JP3431146B2 - 改変した酵素によるキラル合成 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はキラル合成に関する；より詳しくは本発明は
かかる合成を促進するための酵素の改変に関する。

酵素は生物触媒であり、化学的活性および基質の構造
という両方の点において特異的であり、この特異性のた
め、様々な商業的用途に用いられている。かかる活性の
多くは知られているが、ある特定の酵素の触媒作用に対
して、触媒に適合する基質の範囲を変えることおよび／
または触媒効率を変化させることが希望される場合があ
る。キーとなる要素すなわち基質選択性およびこれに由
来する活性のわかっている既存の酵素を、これらの要素
を目的に応じて変化させる所望の改変を生じせしめ、こ
れによって特定の酵素の工業的利用可能性を高めること
が可能であるかもしれない。

酵素活性は、基本的にはアミノ酸組成、特に酵素の特
定の機能領域におけるアミノ酸組成によりその活性が制
御され、これらのアミノ酸を変えるとその活性が変るこ
とが知られているが、これはアミノ酸の交換は特異的ま
たは非特異的方法により行うことができる。例えば、中
和性アミノ酸を導入すれば荷電の変化した基質への触媒
作用が促進される。これは予測し得る変化といえるが、
しかしながら、全体としての確実性が予測される結果
は、特に酵素の３次構造が完全な情報として必要とされ
る程度まで知られていない場合においては得られていな
い。個々の変化を既知の方法により生じさせることは可
能であるが、これは殆ど無限の仕事となることから、最
初に「マクロな変化」を生ぜしめ、その後に「細かい調
整」を別個に行うことが便利である、もちろん、ある場
合には、マクロな変化が十分な場合があるかもしれない
し、または実際に必要とされるのは細かな調整のみであ
るかもしれない。

酵素構造の変化を記載したが、これはいかなる直接の
影響をアミノ酸組成に及ぼしても得られないが、タンパ
ク質転写の前に酵素をコード化するDNAを既知の方法に
よって処理することによって達成し得る。例えば、乳酸
デヒドロゲナーゼ（天然の基質はピルビン酸である）
を、ピルビン酸のカルボン酸アナログであるオキサロ酢
酸に作用させる場合、活性部位に導入された負電荷によ
って活性が実質的に減少するであろう。この場合、中和
電荷を活性部位の正しい領域へ導入することを含む部位
特異的変異処理によって、基質特異性が変化し、酵素が
マレイン酸デヒドロゲナーゼに期待される活性を有する
ようになることが予測される。かかる特異的な変異処理
はおおざっぱには予測し得ると考えられるが、かかる基
質に対する特異性の増加において最終的な改善をするも
のであるとは言えない。代わりの基質、例えばアルキル
鎖の伸びたもの、フェニル残基またはヘテロ環の付加が
あったもの等に対して、部位特異的変位の予測は頼り得
るものであるとは言えない。かかる「非天然基質」に適
合させるために必要な変化は、酵素の活性部位の隣接部
位もしくは活性部位内に生じせしめることが殆どの場合
に必要であり、多くの酵素はこの活性部位はアミノ酸20
個までで構成されており、これは１次配列中の多くの異
なる部分から構成されていてもよい。個々のアミノ酸の
交換により進めようとする場合、その試験のスケールは
現代の技術をもっても不可能な大きさとなるであろうこ
とは明らかである。

上述の不利益を迂回しつつ所望の目的に達成するため
には、例えば乳酸デヒドロゲナーゼの場合には、活性部
位の一部分を構成する既知のループ領域を利用すること
が可能である。便利な第１段階として、ループ領域の少
なくとも一部を、同一酵素の大きいかまたはより小さい
ループ領域の断片と交換してもよい。これによって基質
特異性および触媒の比効率にいくらかの変化が生じる一
方、典型的な活性は保持される。所望の基質に対して最
も約束されたループ領域を選択すると実際、野生型の出
発ループであってもよく、特定のアミノ酸残基をさらな
る変化の標的としてもよい。最も効果的な選択を確保す
るため、興味のある部位における全ての可能なアミノ酸
の組み合わせを調べることが必要である。これはランダ
ムなヌクレオチドを、標的としたアミノ酸をコードする
コドン領域へ導入することによって達成される。多くの
交換生成物から所望の修飾物を選択するためには続いて
のルーチンのクローニング操作が必要である。このスク
リーニングは通常の方法で行われる。酵素エンジニアリ
ングへのこのアプローチは、コードDNA内に唯一のエン
ドヌクレアーゼ制限部位を、それがすでに存在していな
い場合には、所望の部位に導入することによって促進さ
れる。かかる変化はしばしば塩基を、コードの変性によ
りコード化されるアミノ酸を変えることなく変化させる
こと、またはこの代わりに、コードの導入を、可能な限
り同一アミノ酸を維持するよう行う。これによって特に
操作したい興味のある領域をその他より独立して扱うこ
とが可能である。

上述のことより本発明は好ましい触媒活性を保持しつ
つ酵素の特異性および／または効率を改変する方法に関
し、以下の特徴を有する:3次構造が実質的に公知である
かまたは演繹されている酵素を選択する；少なくとも１
カ所の特異性および／または効率の関係する領域を同定
する；該同定領域に結合した唯一の制限部位を、この領
域をコードするDNA内へ導入または同定する；少なくと
も１のコドンのヌクレオチドがランダマイズされている
以外は該同定領域の少なくとも一部に対応するDNAを合
成する、または該同定領域の少なくとも一部と置換する
ために、それ自身同様にランダマイズされている代わり
となる領域を選択する；合成されたまたは置換されたDN
A配列をオリジナルのかかる領域と交換するのに用い
る；合成されたまたは置換されたDNA配列を発現させ
る；および所望の改変を、それをコードするDNAが単離
し得るように選択する。

以下にさらに詳しく述べるが、本発明の方法はデヒド
ロゲナーゼを例として、特にα−ヒドロキシ酸デヒドロ
ゲナーゼ、例えば乳酸デヒドロゲナーゼ等を例として説
明される。この説明において、最初に特異性および／ま
たは効果が関与している領域として同定されたのは酵素
のループ領域である。一般に、ランダム化させたDNAは
イノシントリホスフェートPCR法またはスパイクドオリ
ゴヌクレオチド法もしくはPCRアッセンブリ法により合
成される。これらのすべては以下により詳しく記載す
る。興味ある領域の少なくとも一部に対して置換を選択
する場合、同じ酵素の関連配列に基づく場合が多い。オ
リジナルのDNA配列を合成されたまたは置換DNAで置き換
えた後、プラスミドまたはファージベクターへ内へクロ
ーン化し、発現のために細菌またはウイルスを形質転換
する。その後、スクリーニングを所望の改変を選択する
ために行ってもよい。Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼを例に
取ると、101及び102位が特にランダマイズに適当である
ことが判明した。

本発明はまた、かかる改変酵素を、特にキラル生成物
の合成に用いることに関する。しばしば、かかる操作に
はコファクター・リサイクリング系を含む。一例とし
て、ループ領域が本発明の方法により改変させられてい
るＬ−乳酸デヒドロゲナーゼの使用を含む、２−オキソ
−４−フェニル−プロパン酸の還元が挙げられ、その他
の例として、本発明の方法により得られたMVS/GGを使用
することに特徴付けられる４−メチル−２−オキソ−３
−ペンテン酸の還元が挙げられる。

本発明のアウトラインを述べたので、以下、さらに詳
細に説明する。

化学合成において酵素を用いることは、理論的には可
能であるとして広く受け入れられているが、その化学工
業への応用は稀である。酵素の触媒としての強力な有用
性、例えば立体特異性および位置特異性を穏やかな条件
下で得ることができること、特定の化学的転移に適合す
る酵素を得るべく多くの試みがなされはじめた。

酵素を選択するにはいくつかのアプローチが可能であ
る。現在用い得る酵素による試験によって驚くべき結果
が、文献より予期し得なかった基質特異性の幅について
得られる。従って市販の酵素が、低い触媒効率しか有さ
ないものであっても、経済性の点から工業的操作の基礎
とすることが可能であるかもしれない。第２のアプロー
チは多数の周囲の微生物から特定の形質転換を示すもの
をスクリーニングすることである。かかる活性を得るた
めには、微生物の細胞全体としてまたはその粗精製物と
してより、酵素は純粋な物質として得られることが要求
される。酵素をかかるスクリーニングより十分な量およ
び工業生産に足るリーズナブルなコストで得るには、し
ばしばクロニングおよび遺伝子の発現を含む大規模な開
発が必要である。適当な酵素触媒を選択するための他の
アプローチは、既存の酵素の構造を、その特定の基質に
対しての触媒活性を改善するべく変えることである。こ
のアプローチは「酵素工学」と呼ばれており、ほんの最
近になってホモキラル分子の合成用触媒として有用なも
のを提供するのに大いなる有用性を示した。薬品および
農業用化学品の合成において、異性体の一方を合成する
ことの重要性はよく認識されていることである。

酵素工学上における明らかな魅力にもかかわらず、酵
素の複雑な構造のため、アミノ酸の変化の結果は、最も
良くても限定された予測しかできない。現在、基質の大
きさが変えられ、天然の基質に対してその他の機能が誘
導されている基質認識および触媒機能の細かい領域にお
ける特定のアミノ酸の変化の影響については予測不可能
である。酵素のメカニズムおよび機能に関する古典的な
研究により一般に知られている触媒活性中心のアミノ酸
のうちの一つを除くことにより活性をなくすことは一般
に容易である。非天然基質に対する活性を増強すること
に関してはまだ開発されていない。

酵素工学上の可能性としては20種類のアミノ酸300残
基からなるタンパク質には、10³⁹⁰個の可能な配列があ
る。これらの配列のほとんど大部分は生物的な機能を示
さない。300アミノ酸残基の典型的な大きさのタンパク
質は、いかなる生物的機能に対してであっても全体的に
最適化することは不可能であり、良くて25〜35のアミノ
酸ドメインの実験的組み合わせしかできないことが示唆
される。従って、酵素工学はいずれの目的とする機能に
対しても、大きな骨格を改良することが可能であるべき
である。

近年、DNAのランダム配列を、ファージM13コートタン
パク質の融合タンパク質として発現させる方法が開発さ
れており、これは適当なアフィニティークロマトグラフ
ィーに類似する展開方法によって所望のタンパク質配列
およびその遺伝子を単離することができることを示唆す
る（カン（Kang）、ピーエヌエーエス（PNAS）、88、19
91、4363）。しかしながら、展開はすべての可能な配列
のサンプルについてできるわけではなく、タンパク質工
学においてもスクリーニングし得るM13ファージの数は
限られている（10¹⁵個のプラーク形成ユニットがM13フ
ァージ含有イー・コリ（E.Coli）細胞の培養物11あたり
より産生される）。10¹⁵の変異体において、DNAの長さ
を最適化した場合、4^N＝10¹⁵であることから、すなわち
Ｎ＝24塩基または８アミノ酸となる。他の発生する問題
は、ファージ発現系は触媒でなく結合を規定し、従って
新たな化学的効果を有する酵素を得るためにデザインさ
れているものではないということである。

既存のタンパク質のランダム変異処理もまた、ラジカ
ル的に変化させられたタンパク質を産生させる能力にお
いて、すべての可能なバリアントをサンプリングすると
いう問題により制限されている。さらに、遺伝子コード
は変化に対する抵抗性が非常に高い。コドンの第３位が
余分であるのみならず、同様の性質を有するアミノ酸残
基が同様の配列によりコードされることから、散在する
変異に対して抵抗性である。例えば；（ｉ）Ｔを第２部
位に有するコドンは常に疎水性側鎖を有するアミノ酸を
コードする；（ii）アスパラギン酸およびグルタミン酸
をコードするコドンはその３位が異なるのみである。従
って、チオエートヌクレオチド類を使用するごとき戦略
（ホルム（Holm）、プロト・エング（Prot Eng）、３、
1990、181）によりランダムに分散した変異（唯一の変
異がいずれかのコドンに同じ可能性で存在する）によっ
ては、親のタンパク質に対して劇的に異なる性質を有す
る新規タンパク質を得ることが難しい。

どのようにデザインされた性質でもタンパク質の枠組
内へ操作することは可能であるはずであるが、よく調べ
られているもののみ再デザインがうまくゆくであろう。

合理的再デザインに必要な基本的情報を得るために、
結晶解析、部位指定変異および瞬間カイネティック手法
（transient kinetic techniques）を組み合わせて原核
および真核生物両方のNAD依存性乳酸デヒドロゲナーゼ
の機能と構造とを相関させた。この知識は触媒経路に必
要であるアミノ酸を明らかにするのみならず、負にチャ
ージした基質の酸が活性部位に入った場合に誘導される
形状の主な再配置部分であり、基質の大きさに感受性が
高く、正確にチャージのバランスが取れている内部空隙
と隔離する原因となっているアミノ酸地図を明らかにす
る。この知識を用いて、チャージした基質に関して特異
的で新規な酵素作用を有する酵素をデザインすることが
可能となり、そしてランダム変異のごとき低い統計的可
能性を避けることができる。もちろん、本発明はこの特
定の例に限定されずより一般的に用いることができる。

図１には乳酸デヒドロゲナーゼの活性部位を示す。本
図においては、基質特異性を規定するいくつかの残基が
「アッパー・ジャウ（upper jaw）」上にある。乳酸デ
ヒドロゲナーゼ触媒の律速段階は本ループが粘性の高い
溶媒中をヘリックスα2Gの上へ接近する速度である。律
速段階は「アッパー・ジャウ」上のアミノ酸配列に大き
く依存し、そして化学的反応が形状の変化より非常に速
いため、乳酸デヒドロゲナーゼ系はループ配列を、化学
反応が律速となる危険性を伴わずに容易に異なる基質特
異性を有するよう変化させることができる。従って、酵
素工学によって特定の基質に対して改良された酵素を得
るためには、いくつかの技術の組み合わせが好適に用い
られる。特定の残基を適応する官能基、例えば異なった
荷電を有するように、天然の基質と異なる荷電を有する
ものに対するために交換してもよいが、酵素の異なる基
質へ対する活性を完全にするためには、無限のランダム
なアミノ酸交換の実行が必要となる。これを酵素の特定
の領域に適応し、スクリーニング操作へ用いるために選
択してもよい。

本発明の目的のひとつは、すでに有用であるが基質が
限定されている酵素であるＳ乳酸デヒドロゲナーゼを改
変して、天然の基質であるピルビン酸より大きな酸のα
ケト基を還元する触媒に対して、改良された効果を有す
る酵素を提供することである。特に興味のある基質は、
大きな芳香族基を含有するものである。

操作のベースとして用いる天然の酵素は好熱性乳酸デ
ヒドロゲナーゼ（LDH）のバチルス・ステアロサーモフ
ィラス（Bacillus stearothermophilus）より単離され
たものであって、エッシェリシア・コリ（Escherichia
coli）内へクローン化し、発現させたものである。

本酵素はタンパク質骨格が最もよく調べられている酵
素のうちのひとつであり（ダン（Dunn,C.R.）ら、フィ
ロス・トランス・アール・ソク・ロンドン（Philos.Tra
ns.R.Soc.London）Ｂ、1991、332、177）、阻害、基質
相互作用および遺伝子操作の研究もまたされている。酵
素の物理的安定性、特に熱による変性に対する安定性
は、一般にαヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼとして適応
可能であるリデザインの性質を示すのに理想的な候補者
となり得る。

野生型酵素の改変にはある種のチャレンジである、と
いうのは、ある程度の文献的知識を有するタンパク質で
ある場合でさえ、その結果は予期せざるものであり、ま
た驚くべきものであるからである。従って、良く研究さ
れている酵素の再デザインでさえ、限定された範囲の予
測しかつかないのである。

酵素のアミノ酸組成の変化およびこれによる、カイネ
ティックと基質特異性への影響は自然に生じるものであ
り、この自然の酵素骨格の変化を強化するため、様々な
方法が開発されている。ダンダム変異処理は遺伝情報
（およびこれがコードするタンパク質）内に、古典的な
変異方法によって誘導される。その後、部位指定変異処
理により、遺伝子内の特定の塩基を変えることが可能と
なり、こうして標的タンパク質の既知の位置にあるアミ
ノ酸を指定して変化させることが可能となる。同様の方
法を用いて、酵素内の機能的に重要な領域の特定のアミ
ノ酸配列を置換することによっても達成することができ
る。

タンパク質の詳しい情報、例えば１次配列およびＸ線
解析より得た３次構造、は分子モデルと共に、保護領域
として知られている箇所の内部の様々なアミノ酸の部位
の特定を可能とする。これは様々な乳酸デヒドロゲナー
ゼ酵素のアミノ酸名と共に示される。従ってタンパク質
構造において、異なった種の間でも保持されている構造
は、保護されているものであり酵素の機能の維持に重要
であると考えられる。この情報により特定の酵素におけ
るいかなる変化も、一般的なすべての基質にわたる他の
すべてのホモロガスな酵素に対して正確に指摘すること
が可能となるが、これが可能でなければ同じ生化学反応
を満たすことができないであろう。特に現在興味のある
酵素はα−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼであり、これ
はNADH/NADPH依存性のα−ケト基の還元、およびカルボ
ン酸のα位または反対にα−ヒドロキシ基をケトンへ酸
化させる逆反応を触媒する。

乳酸デヒドロゲナーゼを改変して天然の基質特異性を
拡大し、様々な官能基を有するより大きな基質によって
も増加した反応速度が得られるようにする試みは、従来
技術からは予期し得ぬ結果をもたらした。基質およびこ
れに対応する目的とするキラル生成物を化学合成により
合成することは可能であるかもしれないが、野生型酵素
による還元の後では、かかるアプローチは魅力的ではな
く、タンパク質骨格の再デザインによりさらに合理的で
経済的なアプローチが可能となり得る。さらに、酵素の
変化は天然の基質に対する活性が劇的に減少し、完全に
異なった基質特異性が生成されることが示された。これ
は、酵素が唯一の基質を還元すればよい場合のバイオト
ランスフォーメーション触媒では要求されないかも知れ
ないが、強力な基質混合物が存在する場合、例えば生物
試料である場合等には選択的な転換または特定の化学種
の決定が必要である。この基質特異性の変化は、基質が
必ず他の存在物により汚染されており、これもまたトラ
ンスフォームされる細胞全体を用いたバイオトランスフ
ォーメーションにおいて特に有用であり得る。

ウイルクス（Wilks）らの仕事（バイオケミストリ
ー、1990、29、8587）において、NAD依存性デヒドロゲ
ナーゼの基質特異性を変化させるのに用いた変異戦略が
記載されている。開示された酵素は、一般式:C_nH_2n+1CO
COOHであって直鎖および分岐鎖状のアルキル残基を有
していてもよいピルビン酸の同族体の還元を触媒する。
本研究の最初の目的は、長いアルキル基、およびヒドロ
キシルおよびケト置換基に加えて芳香族基がα−オキソ
酸の同じ基本骨格に結合している基質に対するデザイン
方法を開発することである。

かかる基質を還元し得る酵素は特に、α−ケト化合物
を立体特異的に対応する２級アルコールへ転換させるこ
とができ、化学合成の分野において有用である。２級ア
ルコールの個々の光学異性体を合成することは薬剤およ
び薬品の中間体の光学異性体を合成する上で非常に効果
的である。いくつかのα−ヒドロキシ酸デヒドロゲナー
ゼに認められる好熱性は、酸素反応を反応が加速される
であろう比較的高温で行わせることが可能であり、また
酵素が本質的に安定であるという利点を有する。これら
の酵素はある種の疾病状況の生物学的試料から得られた
特定の基質のレベルの測定に導入することができる。

NAD依存性デヒドロゲナーゼの分野で番号付が行われ
ており、これはもともとつのざめ（dogfish）筋肉の乳
酸デヒドロゲナーゼのＸ線構造に基づいたものである。
このシステムはアミノ酸に、Ｎ末端から昇順に番号を付
ける。本システムにより保存されている残基同定する
と、例えば30及び33位のグリシン、85位のチロシン、10
9位のアルギニン、163位のセリン及び168位のアスパラ
ギン酸である。

したがって、天然または変異処理によるいずれの既存
のNAD依存デヒドロゲナーゼであっても番号により規定
された同一のアミノ酸配列の領域を有する。本規定にお
いて重要な観点は、NAD依存性デヒドロゲナーゼのいず
れのアミノ酸が交換されているかを正確に記載し得るこ
とである。

以下の表１において、並べたアミノ酸配列は３つのNA
D依存性乳酸デヒドロゲナーゼを示す：ブタのM4アイソ
エンザイム、ヒト精巣のアイソエンザイムおよびバチル
ス・ステアロサーモフィラス（Bacillus Stearothermop
hilus）酵素（「−」は連続的なポリペプチド鎖が分断
されることを意味するのではなく、他の酵素と最大ホモ
ロジーを示す配列を一列に並べるために、番号表示を中
断したことを表示するものである。） ヒト精巣に特異的な乳酸デヒドロゲナーゼのcDNA発現ク
ローニング（ミランら（Millan,J.L.,Driscoll,C.E.and
Goldberg E.） 配列はcDNA−ジーン・バンクの番号Ｊφ2938（1986）か
ら得た。

バチルス・ステアロサーモフィラスから得た好熱性乳酸
デヒドロゲナーゼのDNA配列。

バーストフら（Barstow,D.,Clarke,A.R.Wigley,D.Holbr
ook,J.J.and Atkinson,T）ジーン、46、（1986）、47〜
55。

従来の番号系には、おりたたまれたポリペプチドにお
ける特定の構造要素と相関したり、および基質認識部位
または活性化部位のごとき特定の機能性を有していたり
する短い配列がある。

基質認識部位はポリペプチド鎖の稼働性ループにより
その一部が担われており、通常これは98位から110位で
ある。この配列は伝統的に103位の残基とは隣接してい
るが、これを含まない。

ヒドロキシ官能基への還元をするに際してＳ型異性体
を生成するＬ型α−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼは、
可動性表面ループが存在し基質の結合の後にコンフォメ
ーションを変えることが知られている。このループはア
ミノ酸残基98位〜110位から構成されており、109位にア
ルギニンを含有するが、このアルギニンのアミジン基の
からの正電荷が引き伸ばされた基質カルボニル基を安定
化し、それゆえ水素転移に必要な遷移状態とするのに要
求されるエネルギーを減少させるため、触媒作用には重
要である。

ループ領域はまた、基質選択領域においても含有され
ており、それゆえ本発明の酵素工学研究において重要で
ある。

乳酸デヒドロゲナーゼが異なる基質を区別する機構
は、可動性表面ポリペプチドループがタンパク質表面上
を閉鎖した場合に形成されるプロトン−不透過性の、大
きさの固定された内部空洞内へ基質の適合する能力によ
る。ループによる閉鎖は適当な小さくそして単独の負荷
電基質を適合させることが可能なだけでなく、ループに
よる閉鎖はアルギニン109残基を通じて触媒のトリガー
ともなり得る。この可動性ループの組成および長さの多
様性は目下の目的である。これらの実験の便宜のため、
野生型バチルス・ステアロサーモフィラス乳酸デヒドロ
ゲナーゼのアミノ酸235位と236位のアラニンがグリシン
と交換されているものの遺伝子を選択した。この特定の
アミノ酸置換の効果はウイルクス（Wilks）らによって
限定された範囲の基質に関して報告されており（バイオ
ケミストリー、29、8587）一般に、より大きなアルキル
基を有する基質に対する活性を増強することがわかって
いる。ループ交換の原理を示すために用いたものである
が、本技術はこの特定の酵素に限定されるものではな
く、この変異酵素のみならず他のすべての構造的に関連
のあるα−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼに例えば用い
ることができる。

235位および236位のアラニンをグリシンと交換する変
異は、可動性ポリペプチドループ（残基98〜112）にお
ける他の３つの変異、すなわちグリシン102をメチオニ
ンに、リシン103をバリンにおよびプロリン105をセリン
に交換することと連動している（MVS/GG）。

この新しい酵素の構築の、より長い基質への活性を評
価した、特に不飽和分岐鎖基質である４−メチル−２−
オキソ−３−ペンテン酸であって以下のアルコールへ還
元されるものに対する評価を行った。

定常カイネティック測定によれば、野生型酵素によっ
てはこの化合物の還元がゆっくり進み、ターンオーバー
値が0.03S^-1であったが、一方、変異酵素によれば1.2S
^-1であった。Kmを、5mMのフルクトース1,6−ビスホスフ
ェートの存在下、同じ条件の基質濃度（１〜20mM）下で
測定したところ22mMであった。この測定結果は特異性が
よりフレキシブル性の少ない基質へと変化したものと考
えられ、ループ領域が基質の還元に重要であることを示
すものである。

新しいループの構築に用いた方法は、制限酵素部位を
ループ配列をコードするDNAの両方の末端へ挿入するこ
とである。これらの新規制限部位はこの酵素をコードす
るDNAの中において唯一のものであり、開裂され、その
後新しいループ領域をコードするようにデザインされた
合成DNAと再度ライゲートされる。導入される制限酵素
部位のひとつはアミノ酸配列97位付近のSac IIである。
Sac II制限部位の構築には野生型の97位システインコー
ド領域をスレオニンへ変えることが必要である。Xbal部
位は野生型アミノ酸配列の109位アルギニンに保持され
ているが、108位スレオニンに近接したMlu I部位を生成
する結果となる。新しいMlu I部位が形質転換体におい
ては破壊されることを用いて、野生型の遺伝子と容易に
区別し得るという利点も得られる。

ループのデザインアプローチを酵素工学への利用性を
説明するために、３アミノ酸分短い２ループと４アミノ
酸分長い１の新規ループを導入した。この方法によって
製造された新規酵素を基質試験に供し、ループ交換の効
果を測定した。

新規ループは酵素の性質を、その構築に用いた骨格か
ら変えることが明らかに示された。235位および236位の
アミノ酸におけるアラニン−グリシン交換によっても、
および97位アミノ酸システインをスレオニンと交換した
場合の結果もまた示した。

アラニン−グリシン二重変異によるα−ケトカプロエ
ートとα−ケトイソカプロレートのターンオーバーの増
加はウイルクスら（バイオケミストリー、29、1990、85
87）の結果と矛盾しない。芳香族基質２−オキソ−フェ
ニル−プロパン酸： に対するターンオーバーにおける増加はKmの増加を伴
い、これは自明ではなく、この芳香族基質のキラルなα
−ヒドロキシ基の合成において本発明の変異酵素を使用
する点において、有用な改良であることが示される。

アミノ酸97位のシステインをスレオニンと交換して
も、２−オキソ−４−フェニルブタン酸： に対する有益なKm値が野生型酵素のまま保たれる。

これらの個々の変異の芳香族基質の還元に及ぼす影響
は、モホキラルヒドロキシ酸が生理活性化合物の合成の
ための有用なキラル構築ブロックから合成されるとい
う、明らかに興味あるものである。

新しいループ配列の導入によりさらに酵素の基質特異
性が変わり、野生型酵素の場合より天然基質のターンオ
ーバーを減少させる。３つの新しいループ酵素はほとん
どの野生型の触媒能を２−オキソ−４−フェニルプロパ
ン酸に対してターンオーバーおよびKm値に見られるよう
に、ほぼ保持し、長いループおよび第２の短いループの
場合にはターンオーバーが増加する結果となった。

これらの実施例は酵素の活性が、天然の基質およびこ
れより大きな非天然基質の両方に対してループ内の配列
の交換により劇的に変えることができることを説明す
る。

大きなループにおいては、２−オキソ−フェニルに対
するKcat/Kmがピルビン酸に対してより1700倍も良く、
一方野生型酵素では反対にピルビン酸に対しての方が23
0倍良好であったことは、特異性が391000倍変化したこ
とを示す。

酵素の特異性のピルビン酸から２−オキソ−４−フェ
ニルプロパン酸への交換は新規酵素が医化学領域におい
てはしばしばフェニルピルビン酸と名付けられる２−オ
キソ−４−フェニルプロパン酸の、特に血液および尿の
ごとき生体液内濃度の測定に好適であることを示す。

フェニルピルビン酸レベルは正常では低いが、フェニ
ルアラニン濃度の増加により有意な増加を示し、これは
遺伝子病であるフェニルケトン尿症に関与する（ランゲ
ンベック（Langenbeck）ら、ジェイ・インハー・メタブ
・ディス（J.Inher.Metab.Dis.）、４、1981、69）。フ
ェニルピルビン酸還元酵素またはフェニル乳酸デヒドロ
ゲナーゼ酵素はフェニルアラニンデヒドロゲナーゼと共
に使用する事も可能であり、フェニルケトン尿レベルを
測定する際に使用すれば、フェニルピルビン酸からの干
渉を打ち消すことが可能であり、これによってフェニル
アラニンをベースとする方法の感度が上昇する。

ループ領域の両端に制限部位を有する構築物は、様々
な長さおよび様々な配列のループを有するデヒドロゲナ
ーゼの調製に用い得る。従って、ランダム変異処理を乳
酸デヒドロゲナーゼの基質認識に重要であると同定され
ている領域に制限することによって、所望のキラル還元
を行わせる酵素を単離することが可能である。ランダム
変異処理はスパイク・オリグヌクレオチドを特定の位置
または異なった長さのループへ導入する、あるいはこれ
に代えてイノシントリホスフェートをポリメラーゼ連鎖
反応（PCR）へ導入して、ループ領域全体または特定の
残基のいずれかを変異させてもよい。これらの操作の両
方は、変異ライブラリーを、LDHのループ領域をコード
するDNA内へ導入された制限部位を用いて調製する場合
に用いられる。さらなるPCR法を、ループ領域の特定の
位置のランダムに組み合わせたDNAのライブラリーを作
成するのに用いた。この方法では、酵素の基質特異性を
規定する領域に含有される101位及び102位を標的として
行った。

PCRは最初に、相補的な重複する末端を有する300およ
び800塩基対フラグメントを生成させるのに用いた。こ
れらの重複部位にランダムな配列が導入されているプラ
イマリー生成物を、その後お互いにプライムさせ、延長
させLDHハイブリッド遺伝子を得た。非重複末端にアニ
ーリングする２つの外部プライマーと共に行う第２のPC
Rを、最終的にLDH生成物を増幅させるのに用いた。

バチルス・ステアロサーモフィラスのLDH遺伝子の前
処理にはEcoR I/Pst Iで消化させた遺伝子をPKK233−２
またはM13プラスミドベクター内へクローニングするこ
とを含む。現在ではPCR生成物を数多くのベクターのい
ずれへもクローニングすることができるがこれは、コー
ド領域以外にアニーリングする外部プライマー（２）の
うちのひとつへさらにEcoR I部位を導入しているからで
ある。例えば、所望の部位にランダム配列を有する代表
的なライブラリーがあることを確認するために、唯一の
EcoR I部位を有する遺伝子をPUC18内へクローン化し、
これによって高い収率でDNAが小さな断片より得られ、
その後PCR生成物をPKK233−２のごときプラスニドまた
はファージ発現ベクター内へクローン化してもよい（図
２参照）。

PCR法により以下の利点が得られる： 1. 高い収率でPCR生成物が得られる。

2. 生成物を変異DNAとして識別し、これを野生型配列
からMlu I消化により選択し得る。

3. 1kbの生成物を取り扱い、モニターするのが、40塩
基対の野生型配列が変異配列と交換されるよう両端に制
限部位をデザインすることを含む従来の試みより容易で
ある。

4. 処理スピード。

5. EcoR I部位を有するプライマー２のデザインによ
り、多くのベクター内へ遺伝子生成物のクローニングが
可能になった。

6. 二本鎖鋳型を変異処理に使用する。

7. LDH遺伝子の他の領域へ処理する方法を適応し、こ
の重複伸展法を用いて一つの分子内の異なった領域の変
異が容易になる。

8. 3'末端において鋳型と相補性の高い領域を有する変
異オリゴヌクレオチドにより、このオリゴヌクレオチド
ベクターへのアニーリング効率が高い。

酵素のループ領域または実際のいずれかの標的酵素の
いずれかの標的領域をカバーする変異体のライブラリー
を作成する指定ランダム変異処理法をうまく利用するた
めには、所望の性質を有する変異体の遺伝子を発現する
クローン選択のための適当なスクリーニングが必要であ
る。デヒドロゲナーゼは、NADH生成物とフェナジンメタ
スルフェートとのカップリングによるブルー・フォルメ
ザン（blue formazan）染料の形成により検出される。

スクリーニングはカッツェン（Katzen）とシムケ（Sc
himke）（PNAS、54、1218）の研究に基づき、所望の基
質に対する特異性およびNAD⁺をNADHへ還元させる酵素を
発現する能力により行う。還元された補酵素はその後フ
ェナジンメタスルフェートを還元し、これが次にニトロ
ブルー・テトラゾリウムを不溶性のブルー染料に還元す
る。

コンピテントなイー・コリ細胞内へ変異DNAを形質転
換させ、これを15％グリセロールとアンピシリンを含有
する寒天培地上に−80℃で保存した。高い形質転換効率
を有するエレクトロ−コンピテント細胞を得、これはDN
A1μｌあたり10⁶の生成効率を示し、この効率はスクリ
ーニングに供する代表的な変異コロニーを産生させるの
に十分である。本プレートのコピーをベルベット複製材
を用いて作成し、該コピーを一晩培養した。（イー・コ
リLDH活性はフィルターペーパーを67℃で30分間培養す
ると消失するが、野生型酵素の活性はこの温度において
45分間まで失われなかった。）これらのコピーをその後
ある範囲の基質に対してスクリーニングし個々のコロニ
ーを比較した。各マスタープレートを少なくとも３回各
場合の条件を同一としてスクリーニングに供し、確認し
た。

この方法を用いると異なった比率の染色部が乳酸およ
びマレイン酸をそれぞれ基質として野生型コロニーのフ
ィルターコピーと、マレイン酸デヒドロゲナーゼ活性の
変異酵素（Q102R）の該コピーとの間に染色度の違いが
認められ、各コロニーの識別のためのスクリーニングの
正当性を確認した。

以下により本発明をさらに詳細に説明する： 乳酸デヒドロゲナーゼの変異処理 バチルス・ステアロサーモフィラスの乳酸デヒドロゲ
ナーゼ変異体をウインター（Winter）らのオリゴヌクレ
オチド・ミスマッチ法（ネイチャー、1982、299、756）
によりM13内に、変異オリゴクヌクレオチドをイン・ビ
トロの鎖延長のためのプライマーとして用いて作成し
た。235位及び236位におけるアラニンからグリシンへの
二重置換はオリゴヌクレオチド配列 を用いて行った。野生型および変異型酵素はイ・ーコリ
内のPKK223−３プラスミド（バーストフ（Barstow）
ら、ジーン、1986、46、47）内へ発現させた。

Sac IIおよびXbal部位を野生型活性部位ループをコード
する遺伝子の両末端へ構築するための変異処理 54−マー（54−mer）のオリゴヌクレオチドを、それ
ぞれ唯一の制限部位（Sac IIおよびXbal）を活性部位ル
ープ（アミノ酸98〜110）の両端へ導入するための、野
生型鋳型（バーストフ、ロック・シット（loc.cit））
を用いた変異処理を制御するのに用いた。変異を起こさ
せるオリゴヌクレオチドは以下のものである： アニーリング、鎖延長およびクローニングはクラルケ
（Clarke）らの方法（ネイチャー、1986、324、699）に
て行った。

変異体はミニ−プレップ（mini−preps）を作成し、
これをSac IIおよびXba Iにて制限して識別した。変異
体ミニ−プレップをEcoR IおよびXho Iで制限処理を
し、小さなフラグメントをAla235GlyおよびAla236Gly変
異LDHを含有するPKK223−３内へサブクローン化させ、
これより小さなEcoR I/Xho Iフラグメントをはずした
（ウイルクスら、バイオケミストリー、1990、29、858
7）。得られたプラスミド（pLDHrs）をコンピテントな
イー・コリTG2細胞内へ形質転換した。全体の配列は自
動配列決定装置「デュポン・ジェネシス2000」を用いて
再度決定し、正確なループ配列が導入されていることが
示された。野生型遺伝子および変異体の挿入された制限
部位を有する部分的なDNA配列を表２に示した。

表２ 野生型およびループ領域の両端にSac IIおよびXb
a I制限部位を有する変異体のB.ステアロサーモフィラ
スのループ（93−111）領域におけるDNAとタンパク質配
列との比較、およびこれより誘導される様々なループ配
列。

野生型DNAのループ領域における配列（Thrと交換される
Cysを太字で示した）： 変異型DNA（pLDHrs）のループ領域における配列： PCRにより大きなループを合成するのに用いる二つのオ
リグヌクレオチド（LLA、LLB）： 97〜110位の領域における大きなループ配列（注:Mlu I
部位が破壊されている）： PCRによりLeuLysGlyおよびSerLysGly短ループをPCR合成
するためのオリグヌクレオチド： オリジナルの97〜111位の領域における短ループ配列（M
lu I部位は再び破壊されている）： B.ステアロサーモフィラスLDH遺伝子のループ領域のラ
ンダムに組み合わせたライブラリーを構築するためのPC
R組み立て法： 1. アミノ酸101及び102位をコード化する位置において
のみ野生型配列と異なり、かかる部位においては各塩基
Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇのそれぞれが等しい確率で挿入されるよ
う一本鎖オリグヌクレオチドを製造した（オリゴミック
ス101、102フォワード）。

2. 野生型鋳型に存在するMlu I制限部位を108位アミノ
酸第３コドン位を、スレオニンをコードするコドンであ
ることはそのままACGからACTへと変えて破壊した。Mlu
I部位がないことによって、変異体が生成されているこ
とが確認でき、野生型より変異体を選択し得る。

3. オリゴミックス101、102フォワードに対して14塩基
のホモロジーを有するDNAプライマーをクレノウ反応を
用いて相補鎖を作成する（オリゴミックス101、102リバ
ース）のに用いた。

4. 一本鎖ライブラリーオリゴをプライマー１および5n
gの野生型鋳型と共に、300塩基対の生成物を25サイクル
のPCR（94℃で１分間、55℃で１分間、72℃で２分間）
にて作成するために用いた。

5. 二本鎖クレノウオリゴをプライマー２および5ngの
野生型鋳型と共に、800塩基対の生成物であって300塩基
対の生成物と重複するものを作成するために用いた（PC
R条件は４と同じである）。

５において二本鎖オリゴをプライマーとして用いるこ
とは、300および800塩基対の生成物の両方が変異オリゴ
を用いて作成され、プライムされており、101及び102位
における野生型配列がコピーされていないようにするた
めに非常に重要である。

6. ゲルで精製した後、20ngの300塩基対生成物および6
0ngの800塩基対生成物をプライマーなしで混合し、フラ
グメントを結合させるために７回熱サイクル（94℃で２
分、55℃で１分、72℃で４分）を回した。

7. ７回のサイクルの後、プライマー１および２を添加
し、生成物を20サイクル分増幅させた（94℃で1.5分、5
5℃で１分、72℃で2.5分）。

8. 1kbのPCR生成物をその後ゲルにて精製し、EcoR Iで
消化して再びゲル精製を行い、その後EcoR Iで開裂させ
たPUC18プラスミドベクター内にライゲーションさせ、
これをイーコリ内部へ形質転換した。

9. 組換コロニーをIPTGおよびＸ−Gal挿入による不活
性化により選択した。

10. ９個の白色コロニーを選択し、そのうちの７個はL
DH遺伝子の存在およびMlu I消化に対する抵抗性を示す
ことが、ゲルおよび制限酵素分析により示された。他の
２つは挿入部位を有していなかった。

11. かかる変異体の６つの配列をデュポン2000配列決
定機で決定し、ランダム変異処理が成功したことを確認
した。

表３参照のこと： オリゴヌクレオチド重複による二本鎖DNAループフラグ
メントの製造 重複しているオリゴヌクレオチドの各対を30サイクル
のアニーリングおよび延長（94℃で１分、45℃へ２分で
冷却、45℃で１分、72℃へ１分で加熱、72℃で１分のサ
イクルを、0.05MのKCl、10mMのトリス（pH8.3）、1.5mM
のMgCl₂、0.01％のゼラチン、200μＭの各dNTPおよび2.
5ユニットのTAQ DNAポリメラーゼを含有する50μｌの液
内で行う）に供した。二本鎖DNA生成物を精製し、その
後Sac IIおよびXba Iで切断し、同じ酵素にて切断した
プラスミドpLDHrs内へライゲートした。ライゲートされ
た生成物をMlu Iにて制限処理して野生型プラスミドpLD
Hrsを除去した。

DNAは精製し、ミクロ透析し、イー・コリTG2細胞を電
気穿孔法にて形質転換するのに用いた。形質転換した細
胞をアンピシリン耐性により選択した。10個のアンピシ
リン耐性コロニーを選択し、プラスミドDNAを一晩培養
物から精製した。変異ループの存在をMlu I消化に対す
る耐性により確認した。

酵素の発現は上述の方法により行った。

乳酸デヒドロゲナーゼおよび変異体の精製 一晩培養物（11）を遠心分離し、集められた細胞を50
mMのトリエタノールアミン（pH6.0）溶液中へ最懸濁さ
せた。細胞に超音波をかけ、残渣を遠心分離により除い
た。上清中のタンパク質を65％アンモニウムスルフェー
トを用いて沈殿させた。沈殿物を回収し、50mMのトリエ
タノールアミン（pH6.0）に最懸濁し、同じバッファー
にて透析した。透析後、NADHおよびFBPを最終濃度がそ
れぞれ5mMおよび10mMとなるようタンパク質へ添加し、
先に50mMトリエタノールアミン（pH6.0）、3mMのNADHお
よび5mMのFBPで平衡としておいたオキサメートセファロ
ースカラムへロードした。非結合タンパク質をカラムバ
ッファーで洗浄した後、変異LDHを50mMトリエタノール
アミン、pH9.0、0.3MNaCl溶液にて溶出させた。溶出物
を65％のアンモニウムスルフェートで沈殿させ、その後
50mMのトリエタノールアミン溶液（pH7.5）にて最懸
濁、および透析を行った。タンパク質をその後Ｑ−セフ
ァロース・ファースト・フロウ・カラムへロードし、塩
グラジエントにより溶出させた。LDHは0.25MのNaCl濃度
により溶出された。二重グリシン変異体酵素に対してブ
ルー・セファロース−F3GAに交換する以外は、オキサメ
ート・セファロースカラムによる最初のクロマトグラフ
ィー操作と本質的に同じとして行った。すべてのタンパ
ク質は純度98％以上であることをSDSファスト（Phast）
ゲル（ファルマシア）上のクーマッシー・ブルー染色強
度を調べて確認した。タンパク質収量は通常原培養液の
0.2g/lである。

定常カイネティクス 定常測定を以下のごとく、340nmの吸光度の減少によ
りNADH/NAD⁺転換を測定して行った。すべてのアッセイ
は25℃にてKCl（50mM）を含有するビス−トリスバッフ
ァーpH6（20mM）、およびフルクトース−1,6−ビスホス
フェートを用いる場合には5mMにて行った。タンパク質
濃度を280nmの吸光度より、0.91が経路1cmおよびMrが33
000の場合に1mg/mlのタンパク質に対応するという関係
を用いて行った。

これらの測定の結果を表４に示す。

MVS/GG（６ユニット（μモル／分/30℃）およびイー
ストギ酸デヒドロゲナーゼ（５ユニット）を、NADH（0.
02mM）、ギ酸ナトリウム（3.1mM）、フルクトース−1.6
−ビスホスフェート（0.4mM）およびジチオセレイトー
ル（0.08mM）を含有する４−メチル−２−オキソ−３−
ペンテン酸（1.0mM）の脱酸素トリスバッファー（5mM;p
H6;80ml）溶液へ添加した。溶液を室温（〜20℃）にて
窒素雰囲気下で５日間撹拌し、0.2mMのHClをpHを6.0か
ら6.2の範囲に維持するために定期的に添加した。pH2.0
へと酸性化し、酢酸エチルにて抽出したところ、（Ｓ）
−２−ヒドロキシ−４−メチル−３−ペンテン酸が91％
の収率で単離できた。本（Ｒ）−MTPA誘導体を分析し、
ラセミ標準物質と比較すると少なくとも99％エナンチオ
マー過剰であることが認められた。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ハート、キース・ウイリアム イギリス、ビーエス７・０ビーエス、ブ リストル、オーフィールド、ダーンレ ー・アベニュー36番 (72)発明者 エルハウラニ、アイマン イギリス、ビーエス８・１ティーディ ー、ブリストル、ユニバーシティー・オ ブ・ブリストル、デパートメント・オ ブ・バイオケミストリー（番地の表示な し) (56)参考文献 特開 平１−20089（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開247647（ＥＰ，Ａ １) Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏ ｌ．111，Ｎｏ．17（1989）ｐ．6800− 6804 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ. 29，Ｎｏ．37（1990）ｐ．8587−8591 Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ. Ｌｏｎｄ．Ｂ，Ｖｏｌ．332，Ｎｏ. 1263（1991）ｐ．177−184 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，Ｖｏｌ. ３，Ｎｏ．３（1990）ｐ．181−191 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．86，Ｎｏ．23 （1989）ｐ．9094−9098 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ｉ） 三次構造が既知である、あるいは
   演繹されている酵素を選択する； （ii） 少なくとも１の基質特異性および／または酵素
   の効率に関与する領域を同定する； （iii） 選択された酵素の、同定された領域をコード
   する第1DNA配列を酵素の遺伝子配列内に同定する； （iv） 第1DNA配列を単離する； （ｖ） PCR組み立て法を用いて該同定された領域にお
   いて可能な全ての残基によりランダマイズされた１本鎖
   オリグヌクレオチドを合成し、これによって同定された
   DNA配列の全ての可能な変異を含むDNA配列セットであっ
   て、該セットを構成する個々のDNA配列が、第1DNA配列
   と比してランダム化されているものを作成し、そして相
   補鎖をクレノウ反応によって作成する； （vi） 該酵素をコードする遺伝子配列内の第1DNA配列
   を、該DNA配列セットの個々のDNA配列で置き換えて、改
   変遺伝子配列を作成する； （vii） 改変遺伝子配列を発現させる； （viii） 改変遺伝子配列によりコードされる酵素をそ
   の活性によりスクリーニングする；そして （ix） 所望の酵素活性を産生する細胞もしくはウイル
   スを選択して、改変された遺伝子配列を有するDNAを単
   離できるようにする、 工程を含む、酵素の触媒活性を保持しつつその酵素の特
   異性および／または効率を改変する方法。
2. 【請求項２】選択された酵素がデヒドロゲナーゼである
   第１項記載の方法。
3. 【請求項３】デヒドロゲナーゼがα−ヒドロキシ酸デヒ
   ドロゲナーゼである、第２項記載の方法。
4. 【請求項４】酵素の同定された領域が、酵素のループ領
   域である第１項から３項いずれかに記載の方法。
5. 【請求項５】作成したDNA配列のセットをプラスミドま
   たはファージベクター内へクローン化し、これによって
   細菌またはウイルス内へ発現のために形質転換する第１
   項から４項いずれかに記載の方法。
6. 【請求項６】酵素がＬ−乳酸デヒドロゲナーゼであり、
   その101位および102位がランダム化される、請求項１〜
   ５いずれかに記載の方法。