 125 Ala Leu Gln Lys Met Arg Ala Arg Arg Thr Pro Ser Asn Gln Cys His 130 135 140 Val Thr Asn Leu Lys Asp Asn Pro Val Gln Ile Ala Ala Asp Ala Ala 145 150 155 160 Glu Ala Gly Ile Arg Gly Phe Ser Glu Gln Glu Thr Thr Val Gly Ile 165 170 175 Ala Arg Tyr Ala Pro Phe Asn Ala Leu Ala Leu Leu Val Gly Ser Gln 180 185 190 Cys Gly Arg Pro Gly Val Leu Thr Gln Cys Ser Val Glu Glu Ala Thr 195 200 205 Glu Leu Glu Leu Gly Met Arg Gly Leu Thr Ser Tyr Ala Glu Thr Val 210 215 220 Ser Val Tyr Gly Thr Glu Ala Val Phe Thr Asp Gly Asp Asp Thr Pro 225 230 235 240 Trp Ser Lys Ala Phe Leu Ala Ser Ala Tyr Ala Ser Arg Gly Leu Lys 245 250 255 Met Arg Tyr Thr Ser Gly Thr Gly Ser Glu Ala Leu Met Gly Tyr Ser 260 265 270 Glu Ser Lys Ser Met Leu Tyr Leu Glu Ser Arg Cys Ile Phe Ile Thr 275 280 285 Lys Gly Ala Gly Val Gln Gly Leu Gln Asn Gly Ala Val Ser Cys Ile 290 295 300 Gly Met Thr Gly Ala Val Pro Ser Gly Ile Arg Ala Val Leu Ala Glu 305 310 315 320 Asn Leu Ile Ala Ser Met Leu Asp Leu Glu Val Ala Ser Ala Asn Asp 325 330 335 Gln Thr Phe Ser His Ser Asp Ile Arg Arg Thr Ala Arg Thr Leu Met 340 345 350 Gln Met Leu Pro Gly Thr Asp Phe Ile Phe Ser Gly Tyr Ser Ala Val 355 360 365 Pro Asn Tyr Asp Asn Met Phe Ala Gly Ser Asn Phe Asp Ala Glu Asp 370 375 380 Phe Asp Asp Tyr Asn Ile Leu Gln Arg Asp Leu Met Val Asp Gly Gly 385 390 395 400 Leu Arg Pro Val Thr Glu Ala Glu Thr Ile Ala Ile Arg Gln Lys Ala 405 410 415 Ala Arg Ala Ile Gln Ala Val Phe Arg Glu Leu Gly Leu Pro Pro Ile 420 425 430 Ala Asp Glu Glu Val Glu Ala Ala Thr Tyr Ala His Gly Ser Asn Glu 435 440 445 Met Pro Pro Arg Asn Val Val Glu Asp Leu Ser Ala Val Glu Glu Met 450 455 460 Met Lys Arg Asn Ile Thr Gly Leu Asp Ile Val Gly Ala Leu Ser Arg 465 470 475 480 Ser Gly Phe Glu Asp Ile Ala Ser Asn Ile Leu Asn Met Leu Arg Gln 485 490 495 Arg Val Thr Gly Asp Tyr Leu Gln Thr Ser Ala Ile Leu Asp Arg Gln 500 505 510 Phe Glu Val Val Ser Ala Val Asn Asp Ile Asn Asp Tyr Gln Gly Pro 515 520 525 Gly Thr Gly Tyr Arg Ile Ser Ala Glu Arg Trp Ala Glu Ile Lys Asn 530 535 540 Ile Pro Gly Val Val Gln Pro Asp Thr Thr Glu 545 550 555 <210> 4 <211> 194 <212> PRT <213> Klebsiella pneumoniae <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(194) <223> DhaB2, glycerol dehydratase <400> 4 Met Gln Gln Thr Thr Gln Ile Gln Pro Ser Phe Thr Leu Lys Thr Arg 1 5 10 15 Glu Gly Gly Val Ala Ser Ala Asp Glu Arg Ala Asp Glu Val Val Ile 20 25 30 Gly Val Gly Pro Ala Phe Asp Lys His Gln His His Thr Leu Ile Asp 35 40 45 Met Pro His Gly Ala Ile Leu Lys Glu Leu Ile Ala Gly Val Glu Glu 50 55 60 Glu Gly Leu His Ala Arg Val Val Arg Ile Leu Arg Thr Ser Asp Val 65 70 75 80 Ser Phe Met Ala Trp Asp Ala Ala Asn Leu Ser Gly Ser Gly Ile Gly 85 90 95 Ile Gly Ile Gln Ser Lys Gly Thr Thr Val Ile His Gln Arg Asp Leu 100 105 110 Leu Pro Leu Ser Asn Leu Glu Leu Phe Ser Gln Ala Pro Leu Leu Thr 115 120 125 Leu Glu Thr Tyr Arg Gln Ile Gly Lys Asn Ala Ala Arg Tyr Ala Arg 130 135 140 Lys Glu Ser Pro Ser Pro Val Pro Val Val Asn Asp Gln Met Val Arg 145 150 155 160 Pro Lys Phe Met Ala Lys Ala Ala Leu Phe His Ile Lys Glu Thr Lys 165 170 175 His Val Val Gln Asp Ala Glu Pro Val Thr Leu His Val Asp Leu Val 180 185 190 Arg Glu <210> 5 <211> 141 <212> PRT <213> Klebsiella pneumoniae <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(141) <223> DhaB3, glycerol dehydratase <400> 5 Met Ser Glu Lys Thr Met Arg Val Gln Asp Tyr Pro Leu Ala Thr Arg 1 5 10 15 Cys Pro Glu His Ile Leu Thr Pro Thr Gly Lys Pro Leu Thr Asp Ile 20 25 30 Thr Leu Glu Lys Val Leu Ser Gly Glu Val Gly Pro Gln Asp Val Arg 35 40 45 Ile Ser Cys Gln Thr Leu Glu Tyr Gln Ala Gln Ile Ala Glu Gln Met 50 55 60 Gln Arg His Ala Val Ala Arg Asn Phe Arg Arg Ala Ala Glu Leu Ile 65 70 75 80 Ala Ile Pro Asp Glu Arg Ile Leu Ala Ile Tyr Asn Ala Leu Arg Pro 85 90 95 Phe Arg Ser Ser Gln Ala Glu Leu Leu Ala Ile Ala Asp Glu Leu Glu 100 105 110 His Thr Trp His Ala Thr Val Asn Ala Ala Phe Val Arg Glu Ser Ala 115 120 125 Glu Val Tyr Gln Gln Arg His Lys Leu Arg Lys Gly Ser 130 135 140 <210> 6 <211> 607 <212> PRT <213> Klebsiella pneumoniae <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(607) <223> GdrA, glycerol dehydratase reactivation factor <400> 6 Met Pro Leu Ile Ala Gly Ile Asp Ile Gly Asn Ala Thr Thr Glu Val 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ser Asp Asp Pro Gln Ala Arg Ala Phe Val Ala Ser Gly 20 25 30 Ile Val Ala Thr Thr Gly Met Lys Gly Thr Arg Asp Asn Ile Ala Gly 35 40 45 Thr Leu Ala Ala Leu Glu Gln Ala Leu Ala Lys Thr Pro Trp Ser Val 50 55 60 Ser Asp Val Ser Arg Ile Tyr Leu Asn Glu Ala Ala Pro Val Ile Gly 65 70 75 80 Asp Val Ala Met Glu Thr Ile Thr Glu Thr Ile Ile Thr Glu Ser Thr 85 90 95 Met Ile Gly His Asn Pro Gln Thr Pro Gly Gly Val Gly Val Gly Val 100 105 110 Gly Thr Thr Ile Ala Leu Gly Arg Leu Ala Thr Leu Pro Ala Ala Gln 115 120 125 Tyr Ala Glu Gly Trp Ile Val Leu Ile Asp Asp Ala Val Asp Phe Leu 130 135 140 Asp Ala Val Trp Trp Leu Asn Glu Ala Leu Asp Arg Gly Ile Asn Val 145 150 155 160 Val Ala Ala Ile Leu Lys Lys Asp Asp Gly Val Leu Val Asn Asn Arg 165 170 175 Leu Arg Lys Thr Leu Pro Val Val Asp Glu Val Thr Leu Leu Glu Gln 180 185 190 Val Pro Glu Gly Val Met Ala Ala Val Glu Val Ala Ala Pro Gly Gln 195 200 205 Val Val Arg Ile Leu Ser Asn Pro Tyr Gly Ile Ala Thr Phe Phe Gly 210 215 220 Leu Ser Pro Glu Glu Thr Gln Ala Ile Val Pro Ile Ala Arg Ala Leu 225 230 235 240 Ile Gly Asn Arg Ser Ala Val Val Leu Lys Thr Pro Gln Gly Asp Val 245 250 255 Gln Ser Arg Val Ile Pro Ala Gly Asn Leu Tyr Ile Ser Gly Glu Lys 260 265 270 Arg Arg Gly Glu Ala Asp Val Ala Glu Gly Ala Glu Ala Ile Met Gln 275 280 285 Ala Met Ser Ala Cys Ala Pro Val Arg Asp Ile Arg Gly Glu Pro Gly 290 295 300 Thr His Ala Gly Gly Met Leu Glu Arg Val Arg Lys Val Met Ala Ser 305 310 315 320 Leu Thr Asp His Glu Met Ser Ala Ile Tyr Ile Gln Asp Leu Leu Ala 325 330 335 Val Asp Thr Phe Ile Pro Arg Lys Val Gln Gly Gly Met Ala Gly Glu 340 345 350 Cys Ala Met Glu Asn Ala Val Gly Met Ala Ala Met Val Lys Ala Asp 355 360 365 Arg Leu Gln Met Gln Val Ile Ala Arg Glu Leu Ser Ala Arg Leu Gln 370 375 380 Thr Glu Val Val Val Gly Gly Val Glu Ala Asn Met Ala Ile Ala Gly 385 390 395 400 Ala Leu Thr Thr Pro Gly Cys Ala Ala Pro Leu Ala Ile Leu Asp Leu 405 410 415 Gly Ala Gly Ser Thr Asp Ala Ala Ile Val Asn Ala Glu Gly Gln Ile 420 425 430 Thr Ala Val His Leu Ala Gly Ala Gly Asn Met Val Ser Leu Leu Ile 435 440 445 Lys Thr Glu Leu Gly Leu Glu Asp Leu Ser Leu Ala Glu Ala Ile Lys 450 455 460 Lys Tyr Pro Leu Ala Lys Val Glu Ser Leu Phe Ser Ile Arg His Glu 465 470 475 480 Asn Gly Ala Val Glu Phe Phe Arg Glu Ala Leu Ser Pro Ala Val Phe 485 490 495 Ala Lys Val Val Tyr Ile Lys Glu Gly Glu Leu Val Pro Ile Asp Asn 500 505 510 Ala Ser Pro Leu Glu Lys Ile Arg Leu Val Arg Arg Gln Ala Lys Glu 515 520 525 Lys Val Phe Val Thr Asn Cys Leu Arg Ala Leu Arg Gln Val Ser Pro 530 535 540 Gly Gly Ser Ile Arg Asp Ile Ala Phe Val Val Leu Val Gly Gly Ser 545 550 555 560 Ser Leu Asp Phe Glu Ile Pro Gln Leu Ile Thr Glu Ala Leu Ser His 565 570 575 Tyr Gly Val Val Ala Gly Gln Gly Asn Ile Arg Gly Thr Glu Gly Pro 580 585 590 Arg Asn Ala Val Ala Thr Gly Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala Asn 595 600 605 <210> 7 <211> 117 <212> PRT <213> Klebsiella pneumoniae <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(117) <223> GdrB, glycerol dehydratase reactivation factor <400> 7 Met Ser Leu Ser Pro Pro Gly Val Arg Leu Phe Tyr Asp Pro Arg Gly 1 5 10 15 His His Ala Gly Ala Ile Asn Glu Leu Cys Trp Gly Leu Glu Glu Gln 20 25 30 Gly Val Pro Cys Gln Thr Ile Thr Tyr Asp Gly Gly Gly Asp Ala Ala 35 40 45 Ala Leu Gly Ala Leu Ala Ala Arg Ser Ser Pro Leu Arg Val Gly Ile 50 55 60 Gly Leu Ser Ala Ser Gly Glu Ile Ala Leu Thr His Ala Gln Leu Pro 65 70 75 80 Ala Asp Ala Pro Leu Ala Thr Gly His Val Thr Asp Ser Asp Asp His 85 90 95 Leu Arg Thr Leu Gly Ala Asn Ala Gly Gln Leu Val Lys Val Leu Pro 100 105 110 Leu Ser Glu Arg Asn 115 <210> 8 <211> 1668 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <220> <221> gene <222> (1)..(1668) <223> dhaB1, glycerol dehydratase <400> 8 atgaaaagat caaaacgatt tgcagtactg gcccagcgcc ccgtcaatca ggacgggctg 60 attggcgagt ggcctgaaga ggggctgatc gccatggaca gcccctttga cccggtctct 120 tcagtaaaag tggacaacgg tctgatcgtc gagctggacg gcaaacgccg ggaccagttt 180 gacatgatcg accgatttat cgccgattac gcgatcaacg ttgagcgcac agagcaggca 240 atgcgcctgg aggcggtgga aatagcccgc atgctggtgg atattcacgt cagtcgggag 300 gagatcattg ccatcactac cgccatcacg ccggccaaag cggtcgaggt gatggcgcag 360 atgaacgtgg tggagatgat gatggcgctg cagaagatgc gtgcccgccg gaccccctcc 420 aaccagtgcc acgtcaccaa tctcaaagat aatccggtgc agattgctgc tgacgccgcc 480 gaggccggga tccgcggctt ctcagaacag gagaccacgg tcggtatcgc gcgctatgcg 540 ccgtttaacg ccctggcgct gttggtcggt tcgcagtgcg gccgccccgg cgttttgacg 600 cagtgctcgg tggaagaggc caccgagctg gagctgggca tgcgtggctt aaccagctac 660 gccgagacgg tgtcggtcta cggcaccgaa gcggtattta ccgacggcga tgatactccg 720 tggtcgaagg cgttcctcgc ctcggcctac gcctcccgcg ggttgaaaat gcgctacacc 780 tccggcaccg gatccgaagc gctgatgggc tattcggaga gcaagtcgat gctctacctc 840 gaatcgcgct gcatcttcat taccaaaggc gccggggttc aggggctgca aaacggcgcg 900 gtgagctgta tcggcatgac cggcgctgtg ccgtcgggca ttcgggcggt gctggcggaa 960 aacctgatcg cctctatgct cgacctcgaa gtggcgtccg ccaacgacca gactttctcc 1020 cactcggata ttcgccgcac cgcgcgcacc ctgatgcaga tgctgccggg caccgacttt 1080 attttctccg gctacagcgc ggtgccgaac tacgacaaca tgttcgccgg ctcgaacttc 1140 gatgcggaag attttgatga ttacaacatc ctgcagcgtg acctgatggt tgacggcggc 1200 ctgcgtccgg tgaccgaggc ggaaaccatt gccattcgcc agaaagcggc gcgggcgatc 1260 caggcggttt tccgcgagct ggggctgccg ccaatcgccg acgaggaggt ggaggccgcc 1320 acctacgcgc acggtagcaa cgagatgccg ccgcgtaacg tggtggagga tctgagtgcg 1380 gtggaagaga tgatgaagcg caacatcacc ggcctcgata ttgtcggcgc gttgagccgc 1440 agcggctttg aggatatcgc cagcaatatt ctcaatatgc tgcgccagcg ggtcaccggc 1500 gattacctgc agacctcggc cattctcgat cggcagttcg aggtggtgag tgcggtcaac 1560 gacatcaatg actatcaggg gccgggcacc ggctatcgca tctctgccga acgctgggcg 1620 gagatcaaaa atattccggg cgtggttcag cccgacacca ctgaataa 1668 <210> 9 <211> 585 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <220> <221> gene <222> (1)..(585) <223> dhaB2, glycerol dehydratase <400> 9 gtgcaacaga caacccaaat tcagccctct tttaccctga aaacccgcga gggcggggta 60 gcttctgccg atgaacgcgc cgatgaagtg gtgatcggcg tcggccctgc cttcgataaa 120 caccagcatc acactctgat cgatatgccc catggcgcga tcctcaaaga gctgattgcc 180 ggggtggaag aagaggggct tcacgcccgg gtggtgcgca ttctgcgcac gtccgacgtc 240 tcctttatgg cctgggatgc ggccaacctg agcggctcgg ggatcggcat cggtatccag 300 tcgaagggga ccacggtcat ccatcagcgc gatctgctgc cgctcagcaa cctggagctg 360 ttctcccagg cgccgctgct gacgctggaa acctaccggc agattggcaa aaacgccgcg 420 cgctatgcgc gcaaagagtc accttcgccg gtgccggtgg tgaacgatca gatggtgcgg 480 ccgaaattta tggccaaagc cgcgctattt catatcaaag agaccaaaca tgtggtgcag 540 gacgccgagc ccgtcaccct gcacgtcgac ttagtaaggg agtga 585 <210> 10 <211> 426 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <220> <221> gene <222> (1)..(426) <223> dhaB3, glycerol dehydratase <400> 10 atgagcgaga aaaccatgcg cgtgcaggat tatccgttag ccacccgctg cccggagcat 60 atcctgacgc ctaccggcaa accattgacc gatattaccc tcgagaaggt gctctctggc 120 gaggtgggcc cgcaggatgt gcggatctcc tgccagaccc ttgagtacca ggcgcagatt 180 gccgagcaga tgcagcgcca tgcggtggcg cgcaatttcc gccgcgcggc ggagcttatc 240 gccattcctg acgagcgcat tctggctatc tataacgcgc tgcgcccgtt ccgctcctcg 300 caggcggagc tgctggcgat cgccgacgag ctggagcaca cctggcatgc gacagtgaat 360 gccgcctttg tccgggagtc ggcggaagtg tatcagcagc ggcataagct gcgtaaagga 420 agctaa 426 <210> 11 <211> 1824 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <220> <221> gene <222> (1)..(1824) <223> gdrA, glycerol dehydratase reactivation factor <400> 11 atgccgttaa tagccgggat tgatatcggc aacgccacca ccgaggtggc gctggcgtcc 60 gacgacccgc aggcgagggc gtttgttgcc agcgggatcg tcgcgacgac gggcatgaaa 120 gggacgcggg acaatatcgc cgggaccctc gccgcgctgg agcaggccct ggcgaaaaca 180 ccgtggtcgg tgagcgatgt ctctcgcatc tatcttaacg aagccgcgcc ggtgattggc 240 gatgtggcga tggagaccat caccgagacc attatcaccg aatcgaccat gatcggtcat 300 aacccgcaga cgccgggcgg ggtgggcgtt ggcgtgggga cgactatcgc cctcgggcgg 360 ctggcgacgc tgccggcggc gcagtatgcc gaggggtgga tcgtactgat tgacgacgcc 420 gtcgatttcc ttgacgccgt gtggtggctc aatgaggcgc tcgaccgggg gatcaacgtg 480 gtggcggcga tcctcaaaaa ggacgacggc gtgctggtga acaaccgcct gcgtaaaacc 540 ctgccggtgg tagatgaagt gacgctgctg gagcaggtcc ccgagggggt aatggcggcg 600 gtggaagtgg ccgcgccggg ccaggtggtg cggatcctgt cgaatcccta cgggatcgcc 660 accttcttcg ggctaagccc ggaagagacc caggccatcg tccccatcgc ccgcgccctg 720 attggcaacc gttcagcggt ggtgctcaag accccgcagg gggatgtgca gtcgcgggtg 780 atcccggcgg gcaacctcta cattagcggc gaaaagcgcc gcggagaggc cgatgtcgcc 840 gagggcgcgg aagccatcat gcaggcgatg agcgcctgcg ctccggtacg cgacatccgc 900 ggcgaaccgg gcactcacgc cggcggcatg cttgagcggg tgcgcaaggt aatggcgtcc 960 ctgaccgacc atgagatgag cgcgatatac atccaggatc tgctggcggt ggatacgttt 1020 attccgcgca aggtgcaggg cgggatggcc ggcgagtgcg ccatggaaaa tgccgtcggg 1080 atggcggcga tggtgaaagc ggatcgtctg caaatgcagg ttatcgcccg cgaactgagc 1140 gcccgactgc agaccgaggt ggtggtgggc ggcgtggagg ccaacatggc catcgccggg 1200 gcgttaacca ctcccggctg tgcggcgccg ctggcgatcc tcgacctcgg cgccggctcg 1260 acggatgcgg cgatcgtcaa cgcggagggg cagataacgg cggtccatct cgccggggcg 1320 gggaatatgg tcagcctgtt gattaaaacc gagctgggcc tcgaggatct ttcgctggcg 1380 gaagcgataa aaaaataccc gctggccaaa gtggaaagcc tgttcagtat tcgtcacgag 1440 aatggcgcgg tggagttctt tcgggaagcc ctcagcccgg cggtgttcgc caaagtggtg 1500 tacatcaagg agggcgaact ggtgccgatc gataacgcca gcccgctgga aaaaattcgt 1560 ctcgtgcgcc ggcaggcgaa agagaaagtg tttgtcacca actgcctgcg cgcgctgcgc 1620 caggtctcac ccggcggttc cattcgcgat atcgcctttg tggtgctggt gggcggctca 1680 tcgctggact ttgagatccc gcagcttatc acggaagcct tgtcgcacta tggcgtggtc 1740 gccgggcagg gcaatattcg gggaacagaa gggccgcgca acgcggtcgc caccgggctg 1800 ctactggccg gtcaggcgaa ttaa 1824 <210> 12 <211> 354 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <220> <221> gene <222> (1)..(354) <223> gdrB, glycerol dehydratase reactivation factor <400> 12 atgtcgcttt caccgccagg cgtacgcctg ttttacgatc cgcgcgggca ccatgccggc 60 gccatcaatg agctgtgctg ggggctggag gagcaggggg tcccctgcca gaccataacc 120 tatgacggag gcggtgacgc cgctgcgctg ggcgccctgg cggccagaag ctcgcccctg 180 cgggtgggta ttgggctcag cgcgtccggc gagatagccc tcactcatgc ccagctgccg 240 gcggacgcgc cgctggctac cggacacgtc accgatagcg acgatcatct gcgtacgctc 300 ggcgccaacg ccgggcagct ggttaaagtc ctgccgttaa gtgagagaaa ctga 354 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 aaagctagca tgtaccagga tctcgccc 28 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 aatggtacct caggcctggg tgatgaactt 30 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 aacatatgga gaaaaaaatc taccagg 27 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 aaagatcttc aggcctgggt gatg 24 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gtcgagacct ggctggg 17 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 cccagccagg tctcgac 17 <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ccagcatctg ggcgg 15 <210> 20 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ccgcccagat gctgg 15 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ccaggaactg ctgcattgac 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gtcaatgcag cagttcctgg 20 <210> 23 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 tcatgaaatc aaaaagattt gaagtattga ag 32 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ggatccctaa tcttttctaa gttgacctct ttgttc 36 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 ggatccaaag gttcggggat agttatgaag 30 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gagctcttat ctaagtggca gaccctttac aag 33 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 cggcgacact cgtacctggc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gccaggtacg agtgtcgccg 20 <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 attgctagca tgaattttca tcatctggct tac 33 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 aaaggtacct tcggtcattt caggcctcca 30

Claims

서열번호 1의 아미노산 기본서열에서 201 내지 210, 266 내지 272, 및 332 내지 340 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 변이되고, 3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환하는 활성을 가지는 변이형 폴리펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 서열번호 1의 아미노산 기본서열에서 209, 269 및 335 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 변이된 것을 특징으로 하는 변이형 폴리펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 변이는 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판, 글루타민, 히스티딘, 라이신 및 아르기닌 중에서 기본서열의 아미노산과 상이한 것으로 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 변이형 폴리펩타이드.
제2항에 있어서,
상기 변이는 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판, 글루타민, 히스티딘, 라이신 및 아르기닌 중에서 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 변이형 폴리펩타이드.
하기 (a) 내지 (c) 중에서 선택된 어느 하나로 이루어진 핵산분자:
(a) 다음 (1) 내지 (4) 중에서 선택된 하나의 변이를 갖고, 3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환하는 활성을 가지는 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열;
(1) 서열번호 1의 아미노산 기본서열에서 201 내지 210, 266 내지 272, 및 332 내지 340 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 변이;
(2) 서열번호 1의 아미노산 기본서열에서 201 내지 210, 266 내지 272, 및 332 내지 340 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판, 글루타민, 히스티딘, 라이신 및 아르기닌 중에서 기본서열의 아미노산과 상이한 것으로 선택된 아미노산으로 치환되는 변이;
(3) 서열번호 1의 아미노산 기본서열에서 209, 269 및 335 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 변이;
(4) 서열번호 1의 아미노산 기본서열에서 209, 269 및 335 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판, 글루타민, 히스티딘, 라이신 및 아르기닌 중에서 기본서열의 아미노산과 상이한 것으로 선택된 아미노산으로 치환되는 변이;
(b) 상기 (a)에 상보적 서열; 및
(c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 염기 서열.
제5항의 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터.
제6항에 있어서,
글리세롤 데히드라타제(glycerol dehydratase) 또는 디올 데히드라타제(thiol dehydratase)를 암호화하는 핵산분자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제7항에 있어서,
상기 글리세롤 데히드라타제 또는 디올 데히드라타제를 암호화하는 핵산분자는 dhaB1, dhaB2 및 dhaB3을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제7항에 있어서,
글리세롤 데히드라타제 재활성화 인자 또는 디올 데히드라타제 재활성화 인자를 암호화하는 핵산분자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제9항에 있어서,
상기 글리세롤 데히드라타제 재활성화 인자 또는 디올 데히드라타제 재활성화 인자를 암호화하는 핵산분자는 dhaFG, gdrAB 및 ddrAB를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제6항 내지 제10항 중 어느 하나에 따른 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입한 형질전환체.
제11항에 있어서,
상기 숙주세포는 박테리아, 효모 및 곰팡이로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
서열번호 1의 아미노산 기본서열에서 201 내지 210, 266 내지 272, 및 332 내지 340 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산을 변이하는 단계를 포함하는 3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환하는 활성을 가지는 변이형 폴리펩타이드 제조방법.
제14항에 있어서,
상기 서열번호 1의 아미노산 기본서열에서 209, 269 및 335 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산을 변이하는 것을 특징으로 하는 변이형 폴리펩타이드 제조방법.
제14항에 있어서,
상기 변이는 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판, 글루타민, 히스티딘, 라이신 및 아르기닌 중에서 기본서열의 아미노산과 상이한 것으로 선택된 아미노산으로 치환하는 것을 특징으로 하는 변이형 폴리펩타이드 제조방법.
제15항에 있어서,
상기 변이는 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판, 글루타민, 히스티딘, 라이신 및 아르기닌 중에서 선택된 아미노산으로 치환되는 것을 특징으로 하는 변이형 폴리펩타이드 제조방법.
제11항에 따른 형질전환체를 배양하는 단계 및 상기 배양에서 제조된 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 3-히드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환하는 활성을 가지는 변이형 폴리펩타이드 제조방법.
3-히드록시프로피온알데히드(3-Hydroxypropionaldehyde)가 존재하거나 3-히드록시프로피온알데히드가 생산되는 조건에서, 제11항에 따른 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 3-히드록시프로피온산의 생산방법.