KR101966884B1 - 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소 변이체 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 제조방법 - Google Patents
알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소 변이체 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소 변이체 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산(3-HP)의 제조방법에 관한 것으로 더욱 자세하게는 글리세롤로부터 3-HP를 생성하는 반응에 관여하는 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소 변이체 및 이를 이용한 3-HP의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 효소 변이체를 사용하면, 기존의 3-HP 생산 공정에서 문제가 되었던 중간산물인 3-HPA 독성 및 NAD+ 재생 문제를 해결하여, 고농도의 3-HP를 효율적으로 생산할 수 있다.
Description
본 발명은 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소 변이체 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산(3-HP)의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 글리세롤로부터 3-HP를 생성하는 반응에 관여하는 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소 변이체 및 이를 이용한 3-HP의 제조방법에 관한 것이다.
3-히드록시프로피온산((3-Hydroxypropinoic acid, 3-HP)은 바이오매스로부터 생산되는 재생가능한 빌딩블럭으로, 히드록실 및 카르복실기의 두 가지 작용기를 사용하여 많은 유용한 화학물질로 전환할 수 있다. 예를 들어, 3-HP은 촉매반응을 통해 아크릴산으로 전환될 수 있으며, 아크릴산의 세계 시장 규모는 2022년까지 225.5억 달러까지 성장할 것으로 예상된다.
3-HP를 생산하기 위해 당 또는 글리세롤을 이용하는 생합성 경로를 설계하여, 대사적으로 조작된 미생물이 개발되고 있다. 특히 글리세롤을 원료로 하는 대사 경로(화학식 1)는 폐글리세롤(바이오디젤 산업의 부산물)의 저렴한 가격으로 인한 경제적 이점이 있기에 많은 주목을 받고 있다(Yang, F. et al., Biotechnol Biofuels 5:13, 2012; Bozell, J.J. and Petersen, G.R. Green Chemistry 12: 539, 2010; Garlapati, V.K. et al., Biotechnol Rep ( Amst ) 9:9, 2016).
글리세롤은 글리세롤탈수효소(GDHt)에 의해 촉매된 탈수반응을 통해 3-하이드록시프로판알(3-HPA)로 전환되고, 3-HPA의 알데히드 중간체는, 알데히드 탈수소 효소(ALDH)를 통해 NAD(P)+가 NAD(P)H로 환원되는 동시에 3-HP로 산화된다. 조효소 B12-의존 글리세롤 탈수효소(DhaB)는 고가의 비타민 B12가 필요하나, 첫 번째 반응에 널리 사용되어 왔다. 조효소 B12의 필요성을 줄이거나 완전히 없애기 위해, 자연적으로 비타민을 생산할 수 있는 여러 가지 미생물들이 3-HP 생산 재조합 균주 개발에 사용되어 왔으며, 현재까지는 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae)이 가장 성공적인 재조합 균주의 후보였다(Ashok, S. et al., Appl Microbiol Biotechnol 90:1253, 2011; Huang, Y. et al., Bioresour Technol 103:351, 2012; Amin, H.M.et al., Journal of Genetic Engineering and Biotechnology 11:53, 2013; Zhou, S. et al., Biotechnol Bioeng 110:3177, 2013). 다양한 소스 유래의 ALDH 효소를 3-HPA에서 3-HP로의 전환에 적합한지 평가하였으나, 3-HPA의 생산에 적합한 효소를 찾지 못하여 3-HP 생산 재조합 균주의 개발에 어려움이 있었으며, 아조스피릴룸 브라실렌스(Azospirillum brasilense)의 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소 효소(α-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase(KGSADH))가 3-HP 생산에 적합한 ALDH 효소인 것으로 확인되었다(Rathnasingh, C.et al., Biotechnol Bioeng 104:729, 2009; Ko, Y.et al., Process Biochemistry 47:1135, 2012).
3-HP 생산을 위한 재조합 미생물을 개발하는 데에 있어서, ALDH와 관련된 문제점이 있다. 3-HPA의 독성에 의하여 3-HPA의 축적으로 인한 세포 사멸 및 이로인한 3-HP 생산이 중단되는 것이다. 3-HPA의 축적을 방지하기 위하여, ALDH(2단계 효소)의 발현을 조절하여, ALDH 활성을 GDHt(1단계 효소)의 활성보다 높은 수준으로 유지하는 방법이 개발되었다(Rathnasingh, C. et al., Biotechnol Bioeng 104:729, 2009; Ko, Y.et al., Process Biochemistry 47:1135, 2012). 최근에는, UTR 조작을 통하여 두 가지 효소 반응 속도 비율의 최적화에 대하여 연구가 진행되었으며(Lim, H.G. et al., ACS Synth Biol 5:1247, 2016), 최적화된 경로는 3-HP 농도와 생산성을 향상시켰다. 그러나 생합셩 경로에 사용되는 효소의 발현을 조절하는 전략에는 몇 가지 제한이 있다: 1) ALDH의 높은 발현은 숙주 균주에 부담이 될 수 있고, 2) 3-HPA의 농도는 일정 수준 이하로 감소될 수 없으며, 3-HPA에 대한 ALDH의 Km에 의존한다. 3-HPA 독성을 조절하기 위한 보다 효과적인 해결책은 ALDH의 Km을 감소시키기 위하여, 더 높은 활성을 나타내도록 ALDH를 변이시키는 것이다. Chu 등은 야생형 효소보다 1.4배 높은 활성(Kcat)을 보이는 변이체 ALDH을 보고하였다. 5L의 생물 반응기에서 조작된 ALDH 효소는 3-HP 농도를 약 20% 가량 증가시켰다(Chu, H. S. et al. Biotechnol Bioeng 112:356, 2015). 글리세롤-기반 3-HP 생산의 또 다른 문제점은 NAD(P)+의 재생이다. 세포의 산화환원 균형은 세포 생리의 다양한 측면에 영향을 미친다. NAD(P)+ : NAD(P)H의 비율은 대사, 환경 조건에 따라 조절된다. 그러나, 세포 생리에서 3-HPA 및 3-HP의 독성 때문에, NAD(P)+를 NAD(P)H로 전환시키는 외부 도입된 대사경로는 3-HP 생산의 후기 단계에서 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 감소시킬 수 있다. NAD(P)+ 재생에 대한 문제를 해결하기 위하여 질산염 존재 하에서의 혐기성 3-HP 생산이 시도되었으며, NAD(P)H 축적은 NAD(P)H 산화 경로를 도입함으로써 완화시킬 수 있다. 그러나, NAD(P)+에 대하여 낮은 Km을 가지도록 ALDH를 조작하는 것이, 낮은 NAD(P)+ 농도에 대처하는데 더 직접적인 해결책이 될 수 있다.
이에, 본 발명자들은 3-HP 생합성 생산성을 높이는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, ALDH들 중 높은 3-HP 생산성을 나타내는 효소인 KGSADH(Ko, Y.et al., Process Biochemistry 47:1135, 2012)에 대하여 KGSADH의 기질-결합 부위를 변형시키는 직접 진화 조작을 수행하여, 3-HPA 및 NAD+에 대한 활성, 기질 특이성, 생성물 저해, 3-HPA 불활성화, 활성의 PH 의존성 및 온도 민감성을 포함하는 다양한 특성이 향상된 효소 변이체를 선별하고, 상기 변이체 효소를 코딩하는 유전자를 도입한 재조합 슈도모나스 데니트리피칸스(Pseudomonas denitrificans) 균주가 글리세롤로부터 3-HP의 생산능이 현저히 향상되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 3-HP 생합성능이 향상된 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소 변이체 및 이를 코딩하는 유전자를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변이 알데히드 탈수소효소(ALDH)의 유전자를 포함하는 재조합 균주를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 균주를 이용한 3-HP의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 R334Q 및 A337R 변이를 포함하는 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소(α-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase) 변이체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 효소 변이체를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 또는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 3-하이드록시프로피온산을 수득하는 단계.3-하이드록시프로피온산의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소 변이체의 유전자를 사용하면, 기존의 3-HP 생산 공정에서 문제가 되었던 중간산물인 3-HPA 독성 및 NAD+ 재생 문제를 해결하여, 고농도의 3-HP를 효율적으로 생산할 수 있다.
도 1은 KGSADH의 상동성 모델 구조를 나타낸 것으로, A는 상동성 모델링의 주형으로 사용하기 위하여, KGSADH(초록색)와 인간 미토콘드리아 유래 알데히드 디하이드로게네이즈(PDB:1001, 파란색)을 중첩시킨 이미지를 나타낸 것이고, B는 활성 부위의 촉매잔기인 Glu와 Cys를 확대한 것이며, C는 KGSADH의 상동성 모델에서ψ/φ 분포의 Ramachandran 플롯을 나타낸 것이고, D는 KGSADH의 상동성 모델의 단백질 모델에 대한 품질점수(Z-스코어)를 나타낸 것이다.
도 2는 KGSADH의 상동성 모델을 이용하여 나타낸 활성부위에 인접한 잔기를 나타낸 것이다(분홍색 C287 및 E253).
도 3은 라이브러리 제작을 위한 타겟 잔기를 나타낸 것으로, A는 KGSADH의 상동성 모델링을 이용한 알데히드 결합 부위의 단일부위 변이 라이브러리 제작을 위한 잔기를 나타낸 것으로, 알데히드 결합부위 가장자리의 13개 잔기와 GabD4 결과에 의한 2개 잔기(E215 및 K273)을 무작위 돌연변이 위치로 선택하였으며, 촉매부위(C287 및 E253)는 분홍색으로 나타내었다. B는 KGSADH의 결정구조를 사용하여 NAD+(PDB:5X5U)와 결합하여 선택된 NAD+ 결합포켓 라이브러리를 제작하기 위하여 선택된 잔기를 나타낸 것이다.
도 4는 KGSADH와 GabD4의 아미노산 서열 배열을 나타낸 것으로, BoxShade (http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)을 사용하여 배열한 것이다. 일치 또는 유사 잔기는 각각 검은색과 회색 박스로 나타내었으며, GabD4 조작에서 타겟팅된 두 위치(E206 및 E269, KGSADH에서는 E215 및 K273)는 분홍색으로 나타내었다.
도 5의 A는 알데하이드 결합 부위의 단일 부위 라이브러리 스크리닝에 의하여 확인된 변이들의 결합을 위한 라이브러리를 생성하기 위하여 선택된 잔기를 나타낸 것이고, B는 각 위치에 도입되는 아미노산을 나타낸 것이다. 동의 코돈을 이용하여 의도하지 않게 도입된 아미노산들은 붉은색으로 나타내었다.
도 6은 야생형 KGSADH와 본 발명에서 조작된 효소의 특성을 나타낸 것으로, A는 3-HPA에 대한 활성과 비교한 몇가지 알데하이드 기질에 대한 활성을 나타낸 것이고, B는 NADH에 의한 KGSADH의 생성물 억제를 나타낸 것이며, C는 3-HPA에 의한 KGSADH의 불활성화를 나타낸 것이다. 각 변이체는 20mM 3-HPA와 함께 정해진 기간 동안 반응시켰고, 반응이 끝난 후 활성을 측정하였다. KGSADH의 결과는 파란색으로 나타내었으며, WT-QR은 갈색, 104-QR은 녹색, 106-QR은 보라색 및 108-QR은 청록색으로 나타내었다.
도 7은 KGSADH 및 그 변이체의 효소 활성이 생성물인 3-HP에 의한 저해되는 것을 나타낸 것이다.
도 8은 pH 변화에 따른 KGSADH 및 그 변이체의 효소의 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 열처리에 의한 KGSADH 및 그 변이체의 불활성화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 WT-QR 변이체의 모델 구조를 나타낸 것으로, A는 KGSADH 구조(PDB:5X5U)와 WT-QR 모델구조를 중첩시킨 결과를 나타낸 것이고, B는 NAD+ 결합 포켓에서의 상호작용을 확대한 것이며, C는 알데하이드 결합 포켓의 입구를 나타낸 것으로, 알데하이드 결합 포켓 입구에 위치하는 루프와 α-헬릭스 사이의 거리를 나타내었다. D는 활성부위와 근접한 잔기들의 방향을 나타낸 것이다. KGSADH의 구조는 청록색으로 나타내었고, WT-QR의 모델구조는 오렌지색으로 나타내었다.
도 11은 KGSADH 구조(PDB:5X5U)와 WT-QR 모델구조 사이의 Cα 원자의 RMSD 값을 나타낸 것이다.
도 12는 재조합 P. denitrificans 균주를 이용한 글리세롤로부터 3-HP를 생산한 결과를 나타낸 것으로, A-B는 KGSADH를 포함하는 P. denitrificans Δ3hpdH Δ3hibdhIV 균주(A)와 108-QR 변이체를 포함하는 P. denitrificans Δ3hpdH Δ3hibdhIV 균주(B)의 시간별 프로파일을 나타낸 것이으로, ■는 세포성장(OD600), ●는 글리세롤 농도, ▲는 3-HP 농도, ○는 pH를 나타낸다. C는 배양배지에 축적되는 3-HPA를 나타낸 것으로, 3-HPA 면적을 12시간은 파란색, 24시간은 갈색으로 나타내었다. D는 DhaB 활성을 나타낸 것이고, E는 KGSADH 활성을 나타낸 것이다. D-E는 12시간(파란색)과 24시간(갈색)에서 세포 용해물에서의 효소활성을 측정하여 나타낸 것이다.
도 2는 KGSADH의 상동성 모델을 이용하여 나타낸 활성부위에 인접한 잔기를 나타낸 것이다(분홍색 C287 및 E253).
도 3은 라이브러리 제작을 위한 타겟 잔기를 나타낸 것으로, A는 KGSADH의 상동성 모델링을 이용한 알데히드 결합 부위의 단일부위 변이 라이브러리 제작을 위한 잔기를 나타낸 것으로, 알데히드 결합부위 가장자리의 13개 잔기와 GabD4 결과에 의한 2개 잔기(E215 및 K273)을 무작위 돌연변이 위치로 선택하였으며, 촉매부위(C287 및 E253)는 분홍색으로 나타내었다. B는 KGSADH의 결정구조를 사용하여 NAD+(PDB:5X5U)와 결합하여 선택된 NAD+ 결합포켓 라이브러리를 제작하기 위하여 선택된 잔기를 나타낸 것이다.
도 4는 KGSADH와 GabD4의 아미노산 서열 배열을 나타낸 것으로, BoxShade (http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)을 사용하여 배열한 것이다. 일치 또는 유사 잔기는 각각 검은색과 회색 박스로 나타내었으며, GabD4 조작에서 타겟팅된 두 위치(E206 및 E269, KGSADH에서는 E215 및 K273)는 분홍색으로 나타내었다.
도 5의 A는 알데하이드 결합 부위의 단일 부위 라이브러리 스크리닝에 의하여 확인된 변이들의 결합을 위한 라이브러리를 생성하기 위하여 선택된 잔기를 나타낸 것이고, B는 각 위치에 도입되는 아미노산을 나타낸 것이다. 동의 코돈을 이용하여 의도하지 않게 도입된 아미노산들은 붉은색으로 나타내었다.
도 6은 야생형 KGSADH와 본 발명에서 조작된 효소의 특성을 나타낸 것으로, A는 3-HPA에 대한 활성과 비교한 몇가지 알데하이드 기질에 대한 활성을 나타낸 것이고, B는 NADH에 의한 KGSADH의 생성물 억제를 나타낸 것이며, C는 3-HPA에 의한 KGSADH의 불활성화를 나타낸 것이다. 각 변이체는 20mM 3-HPA와 함께 정해진 기간 동안 반응시켰고, 반응이 끝난 후 활성을 측정하였다. KGSADH의 결과는 파란색으로 나타내었으며, WT-QR은 갈색, 104-QR은 녹색, 106-QR은 보라색 및 108-QR은 청록색으로 나타내었다.
도 7은 KGSADH 및 그 변이체의 효소 활성이 생성물인 3-HP에 의한 저해되는 것을 나타낸 것이다.
도 8은 pH 변화에 따른 KGSADH 및 그 변이체의 효소의 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 열처리에 의한 KGSADH 및 그 변이체의 불활성화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 WT-QR 변이체의 모델 구조를 나타낸 것으로, A는 KGSADH 구조(PDB:5X5U)와 WT-QR 모델구조를 중첩시킨 결과를 나타낸 것이고, B는 NAD+ 결합 포켓에서의 상호작용을 확대한 것이며, C는 알데하이드 결합 포켓의 입구를 나타낸 것으로, 알데하이드 결합 포켓 입구에 위치하는 루프와 α-헬릭스 사이의 거리를 나타내었다. D는 활성부위와 근접한 잔기들의 방향을 나타낸 것이다. KGSADH의 구조는 청록색으로 나타내었고, WT-QR의 모델구조는 오렌지색으로 나타내었다.
도 11은 KGSADH 구조(PDB:5X5U)와 WT-QR 모델구조 사이의 Cα 원자의 RMSD 값을 나타낸 것이다.
도 12는 재조합 P. denitrificans 균주를 이용한 글리세롤로부터 3-HP를 생산한 결과를 나타낸 것으로, A-B는 KGSADH를 포함하는 P. denitrificans Δ3hpdH Δ3hibdhIV 균주(A)와 108-QR 변이체를 포함하는 P. denitrificans Δ3hpdH Δ3hibdhIV 균주(B)의 시간별 프로파일을 나타낸 것이으로, ■는 세포성장(OD600), ●는 글리세롤 농도, ▲는 3-HP 농도, ○는 pH를 나타낸다. C는 배양배지에 축적되는 3-HPA를 나타낸 것으로, 3-HPA 면적을 12시간은 파란색, 24시간은 갈색으로 나타내었다. D는 DhaB 활성을 나타낸 것이고, E는 KGSADH 활성을 나타낸 것이다. D-E는 12시간(파란색)과 24시간(갈색)에서 세포 용해물에서의 효소활성을 측정하여 나타낸 것이다.
3-히드록시프로피온산(3-Hydroxypropinoic acid, 3-HP)은 탈수반응을 통해 글리세롤을 3-히드록시프로판알(3-Hydroxypropanal, 3-HPA)로 전환한 뒤, 산화반응을 통해 3-HP로 전환시키는 두 가지 효소 반응을 통해 생산된다. 기존에 재조합 미생물을 이용하여 3-HP를 생산하는데에 있어서, 3-HPA의 독성과 NAD+ 재생의 효율이 낮다는 점에서 문제가 있었다. 본 발명은 이러한 문제를 해결하기 위해, 알데히드 탈수소 효소인 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소(α-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase(KGSADH)에서 기질인 3-HPA과 NAD+의 예상 결합 부위를 무작위로 치환한 라이브러리에서 높은 활성을 나타내는 효소를 스크리닝하였다. 스크리닝된 KGSADH 변이체는 3-HPA과 NAD+ 모두에 대하여 매우 낮은 Km값을 나타내었으며, 또한, 알데히드 및 NAD+에 대한 기질 특이성이 높았고, NADH에 의한 저해(억제)가 적으며, 야생형 효소보다 3-HPA에 의한 불활성화에 대한 저항성이 높은 것으로 확인되었다.
본 발명의 KGSADH 변이체를 발현하는 재조합 Pseudomonas denitrificans 균주는 중간산물인 3-HPA의 축적이 적어, 3-HP의 생산에 관여하는 효소의 불활성화 정도가 감소하고, 야생형 KGSADH를 발현하는 균주보다 높은 세포 성장을 나타내었다. 따라서, 본 발명에 따른 KGSADH 변이체를 발현하는 재조합 균주는 배양 후반부에도 3-HP를 지속적으로 생산하여, 최종적으로 3-HP 생산량을 약 40% 향상시켰다.
따라서, 본 발명은 일관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 R334Q 및 A337R 변이를 포함하는 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소(α-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase) 변이체에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서는 KGSADH의 알데히드 결합포켓에 변이를 가지면서 높은 효소활성을 가지는 변이체 104, 106 및 108을 스크리닝 하였으며(표 3 및 표 4 참조), NAD+ 결합 포켓의 변이 중 R334Q 및 A337R변이가 NAD+ 결합능 뿐만아니라, 3-HPA에 대한 결합능도 향상시키는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 효소변이체는 서열번호 2~5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서, A110S, N159V, K273A, K273E, K273S, R281Q, A442P, T443D, T443E, P444T 및 P444A로 구성되는 변이에서 선택되는 변이를 포함하는 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소(α-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase) 변이체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서, A110S, K273A, A442P 및 P444T 변이를 포함하는 변이체인 것을 특징으로 할 수 있고, A442P 및 P444T 변이를 포함하는 변이체인 것을 특징으로 할 수 있으며, K273A, A442P, T443E 및 P444A 변이를 포함하는 변이체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서는 재조합 미생물을 사용하여 글리세롤로부터 3-HP를 생물학적으로 생산하는데 있어서 문제가 되었던 중간체인 3-HPA의 독성 및 배양의 후기 단계에서 낮은 NAD+ 재생 효율 등을 해결하기 위하여 알데히드 탈수소효소인 KGSADH에서 기질인, 3-HPA 및 NAD+에 대한 효소 활성을 개선한 변이체를 제작하였다. KGSADH 변이체는 기질 결합 포켓을 표적으로 하는 다양한 라이브러리를 스크리닝하여 분리하였다. 변이 효소는 야생형 효소에 비해 향상된 활성을 보였다. 특히, 3-HPA 및 NAD+에 대한 효소의 Km 값이 현저하게 감소하였다. 또한, KGSADH 변이체는 다음의 몇 가지 특성을 나타낸다: 알데히드 및 환원 보조 인자에 대해 높은 기질 특이성을 가지고; NADH에 의한 생산 저해가 감소되고; 3-HPA에 의한 불활성화에 대하여 높은 내성을 나타낸다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기 효소 변이체를 코딩하는 유전자; 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터; 및 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 7~10 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 글리세롤 탈수소효소를 추가로 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는 슈도모나스 데니트리피칸스(P. denitrificans) D3hpdH D3hibdhIV 균주(KCTC 12572BP, 대한민국 등록특허 제1,555,867호)를 재조합 미생물의 모 균주로 사용하였으나, 글리세롤 탈수소효소를 발현하는 균주라면 제한없이 사용할 수 있으며, 외래에서 도입된 글리세럴 탈수소효소를 발현하는 균주도 사용될 수 있다. 아울러, 재활성인자(GdrAB)를 추가로 발현하는 균주를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에서는, KGSADH 변이체를 발현하는 재조합 Pseudomonas denitrificans 균주를 제조하고, 상기 균주를 글리세롤 함유 배지에서 배양하는 경우, 3-HPA의 축적이 감소되어 효소의 불활성화 정도가 감소하고, 야생형 KGSADH를 발현하는 균주보다 높은 세포 성장을 나타내었으며, 배양 후반부에도 3-HP를 지속적으로 생산하여, 최종적으로 3-HP 생산량을 야생형 균주보다 약 40% 향상시켰다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 3-하이드록시프로피온산을 수득하는 단계를 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서는 재조합 슈도모나스 데니트리피칸스(P.denitrificans) 균주에서 3-HP 생산을 위해 변이 효소인 108-QR와 야생형 KGSADH와 비교하였다.
변이 효소를 함유하는 미생물은 야생형 효소와 비교하였을 때, 3-HPA 축적이 적고, 글리세롤로부터 3-HP를 생성하는 2가지 효소의 불활성화가 적었으며, 세포 성장이 높고, 3-HP 생산이 더 높았다. 이러한 현상은 배양 후기 단계에서 더욱 뚜렷하게 나타났다. 경제적으로 실현 가능한 3-HP 생산 공정 개발과 관련된 3-HPA 독성 및 NAD+ 재생 문제는 본 발명에 따른 알데히드 탈수소효소 변이체를 사용하는 것을 통해 해결될 수 있을 것으로 예상된다.
용어 “벡터 (vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 “플라스미드 (plasmid)” 및 “벡터 (vector)”는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다.
“발현 조절 서열 (expression control sequence)”이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 이. 콜라이에서 단백질을 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 “작동가능하게 연결 (operably linked)”된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, “작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본원 명세서에 사용된 용어 “발현 벡터”는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
본 발명의 변이체를 발현현시키기 위해 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 숙주에 적합한 발현 벡터에는, 예를 들어 SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열을 포함한다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 E. coli에서 얻는 것을 예시할 수 있는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2μ 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL 941이다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질전환”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질감염”은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
발명의 숙주 세포는 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 생쥐 세포같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포는 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. 본 발명의 단백질을 코딩하는 cDNA를 클로닝할 때에는 동물세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 어류 기원의 CHSE-214, FHM, RTG-2 및 EPC를 예시하였으나 물론 이에 제한되는 것은 아니다. COS 세포를 이용하는 경우에는 COS 세포에서 SV40 라지 T안티겐(large T antigen)이 발현하고 있으므로 SV40의 복제개시점을 갖는 플라스미드는 세포중에서 다수 카피(copy)의 에피솜(episome)으로 존재하도록 되고 통상보다 고 발현이 기대될 수 있다. 도입된 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종으로부터 얻을 수 있거나, 숙주 세포와 다른 종의 것일 수 있거나, 또는 그것은 어떠한 이종 또는 상동성 DNA를 포함하는 하이브리드 DNA 서열일 수 있다.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 목적단백질의 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
1:
KGSADH의
알데히드 결합 포켓 조작
KGSADH의 결합 포켓을 변이시키기 위하여, 우선, KGSADH의 활성 부위에 가까운 잔기를 표적으로 삼았다. 효소의 상동성 모델은 알데히드 기질인 크로톤알데히드(PDB :1O01)40와 복합체를 이루는 인간 미토콘드리아 알데히드 탈수소 효소의 구조를 주형으로 삼아 실험하였다(도 1).
KGSADH의 3차원 구조는 인간 미토콘드리아 알데히드 탈수소효소(PDB ID: 1O01)의 X선 구조를 주형으로 사용하여, 상동성 모델링을 통해 구축하였다(도 1A)(Perez-Miller, S. J. & Hurley, T. D. Biochemistry 42:7100, 2003).상기 모델링은 MOE(Molecular Operating Environment)를 사용하여 제작되었으며, PROCHECK 및 ProSA 온라인 구조 분석을 통해 평가하였다. PYMOL뷰어(http://www.pymol.org)를 사용하여 단백질 구조를 육안으로 검사하였다.
해당 서열과 다른 알데히드 탈수소 효소들의 서열을 비교한 결과, 촉매 잔기는 E253과 C287인 것을 예측하였다. 주형과 모델링된 KGSADH 구조의 중첩은 이러한 예측을 뒷받침하였다(도 1B). 모델링된 구조에 기초하여, 10개의 라이브러리를 생성하는 NNK(K는 G 또는 T) 동의코돈을 사용하여, 촉매 잔기에 가까운 10개 부분을 선택하고, 개별적으로 무작위로 추출하였다(도 2).
라이브러리 구축 방법
KGSADH 변이체 라이브러리는 어셈블리 PCR 방법을 사용하여, KGSADH 유전자를 돌연변이시켜 제작하였다. pQE80L/KGSADH 플라스미드(Watanabe, S. et al.,J Biol Chem 281:28876, 2006)를 주형으로 사용하였다. 사용된 프라이머는 표 1에 나타냈다.
| No. | Primer | Sequence | 서열 번호 |
|
| 1 | KGSADH library F | GATTCAATTGTGAGCGGATAAC | 11 | |
| 2 | KGSADH library R | CTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCG | 12 | |
| 3 | KGSADH 213 F | GGCGATCCGGCCNNKATCTCGTCGTACCTG | 13 | |
| 4 | KGSADH 213 R | CAGGTACGACGAGATNMMGGCCGGATCGCC | 14 | |
| 5 | KGSADH 273 F | GTTGCGCTCGCGGTGNNKGCGGCCGGCGG | 15 | |
| 6 | KGSADH 273 R | CCGCCGGCCGCMNNCACCGCGAGCGCAAC | 16 | |
| 7 | KGSADH 106 F | CCGAAGCGCGCGTCNNKGTGCTGTCGGCGG | 17 | |
| 8 | KGSADH 106 R | CCGCCGACAGCACMNNGACGCGCGCTTCGG | 18 | |
| 9 | KGSADH 110 F | GTCGAAGTGCTGTCGNNKGCGGACATCATC | 19 | |
| 10 | KGSADH 110 R | GATGATGTCCGCMNNCGACAGCACTTCGAC | 20 | |
| 11 | KGSADH 159 F | GTGGAATTTCCCGGTCNNKCAGGTCGTGCGCAAG | 21 | |
| 12 | KGSADH 159 R | CTTGCGCACGACCTGMNNGACCGGGAAATTCCAC | 22 | |
| 13 | KGSADH 281 F | GGCGGCGCGAAGTTCNNKAACGCGGGGCAGG | 23 | |
| 14 | KGSADH 281 R | CCTGCCCCGCGTTMNNGAACTTCGCGCCGCC | 24 | |
| 15 | KGSADH 283 F | GAAGTTCCGCAACNNKGGGCAGGTCTGCATC | 25 | |
| 16 | KGSADH 283 R | GATGCAGACCTGCCCMNNGTTGCGGAACTTC | 26 | |
| 17 | KGSADH 442 F | GATCAACCAGCCGNNKACGCCGTGGCCGGAAATG | 27 | |
| 18 | KGSADH 442 R | CATTTCCGGCCACGGCGTMNNCGGCTGGTTGATC | 28 | |
| 19 | KGSADH 443 F | GATCAACCAGCCGGCGNNKCCGTGGCCGGAAATG | 29 | |
| 20 | KGSADH 443 R | CATTTCCGGCCACGGMNNCGCCGGCTGGTTGATC | 30 | |
| 21 | KGSADH 444 F | CAACCAGCCGGCGACGNNKTGGCCGGAAATGCC | 31 | |
| 22 | KGSADH 444 R | GGCATTTCCGGCCAMNNCGTCGCCGGCTGGTTG | 32 | |
| 23 | KGSADH 445 F | CAGCCGGCGACGCCGNNKCCGGAAATGCCGTTC | 33 | |
| 24 | KGSADH 445 R | GAACGGCATTTCCGGMNNCGGCGTCGCCGGCTG | 34 | |
| 25 | KGSADH 98 F | GAGCAGGGCNNKCCGCTCACCGAAGCG | 35 | |
| 26 | KGSADH 98 R | CGCTTCGGTGAGCGGMNNGCCCTGCTC | 36 | |
| 27 | KGSADH 99 F | CAGGAGCAGGGCAAGNNKCTCACCGAAG | 37 | |
| 28 | KGSADH 99 R | CTTCGGTCAGMNNCTTGCCCTGCTCCTG | 38 | |
| 29 | KGSADH 105 F | CACCGAAGCGCGCNNKGAAGTGCTGTC | 39 | |
| 30 | KGSADH 105 R | GACAGCACTTCMNNGCGCGCTTCGGTG | 40 | |
| 31 | KGSADH 109 F | GTCGAAGTGCTGNNKGCGGCGGACATC | 41 | |
| 32 | KGSADH 109 R | GATGTCCGCCGCMNNCAGCACTTCGAC | 42 | |
| 33 | KGSADH A110A/S F | CGAAGTGCTGTCGKCCGCGGACATCATCG | 43 | |
| 34 | KGSADH A110A/S R | CGATGATGTCCGCGGMCGACAGCACTTCG | 44 | |
| 35 | KGSADH N159N/A/V F | GTGGAATTTCCCGGTCRHCCAGGTCGTGCGCAAG | 45 | |
| 36 | KGSADH N159N/A/V R | CTTGCGCACGACCTGGDYGACCGGGAAATTCCAC | 46 | |
| 37 | KGSADH K273K/A/S/E F | GTTGCGCTCGCGGTGDMAGCGGCCGGCGG | 47 | |
| 38 | KGSADH K273K/A/S/E R | CCGCCGGCCGCTKHCACCGCGAGCGCAAC | 48 | |
| 39 | KGSADH R281R/Q F | GGCGGCGCGAAGTTCCRKAACGCGGGGCAGG | 49 | |
| 40 | KGSADH R281R/Q R | CCTGCCCCGCGTTMYGGAACTTCGCGCCGCC | 50 | |
| 41 | KGSADH A442T443P444 F |
GCTGTGGATCAACCAGCCGSCGRMWVMATGGCCGGAAATGCCGTTCG | 51 | |
| 42 | KGSADH A442T443P444 R |
CGAACGGCATTTCCGGCCATKBWKYCGSCGGCTGGTTGATCCACAGC | 52 | |
| 43 | P211A212 PA F | GATCGGCCTCGTGTACGGCGATCCGGCCGAAATCTCGTCGTACCTG | 53 | |
| 44 | P211A212 PA R | CAGGTACGACGACATTTCGGCCGGATCGCCGTACACGAGGCCGATC | 54 | |
| 45 | P211A212 PP F | GATCGGCCTCGTGTACGGCGATCCGCCGGAAATCTCGTCGTACCTG | 55 | |
| 46 | P211A212 PP R | CAGGTACGACGAGATTTCCGGCGGATCGCCGTACACGAGGCCGATC | 56 | |
| 47 | P211A212 GA F | GATCGGCCTCGTGTACGGCGATGGCGCCGAAATCTCGTCGTACCTG | 57 | |
| 48 | P211A212 GA R | CAGGTACGACGAGATTTCGGCGCCATCGCCGTACACGAGGCCGATC | 58 | |
| 49 | P211A212 GP F | GATCGGCCTCGTGTACGGCGATGGCCCGGAAATCTCGTCGTACCTG | 59 | |
| 50 | P211A212 GP R | CAGGTACGACGAGATTTCCGGGCCATCGCCGTACACGAGGCCGATC | 60 | |
| 51 | V235Q238L239 F | CACGGGTTCGACGCCGRYCGGCAAGMWAVTTGCCTCGCTGGCGGGCCTG | 61 | |
| 52 | V235Q238L239 R | CAGGCCCGCCAGCGAGGCAABTWKCTTGCCGRYCGGCGTCGAACCCGTG | 62 | |
| 53 | R334A337A F | GCTCGCGAACCCGCGCCRSCTGACCGCGATGGCGTCGGTCATCGAC | 63 | |
| 54 | R334A337A R | GTCGATGACCGACGCCATCGCGGTCAGSYGGCGCGGGTTCGCGAGC | 64 | |
| 55 | R334A337K F | GCTCGCGAACCCGCGCCRSCTGACCAAAATGGCGTCGGTCATCGAC | 65 | |
| 56 | R334A337K R | GTCGATGACCGACGCCATTTTGGTCAGSYGGCGCGGGTTCGCGAGC | 66 | |
| 57 | R334A337R F | GCTCGCGAACCCGCGCCRSCTGACCCGTATGGCGTCGGTCATCGAC | 67 | |
| 58 | R334A337R R | GTCGATGACCGACGCCATACGGGTCAGSYGGCGCGGGTTCGCGAGC | 68 | |
| 59 | R334Q/A337R F | GCTCGCGAACCCGCGCCAGCTGACCCGTATGGCGTCGGTCATCGAC | 69 | |
| 60 | R334Q/A337R R | GTCGATGACCGACGCCATACGGGTCAGCTGGCGCGGGTTCGCGAGC | 70 | |
제한효소 BamH1 및 Pst1 부위를 이용하여, 프라이머 1 및 2 로부터의 PCR 산물을 pQE80L 플라스미드에 연결시켰다. 생성된 KGSADH 라이브러리를 대장균 DH10β로 형질전환시켰다. 프라이머 1-32는 알데하이드 결합 포켓을 위한 단일 부위 변이 라이브러리를 구축하는데 사용하였고, 프라이머 1, 2 및 33-42는 단일 부위 변이 라이브러리로부터 유익한 돌연변이를 조합하기 위해 사용하였다. 단일 부위 변이 프라이머 1, 2 및 43-58은 NAD+ 결합 부위 라이브러리에 사용하였다.pQE80L 플라스미드 내에 포함된 야생형 및 돌연변이 KGSADH 효소는 대장균 DH10β 세포에서 발현시켰다.
KGSADH
라이브러리의 스크리닝 방법
변이체 라이브러리에서 스크리닝은 다음과 같이 수행하였다.
3-HPA에서 3-HP로의 산화는 NAD+에서 NADH로의 환원과 짝반응으로 일어나므로, 340nm에서 흡광도의 증가(NADH의 λmax = 340nm)를 사용하여, KGSADH에 의해 촉매된 반응을 모니터하였다. 단일 콜로니를 각 라이브러리로부터 골라 96 웰 플레이트(U 타입)에 접종하였다. 세포를 200μg/mL의 암피실린이 포함된 100μL 2xYT 배지에서 37℃ 조건으로 밤새 배양한 다음, 동일하게 새로운 배지로 옮겼다. OD600이 0.5에 근접할 때, 1mM IPTG를 첨가하여, KGSADH 및 그 변이체 발현을 유도하였다. 6시간 후, 3,134g, 4℃ 조건에서 45분 동안 원심 분리하여 세포를 수확하고, 세포 펠릿을 -80℃에서 보관하였다. 세포 펠릿은 100μL 추출 버퍼(10 % B-PER, 100μg/ML 리소자임 및 5U/ML DNase를 포함하는 100mM 인산 버퍼, pH 8)에 서스펜션하고, 25℃ 조건에서 1시간 동안 배양하였다. 세포 용해물을 3,134g, 4℃ 조건에서 45분 동안 원심분리하였다. 10 ㎕의 상층액을 170㎕의 활성 에세이 완충액(1mM EDTA, 1mM DTT 및 1mM β-머캅토에탄올을 함유하는 100mM 인산염 완충액, pH 6)으로 희석하고, 활성 에세이는 기질, 3-HPA 및 NAD+를 첨가하여 개시하였다. 3-HP 형성 속도는 340nm에서 ΔA/min을 사용하여 결정하였다. 또한, 세포 성장에 따른 효소 농도를 보정하기 위해 3-HP 생산 속도(ΔA/min)를 OD600으로 나누어 결과를 확인하였다.
효소의 정제방법
각 야생형 및 KGSADH 변이체 효소는 다음의 방법으로 정제하였다. pQE80L 플라스미드 내의 야생형 KGSADH 및 KGSADH 변이체 효소 유전자는 대장균 DH10β 세포에서 발현되고, OD600이 0.5에 도달할 때까지 세포를 37℃의 2xYT 배지에서 배양한 다음, 효소의 발현은 1mM IPTG 로 유도하였다. 6시간 후, 세포를 9,300g, 4℃ 조건에서 15분 동안 원심분리하여 수득하고, 세포 펠릿은 -80 ℃에서 보관하였다. N 말단 His6-태그를 갖는 KGSADH 효소 및 그 변이체는 제조자의 지시에 따라 Ni-NTA 수지를 사용하여 정제하였다. 원심분리 한외여과 필터를 사용하여, 단백질 완충액을 150mM NaCl 을 함유한 10mM 인산 완충액, pH 7.4로 교환하고, 정제된 단백질을 저장 완충액 (20mM 인산 칼륨, pH 7.5, 1mM EDTA, 1mM DTT 및 50%(v/v) 글리세롤을 함유)에 저장하였다. 정제된 단백질의 농도는 ProtParam 사이트 (http://web.expasy.org/protparam/)의 계산된 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.
효소의 특징 분석 방법
야생형 및 변이 효소의 kcat및 Km값은 A340(ε=6,220M-1cm-1)의 증가를 모니터링하여 25℃ 조건에서 반응 속도를 측정하여 결정하였다. 3-HPA에 대한 운동 상수를 결정하기 위해, 효소 농도를 1mM EDTA, 1mM DTT, 0.2 % BSA(w/v) 및 2mM NAD+ 를 함유하는 100mM 인산 완충액(pH 8 또는 pH 6)에서 20nM로 조정하였다. 반응은 다양한 농도의 3-HPA의 첨가에 의해 시작하였다. NAD+ 또는 NADP+의 kcat및 Km값의 경우, 효소를 NAD+ 또는 NADP+가 없는 완충액으로 희석하고, 3mM 3-HPA를 첨가하고 NAD+ 또는 NADP+의 농도를 변화시켜 반응을 시작하였다. 이후, Origin 소프트웨어 (Northaempton, MA, USA)를 사용하여 Michaelis-Menten 방정식에 대한 비선형 회귀 분석으로 분석하였다. 다양한 알데히드 기질에 대한 효소의 상대 활성은 1mM EDTA, 1mM DTT, 0.2% BSA (w/v), 1.5mM NAD+ 및 1mM 알데하이드 (3-HPA 프로피온알데하이드, 부티르알데하이드, 발레알데하이드 또는 헥사알데하이드) 를 함유하는 pH 8, 100mM 인산염 완충액 내에서의 활성을 25℃ 조건에서 측정하였다. 3-HP에 의한 KGSADH 효소 억제는 1mM EDTA, 1mM DTT, 0.2% BSA (w/v), 2mM NAD+ 및 1- 1000mM 3-HP를 함유하는 100mM 완충액, pH 8에서의 활성을 측정하여 분석하였다. NADH 억제는 3mM 3-HPA 및 0~3mM NADH를 함유하는 동일한 완충액에서 분석하였다. 효소 활성에 대한 pH의 영향은 아세테이트 완충액(pH 4 및 5), 인산 완충액(pH 6-8) 및 글리신 완충액(pH 9 및 10)을 사용하여 조사하였다. 반응은 1mM EDTA, 1mM DTT, 0.2 % BSA (w/v), 2mM NAD+ 및 3mM 3-HPA를 함유하는 100mM 완충액에서 25℃ 조건 하에 수행하였다. 3-HPA에 의한 KGSADH의 불활성화는 20mM 3-HPA와 효소를 다양한 시간 동안 배양한 후에 잔류 활성을 측정하여 조사하였다. 효소 활성은 1mM EDTA, 1mM DTT, 0.2% BSA (w/v) 및 2mM NAD를 함유하는 100 mM 인산염 완충액, pH8에서 25℃ 조건 하에 측정하였다. 효소의 열 불활성화는 효소를 65℃ 조건에서 다양한 시간 동안 배양한 후에 잔류 활성을 측정하여 분석하였다. 효소 활성은 1mM EDTA, 1mM DTT, 0.2 % BSA (w/v), 2mM NAD+ 및 3mM 3-HPA 를 함유하는 100mM 인산염 완충액, pH8에서 25℃ 조건 하에 측정하였다. 3-HPA 또는 열처리에 의한 불활성화에 대한 반감기 (t1/2) 값은 Origin 소프트웨어를 사용하여, 데이터를 지수 감쇠 (y = aebx)에 맞추어 측정하였다.
KGSADH
효소의 구조적
모델링
KGSADH 의 3차원 구조는 주형으로, 인체 미토콘드리아 알데히드 탈수소 효소 (PDB ID: 1O01) 의 X선 구조를 주형으로 사용하여, 상동성 모델링을 통해 구축하였다(Perez-Miller, S. J. & Hurley, T. D. Biochemistry 42:7100, 2003). 이 모델은 MOE (Molecular Operating Environment) 를 사용하여 제작되었으며, PROCHECK 및 ProSA 온라인 구조 분석을 통해 평가하였다(Barbirato, F., Soucaille, P. & Bories, Appl Environ Microbiol 62:4405, 1996; Wiederstein, M. & Sippl, M. J. Nucleic Acids Res 35:W407, 2007). PYMOL뷰어(http://www.pymol.org)를 사용하여 단백질 구조를 확인하였다.
NAD+(PDB ID: 5X5U)와 복합체를 이룬 KGSADH와 apo 형태(PDB ID: 5X5T)의 결정 구조는 Protein Data Bank에서 검색하여 구조적 변화 및 누락된 잔기를 조사하였다. 추가적인 구조 분석을 위하여, 결합되지 않은 용매 분자 및 그 외 비구조적 잔기를 제거하였다. LowMode ensemble 하에서 MOE 내의 잔기 스캔 모듈을 통해 NAD+와 복합된 WT-QR의 In silico 구조를 생성하였다. LowModeMd Search 방법은 일정한 온도에서 ~1 ps 분자 동역학 시뮬레이션을 사용하여, 변이 형태를 생성하고, Amber10:EHT force filded에서 모든 원자 에너지를 최소화하는 것이다. Pymol 및 MOE 는 육안검사와 구조적 형태를 생성하는 데에 사용하였다.
그 결과, 각각의 라이브러리에서 약 200개의 콜로니를 스크리닝하였다. 3-HPA 및 NAD+에 대해 선택된 기질 농도는 각각 1.5mM 및 1.0mM 이다. 라이브러리를 스크리닝하기 위해 pH 6의 용액을 선택하였다. 3-HP 생산은 세포질 pH를 감소시킬 수 있기 때문에, 낮은 pH에서 개선된 활성 및/또는 변이체 내성을 발견하여야 한다. 그러나, 야생형 클론보다 높거나 비슷한 활성을 나타내는 클론은 아미노산 서열에 변화가 없었다(데이터 미기재). 이는 KGSADH의 구조 및/또는 촉매 작용에서 상기 10개 잔기가 중요한 역할을 한다는 것을 암시한다.
따라서, 다음으로 촉매 잔기와 거리가 있는 알데히드 결합 포켓 내의 잔기의 변이에 촛점을 맞추었다. 주형 구조와 KGSADH의 상동성 모델을 비교하여, 13개의 잔기를 선택하였다(도 3). Cupriavidus necator(GAbD4)의 알데히드 탈수소 효소 조작에 대한 보고서(Chu, H. S. et al.,Biotechnol Bioeng 112:356, 2015)에 근거하여 두 개의 잔기(E213 및 K273)를 더 선택하였다. 본 발명에서 GabD4의 두 잔기(E209 및 E269)는 효소를 조작하기 위하여 무작위로 추출하였다. KGSADH와 GabD4의 유사 시퀀스 정렬을 기반으로, KGSADH의 E213과 K273을 표적위치로 선택하였다(도 4). 표적 잔기는 NNK 동의코돈을 사용하여 무작위로 선택하여 15개의 라이브러리를 생성하였다. 각 라이브러리에 대해 약 200개의 콜로니를 스크리닝하였다. 야생형 클론에 비해 유사하거나 더 높은 효소 활성을 나타내고, 아미노산 서열의 변화를 포함하는 11개의 클론에서 효소를 정제하고, Kcat및 Km동역학 특성을 분석하였다(표 2).
| Enzyme |
3-HPA* | NAD+** | ||||
| kcat (s-1) | Km (mM) | kcat/Km (s-1 mM-1) |
kcat (s-1) | Km (mM) | kcat/Km (s-1 mM-1) |
|
| KGSADH | 15.33 ±2.074 | 1.63 ±0.136 | 9.42 ±0.88 | 11.92 ±1.658 | 0.214 ±0.0183 | 55.72 ±7.15 |
| A110S | 16.43 ±7.258 | 1.76 ±0.734 | 9.60 ±2.90 | 10.39 ±0.948 | 0.198 ±0.0454 | 53.70 ±17.08 |
| N159V | 11.35 ±6.096 | 6.82 ±3.893 | 1.64 ±0.10 | 5.76 ±1.713 | 0.067 ±0.0246 | 87.45 ±18.80 |
| K273A | 16.44 ±5.784 | 1.97 ±0.982 | 8.93 ±2.60 | 11.89 ±2.143 | 0.161 ±0.0445 | 73.29 ±5.26 |
| K273E | 13.61 ±4.341 | 1.58 ±0.674 | 8.85 ±2.48 | 12.63 ±3.139 | 0.235 ±0.0262 | 53.49 ±14.98 |
| K273S | 16.36 ±3.428 | 1.69 ±0.415 | 9.79 ±2.90 | 11.37 ±0.564 | 0.164 ±0.0230 | 68.44 ±6.20 |
| R281Q | 13.16 ±3.314 | 1.32 ±0.553 | 10.57 ±3.29 | 9.31 ±0.170 | 0.139 ±0.0097 | 66.25 ±5.84 |
| A442P | 18.26 ±3.584 | 1.83 ±0.601 | 10.26 ±2.60 | 10.87 ±2.151 | 0.188 ±0.0002 | 56.88 ±11.20 |
| T443D | 14.61 ±4.942 | 1.16 ±0.320 | 12.46 ±3.65 | 12.25 ±3.351 | 0.218 ±0.0520 | 55.04 ±1.98 |
| T443E | 21.63 ±6.315 | 2.10 ±0.441 | 10.20 ±2.64 | 15.53 ±1.871 | 0.277 ±0.0614 | 55.86 ±5.75 |
| P444E | 11.32 ±3.772 | 1.13 ±0.082 | 9.66 ±2.87 | 9.80 ±0.990 | 0.167 ±0.0079 | 57.47 ±3.12 |
| P444T | 17.94 ±6.263 | 1.66 ±0.436 | 10.48 ±1.82 | 13.38 ±1.761 | 0.227 ±0.0388 | 58.06 ±2.29 |
라이브러리의 몇몇 클론은 야생형 효소보다 3-HPA 또는 NAD+에 대해 약간 더 높은 활성(Kcat/Km)을 보였으나, 두 기질 모두에 향상된 활성을 갖는 변이체는 없었다. 흥미롭게도, N159V 돌연변이는 3-HPA에 대한 Km값을 현저하게 증가시켜 Kcat/Km을 5.7배 감소시켰으나, NAD+에 대한 Km은 감소하여, NAD+에 대하여 증가된 활성을 나타내었다. KGSADH의 N159는 NAD+ 결합 포켓에 가깝게 위치하고 있지만, 기질과 직접적으로 상호작용하지는 않으며, 이 잔기는 3-HPA와 상호 작용한다고 알려져 있다. 따라서, N159V 돌연변이가 기질 결합 포켓에서 비교적 큰 구조적 변화를 일으킨다고 생각되었다.알데히드 결합 부위에서 발견된 돌연변이의 조합을 조사하기 위해 추가적인 라이브러리를 생성하였으며, 타겟 위치를 다중 아미노산으로 대체하기 위해 동의코돈을 사용하였다(도 5). 라이브러리의 이론적 크기는 27648개이고, 대략 8000개의 콜로니를 조사하였다. 세포용해물에서 높은 효소 활성이 나타난 3가지 변이체(104, 106 및 108)를 분리하여 그들의 아미노산 서열을 분석하여 표 3에 나타내었으며, 야생형 KGSADH와 다른 서열을 회색으로 나타내었다. 이들 효소를 정제하고, 3-HPA 및 NAD+에 대한 이들의 촉매 성질을 확인하였다(표 4). 변이체 108은 3-HPA에 대한 Kcat/Km값에 의해 입증된 바와 같이, 향상된 촉매 활성을 나타냈다. 변이체 108의 Km은 야생형 효소의 Km보다 2배 이상 감소하였으나, 변이체 104 및 변이체 106는 3-HPA에 대하여 야생형 효소 Kcat/Km보다 낮은 값을 가졌다. 흥미롭게도, 상기 3가지 변이체 모두 3-HPA와 달리 NAD+에 향상된 촉매 활성을 나타내었는데, 이는 주로 증가된 Kcat값의 영향이 컸다.
실시예
2:
KGSADH의
NAD
+-결합 포켓 조작
본 실시예에서는 KGSADH의 NAD+ 결합 부위를 조사하였다. KGSADH의 NAD+에 대한 Km은 0.21mM이다. ALDHs의 알데히드 결합 부위는 기질만큼 다양하지만, ALDHs의 NAD+에 대한 결합 부위는 상대적으로 잘 보존되어있는 것으로 알려져 있다(Perozich, J., et al., Protein Sci 8:137, 1999). 따라서, 본 실시예에서는 NAD+에 대한 Km값이 각각 0.047mM 및 0.0019mM인 NAD+와 결합하는 2개의 ALDH(PDB:1A4Z, 1BXS)의 결정 구조를 사용하여 NAD+와의 상호작용을 측정하였다(Leicht, W.et al., Eur . J. Biochem . 83:1896,1978; Hart, G. J. & Dickinson, F. M. Biochem . J. 203:617, 1982).
상기 ALDH 결정구조에서, NAD+와 결합하는 19개의 위치가 확인되었고, 상기 위치의 사이드 체인은 NAD+와 상호 작용하고, 상기 위치에 대응하는 KGSADH의 잔기위치를 유사 시퀀스 정렬을 이용하여 확인하였다(표 5). 그 다음, KGSADH의 해당 위치에서 아미노산 잔기는 NAD+에 대해 낮은 Km값을 나타내는 ALDH의 아미노산 잔기와 비교하였다(표 5). 이들 중 일부 변이체는(P153, Q160, T230, F386 및 F450)는 촉매 잔기에 가까운 잔기를 타겟으로 실험하였기 때문에(도 2), NAD+결합 포켓 라이브러리를 만드는 것에 포함하지 않았다. 낮은 Km값을 나타내는 다른 ALDH의 서열과 비교했을 때, 약간의 변이를 보이는 7가지 위치(P211, A212, V235, Q238, L239, R334 및 A337)를 선택하여 무작위로 변이시켰다(표 6). 표 6에서 의도치 않은 변이는 붉은색으로 나타내었다.
*는 KGSADH 서열에 기초한 아미노산 위치를 나타낸 것이다.
1 Chu, H. S. et al. Biotechnol Bioeng 112:356, 2015
2 Hart, G. J. & Dickinson, F. M. Biochem . J. 203:617, 1982
3 Leicht, W.et al. Eur . J. Biochem . 83:189, 1978
4 Rodriguez-Zavala, J. S. & Weiner, H. Biochemistry 41:8229, 2002
5 Wierzchowski, J. et al., Arch Oral Biol 53:423, 2008
6 Stagos, D. et al. Drug Metab Dispos 38:1679, 2010.
7 Larson, H. N.et al., Biol Chem 280:30550, 2005
8 Ho, K. K., Hurley, T. D. & Weiner, H. Biochemistry 45:9445, 2006
9 Ni, L.et al., Protein Sci 8, 2784, 1999
10 Diaz-Sanchez, A. G. et al. Plant Physiol 158:1570, 2012
11 Rodriguez-Zavala, J. S.et al., Protein Sci 15:1387, 2006
12 Lindahl, R. & Evces, S. The journal of Biological Chemistry 259:11991, 1984).
13 Vandecasteele, J. P. & Guerrillot, L. Methods Enzymol 89:484, 1982.
14 Koncitikova, R. et al., Biochem J 468, 109, 2015
낮은 기질 농도(0.5mM 3-HPA 및 0.3mM NAD+)에서 감소된 Km값을 갖는 변이체를 스크리닝하기 위하여, 주형으로 클론 104 및 106을 사용하여 2개의 라이브러리를 제조하고, 각 클론의 세포 용해물에서 높은 활성을 나타내는 두 라이브러리의 클론을 분리하고, 아미노산 서열을 표 7에 나타내었다. 표 7의 (A)는 104 클론을 주형으로 이용한 스크리닝 결과이고, (B)는 106 클론을 주형으로 이용한 스크리닝 결과이다. 주형과 다른 아미노산을 회색으로 나타내었다.
가장 높은 활성을 나타내는 클론 104-M5는 위치 R334 및 A337에서 2개의 변이를 가지고 있으며, 두 잔기는 각각 Q와 R로 변이되었다. 흥미롭게도, 106 클론의 라이브러리로부터 분리된 2개의 클론(클론 106-M4 및 106-M5)은 표적화된 NAD+ 결합 부위에서 동일한 변화(R334Q 및 A337R)를 가졌고, 상기 두 클론과 비슷한 활성을 보이는 다른 클론(106-M8)은 238위치(Q238K)에서 한 개의 추가적인 변이를 가지고 있었다(표 7의 B). 이 결과를 바탕으로, 본 발명에서는 108 변이체에 R334Q 및 A337R 변이를 도입하였다. 세 가지 변이체 효소(104-QR, 106-QR 및 108-QR: 서열은 표 3 참조)를 정제하고, 3-HPA 및 NAD+에 대한 촉매 성질 Kcat및 Km을 분석하였다(표 4). NAD+ 결합 포켓의 두 변이는 NAD+에 대한 Km를 감소시켰고, 예기치 않게 3-HPA의 Km값 또한 감소하였다. 그러나, Kcat값도 감소하여, Kcat/Km는 결과적으로 2~4배 향상되었다. NAD+ 결합 포켓의 변이가 효소의 3-HPA에 대한 결합에 이러한 효과를 나타내는 것은 매우 흥미로운 일이다. 두 변이체는 3-HPA 결합 위치에서 멀리 떨어져 있다. 다른 변이가 없는 변이 R334Q와 A337R의 효과를 조사하기 위하여, 상기 변이체를 야생형 효소에 도입하고, 촉매 성질을 분석하였다(표 4). WT-QR로 명명된 R334Q 및 A337R 변이가 있는 야생형 효소는, 3가지 변이 효소들과 마찬가지로 3-HPA 및 NAD+의 Km 값이 감소되는 것을 보였으며, 이는 두 변이가 NAD+ 결합 포켓뿐만 아니라 3-HPA 결합에도 영향을 주는 것을 의미한다. 그러나 본 발명에서 스크리닝된 변이체는 WT-QR보다 더 높은 활성(Kcat/Km)이 나타나며, 이는 NAD+ 결합 부위의 두 가지 변이 외에도 다른 변이가 촉매 효율을 향상시키는 데에 기여하는 것을 나타낸다.
실시예
3:
KGSADH
효소의 생산
및 기질
특이성의 저해
야생형 KGSADH는 원래의 기질인 알파-케토글루타르산 세미알데히드뿐만 아니라 다양한 알데히드 기질에도 효소 활성을 가진다. KGSADH 변이체의 돌연변이가 기질 특이성에 어떻게 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 여러 알데히드 화합물에 대한 활성을 비교하였다(도 6의 A). 모든 변이체는 3-HPA와 비교한 다른 알데히드에 대한 상대적 활성이 야생형 효소에 비해 낮았으며, 이는 야생형 효소가 조작된 변이 효소보다 알데히드 기질들에 대하여 더 넓은 스펙트럼을 가지는 것을 의미한다. 특히, 3-HPA에 대하여 가장 높은 특이성을 나타낸 108-QR 변이체는 3-HPA에 대한 Km값이 확인한 모든 효소 중 가장 낮았다. 흥미롭게도, NAD+ 결합 부위에서만 변이를 갖는 WT-QR 또한 3-HPA에 대한 특이성이 증가하였다. 즉, WT-QR의 3-HPA에 대한 Km 감소뿐만 아니라, 두 개의 돌연변이인 R334Q 및 A337R가 알데히드 결합 포켓에서 거리가 떨어져 있어도 이의 구조적 변화를 유도하는 것을 보여준다. 야생형KGSADH 효소가 보조 인자에 활성을 나타내기 때문에, KGSADH 변이체의 NADP+에 대한 활성도 분석하여 나타내었다(표 4 참조). 변이체 효소는 야생형 효소보다 NADP+에 대해 몇 배 낮은 Km값을 가지며, 높은 촉매 활성(Kcat/Km)을 나타내었으며, 야생형 효소에 비하여, NAD+에 대한 변이체 효소의 활성은 NADP+에 대한 활성보다 높았다.
KGSADH 변이체를 사용하여 3-HP 생산하기 위하여는 재조합 미생물 내에서 고농도의 3-HP와 NADH를 생성하여야 한다. 따라서 본 실시예에서는 3-HP로부터 3-HPA 형성의 역반응 및 3-HP와 NADH에 의한 생산물 저해에 대해 조사하였다. 목표로 하는 3-HP 생성 비율은 약 100g/L이기 때문에, 3-HP를 대해 시험한 최고 농도는 1M로 하였다. 보고된 NAD+ 및 NADH 의 농도를 고려하여 NADH의 최고농도는 3mM로 선택하였다(Bennett, B. D. et al.,Nat Chem Biol 5: 593, 2009). 340nm에서의 흡광도를 측정하여 확인한 결과, 역반응은 1M 3-HP 및 3mM NADH까지 일어나지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 그러나, 3-HP 및 NADH 모두에서 생성물 억제가 관찰되었다. 3-HP 100mM 농도까지는 억제가 확인되지 않았으나, 1M 3-HP에서는 KGSADH 효소의 활성이 약 40% 감소하였다(도 7). KGSADH 효소 및 변이체들 사이의 3-HP에 의한 저해효과에는 큰 차이가 없었다. 흥미롭게도, 야생형 KGSADH는 변이체보다 훨씬 높은 NADH에 의한 저해를 보였다(도 6의 B). 야생형 효소의 경우 0.5mM NADH에서도 저해가 관찰되었으며, 효소 활성은 NADH 농도 증가에 따라 선형적으로 감소하였다. 대조적으로, 변이체들은 2mM NADH까지 활성의 큰 감소를 나타내지 않았다. 3mM NADH에서의 잔류 활성은 NADH가 없는 경우와 비교하면 약 60% 정도였다. NADH의 농도는 미생물의 세포질에서 2mM를 넘는 경우가 거의 없다. 따라서, 본 발명의 KGSADH 변이체의 경우,재조합 미생물에 의한 3-HP 생산 동안, NADH에 의한 억제는 발생하지 않다는 것을 알 수 있다.
실시예
4:pH
민감도, 3-HPA 불활성화 및
KGSADH
효소의 열 불활성화
본 발명의 라이브러리의 스크리닝은 약간의 산성 조건하에서 수행하였으며, 낮은 pH에서 허용되는 변이체 및/또는 개선된 활성을 나타내는 변이체를 찾고, 조작된 효소의 촉매 성질은 pH 6에서 분석하였다(표 8).
* 3-HPA에 대한 kcat 및 Km는 2 mM NAD+.조건에서 확인하였다.
** NAD+에 대한 kcat and Km 은 3 mM 3-HPA 조건에서 확인하였다.
일반적으로 Kcat값은 낮은 pH에서는 감소하지만, Km값은 많이 변하지 않았다. 흥미롭게도, 변이체 WT-QR 및 106-QR에 대해, 3-HPA의 Km값은 pH 6에서 pH 8보다 낮았다. pH 6 대 pH 8 에서 이들 두 변이체의 Kcat/Km값의 비율은 다른 효소들의 비율보다 높았다(표 8). NAD+ 결합 포켓에서 두 개의 변이인 R334Q 및 A337R은 산성 pH에서 3-HPA의 Km을 낮추는데 중요한 역할을 하였다. 그러나, 104-QR 및 108-QR도 같은 변이를 가지고 있지만, 왜 WT-QR 및 106-QR 만이 pH 6에서 Km이 감소하는지에 대한 이유는 분명하지 않다. 106-QR은 알데히드 결합 부위 근처에 2개의 변이를 가지고 있는 반면, 104-QR과 108-QR은 4개의 변이를 가지고 있다. 따라서, 이 두 효소와 WT-QR의 구조적 차이는 WT-QR과 106-QR 사이의 구조적 차이와 비교하여 더 클 수 있다. 효소의 상대 활성을 pH 4-10 범위에서 확인하였다(도 8). pH 4 및 pH 5는 아세테이트 버퍼를 사용하였고, pH 6-8은 인산 버퍼를 사용하였으며, pH 9 및 pH10은 글리신 버퍼를 사용하였다. 사용된 기질의 농도(3mM 3-HPA 및 2mM NAD+)를 고려할 때, 이러한 상대 활성은 Kcat/Km보다는 Kcat을 반영한다. pH 10을 제외한 시험한 모든 pH 값에서 효소 간에는 큰 차이가 없었다. 모든 변이체의 활성은 pH10 까지도 증가하였고, 야생형 KGSADH는 pH 9에서 가장 높은 활성을 나타냈다. 변이형 효소는 야생형 효소보다 알칼리 조건에 더 내성을 가지고 있는 것으로 나타났다.
3-HPA는 반응성이 매우 높은 화합물이며 Cys, Lys His 및 Arg 등 다양한 아미노산의 사이드체인과 반응하며, 이러한 사이드체인의 화학적 변형은 효소 활성의 손실을 초래할 수 있다. 우리는 KGSADH 변이체의 불활성화 동역학을 분석하였다(도 6의 C). 고농도(20mM)의 3-HPA와 함께 반응시켰였을 때, 변이체 효소는 야생형 KGSADH 보다 3-HPA 불활성화에 대한 저항성이 더 높았다: 적합한 지수함수형 붕괴(fitted expoetntial decay)를 사용하여 계산된 KGSADH 변이체의 반감기(t1/2)는 야생형 효소보다 50% 이상 높았다(표 9).
| KGSADH | WT-QR | 104-QR | 106-QR | 108-QR | |
| t1/2 (min) | 105.34 | 173.72 | 146.54 | 174.60 | 172.42 |
| KGSADH | WT-QR | 104-QR | 106-QR | 108-QR | |
| t1/2 (min) | 14.67 | 12.42 | 10.10 | 8.43 | 10.53 |
알칼리성 조건과 3-HPA 불활성화의 저항성은 효소의 개선된 안정성 때문이다. 따라서, 본원발명은 KGSADH 및 변이체의 열 안정성을 비교하여 도 9 및 표 10에 나타내었다. 각 효소는 65℃에서 일정 기간동안 열처리한 후, 잔여 활성을 측정하였다. 예상과는 달리, 야생형 효소는 열 불활성화에 대해 가장 높은 내성을 보였다. 이는 구조적 안정성과 관련이 있다. 따라서, 조작된 효소의 3-HPA에 의한 불활성화에 대한 내성 및 염기성 pH에 대한 저항력은 열역학적 안정성에 기인하는 것이 아니라, 재설계된 기질 결합 부위, 향상된 활성에 대한 상관관계, 기질 특이성의 변화 및 NADH로 인한 감소된 생산 저해와 관련이 있을 수 있다는 것을 의미한다.
실시예
5: WT-
QR
변이체의
구조적
모델링
실시예 4의 결과로 부터 NAD+ 결합 부위의 변이인 R334Q 및 A337R이 KGSADH의 다양한 촉매 특성(NAD+ 및 3-HPA에 대한 Km, 기질 특이성, NADH에 의한 생성물 저해, pH 민감성 및 3-HPA 불활성화에 대한 저항성) 에 영향을 미친다는 것을 알 수 있다. 상기 두 변이의 효과를 조사하기 위하여, WT-QR의 구조는 NAD+와 복합체를 형성한 KGSADH의 결정구조를 기반으로 하여, 분자 작동 환경(MOE)을 사용하여 모델링하였다(도 10 및 도 11). R334Q 변이 및 A337R 변이는 NAD+와의 새로운 상호 작용을 일으킨다. 야생형 효소에서 R334의 사이드체인의 구아니딘기는 수소 결합을 통해 니코틴아미드기에 가까운 리보스 고리와 상호 작용하지만, A337은 NAD+와 상호 작용하지 않았다(도 10의 B). 그러나, WT-QR 변이체의 Q334 및 R337은 니코틴아미드에 가까운 인산기와 상호 작용하여, 돌연변이가 있는 부위의 구조적 변화(잔기 325-337) 및 NAD+ 결합 포켓의 구조 변화를 가져온다(도 10의 B). 새로운 상호작용은 NAD+에 대한 WT-QR의 Km을 감소시킬 수 있다. 의외로, NAD+ 결합 부위 이외에 WT-QR 알데히드 결합 포켓(잔기 101-109,265-290 및 436-442) 기질 입구(결합) 영역은 WT 구조의 것과 비교하여 골격 구조 변화를 보여준다(도 10의 C 및 도 11).
잔기 441-445의 펩타이드 골격(backbone)은 안쪽으로 이동하고, 따라서 WT 효소에 비해, 알데히드 결합 포켓의 입구 크기가 감소하며, 이는 Km의 감소 및 3-HPA에 대한 특이성 증가를 설명할 수 있다(도 10의 C). 3-HPA 결합 부위를 표적으로 하여 구축된 라이브러리를 스크리닝하여 분리된 3가지 변이(104, 106 및 108)는 잔기 442, 443 또는 444에 변이가 있다(표 3 참조). 촉매 잔기에 가까운 영역에서 펩타이드 골격(backbone) 구조에 큰 차이는 없었지만, 사이드체인의 구조적 차이가 관찰되었으며, 이는 변이체 효소의 Kcat의 감소와 관련될 수 있다(도 10의 D).
실시예
: 6: 플라스크 규모의 재조합
P.
denitrificans
균주에 의한 글리세롤로부터 3-HP의 생산
본 발명에서는 Km 값을 줄임으로써 3-HPA 및 NAD+에 대해 높은 활성을 가지는 KGSADH 변이체를 제작하였으며, 본 실시예에서는 상기 변이체가 도입된 재조합 박테리아 균주를 이용하여 글리세롤로부터 3-HP를 생산하는데 있어서, 변이체 효소가 어떻게 작용하는지를 조사하였다. 108-QR 효소는 변이체 효소들 중 가장 높은 활성을 나타냈다. 따라서, 야생형 KGSADH와 이 변이체를 비교하였다.
슈도모나스 데니트리피칸스(P. denitrificans) D3hpdH D3hibdhIV 균주(KCTC 12572BP, 대한민국 등록특허 제1,555,867호)는 글리세롤 탈수효소(DhaB), 재활성인자(GdrAB) 및 KGSADH를 발현하기 위하여 pUCPK 플라스미드 (입수처 기재) 로 형질전환하였다. DhaB 및 GdrAB에 대한 유전자는 구성적 bla 프로모터 하에 있고, KGSADH에 대해서는 구성적 3hibdhIV 프로모터 하에 있다. 상기 효소는 3-HP 생산의 후기 단계에서 NAD+의 낮은 재생의 문제를 해결하기 위해, NAD+의 Km을 줄이도록 설계하였다.
야생형 KGSADH의 성능과 변이체 108-QR의 성능을 비교하기 위하여, 재조합 Psuedomonas denitrificans를 삼각 플라스크에서 배양하였다. 생성된 3-HP를 분해하지 않는 P. denitrificans D3hpdH D3hibdhIV(KCTC 12572BP)를 숙주로 사용하였다. dhaB-gdrAB 및 kgsadh 유전자는 각각 구성 bla 프로모터(Zhou, S.et al.,Biotechnol Bioeng 110:3177, 2013) 및 3hibdhIV 프로모터(Zhou, S.et al., Biotechnol Biofuels 8: 169, 2015) 하에 클로닝하였다. 배양은 200rpm, 37℃ 조건의 진탕 배양기에서, 250 mL 삼각 플라스크에서 100 mL 부피로 수행하였다. 100 mmol의 인산 칼륨, 0.25g의 MgSO4·7H2O, 1.0g의 NaCl, 1.0g의 NH4Cl, 1g의 효모 추출물, 2.0g의 트립톤, 2.5g의 글루코오스, 2.5g의 L-글루타메이트, 30mg의 카나마이신, 25mg의 염화 코발트 및 글리세롤 100mmol을 함유하는 변형된 M9 배지를 사용하였다. 조세포 추출물에서의 DhaB 및 KGSADH 활성은 이전에 연구된 방법을 사용하여 측정하였다 (Raj, S. M. et al., Process Biochemistry 43:1440, 2008);Sankaranarayanan, M. et al., J Ind Microbiol Biotechnol 44:477,2017).
그 결과, 도 12의 A와 B에 나타난 바와 같이, 배양 초기 기간(3-12시간)동안, 야생형 KGSADH 또는 108-QR을 함유하는 두 개의 재조합 슈도모나스 데니트리피칸스(P.denitrificans) 균주 간에 3-HP 생산 및 세포 성장에는 큰 차이가 없었지만, 배양 후기(15-24 시간)에는 3-HP 생산과 세포 증식의 차이가 나타났다. 108-QR을 함유하는 슈도모나스 데니트리피칸스(P.denitrificans)는 야생형 KGSADH를 함유하는 슈도모나스 데니트리피칸스(P.denitrificans)보다 높은 3-HP 농도(titer)(24시간 기준 53mM : 37mM)와 더 높은 세포 성장 (24시간 기준 OD600=2.1 vs. OD600=1.6)을 보였다(도 12의 A 및 B). 12시간 및 24시간에 2개의 균주간의 3-HPA 농도를 비교한 결과, 도 12의 C에 나타난 바와 같이, 108-QR를 함유하는 슈도모나스 데니트리피칸스(P.denitrificans)는 초기와 후기 모두에서 낮은 3-HPA 축적을 보였다. 3-HPA의 정확한 농도를 측정하기가 어렵기 때문에, HPLC 분석의 피크 영역을 표시하였다. 3-HPA 독성은 DhaB 및 KGSADH와 같은 세포 효소의 불활성화와 관련이 있다. 108-QR 변이체를 함유하는 슈도모나스 데니트리피칸스(P.denitrificans)에서 중간체 축적의 감소는 배양 동안 두 효소의 활성 감소를 줄여준다. 즉, Km의 감소에 의한 높은 효소 활성이 배양 후기에서도 3-HP 생산성 유지를 가능하게 하여, 3-HP 생산을 증가시킨다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Noroo Holdings Co. Ltd.
<120> Varints of alpha-Ketoglutaric Semialdehyde Dehydrogenase and
Method for Preparing 3-Hydroxypropinoic Acid Using Thereof
<130> P17-B171
<160> 70
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 481
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KGSADH
<400> 1
Met Ala Asn Val Thr Tyr Thr Asp Thr Gln Leu Leu Ile Asp Gly Glu
1 5 10 15
Trp Val Asp Ala Ala Ser Gly Lys Thr Ile Asp Val Val Asn Pro Ala
20 25 30
Thr Gly Lys Pro Ile Gly Arg Val Ala His Ala Gly Ile Ala Asp Leu
35 40 45
Asp Arg Ala Leu Ala Ala Ala Gln Ser Gly Phe Glu Ala Trp Arg Lys
50 55 60
Val Pro Ala His Glu Arg Ala Ala Thr Met Arg Lys Ala Ala Ala Leu
65 70 75 80
Val Arg Glu Arg Ala Asp Ala Ile Ala Gln Leu Met Thr Gln Glu Gln
85 90 95
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100 105 110
Ile Ile Glu Trp Phe Ala Asp Glu Gly Arg Arg Val Tyr Gly Arg Ile
115 120 125
Val Pro Pro Arg Asn Leu Gly Ala Gln Gln Thr Val Val Lys Glu Pro
130 135 140
Val Gly Pro Val Ala Ala Phe Thr Pro Trp Asn Phe Pro Val Asn Gln
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165 170 175
Val Lys Ala Pro Glu Glu Thr Pro Ala Ser Pro Ala Ala Leu Leu Arg
180 185 190
Ala Phe Val Asp Ala Gly Val Pro Ala Gly Val Ile Gly Leu Val Tyr
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Ser Leu Ala Gly Leu His Met Lys Arg Ala Thr Met Glu Leu Gly Gly
245 250 255
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260 265 270
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355 360 365
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435 440 445
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450 455 460
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Val
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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35 40 45
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50 55 60
Val Pro Ala His Glu Arg Ala Ala Thr Met Arg Lys Ala Ala Ala Leu
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Val
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180 185 190
Ala Phe Val Asp Ala Gly Val Pro Ala Gly Val Ile Gly Leu Val Tyr
195 200 205
Gly Asp Pro Ala Glu Ile Ser Ser Tyr Leu Ile Pro His Pro Val Ile
210 215 220
Arg Lys Val Thr Phe Thr Gly Ser Thr Pro Val Gly Lys Gln Leu Ala
225 230 235 240
Ser Leu Ala Gly Leu His Met Lys Arg Ala Thr Met Glu Leu Gly Gly
245 250 255
His Ala Pro Val Ile Val Ala Glu Asp Ala Asp Val Ala Leu Ala Val
260 265 270
Lys Ala Ala Gly Gly Ala Lys Phe Arg Asn Ala Gly Gln Val Cys Ile
275 280 285
Ser Pro Thr Arg Phe Leu Val His Asn Ser Ile Arg Asp Glu Phe Thr
290 295 300
Arg Ala Leu Val Lys His Ala Glu Gly Leu Lys Val Gly Asn Gly Leu
305 310 315 320
Glu Glu Gly Thr Thr Leu Gly Ala Leu Ala Asn Pro Arg Gln Leu Thr
325 330 335
Arg Met Ala Ser Val Ile Asp Asn Ala Arg Lys Val Gly Ala Ser Ile
340 345 350
Glu Thr Gly Gly Glu Arg Ile Gly Ser Glu Gly Asn Phe Phe Ala Pro
355 360 365
Thr Val Ile Ala Asn Val Pro Leu Asp Ala Asp Val Phe Asn Asn Glu
370 375 380
Pro Phe Gly Pro Val Ala Ala Ile Arg Gly Phe Asp Lys Leu Glu Glu
385 390 395 400
Ala Ile Ala Glu Ala Asn Arg Leu Pro Phe Gly Leu Ala Gly Tyr Ala
405 410 415
Phe Thr Arg Ser Phe Ala Asn Val His Leu Leu Thr Gln Arg Leu Glu
420 425 430
Val Gly Met Leu Trp Ile Asn Gln Pro Pro Thr Thr Trp Pro Glu Met
435 440 445
Pro Phe Gly Gly Val Lys Asp Ser Gly Tyr Gly Ser Glu Gly Gly Pro
450 455 460
Glu Ala Leu Glu Pro Tyr Leu Val Thr Lys Ser Val Thr Val Met Ala
465 470 475 480
Val
<210> 6
<211> 1446
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KGSADH
<400> 6
atggctaacg tgacttatac ggatacgcaa ctgctgatcg acggcgagtg ggtcgacgcc 60
gcgagcggca agacgatcga cgtcgtgaac ccggcgaccg gcaagccgat cggcagggtg 120
gcccatgcgg gcatcgccga tctcgaccgt gcgctcgccg ccgcgcaaag cggcttcgag 180
gcatggcgca aggtgcccgc gcacgagcgc gcggcgacga tgcgcaaggc ggccgcgctg 240
gtgcgtgaac gcgccgacgc gatcgcgcag ctgatgacgc aggagcaggg caagccgctc 300
accgaagcgc gcgtcgaagt gctgtcggcg gcggacatca tcgaatggtt cgcggacgaa 360
ggccgccgcg tgtacggccg gatcgtgccg ccgcgcaacc tcggcgcaca gcagacggtc 420
gtgaaggagc cggtcggccc ggtcgccgcg ttcacgccgt ggaatttccc ggtcaaccag 480
gtcgtgcgca agctgagcgc cgcgctggca accggctgtt cgttcctcgt gaaagcgccg 540
gaagaaaccc ccgcgtcgcc ggccgcgctg ctgcgcgcct tcgtcgacgc aggcgtgccg 600
gccggcgtga tcggcctcgt gtacggcgat ccggccgaaa tctcgtcgta cctgatcccg 660
cacccggtga tccgcaaggt cacgttcacg ggttcgacgc cggtcggcaa gcagctcgcc 720
tcgctggcgg gcctgcacat gaagcgcgcg acgatggagc tgggcgggca cgcaccggtg 780
atcgtggccg aagacgccga cgttgcgctc gcggtgaaag cggccggcgg cgcgaagttc 840
cgcaacgcgg ggcaggtctg catctcgccg acgcgcttcc tcgtgcacaa cagcatccgc 900
gacgaattca cgcgcgcgct ggtcaagcat gccgaagggc tgaaggtcgg caacggcctc 960
gaggaaggca cgacgctcgg cgcgctcgcg aacccgcgcc ggctgaccgc gatggcgtcg 1020
gtcatcgaca acgcgcgcaa ggtcggtgcg agcatcgaaa ccggcggcga gcggatcggc 1080
tcggaaggca acttcttcgc gccgaccgtg atcgcgaacg tgccgctcga tgcggacgtg 1140
ttcaacaacg agccgttcgg cccggtcgcg gcgattcgcg gtttcgacaa gctcgaagag 1200
gcgatcgcgg aagcgaaccg tttgccgttc ggtcttgccg gctacgcgtt cacgcgttcg 1260
ttcgcgaacg tgcacctgct cacgcagcgc ctcgaagtcg ggatgctgtg gatcaaccag 1320
ccggcgacgc cgtggccgga aatgccgttc ggcggcgtga aggactcggg ctacggttcg 1380
gaaggcggcc cggaagcgct cgagccgtac ctggtcacga agtcggtgac ggtgatggcc 1440
gtctga 1446
<210> 7
<211> 1446
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WT-QR
<400> 7
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gcatggcgca aggtgcccgc gcacgagcgc gcggcgacga tgcgcaaggc ggccgcgctg 240
gtgcgtgaac gcgccgacgc gatcgcgcag ctgatgacgc aggagcaggg caagccgctc 300
accgaagcgc gcgtcgaagt gctgtcggcg gcggacatca tcgaatggtt cgcggacgaa 360
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gtgaaggagc cggtcggccc ggtcgccgcg ttcacgccgt ggaatttccc ggtcaaccag 480
gtcgtgcgca agctgagcgc cgcgctggca accggctgtt cgttcctcgt gaaagcgccg 540
gaagaaaccc ccgcgtcgcc ggccgcgctg ctgcgcgcct tcgtcgacgc aggcgtgccg 600
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gacgaattca cgcgcgcgct ggtcaagcat gccgaagggc tgaaggtcgg caacggcctc 960
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gtctga 1446
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<211> 1446
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 108-QR
<400> 8
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gtctga 1446
<210> 9
<211> 1446
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 104-QR
<400> 9
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gacgaattca cgcgcgcgct ggtcaagcat gccgaagggc tgaaggtcgg caacggcctc 960
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gtctga 1446
<210> 10
<211> 1446
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106-QR
<400> 10
atggctaacg tgacttatac ggatacgcaa ctgctgatcg acggtgagtg ggtcgacgcc 60
gcgagcggca agacgatcga cgtcgtgaac ccggcgaccg gcaagccgat cggcagggtg 120
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ggccgccgcg tgtacggccg gatcgtgccg ccgcgcaacc tcggcgcaca gcagacggtc 420
gtgaaggagc cggtcggccc ggtcgccgcg ttcacgccgt ggaatttccc ggtcaaccag 480
gtcgtgcgca agctgagcgc cgcgctggca accggctgtt cgttcctcgt gaaagcgccg 540
gaagaaaccc ccgcgtcgcc ggccgcgctg ctgcgcgcct tcgtcgacgc aggcgtgccg 600
gccggcgtga tcggcctcgt gtacggcgat ccggccgaaa tctcgtcgta cctgatcccg 660
cacccggtga tccgcaaggt cacgttcacg ggttcgacgc cggtcggcaa gcaacttgcc 720
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gacgaattca cgcgcgcgct ggtcaagcat gccgaagggc tgaaggtcgg caacggcctc 960
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gtcatcgaca acgcgcgcaa ggtcggtgcg agcatcgaaa ccggcggcga gcggatcggc 1080
tcggaaggca acttcttcgc gccgaccgtg atcgcgaacg tgccgctcga tgcggacgtg 1140
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gcgatcgcgg aagcgaaccg tttgccgttc ggtcttgccg gctacgcgtt cacgcgttcg 1260
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gaaggcggcc cggaagcgct cgagccgtac ctcgtcacga agtcggtgac ggtaatggcc 1440
gtctga 1446
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
cttccttagc tcctgaaaat ctcg 24
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
ggcgatccgg ccnnkatctc gtcgtacctg 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
caggtacgac gagatnmmgg ccggatcgcc 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 16
ccgccggccg cmnncaccgc gagcgcaac 29
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 17
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 18
ccgccgacag cacmnngacg cgcgcttcgg 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 19
gtcgaagtgc tgtcgnnkgc ggacatcatc 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 20
gatgatgtcc gcmnncgaca gcacttcgac 30
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 21
gtggaatttc ccggtcnnkc aggtcgtgcg caag 34
<210> 22
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 22
cttgcgcacg acctgmnnga ccgggaaatt ccac 34
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 23
ggcggcgcga agttcnnkaa cgcggggcag g 31
<210> 24
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 24
cctgccccgc gttmnngaac ttcgcgccgc c 31
<210> 25
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 25
gaagttccgc aacnnkgggc aggtctgcat c 31
<210> 26
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 26
gatgcagacc tgcccmnngt tgcggaactt c 31
<210> 27
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 27
gatcaaccag ccgnnkacgc cgtggccgga aatg 34
<210> 28
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 28
catttccggc cacggcgtmn ncggctggtt gatc 34
<210> 29
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 29
gatcaaccag ccggcgnnkc cgtggccgga aatg 34
<210> 30
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 30
catttccggc cacggmnncg ccggctggtt gatc 34
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 31
caaccagccg gcgacgnnkt ggccggaaat gcc 33
<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 32
ggcatttccg gccamnncgt cgccggctgg ttg 33
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 33
cagccggcga cgccgnnkcc ggaaatgccg ttc 33
<210> 34
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 34
gaacggcatt tccggmnncg gcgtcgccgg ctg 33
<210> 35
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 35
gagcagggcn nkccgctcac cgaagcg 27
<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 36
cgcttcggtg agcggmnngc cctgctc 27
<210> 37
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 37
caggagcagg gcaagnnkct caccgaag 28
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 38
cttcggtcag mnncttgccc tgctcctg 28
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 39
caccgaagcg cgcnnkgaag tgctgtc 27
<210> 40
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 40
gacagcactt cmnngcgcgc ttcggtg 27
<210> 41
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 41
gtcgaagtgc tgnnkgcggc ggacatc 27
<210> 42
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 42
gatgtccgcc gcmnncagca cttcgac 27
<210> 43
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 43
cgaagtgctg tcgkccgcgg acatcatcg 29
<210> 44
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 44
cgatgatgtc cgcggmcgac agcacttcg 29
<210> 45
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 45
gtggaatttc ccggtcrhcc aggtcgtgcg caag 34
<210> 46
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 46
cttgcgcacg acctggdyga ccgggaaatt ccac 34
<210> 47
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 47
gttgcgctcg cggtgdmagc ggccggcgg 29
<210> 48
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 48
ccgccggccg ctkhcaccgc gagcgcaac 29
<210> 49
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 49
ggcggcgcga agttccrkaa cgcggggcag g 31
<210> 50
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 50
cctgccccgc gttmyggaac ttcgcgccgc c 31
<210> 51
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 51
gctgtggatc aaccagccgs cgrmwvmatg gccggaaatg ccg 43
<210> 52
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 52
cgaacggcat ttccggccat kbwkycgscg gctggttgat ccacagc 47
<210> 53
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 53
gatcggcctc gtgtacggcg atccggccga aatctcgtcg tacctg 46
<210> 54
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 54
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<210> 55
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<212> DNA
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<220>
<223> primer
<400> 55
gatcggcctc gtgtacggcg atccgccgga aatctcgtcg tacctg 46
<210> 56
<211> 46
<212> DNA
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<220>
<223> primer
<400> 56
caggtacgac gagatttccg gcggatcgcc gtacacgagg ccgatc 46
<210> 57
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 57
gatcggcctc gtgtacggcg atggcgccga aatctcgtcg tacctg 46
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<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> primer
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caggtacgac gagatttcgg cgccatcgcc gtacacgagg ccgatc 46
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<220>
<223> primer
<400> 59
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<210> 60
<211> 46
<212> DNA
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<220>
<223> primer
<400> 60
caggtacgac gagatttccg ggccatcgcc gtacacgagg ccgatc 46
<210> 61
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 61
cacgggttcg acgccgrycg gcaagmwavt tgcctcgctg gcgggcctg 49
<210> 62
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 62
caggcccgcc agcgaggcaa btwkcttgcc grycggcgtc gaacccgtg 49
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<212> DNA
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<220>
<223> primer
<400> 63
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<210> 64
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<220>
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gtcgatgacc gacgccatcg cggtcagsyg gcgcgggttc gcgagc 46
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<212> DNA
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<220>
<223> primer
<400> 65
gctcgcgaac ccgcgccrsc tgaccaaaat ggcgtcggtc atcgac 46
<210> 66
<211> 46
<212> DNA
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<220>
<223> primer
<400> 66
gtcgatgacc gacgccattt tggtcagsyg gcgcgggttc gcgagc 46
<210> 67
<211> 46
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<220>
<223> primer
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gctcgcgaac ccgcgccrsc tgacccgtat ggcgtcggtc atcgac 46
<210> 68
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 68
gtcgatgacc gacgccatac gggtcagsyg gcgcgggttc gcgagc 46
<210> 69
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 69
gctcgcgaac ccgcgccagc tgacccgtat ggcgtcggtc atcgac 46
<210> 70
<211> 46
<212> DNA
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<220>
<223> primer
<400> 70
gtcgatgacc gacgccatac gggtcagctg gcgcgggttc gcgagc 46
Claims (10)
- 서열번호 1의 아미노산 서열에서, A442P 변이를 포함하는 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소(α-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase) 변이체.
- 제1항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서, P444T 변이를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소(α-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase) 변이체.
- 제1항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서, A110S, K273A 및 P444T변이를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소(α-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase) 변이체.
- 제1항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서, K273A, T443E 및 P444A 변이를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소(α-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase) 변이체.
- 제1항의 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소 변이체를 코딩하는 유전자.
- 제5항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
- 제5항의 유전자 또는 제6항의 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
- 제7항에 있어서, 글리세롤 탈수소효소를 추가로 발현하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 다음 단계를 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 제조방법;
(a) 제7항의 재조합 미생물을 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 3-하이드록시프로피온산을 수득하는 단계.
- 제9항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 글리세롤 함유 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190016814A KR101966884B1 (ko) | 2019-02-13 | 2019-02-13 | 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소 변이체 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020190016814A KR101966884B1 (ko) | 2019-02-13 | 2019-02-13 | 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소 변이체 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 제조방법 |
Related Parent Applications (1)
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Family
ID=67624550
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020190016814A KR101966884B1 (ko) | 2019-02-13 | 2019-02-13 | 알파-케토글루타릭 세미알데히드 탈수소효소 변이체 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 제조방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101966884B1 (ko) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090127516A (ko) * | 2008-06-09 | 2009-12-14 | 부산대학교 산학협력단 | 글리세롤디하이드라타제 및 3-하이드록시프로피온알데히드디하이드로게나제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용한3-하이드록시프로피온산의 제조방법 |
| KR20150007393A (ko) * | 2013-07-10 | 2015-01-21 | 삼성종합화학주식회사 | 숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제의 변이형 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 핵산분자, 재조합 벡터, 형질전환체 및 이를 사용한 변이형 폴리펩타이드 또는 3-히드록시프로피온산의 제조방법 |
| CN105567622A (zh) * | 2016-03-02 | 2016-05-11 | 浙江工业大学 | 一种重组大肠杆菌及合成3-羟基丙酸中的应用 |
-
2019
- 2019-02-13 KR KR1020190016814A patent/KR101966884B1/ko active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090127516A (ko) * | 2008-06-09 | 2009-12-14 | 부산대학교 산학협력단 | 글리세롤디하이드라타제 및 3-하이드록시프로피온알데히드디하이드로게나제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용한3-하이드록시프로피온산의 제조방법 |
| KR20150007393A (ko) * | 2013-07-10 | 2015-01-21 | 삼성종합화학주식회사 | 숙신산 세미알데히드 데하이드로게나제의 변이형 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 핵산분자, 재조합 벡터, 형질전환체 및 이를 사용한 변이형 폴리펩타이드 또는 3-히드록시프로피온산의 제조방법 |
| CN105567622A (zh) * | 2016-03-02 | 2016-05-11 | 浙江工业大学 | 一种重组大肠杆菌及合成3-羟基丙酸中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Chu, H. S. 등, Biotechnol. Bioeng., Vol.112, No.2, p.356-364(2015.02.) * |
| Kun Niu 등, 3 Biotech, Vol.7, No.314, p.1-8(2017.09.14.) * |
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