KR20220119862A - 단량체 이소시트레이트 디하이드로게나아제에 기반한 nadph 재생 시스템 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단량체 이소시트레이트 디하이드로게나아제(isocitrate dehydrogenase; IDH)에 기반한 NADPH 재생 시스템 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 NADPH 의존적 효소의 효소 반응에 사용되는 조효소인 NADPH의 재생을 위해, 단량체 형태의 이소시트레이트 디하이드로게나아제에 기반한 NADPH 재생 시스템 및 이의 응용 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제 재조합 단백질(CgIDH) 및 아조토박터 비네란디 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제 재조합 단백질(AvIDH)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 단백질의 제조방법, 이를 통해 제조된 재조합 단백질을 이용한 NADPH 재생 시스템에 관한 것으로, 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환체에서 NADPH 재생 시스템에서 효율적으로 사용될 수 있는 단량체 형태의 효소를 발굴하였고, 이를 이용한 NADPH 재생 시스템은 NADPH 의존적 효소에 NADPH를 제공하는 생물학적 부품과 생촉매 소재로서 활용가치가 매우 높다.

Description

단량체 이소시트레이트 디하이드로게나아제에 기반한 NADPH 재생 시스템 및 이의 용도{NADPH-regeneration system based on monomeric isocitrate dehydrogenase and use thereof}
본 발명은 단량체 이소시트레이트 디하이드로게나아제(isocitrate dehydrogenase; IDH)에 기반한 NADPH 재생 시스템 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 NADPH 의존적 효소의 효소 반응에 사용되는 조효소인 NADPH의 재생을 위해, 단량체 형태의 이소시트레이트 디하이드로게나아제에 기반한 NADPH 재생 시스템 및 이의 응용 방법에 관한 것이다.
NADPH 의존적 효소, 예를 들어 시토크롬 P450(cytochrome P450)은 대부분의 생물 종에서 발견되는 모노옥시게나아제(monooxygenase)로서 기능을 갖는 효소 그룹이다.
시토크롬 P450은 광범위한 기질의 산화 반응을 매개할 수 있기 때문에 다양한 생합성 경로에 적용이 가능하고, 고부가가치의 생물학적 화합물을 생성하기 때문에, 약물 대사 분야에 있어 큰 잠재력을 가질 뿐만 아니라, 산업 공정 상의 효소로의 활용 가치가 매우 높다.
또한 시토크롬 P450은 생체 내에서 약물 또는 호르몬 등의 대사 과정에서 중요한 산화 반응을 수행하는 효소이며, 인간에게 투여되는 약물의 75% 이상에 대한 대사를 담당하고 있어, 신약 개발 과정에서 약물의 대사, 및 독성 평가 과정의 핵심 요소로 알려져 있다. 그 뿐만 아니라, 다양한 기질의 하이드록실화 반응에 관여하여 기능성을 조절하는 것이 가능하기 때문에 최적의 대사산물 발굴 또는 고부가가치화(high value added) 과정에도 폭넓게 활용 가능하다.
대부분의 시토크롬 P450은 막 단백질로 존재하기 때문에, 외래 숙주에서의 발현 및 정제가 어렵고, 환원 효소로부터 전자를 제공받아야 하기 때문에 전자 전달 물질로서 NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced form)를 필요로 한다. 그러나, 효소 반응에 사용되는 조효소(cofactor)인 NADPH는 매우 불안정하고, 매우 고가이기 때문에, 시토크롬 P450을 산업적으로 활용하는데 많은 제약이 따르는 실정이다.
한편, 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 유래 시토크롬 P450인 시토크롬 P450 BM3는 다른 시토크롬 P450과 달리, 효소 활성에 관여하는 옥시게나아제 도메인 및 조효소의 산화를 통해 효소 활성에 필요한 환원력을 제공하는 리덕타아제 도메인이 모노시스트론성 단백질의 형태로 발현될 뿐만 아니라 세포질에서 발현되어, 발현 및 정제가 용이한 장점이 있다. 또한, 크기가 약 119 kDa의 멀티도메인 단백질임에도, 대장균(Escherichia coli)에서 가용성으로 과발현이 가능한 특징이 있다. 이로 인해, 시토크롬 P450 BM3를 산업 공정용 효소로 활용하기 위해, 기질 특이성 및 효소 활성 등을 개량하는 연구가 활발히 진행되고 있다.
그러나, 시토크롬 P450의 조효소인 NADPH는 전술한 바와 같이, 불안정하고 매우 고가이기 때문에, 여전히 산업적 활용에 제약이 있다. 이에 대한 해결을 위해, 다양한 NADPH 재생 시스템(NADPH-regeneration system)의 개발이 이루어져 왔다. 구체적으로, NADPH 재생 시스템은 전기화학적, 광학적 및 효소를 이용한 방법이 있으며, 이 중 주로 효소를 이용한 방법이 사용된다.
효소를 매개로 하는 NADPH 재생 시스템에 사용되는 효소의 예로는 알코올 디하이드로게나아제(alcohol dehydrogenase, ADH), 포메이트 디하이드로게나아제(formate dehydrogenase, FDH), 글루코스 디하이드로게나아제(glucose dehydrogenase, GDH), 및 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나아제(glucose 6-phosphate dehydrogenase, G6PDH) 등의 생체 내 대사 경로에서 NADPH를 생산하는 효소를 들 수 있다.
그러나, 현재 NADPH 재생 시스템에 사용되는 효소는 모두 다량체(multimeric form)이며, 대장균에서 가용성 발현이 어려운 문제가 있다. 특히, 다량체의 구조적 특징으로 인해 시토크롬 P450 등의 NADPH 의존적 효소와 NADPH 재생 시스템에서 사용되는 효소의 융합(fusion protein) 발현 시, 효소 반응 및 가용성 발현에 부정적 영향이 있어, 효소 공정 또는 전세포 공정(whole-cell reaction)으로 고부가가치 물질을 생산하는 경우, 심각한 제한 요인으로 작용한다.
따라서, NADPH 의존적 효소가 촉매로 작용하는 효소 반응에 NADPH를 안정적으로 공급할 수 있는 NADPH 재생 시스템에 대한 요구가 당해 기술 분야에 존재하며, 종래 기술의 NADPH 재생 시스템에서 사용되는 효소의 문제점 해결을 위해, 단량체 형태(monomeric form)이며, 대장균에서 가용성 과발현이 가능하고, NADPH 의존적 효소와의 융합 발현도 구현할 수 있는, NADPH 재생 시스템에 사용 가능한 효소의 발굴이 절실한 상황이다.
대한민국 등록특허공보 제2022137호. 대한민국 등록특허공보 제1152878호.
Xiaodong Wang et al., Chem., 2(5) pp.621-654 (2017).
효소 또는 전세포를 이용하여, 조효소에 의존적인 유용한 활성에 의한 생촉매 공정의 개발 과정에서, 생산성 또는 산물의 가격을 결정하는 고가의 조효소 재생 문제의 해결을 위해, 본 발명에서는 단량체 형태로 대장균에서 가용성 발현되며, NADPH 재생 시스템에 사용할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제재조합 단백질 및 아조토박터 비네란디(Azotobacter vinelandii) 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제 재조합 단백질과 이를 이용한 신규한 NADPH 재생 시스템을 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 NADPH 재생용 재조합 발현 벡터는 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 아조토박터 비네란디 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 일 예에 따른 NADPH 재생용 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 NADPH 의존적 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 NADPH 재생용 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 아조토박터 비네란디 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 NADPH 재생용 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 NADPH의존적 효소는 디하이드로게나아제(dehydrogenase), 리덕타아제(reductase), 옥시도리덕타아제(oxidoreductase), 트랜스하이드로게나아제(transhydrogenase), 퍼옥시다아제(peroxidase), 옥시게나아제(oxygenase), 모노옥시게나아제(monooxygenase), 플라보독신(flavodoxin) 및 디할로게나아제(dehalogenase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 NADPH 재생용 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 NADPH의존적 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에 재조합되어 융합되거나, 화학적 링커의 첨가에 의해 연결되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 NADPH 재생용 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 화학적 링커는 BS(PEG)5(PEGylated bis(sulfosuccinimidyl) suberate), BS(PEG)9(PEGylated bis(sulfosuccinimidyl) suberate), BS2G-d0 (bis(sulfosuccinimidyl) glutarate-d0), BS2G-d4(bis(sulfosuccinimidyl) 2,2,4,4-glutarate-d4), DSBU(disuccinimidyl dibutyric urea), DFDNB(1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene), DMP(dimethyl pimelimidate), DMS(dimethyl suberimidate), DSG(disuccinimidyl glutarate), DSP(dithiobis(succinimidyl) propionate), DSS(disuccinimidyl suberate), DSSO(disuccinimidyl sulfoxide), DST(disuccinimidyl tartarate), DTBP(dimethyl-3,3-dithiobis propionimidate), EGS(ethylene glycol bis(succinimidyl) succinate), TSAT(tris-(succinimidyl) aminotriacetate) 및 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 NADPH 재생용 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 일 예에 따른 형질전환체에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli)일수 있다.
본 발명에 따른 재조합 단백질의 제조방법은 상기 NADPH 재생용 재조합 발현 벡터를 제작하는 단계; 상기 재조합 발현 벡터를 형질전환하여 형질전환체를 제작하는 단계; 상기 형질전환체를 배양하여 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제 또는 아조토박터 비네란디 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제를 과발현하는 단계; 및 과발현된 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 예에 따른 재조합 단백질의 제조방법에 있어서, 상기 배양은 28 내지 32℃에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 재조합 단백질의 제조방법을 통해 제조된, 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명의 일 예에 따른 재조합 단백질에 있어서, 상기 재조합 단백질은 단량체 형태로 가용성 발현되며, NADPH 의존적 효소와 함께 사용 가능한 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 재조합 단백질에 있어서, 상기 NADPH 의존적 효소는 디하이드로게나아제, 리덕타아제, 옥시도리덕타아제, 트랜스하이드로게나아제, 퍼옥시다아제, 옥시게나아제, 모노옥시게나아제, 플라보독신 및 디할로게나아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 재조합 단백질에 있어서, 상기 NADPH 의존적 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에 재조합되어 융합되거나, 화학적 링커의 첨가에 의해 연결되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 재조합 단백질에 있어서, 상기 화학적 링커는 BS(PEG)5, BS(PEG)9, BS2G-d0, BS2G-d4, DSBU, DFDNB, DMP, DMS, DSG, DSP, DSS, DSSO, DST, DTBP, EGS, TSAT 및 EDC로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 재조합 단백질을 포함하는, NADPH 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 재조합 단백질을 NADPH 의존적 효소 반응계에 첨가하여 NADPH를 재생하는 단계를 포함하는, NADPH 재생방법을 제공한다.
본 발명은 상기 재조합 단백질을 포함하는, NADPH 재생용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 기질 하이드록실화용 조성물은 상기 재조합 단백질; 및 시토크롬 P450 단백질을 포함한다.
본 발명의 일 예에 따른 기질 하이드록실화용 조성물에 있어서, 상기 기질은 오메프라졸, 오메프라졸 설파이드, 에톡시쿠마린 및 니트로페놀로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 기질 하이드록실화용 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내(in vitro) 독성검사 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 재조합 단백질과 NADPH 의존적 효소를 동시 발현 또는 융합 발현하여, 목적 기질을 전환하는 방법을 제공한다.
본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제 재조합 단백질 및 아조토박터 비네란디 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 단백질의 제조방법, 이를 통해 제조된 재조합 단백질을 NADPH 재생 시스템에 관한 것으로, 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환체에서 NADPH 재생 시스템에서 효율적으로 사용될 수 있는 단량체 형태의 효소를 발굴하였고, 이를 이용한 NADPH 재생 시스템은 NADPH 의존적 효소에 NADPH를 제공하는 생물학적 부품과 생촉매 소재로서 활용가치가 매우 높다.
도 1은 본 발명에 따른 단량체 형태의 이소시트레이트 디하이드로게나아제 기반 NADPH 재생 시스템을 나타낸 모식도이고,
도 2는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제 재조합 단백질(이하, CgIDH로 언급될 수 있음) 및 아조토박터 비네란디 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제 재조합 단백질(이하, AvIDH로 언급될 수 있음)을 발현시키기 위한 재조합 벡터를 나타낸 것이고,
도 3은 CgIDH 및 AvIDH의 발현 온도에 따른 SDS-PAGE 분석 결과이고,
도 4는 CgIDH 및 AvIDH의 순수 분리 정제 결과를 확인할 수 있는 SDS-PAGE 분석 결과이고,
도 5는 CgIDH 및 AvIDH의 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 분석 결과이고,
도 6은 CgIDH 및 AvIDH의 동역학적 상수(Km 및 Vmax) 분석 결과이고,
도 7은 CgIDH 및 AvIDH의 효소 활성 측정 결과이고,
도 8은 CgIDH 또는 AvIDH 각각을 NADPH 의존적 효소인 시토크롬 P450 BM3와 커플링 반응시켜 분광광도계로 분석한 결과이고,
도 9는 CgIDH 또는 AvIDH와 시토크롬 P450 BM3의 커플링 반응을 위한 최적의 효소 농도비를 결정하기 위한 분석 결과이고,
도 10은 CgIDH 또는 AvIDH와 시토크롬 P450 BM3의 커플링 반응에 의한 기질의 하이드록실화 반응을 HPLC 분석한 결과이고,
도 11은 CgIDH 또는 AvIDH의 저장 안정성 평가 결과이고,
도 12는 CgIDH 및 AvIDH 재조합 단백질의 반응 생성물인 α-케토글루타레이트에 의한 효소 활성 억제 효과의 평가 결과이다.
이하 첨부한 표 또는 도면들을 참조하여 본 발명의 단량체 이소시트레이트 디하이드로게나아제에 기반한 NADPH 재생 시스템 및 이의 용도에 대해 상세히 설명한다.
도면이 기재되어 있을 경우, 이는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 상기 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.
제 1, 제 2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는 데 사용될 수 있지만, 상기 구성 요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제 1 구성요소는 제 2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제 2 구성요소도 제 1 구성요소로 명명될 수 있다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의되지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한 본 발명의 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.
또한 본 발명의 명세서에서 특별한 언급 없이 사용된 단위는 중량을 기준으로 하며, 일 예로 % 또는 비의 단위는 중량% 또는 중량비를 의미한다.
또한 본 발명의 명세서에서, “포함한다”는 표현은 “구비한다”, “함유한다”, “가진다” 또는 “특징으로 한다” 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다. 또한 “실질적으로…로 구성된다”는 표현은 특정된 요소, 재료 또는 공정과 함께 열거되어 있지 않은 다른 요소, 재료 또는 공정이 발명의 적어도 하나의 기본적이고 신규한 기술적 사상에 허용할 수 없을 만큼의 현저한 영향을 미치지 않는 양으로 존재할 수 있는 것을 의미한다. 또한 “구성된다”는 표현은 기재된 요소, 재료 또는 공정만이 존재하는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서에서, “재생”은 특별히 언급하지 않는 한, 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이 NADPH 의존적 효소에 의해 생성된 NADP+를 NADPH로 전환함으로써 NADPH 의존적 효소와 함께 NADPH를 재순환시키는 공정뿐만 아니라, 유리 NADP+로부터 NADPH를 생성하는 반응도 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서에서, 용어 "벡터(vector)”, "발현 벡터(expression vector)”또는 “재조합 발현 벡터(recombinant expression vector)는 유전자 전사와 번역에 제공되는 요소와 추가 단편을 포함하고, 작동 가능하도록 연결된 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 추가 단편은 프로모터, 전사종결 서열 등을 포함한다. 벡터, 발현 벡터, 또는 재조합 발현 벡터는 하나 이상의 복제 개시점과 하나 이상의 선택 마커(selection marker) 등을 포함한다. 벡터, 발현 벡터, 또는 재조합 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드(plasmid) 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 포함한다.
본 발명의 명세서에서, 용어 "재조합 단백질(recombination protein)”은 이종 숙주를 이용하여 다른 종의 세포로부터 유래된 유전자를 발현시키는 통상의 발현 단백질을 의미하나, 필요한 경우 목적 단백질 서열의 아미노 또는 카르복실 말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 포함한다. 본 발명에서는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제 재조합 단백질(CgIDH)과 아조토박터 비네란디 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제 재조합 단백질(AvIDH)의 카르복실 말단에, 정제의 용이함을 위해 친화성 태그를 더 포함할 수 있으며, 상기 친화성 태그는 히스티딘 태그(his-tag)를 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 NADPH 재생용 재조합 발현 벡터는 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 아조토박터 비네란디 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제 재조합 단백질(CgIDH 또는 AvIDH) 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이때, 상기 재조합 발현 벡터는 바람직하게는 상기 재조합 단백질 단량체가 가용성으로 과발현(overexpressioin)되도록 하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제는 구체적인 일 예로 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 아조토박터 비네란디 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 CgIDH 또는 AvIDH를 코딩할 수 있는 핵산 서열이라면 특별히 제한되는 것은 아니며, 일 예로 CgIDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7의 핵산 서열로 이루어질 수 있고, AvIDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 핵산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 폴리뉴클레오티드는 재조합 발현 벡터에 도입 시, 단백질의 발현이 잘 이루어질 수 있도록 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
이때, 용어 “작동 가능하게 연결(operably linked)”이란, 일반적인 기능을 수행할 수 있도록 핵산 발현 조절 서열과, 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 뜻한다. 일 예로, 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어, 코딩 서열의 발현에 영향을 줄 수 있다. 발현 벡터와의 작동 가능한 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 통해 제작할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소나 상동 유전자 재조합 기술 등을 적절히 도입하여 사용할 수 있음은 물론이다.
상기 프로모터는 본 발명의 재조합 벡터를 도입하고자 하는 대상(숙주, host)에서 유래된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 예를 들면 T7 프로모터 등을 들 수 있다.
상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환체에서, CgIDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 AvIDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 CgIDH 및/또는 AvIDH가 발현된다.
본 발명의 재조합 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 주형으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직한 일 예로 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서와 같은 발현 조절 요소 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 벡터가 도입된 형질전환체의 선별을 위해 항생제 저항성 마커를 포함할 수 있고, 이는 벡터에 내재된 것이거나 외부에서 도입된 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 NADPH 재생용 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 NADPH 의존적 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있으며, 상기 NADPH 의존적 효소의 구체적인 일 예로 디하이드로게나아제, 리덕타아제, 옥시도리덕타아제, 트랜스하이드로게나아제, 퍼옥시다아제, 옥시게나아제, 모노옥시게나아제, 플라보독신 및 디할로게나아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있으며, 바람직하게는 디하이드로게나아제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 NADPH 재생용 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 NADPH의존적 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에 재조합되어 융합되거나, 화학적 링커의 첨가에 의해 연결되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 NADPH 재생용 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 화학적 링커는 BS(PEG)5, BS(PEG)9, BS2G-d0, BS2G-d4, DSBU, DFDNB, DMP, DMS, DSG, DSP, DSS, DSSO, DST, DTBP, EGS, TSAT 및 EDC로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 NADPH 재생용 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 형질전환체를 제공한다. 상기 형질전환체는 본 발명의 재조합 발현 벡터가 도입되어 CgIDH 및/또는 AvIDH를 발현할 수 있다면 그 종류는 제한되지 않으나, 일 예로 에스체리시아속, 살모넬라속, 시겔라속, 엔테로박터속, 프로테우스속, 슈도모나스속, 모락셀라속, 헬리코박터속, 스테노트로포모나스속, 델로비브리오속, 레지오넬라속, 네이세리아속, 및 에르위니아속에 포함되는 균주에서 선택될 수 있으며, 구체적인 일 예로, 대장균, 더욱 구체적으로 대장균 BL21(DE3)일 수 있다.
상기 형질전환체의 제작 시, 형질전환 방법은 당해 기술분야의 통상적인 방법에 의해 실시할 수 있으며, 일 예로, 자연도입법, 열 충격법, 전기충격법 등에 의해 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법을 제공하며, 보다 구체적으로 상기 재조합 단백질의 제조방법은 상기 NADPH 재생용 재조합 발현 벡터를 제작하는 단계; 상기 재조합 발현 벡터를 형질전환하여 형질전환체를 제작하는 단계; 상기 형질전환체를 배양하여 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제 또는 아조토박터 비네란디 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제를 과발현하는 단계; 및 과발현된 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
상기 형질전환체의 배양 시, 배양 조건은 특별히 한정되는 것은 아니며, 공지된 배양 조건을 도입하여 사용할 수 있음은 물론이다. 구체적인 일 예로, 상기 배양은 28 내지 32℃, 바람직하게는 29 내지 31℃, 더욱 바람직하게는 30℃에서 수행될 수 있으며, 상기 배양 온도 범위에서 90% 이상의 목적 단백질의 가용성 발현이 구현될 수 있다. 미생물 배양을 위한 배지 또한 공지된 배지 중에서 적절히 도입하여 사용할 수 있으며, 구체적인 일 예로, LB(Luria-Bertani) 배지를 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
형질전환체가 상기 재조합 발현 벡터의 도입에 의해 재조합 단백질을 발현 시, 상기 배양 배지는 형질전환된 미생물의 선별을 위해 적절한 항생제를 더 포함할 수 있으며, 필요에 따라 재조합 단백질의 발현 촉진을 위한 물질, 일 예로 IPTG(isopropyl β 등을 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 재조합 단백질의 제조 방법은 상기 형질전환체의 배양물로부터 재조합 단백질을 분리, 정제하여 얻는 것일 수 있으며, 이때, 배양물은 형질전환체 또는 그 배양 배지일 수 있고, 상기 배양 배지는 형질전환체를 포함하거나 형질전환체를 분리한 배지일 수 있다.
또한, 상기 재조합 단백질의 용이한 분리, 정제를 위해 상기 형질전환체는 파괴된 것일 수 있으며, 구체적인 방법으로 초음파 분해 등을 통한 물리적 파괴, 계면활성제 등을 통한 화학적 파괴 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 재조합 단백질의 제조방법은 CgIDH 및/또는 AvIDH를 분리 및 정제하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 단계는 발현된 단백질을 원하는 목적 또는 용도로 활용하기 위해 수행되는 당해 기술 분야의 통상의 분리 과정, 정제 과정을 도입하여 수행할 수 있음은 물론이다. 이와 같은 분리, 정제 과정을 통해, 고수율의 재조합 단백질을 수득할 수 있다.
본 발명은 상기 재조합 단백질을 NADPH 의존적 효소 반응계에 첨가하여 NADPH를 재생하는 단계를 포함하는, NADPH 재생 방법, NADPH 재생 시스템 및 시토크롬 P450과 같은 NADPH 의존적 효소의 조효소인 NADPH 재생 방법을 제공한다.
상기 NADPH 의존적 효소의 구체적인 일 예로 디하이드로게나아제, 리덕타아제, 옥시도리덕타아제, 트랜스하이드로게나아제, 퍼옥시다아제, 옥시게나아제, 모노옥시게나아제, 플라보독신 및 디할로게나아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있으며, 바람직하게는 디하이드로게나아제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 NADPH 의존적 효소는 CgIDH 및/또는 AvIDH에 재조합되어 융합되거나, 화학적 링커에 의해 연결되는 것일 수 있으며, 상기 화학적 링커는 BS(PEG)5, BS(PEG)9, BS2G-d0, BS2G-d4, DSBU, DFDNB, DMP, DMS, DSG, DSP, DSS, DSSO, DST, DTBP, EGS, TSAT 및 EDC로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 재조합 단백질을 포함하는, NADPH 재생용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 단백질; 및 NADPH 시토크롬 P450 단백질을 포함하는 기질 하이드록실화용 조성물을 제공한다.
이때, 상기 재조합 단백질은 이를 포함하는 NADPH 재생 관련 구조체(시스템)를 의미하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적인 일 예로, 상기 기질은 오메프라졸, 오메프라졸 설파이드, 에톡시쿠마린 및 니트로페놀로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 기질 하이드록실화용 조성물은 CgIDH 및/또는 AvIDH를 이용한 NADPH 재생 시스템이 포함되어, 시토크롬 P450을 위해 사용되는 고가의 NADPH를 제공할 뿐만 아니라, 유전적 융합에 의해 시토크롬 P450 단백질을 포함하고 있어, 광범위한 기질의 하이드록실화 반응의 생물학적 촉매로서 사용할 수 있다.
본 발명은 상기 기질 하이드록실화용 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내(in vitro) 독성검사 방법을 제공한다. 이때 상기 독성 검사의 종류는 특별히 제한되는 것은 아니나, 약물 독성 검사 또는 간독성 검사 등을 들 수 있다.
본 발명은 상기 재조합 단백질과 NADPH 의존적 효소를 동시 발현 또는 융합 발현하여, 목적 기질을 전환하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
[균주, 시약, 재료 및 실험 프로토콜]
- 본 발명에서, 중합효소연쇄반응(PCR), DNA 클로닝, 형질전환 등을 위해 사용된 시약, 재료 및 프로토콜은 다음과 같으며, 이는 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 있어 자명할 것이다.
- 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032는 국제 기탁 기관인 ATCC (USA)에서 분양 받아 사용하였다.
- 아조토박터 비네란디 KACC10899는 국립농업과학원(KACC, 대한민국)에서 분양 받아 사용하였다.
- 대장균 XL1-Blue는 Yeastern Biotech. (Taiwan)에서 구입하여 사용하였다.
- 대장균 BL21(DE3)은 Yeastern Biotech. (Taiwan)에서 구입하여 사용하였다.
- pET24a 플라스미드는 New England Labs (UK)에서 구입하여 사용하였다.
- PureLinkTM Genomic DNA Kit는 Thermo Fisher Scientific Korea (대한민국)에서 구입하여 사용하였다.
- 유전자 증폭을 위한 프라이머는 BIONICS사 (대한민국)에서 합성하여 사용하였다.
- Speed-Pfu DNA Polymerase는 나노헬릭스㈜ (대한민국)에서 구입하여 사용하였다.
- In-Fusion®HD 클로닝 키트는 Takara Korea Biomedical Inc. (대한민국)에서 구입하여 사용하였다.
- 기타 NdeI, XhoI 제한효소는 Takara Korea Biomedical Inc. (대한민국)에서 구입하여 사용하였다.
- 그 외의 시약은 Sigma-Aldrich (USA) 등에서 구입하여 사용하였다.
형질전환체
플라스미드 형질전환 및 유전자 조작을 위한 형질전환체는 대장균 XL1-Blue를 사용하였다.
단백질 발현을 위한 형질전환체로는 대장균 BL21(DE3)을 사용하였다.
히스티딘 태그(his-tag)
재조합 단백질의 아미노 말단(N-말단)에 히스티딘 태그를 융합하면, 경우에 따라 단백질 전체의 발현 및 구조에 영향을 미칠 수 있으므로, 카르복실 말단(C-말단)에 히스티딘 태그가 융합되도록 프라이머를 합성하였다.
[실시예 1] 재조합 단백질의 과발현 및 제조를 위한 재조합 벡터 제작
플라스미드 제작은 표준 DNA 조작 기법을 기준으로 수행하였다.
먼저, PureLinkTM Genomic DNA Kit를 이용하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 및 아조토박터 비네란디 KACC10899로부터 각각의 게놈 DNA를 추출하였다.
이후, 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여, PCR을 수행하였다.
이때, PCR 반응을 위해, 하기 표 1의 각 서열로 구성된 프라이머를 각각 합성하여 사용하였다.
서열번호 프라이머 명칭 서열(5'->3') 제한효소
3 CgIDH infusion F 5'-GAA GGA GAT ATA CAT ATG GCT AAG ATC ATC TGG ACC CG-3' NdeI
4 CgIDH infusion R 5'-GTG GTG GTG GTG CTC GAG CTT CTT CAG TGC GTC AAC GAT CTC-3' XhoI
5 AvIDH infusion F 5'-GAA GGA GAT ATA CAT ATG TCC ACA CCG AAG ATT ATC TAT ACG C-3' NdeI
6 AvIDH infusion R 5'-GTG GTG GTG GTG CTC GAG TGC AAG AGG TGC CAG AGC C-3' XhoI
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로, 상기 서열번호 3, 4의 프라이머를 이용하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제 단백질(CgIDH)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 1을 PCR 증폭하고, 아조토박터 비네란디 KACC10899에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로, 상기 서열번호 5, 6의 프라이머를 이용하여, 아조토박터 비네란디 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제 단백질(AvIDH)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 2를 동일한 방식으로 증폭하였다. 상기 PCR 증폭 시, 변이 유발 빈도가 낮은 중합효소인 Speed-Pfu DNA 중합효소를 사용하였다.
PCR을 통해 얻은 DNA 단편을 각각 NdeI 및 XhoI 제한효소 처리한 pET24a 플라스미드에 In-Fusion®HD 클로닝 키트를 이용하여 클로닝하였다.
그 결과를 도 2에 도시하였다.
도 2a 및 도 2b는 각각 서열번호 1과 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자(cgIDH 및 avIDH)를 T7 프로모터 조절 하에서 전사 및 번역시키기 위한 재조합 벡터의 모식도를 나타낸다.
[실시예 2] 재조합 단백질의 발현 조건 확립 및 정제
재조합 단백질의 발현 조건 확립
재조합 단백질 정제를 위한 고발현 조건 확인을 위해, IDH 단백질의 발현 양상을 확인하면서, 발현 조건을 확립하였다.
상기 실시예 1에서 제작한 재조합 발현 벡터인 pET24a-CgIDH 및 pET24a-AvIDH를, 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 자명한 방법을 이용하여, 대장균 XL1-Blue에 각각 형질전환한 후, 50 ug/mL의 카나마이신을 포함하는 LB 고체 배지에 도말한 후, 37℃에서 하룻밤 배양하였다.
이어서, 상기 재조합 발현 벡터가 도입된 대장균 XL1-Blue를 각각 50 ug/mL의 카나마이신을 포함하는 LB 액체 배지에 접종하고, 37℃에서 220 rpm으로 진탕 배양하여 수확한 균체로부터 재조합 발현 벡터를 순수 분리하였다.
상기 과정을 통해 분리한 재조합 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 각각 형질전환한 후, 50 ug/mL의 카나마이신을 포함하는 LB 고체 배지에 도말한 후, 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 이후, 배지에서 성장한 단일 클론을 50 ug/mL의 카나마이신을 포함하는 LB 액체 배지에 접종한 후, 37℃에서 220 rpm으로 전배양하면서 600 nm에서 흡광도(OD600)를 측정하였다.
배양액의 흡광도가 2.0~2.5에 도달하였을 때, 동일한 조성을 갖는 LB 액체 배지에 계대한 후, 흡광도가 0.6에 도달할 때까지 배양하였다. 이후, 100 mM IPTG를 최종 농도가 0.2 mM이 되도록 첨가하고, 37℃ 및 30℃에서 220 rpm으로 2.5시간 추가 배양하였다.
배양 종료 후, 600 nm에서의 흡광도가 2.0이 되도록 보정한 후, 세포를 수확하였다.
이를 1 x PBS(phosphate-buffered saline, pH 7.4) 200 uL에 재현탁한 후, 초음파 처리하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄 직후, 전체 단백질 분획을 취한 후, 4℃에서 16,000 x g로 30분간 원심분리하여 불용성 응집체를 제거하고, 가용성 분획을 분취하였다.
각 단계에서 취한 시료에 5 x 샘플 로딩 버퍼(0.225 M Tris-HCl pH 6.8, 50% 글리세롤, 5% SDS, 0.005 M 브로모페놀블루 및 0.25 M 디티오트레이톨(DTT))를 5:1의 비율로 첨가하고, 95℃에서 15분간 가열하여, 모든 단백질의 변성을 유도하였다.
이어서, 각 시료를 천천히 냉각한 후, 10% 아크릴아마이드 겔에 준비한 시료를 로딩하여 150 V로 고정한 후, 전기영동을 수행하였다. 전기영동 완료 후, 아크릴아마이드 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 용액으로 염색하여 CgIDH 및 AvIDH의 온도에 따른 발현 양상을 비교하여 도 3에 도시하였다.
도 3a 및 도 3b는 각각 CgIDH 및 AvIDH를 대장균 BL21(DE3)에서 발현시킨 후, 발현 양상의 확인을 위한 SDS-PAGE 분석 결과로, 상기 2가지 재조합 단백질의 발현 온도를 각각 30℃ 및 37℃로 상이하게 설정한 후 발현시켰다.
그 결과, CgIDH는 30℃에서 발현 시 약 80 kDa의 위치에서 가용성 과발현된 밴드를 확인하였고, AvIDH는 30℃에서 발현 시 약 70 kDa의 위치에서 가용성 과발현된 밴드를 확인하였다.
이로부터, 상기 재조합 단백질 2종 모두 발현 온도를 37℃로 설정한 경우 가용성 발현이 일어나지 않으나, 발현 온도를 30℃로 설정한 경우 90% 이상 가용성 발현되는 것을 확인하였다.
재조합 단백질의 정제
상기와 같이 발현된 단백질의 정제를 위해, 배양 부피를 100 mL로 증가시킨 후, 상기 배양 방법과 동일한 절차로 배양하였다.
이를 통해 수확한 각 세포를 300 mM 염화나트륨을 함유하는 60 mM 인산칼륨 버퍼(photassium phosphate buffer, pH 7.7) 40 mL을 첨가하여 재현탁하였다.
재현탁된 세포를 초음파 처리하여 파괴하고, 4℃에서 16,000 x g로 60분간 원심분리하여 불용성 응집체가 제거된 상등액을 분리하였다. 이후, 40 mL 가용성 단백질 용액을 5 mL Histrap 컬럼(GE Healthcare Life Science, USA)에 각각 로딩하였다.
각각의 가용성 단백질 분획 로딩을 완료한 후, 충분히 세척하고, 250 mM 이미다졸 농도까지 농도 구배를 주어 재조합 단백질을 용출시켰다.
도 4는 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용한 CgIDH 및 AvIDH의 정제 결과를 확인할 수 있는 SDS-PAGE 결과이다.
이로부터, CgIDH는 약 40~60 mM 이미다졸 농도에서 용출되었고, AvIDH는 약 90~110 mM 이미다졸 농도에서 용출되었다. 특히, 용출된 CgIDH 및 AvIDH 모두 95% 이상의 고순도로 정제된 것을 확인하였다.
추가적으로, 단백질 정량 시험(Bradford assay)을 통해, 용출된 분획의 단백질을 정량한 결과, 두 재조합 단백질 모두 1 g/L의 정제 수율(purification yield)를 나타내, 배양 조건이 최적화되지 않은 실험실 수준의 정제에서도 높은 수율을 나타내는 것을 확인하였다.
[실시예 3] 정제된 재조합 단백질의 4차 구조
상기 과정을 통해 정제된 재조합 단백질의 다량체(4차 구조) 형성 여부 확인을 위해, 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다.
우선 상기 실시예 2에서 정제한 CgIDH 및 AvIDH를 SuperdexTM 200 Increase 10/300 GL 컬럼(GE Healthcare Life Science, USA)에 각각 로딩한 후, 1 x PBS (pH 7.4)를 이용하여 크기 배제 크로마토그래피를 수행하고, 대조군으로 시토크롬 P450 BM3(청색, 119 kDa), 표준물질로서 콘알부민(conalbumin, 보라색, 75 kDa) 및 난알부민(ovalbumin, 주황색, 45 kDa)을 사용하였다.
크기 배제 크로마토그래피 수행 결과를 도 5에 도시하였다.
이로부터 확인할 수 있는 바와 같이, CgIDH 및 AvIDH는 SDS-PAGE 분석 결과와 일치하는 피크 위치에서 용출되었으며, 이는 상기 재조합 단백질 모두 단량체 형태(monomeric form)를 가지는 것을 의미하는 것이다.
[실시예 4] 정제된 재조합 단백질의 동력학적 상수 분석(kinetic constant analysis)
재조합 단백질의 효소 활성과 관련된 동력학적 특성, 즉 동력학적 상수(kinetic constants) 분석을 하기 과정으로 수행하였다.
문헌(Chen, R. & Yang, H. Biochemistry and Biophysics, 383(2):238-245 (2000); 및 Watanabe, S. Microbiology 151(4):1083-1094 (2005))에 기재된 방법을 기초로, 상기 실시예 2에서 정제된 재조합 단백질에 대해 각각 동력학적 활성 분석을 수행하였다.
이때, 효소 반응 속도론에서 이용되는 반응상수로서 효소의 기질에 대한 친화도를 나타내는 Km(uM), 효소의 대사 회전수(turnover number)를 의미하는 Kcat(S-1) 및 효소의 반응 효율을 나타내는 Kcat/Km(S-1, M-1) 값을 결정하였다. 대조군으로 야생형 CgIDH 및 AvIDH의 파라미터를 사용하였으며, 그 결과를 도 6에 도시하였다.
이로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 CgIDH 및 AvIDH는 모두 야생형 대비 소폭 감소한 Kcat을 나타냈으나, 시토크롬 P450 등의 NADPH 의존적 효소 반응에 필요한 NADPH를 제공하기 위한 효소 활성은 충분히 높은 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 재조합 단백질의 활성은 야생형과 같은 수준인 것으로 볼 수 있으며, 상기 실시예 3의 4차 구조 분석 결과의 신뢰성을 지지할 수 있는 결과이다. 즉, 상기 결과는 재조합 단백질의 제조 과정에서 4차 구조의 변화가 없었음을 의미하는 간접적이나 유의미한 결과로 해석할 수 있다.
[실시예 5] 재조합 단백질의 비활성(specific activity) 분석
IDH 재조합 단백질의 활성으로 인한 NADPH 재생 정도를 확인하기 위해, 100 mM 인산칼륨 버퍼(pH 7.4), 0.8 mM 황산망간(MnSO4), 0.8 mM DL-이소시트르산(DL-isocitric acid) 및 0.5 mM NADP를 포함하는 반응액에 CgIDH 및 AvIDH를 최종 농도 5 nM이 되도록 첨가하여, 효소 활성에 따른 NADPH의 증가 정도를 분광광도계로 측정하였다.
분광광도계를 이용한 형광 측정 시, 여기 파장은 350 nm, 방출 파장은 450 nm로 설정하였고, 측정 결과를 도 7에 도시하였다.
이로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 적색 원으로 표시된 CgIDH와 녹색 사각형으로 표시된 AvIDH 각각의 단백질을 포함하는 각 반응액에서, 경시적으로 NADPH가 증가하는 것을 확인하였는데, 이는 CgIDH 및 AvIDH 모두 이소시트르산을 α-케토글루타레이트로 전환하는 효소 반응을 통해, NADPH를 생성한다는 것을 시사한다.
또한, 동일한 양의 재조합 단백질의 효소 활성을 비교할 때, CgIDH 효소 반응 기울기가 AvIDH 효소 반응 기울기 대비 높은 것으로 나타났으며, 이는 CgIDH의 효소 활성이 더 높다는 것을 의미한다. 이와 같은 결과는 상기 실시예 4의 도 6에서의 결과와도 부합되는 것이다.
상기 결과로부터 CgIDH 및 AvIDH의 비활성(specific activity)은 각각 57 U/mg 및 28 U/mg에 해당하는 것을 확인하였다.
[실시예 6] 이소시트레이트 디하이드로게나아제 기반 NADPH 재생 시스템 및 시토크롬 P450 BM3의 커플링 반응 분석
IDH 재조합 단백질을 이용한 NADPH 재생 시스템을 통해, NADPH 의존적 효소의 조효소인 NADPH를 연속적으로 공급될 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 100 mM 인산칼륨 버퍼(pH 7.4), 0.8 mM 황산망간, 40 mM DL-이소시트르산, 0.5 mM NADP 및 2 mM 오메프라졸을 포함하는 반응액에 CgIDH 및 시토크롬 P450 BM3를 첨가하여 반응물을 준비하고, 같은 방법으로 AvIDH 및 시토크롬 P450 BM3를 이용하여 반응물을 준비한 후, 각각의 반응물에 대해 37℃에서 CgIDH 및 AvIDH와 시토크롬 P450 BM3의 커플링 반응을 진행하였다.
조효소 재생 확인을 위한 NADPH 자체 형광 분석
상기 과정에서 반응액에 최종 농도로 2 nM CgIDH 및 500 nM 시토크롬 P450 BM3를 각각 첨가하고, 동일한 방법으로 최종 농도로 2 nM AvIDH 및 500 nM 시토크롬 P450 BM3을 각각 첨가한 후, 각각의 반응물을 37℃에서 반응시킨 후, NADPH의 증가 여부를 분광광도계를 이용하여 측정하였다.
분광광도계를 이용한 형광 측정 시, 여기 파장은 350 nm, 방출 파장은 450 nm로 설정하였고, 측정 결과를 도 8에 도시하였다.
이때, 상기 반응액에 IDH 재조합 단백질을 첨가하지 않은 경우를 음성 대조군(도 8a의 청색 원)으로 사용하고, 상기 반응액에 시토크롬 P450 BM3를 첨가하지 않은 2가지 경우는 양성 대조군(도 8a의 분홍 사각형 및 녹색 삼각형)으로 사용하였다.
도 8b는 음성 대조군(청색 원)과 함께 2가지 커플링 반응(CgIDH 및 시토크롬 P450 BM3(적색 사각형); AvIDH 및 시토크롬 P450 BM3(녹색 삼각형))에 대한 형광 측정 결과를 나타낸 것으로, 세로축(y축)의 형광 강도 스케일을 0 내지 500 a.u.까지 설정하여 확대한 것이다.
이로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 커플링된 2가지 단백질이 모두 존재하는 반응액의 경우에서만 반응 초기에 IDH 재조합 단백질에 의해 생성된 NADPH로 인해 형광 강도가 다소 증가하지만, 일정 시간 경과 후에는 형광 강도가 일정 수준을 유지하였는데, 이는 IDH 재조합 단백질에 의해 생성된 NADPH가 NADPH 의존적 효소인 시토크롬 P450 BM3에 의해 소모되고, 동시에 생성된 NADP는 다시 IDH 재조합 단백질에 의해 NADPH로 재생됨으로써, 조효소인 NADPH의 효율적인 재생이 이루어지고 있음을 시사하는 것이다. IDH 재조합 단백질, NADPH 의존적 효소, NADP 및 NADPH가 관여하는 반응을 NADPH의 재생의 관점에서 개략적으로 나타내면 하기 반응식 1과 같다:
[반응식 I]
NADP+ + IDH 재조합 단백질 → NADPH + NADPH 의존적 효소 → NADP+
효소 농도비 결정
상기 반응에서는 IDH 재조합 단백질 대비 시토크롬 P450 BM3의 양이 많아 NADPH가 반응액 내에 적은 농도로 존재하였기 때문에, 보다 적절한 효소 농도비의 확립을 위해 100 mM 인산칼륨 버퍼(pH 7.4), 0.8 mM 황산망간, 40 mM DL-이소시트르산, 0.5 mM NADP 및 2 mM 오메프라졸을 포함하는 반응액에 500 nM 시토크롬 P450 BM3를 첨가하고, CgIDH 및 AvIDH를 각각 2 nM, 5 nM, 10 nM (각각 1:250, 1:100, 1:50의 농도비)로 첨가하여 반응물을 준비하고, 각각의 반응물을 37℃에서 커플링 반응시킨 후, NADPH의 증가 정도를 같은 방법으로 측정하였다.
그 결과를 도 9에 도시하였다.
도 9a는 CgIDH와 시토크롬 P450 BM3의 커플링 반응 결과를 나타낸 것으로, 두 효소의 농도비는 1:250(분홍색 사각형), 1:100(적색 삼각형) 및 1:50(적색 역삼각형)으로 설정하였다.
또한 도 9b는 AvIDH와 시토크롬 P450 BM3의 커플링 반응 결과를 나타낸 것으로, 두 효소의 농도비는 1:250(녹색 사각형), 1:100(녹색 삼각형) 및 1:50(녹색 역삼각형)으로 설정하였다.
상기 도 8에서와 동일하게, 반응액에 IDH 재조합 단백질을 첨가하지 않은 경우를 음성 대조군(도 9a 및 9b의 청색 원)으로 사용하였다.
이로부터 확인할 수 있는 바와 같이, CgIDH 및 AvIDH의 농도에 따라 NADPH가 일정 수준으로 유지되는 구간이 상이하였으며, 형광 강도가 2000 a.u.로 유지되는 효소 농도비(CgIDH의 경우 1:50, AvIDH의 경우 1:100)를 적합한 효소 농도비로 설정하여 이후 분석을 수행하였다.
기질 하이드록실화 반응의 HPLC 분석
상기 반응에서 실질적인 NADPH 재생을 통해 시토크롬 P450 BM3의 활성이 유지되어, 기질 중 하나에 해당하는 오메프라졸의 하이드록실화 반응이 일어나는지 확인하기위해, 100 mM 인산칼륨 버퍼(pH 7.4), 0.8 mM 황산망간, 40 mM DL-이소시트르산, 0.5 mM NADP 및 2 mM 오메프라졸을 포함하는 반응액 1 mL에 각각 CgIDH 및 시토크롬 P450 BM3를 최종 농도 10 nM 및 500 nM, AvIDH 및 시토크롬 P450 BM3를 최종 농도 5 nM 및 500 nM 로 첨가하여 반응물을 준비하고, 각각의 반응물을 37℃에서 기질 전환 반응을 시킨 후, 기질의 하이드록실화 반응 정도를 HPLC를 이용하여 측정하였다.
반응 혼합물은 시간별로 90 uL씩 회수하고, 90 uL의 메탄올과 각각 혼합하여 반응을 정지시킨 후 HPLC 분석을 수행하였다. 구체적인 HPLC 수행 조건은 다음과 같다.
- HPLC는 Alliance HPLC 시스템(Waters)을 이용하여 수행하였다.
- 컬럼은 SunFire 18C 컬럼을 사용하였다.
- 샘플 로딩량은 20 uL로 설정하였다.
- HPLC 이동상으로 30% 아세토니트릴을 1 mL/min의 유속으로 흘려주었고, 용출액을 302 nm의 자외선(UV)로 측정하였다.
- 분석은 Empower 3(Waters) 프로그램을 사용하여 수행하였다.
대조군으로는 NADPH 재생 시스템을 이용하지 않고, NADPH 자체 및 기질을 첨가하여, 시토크롬 P450 BM3 활성을 통한 기질의 하이드록실화 반응을 진행하여, 동일한 방식으로 HPLC 분석하였다. 상기 결과를 도 10에 도시하였다.
이로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 3가지 반응액(CgIDH와 시토크롬 P450 BM3의 커플링 반응(적색), AvIDH와 시토크롬 P450 BM3의 커플링 반응(녹색), 대조군(청색)) 모두에서 시간의 경과에 따라 5분 시점에서 커플링 반응에 의한 생성물, 즉 기질인 오메프라졸의 하이드록실화 형태인 5'-하이드록시오메프라졸이 용출되었으며, 각 피크의 형태는 유사한 것을 확인하였다.
또한 대조군에서 생성된 5'-하이드록시오메프라졸의 용출량을 기준으로, 본 발명의 NADPH 재생 시스템과 커플링 반응에 의해 생성된 5'-하이드록시오메프라졸의 용출량은 CgIDH와 P450 BM3의 커플링 반응의 경우 126%, AvIDH와 P450 BM3의 커플링 반응의 경우 114%로 측정되었다.
이는 본 발명의 NADPH 재생 시스템이 NADPH 의존적 효소의 효소 반응에 NADPH를 더욱 효과적으로 공급할 수 있다는 것을 시사한다.
[실시예 7] 재조합 단백질의 저장 안정성
본 발명에서 제조된 재조합 단백질의 안정성을 평가하기 위해, 4℃에 저장된 각각의 재조합 단백질을 일정 시간 경과 후, 최종 농도 5 nM로 100 mM 인산칼륨 버퍼(pH 7.4), 0.8 mM 황산망간, 40 mM DL-이소시트르산, 및 0.5 mM NADP를 포함하는 반응액에 첨가하여 실시예 5에 기재된 바와 같이 반응을 진행시키고, NADPH 증가 정도를 측정하였다. 측정 결과는 도 11에 도시하였다.
이로부터 확인할 수 잇는 바와 같이, 4℃에서 30일간 저장한 후, 동일 조건으로 측정한 CgIDH 및 AvIDH 재조합 단백질의 효소 활성은 감소되지 않은 것을 확인하였다.
특히, 저장 전에 비해 10 내지 20% 활성이 증가한 것을 확인하였으며, 이는 반응 조건과 단백질 정량에 따른 편차 발생 구간임을 고려하면, 초기 활성의 90 내지 110% 범위에서 활성이 유지되고 있다는 것을 시사한다.
즉, 본 발명의 NADPH 재생 시스템은, NADPH 의존적 효소 반응을 위한 독립적인 구성 요소로서 안정적으로 활용될 수 있으며, 시토크롬 P450 BM3 이외에 다른 NADPH 의존적 효소 활성을 위한 NADPH 재생 과정에서 대량 생산과 장기 보관에 유리한 안정성을 보유함으로써, 핵심적인 부품으로 적용될 수 있음을 확인하였다.
[실시예 8] 재조합 단백질의 생산물에 따른 효소 활성 억제 효과
본 발명에서 제조된 재조합 단백질의 효소 반응생성물인 α-케토글루타레이트에 의한 효소 활성 억제 효과 확인을 위해, 100 mM 인산칼륨 버퍼(pH 7.4), 0.8 mM 황산망간, 40 mM DL-이소시트르산, 및 0.5 mM NADP를 포함하는 반응액에 각각 5 nM의 CgIDH 및 5 nM AvIDH를 첨가한 반응물을 제조한 후, α-케토글루타레이트를 농도별로 첨가하여 실시예 5에 기재된 바와 같이 반응을 진행시키고, NADPH 증가 정도를 측정하였다. 측정 결과는 도 12에 도시하였다. 이때, 대조군으로는 α-케토글루타레이트를 첨가하지 않은 실험군을 사용하였다.
이로부터 확인할 수 있는 바와 같이, CgIDH는 첨가된 10 mM α-케토글루타레이트에 의해 효소 활성이 30%까지 감소되었으며, AvIDH는 첨가된 20 mM α-케토글루타레이트에 의해 효소 활성이 30%까지 감소된 것을 확인하였다.
이는 회분식 공정으로 NADPH 재생 시스템을 가동하는 경우, 효소 반응 생성물에 의해 효소 활성 억제 현상이 발생할 수 있음을 의미하며, 이의 해결을 위해, 연속공정, 실관막 반응기 등을 도입하여 효소 반응 생성물의 제거 과정을 수행하는 것이 바람직하다는 것을 시사한다. 그러나, 반응 공정의 pH를 pH 조절제 등을 첨가하여 보정하는 경우, 이러한 억제 효과는 50% 이상 향상될 수 있다는 결과 또한 확인하였다(결과 미첨부).
[실시예 9] NADPH 재생 시스템과 시토크롬 P450 BM3의 기질 변화에 따른 커플링 반응 분석
상기 실시예 6에서, 기질인 오메프라졸을 각각 오메프라졸 설파이드, 에톡시쿠마린, 니트로페놀로 각각 변경한 후, 동일한 조건으로 NADPH 재생 능력을 분석하였다.
그 결과, 오메프라졸 이외의 다른 기질을 사용하는 경우에도 동일한 기질 전환 결과를 확인하였으며, 이는 기질의 종류와 상관없이 IDH 재조합 단백질을 이용한 NADPH 재생 시스템이 NADPH 의존적 효소 활성을 유지하는 NADPH 재생 능력을 보유하고 있음을 시사하는 것이다. 즉, NADPH 재생 시스템의 견고한 핵심 부품(parts)으로 적합함을 의미하는 것이라 할 수 있다.
[실시예 10] NADPH 재생 시스템과 NADPH 의존적 효소의 변화에 따른 커플링 반응 분석
상기 실시예 6에서, NADPH 의존적 효소인 시토크롬 P450을 각각 만니톨 2-디하이드로게나아제(mannitol 2-dehydrogenase), 메틸말로네이트-세미알데히드 디하이드로게나아제(methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase), 글루타메이트 디하이드로게나아제(glutamate dehydrogenase) 및 페닐알라닌 디하이드로게나아제(phenylalanine dehydrogenase)로 변경한 후, 동일한 조건으로 NADPH 재생 능력을 분석하였다.
그 결과, 시토크롬 P450 BM3 이외의 다른 종류의 NADPH 의존적 효소의 경우에도 동일한 결과를 확인하였으며, 이는 NADPH 의존적 효소의 종류와 상관없이 IDH 재조합 단백질을 이용한 NADPH 재생 시스템이 NADPH 의존적 효소의 효소 활성을 유지하는 NADPH 재생 능력을 보유하고 있음을 시사하는 것이다. 즉, NADPH 재생 시스템의 견고한 핵심 부품으로 적합함을 의미하는 것이라 할 수 있다.
[실시예 11] 재조합 단백질과 시토크롬 P450의 동시 발현을 통한 전세포 반응 분석
본 발명에 따른 IDH 재조합 단백질과 시토크롬 P450 BM3가 조작된 플라스미드를 이용하여 형질전환된 형질전환체를 상기 실시예에서와 같이 배양하고, 배양액에 0.8 mM 황산망간, 2 mM 오메프라졸 및 충분한 양의 인산칼륨 버퍼(pH 7.4), DL-이소시트르산, 0.5 mM NADP를 첨가한 후, 상기 실시예에서와 같은 방법으로 HPLC 분석을 수행하였다.
그 결과, 세포 파쇄액으로부터 5'-하이드록시오메프라졸이 용출되는 것을 확인하였으며, 이로부터, IDH 재조합 단백질을 이용한 NADPH 재생 시스템과 NADPH 의존적 효소를 동시에 발현시킨 전세포 반응을 통해서도 기질 전환이 가능함을 시사하는 것이다.
[실시예 12] 재조합 단백질과 시토크롬 P450의 융합 발현을 통한 전세포 반응 분석
본 발명에 따른 IDH 재조합 단백질과 시토크롬 P450 BM3가 세포 내에서 융합 발현되도록 조작된 플라스미드를 이용하여 형질전환된 형질전환체를 상기 실시예에서와 같이 배양하고, 배양액에 0.8 mM 황산망간, 2 mM 오메프라졸 및 충분한 양의 인산칼륨 버퍼(pH 7.4), DL-이소시트르산, 0.5 mM NADP를 첨가한 후, 상기 실시예에서와 같은 방법으로 HPLC 분석을 수행하였다.
그 결과, 세포 파쇄액으로부터 5'-하이드록시오메프라졸이 용출되는 것을 확인하였으며, 이로부터, IDH 재조합 단백질을 이용한 NADPH 재생 시스템과 NADPH 의존적 효소를 융합 발현시킨 전세포 반응을 통해서도 기질 전환이 가능함을 시사하는 것이다.
상기 결과는 IDH 재조합 단백질을 이용한 NADPH 재생 시스템과 NADPH 의존적 효소의 융합 발현을 통해 종래 시토크롬 P450 BM3 및 NADPH 재생 시스템(예를 들어, G6PDH 등)의 근본적인 단점 중 하나인 융합 발현을 통한 NADPH의 효율적인 재생의 어려움을 극복한 것으로서, 향후 단일 단백질로서 융합 발현된 IDH 재조합 단백질을 이용한 NADPH 재생 시스템과 NADPH 의존적 효소는 생산성이 우수한 신규 공정 개발 등에 광범위하게 사용될 수 있다
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Val Lys Lys Phe Pro His Arg Met 145 150 155 160 Gly Glu Trp Ser Ala Asp Ser Lys Thr Asn Val Ala Thr Met Asp Ala 165 170 175 Asn Asp Phe Arg His Asn Glu Lys Ser Ile Ile Leu Asp Ala Ala Asp 180 185 190 Glu Val Gln Ile Lys His Ile Ala Ala Asp Gly Thr Glu Thr Ile Leu 195 200 205 Lys Asp Ser Leu Lys Leu Leu Glu Gly Glu Val Leu Asp Gly Thr Val 210 215 220 Leu Ser Ala Lys Ala Leu Asp Ala Phe Leu Leu Glu Gln Val Ala Arg 225 230 235 240 Ala Lys Ala Glu Gly Ile Leu Phe Ser Ala His Leu Lys Ala Thr Met 245 250 255 Met Lys Val Ser Asp Pro Ile Ile Phe Gly His Val Val Arg Ala Tyr 260 265 270 Phe Ala Asp Val Phe Ala Gln Tyr Gly Glu Gln Leu Leu Ala Ala Gly 275 280 285 Leu Asn Gly Glu Asn Gly Leu Ala Ala Ile Leu Ser Gly Leu Glu Ser 290 295 300 Leu Asp Asn Gly Glu Glu Ile Lys Ala Ala Phe Glu Lys Gly Leu Glu 305 310 315 320 Asp Gly Pro Asp Leu Ala Met Val Asn Ser Ala Arg Gly Ile Thr Asn 325 330 335 Leu His Val Pro Ser Asp Val Ile Val Asp Ala Ser Met Pro Ala Met 340 345 350 Ile Arg Thr Ser Gly His Met Trp Asn Lys Asp Asp Gln Glu Gln Asp 355 360 365 Thr Leu Ala Ile Ile Pro Asp Ser Ser Tyr Ala Gly Val Tyr Gln Thr 370 375 380 Val Ile Glu Asp Cys Arg Lys Asn Gly Ala Phe Asp Pro Thr Thr Met 385 390 395 400 Gly Thr Val Pro Asn Val Gly Leu Met Ala Gln Lys Ala Glu Glu Tyr 405 410 415 Gly Ser His Asp Lys Thr Phe Arg Ile Glu Ala Asp Gly Val Val Gln 420 425 430 Val Val Ser Ser Asn Gly Asp Val Leu Ile Glu His Asp Val Glu Ala 435 440 445 Asn Asp Ile Trp Arg Ala Cys Gln Val Lys Asp Ala Pro Ile Gln Asp 450 455 460 Trp Val Lys Leu Ala Val Thr Arg Ser Arg Leu Ser Gly Met Pro Ala 465 470 475 480 Val Phe Trp Leu Asp Pro Glu Arg Ala His Asp Arg Asn Leu Ala Ser 485 490 495 Leu Val Glu Lys Tyr Leu Ala Asp His Asp Thr Glu Gly Leu Asp Ile 500 505 510 Gln Ile Leu Ser Pro Val Glu Ala Thr Gln Leu Ser Ile Asp Arg Ile 515 520 525 Arg Arg Gly Glu Asp Thr Ile Ser Val Thr Gly Asn Val Leu Arg Asp 530 535 540 Tyr Asn Thr Asp Leu Phe Pro Ile Leu Glu Leu Gly Thr Ser Ala Lys 545 550 555 560 Met Leu Ser Val Val Pro Leu Met Ala Gly Gly Gly Leu Phe Glu Thr 565 570 575 Gly Ala Gly Gly Ser Ala Pro Lys His Val Gln Gln Val Gln Glu Glu 580 585 590 Asn His Leu Arg Trp Asp Ser Leu Gly Glu Phe Leu Ala Leu Ala Glu 595 600 605 Ser Phe Arg His Glu Leu Asn Asn Asn Gly Asn Thr Lys Ala Gly Val 610 615 620 Leu Ala Asp Ala Leu Asp Lys Ala Thr Glu Lys Leu Leu Asn Glu Glu 625 630 635 640 Lys Ser Pro Ser Arg Lys Val Gly Glu Ile Asp Asn Arg Gly Ser His 645 650 655 Phe Trp Leu Thr Lys Phe Trp Ala Asp Glu Leu Ala Ala Gln Thr Glu 660 665 670 Asp Ala Asp Leu Ala Ala Thr Phe Ala Pro Val Ala Glu Ala Leu Asn 675 680 685 Thr Gly Ala Ala Asp Ile Asp Ala Ala Leu Leu Ala Val Gln Gly Gly 690 695 700 Ala Thr Asp Leu Gly Gly Tyr Tyr Ser Pro Asn Glu Glu Lys Leu Thr 705 710 715 720 Asn Ile Met Arg Pro Val Ala Gln Phe Asn Glu Ile Val Asp Ala Leu 725 730 735 Lys Lys Leu Glu His His His His His His 740 745 <210> 2 <211> 749 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AvIDH protein <400> 2 Met Ser Thr Pro Lys Ile Ile Tyr Thr Leu Thr Asp Glu Ala Pro Ala 1 5 10 15 Leu Ala Thr Tyr Ser Leu Leu Pro Ile Ile Lys Ala Phe Thr Gly Ser 20 25 30 Ser Gly Ile Ala Val Glu Thr Arg Asp Ile Ser Leu Ala Gly Arg Leu 35 40 45 Ile Ala Thr Phe Pro Glu Tyr Leu Thr Asp Thr Gln Lys Ile Ser Asp 50 55 60 Asp Leu Ala Glu Leu Gly Lys Leu Ala Thr Thr Pro Asp Ala Asn Ile 65 70 75 80 Ile Lys Leu Pro Asn Ile Ser Ala Ser Val Pro Gln Leu Lys Ala Ala 85 90 95 Ile Lys Glu Leu Gln Gln Gln Gly Tyr Lys Leu Pro Asp Tyr Pro Glu 100 105 110 Glu Pro Lys Thr Asp Thr Glu Lys Asp Val Lys Ala Arg Tyr Asp Lys 115 120 125 Ile Lys Gly Ser Ala Val Asn Pro Val Leu Arg Glu Gly Asn Ser Asp 130 135 140 Arg Arg Ala Pro Leu Ser Val Lys Asn Tyr Ala Arg Lys His Pro His 145 150 155 160 Lys Met Gly Ala Trp Ser Ala Asp Ser Lys Ser His Val Ala His Met 165 170 175 Asp Asn Gly Asp Phe Tyr Gly Ser Glu Lys Ala Ala Leu Ile Gly Ala 180 185 190 Pro Gly Ser Val Lys Ile Glu Leu Ile Ala Lys Asp Gly Ser Ser Thr 195 200 205 Val Leu Lys Ala Lys Thr Ser Val Gln Ala Gly Glu Ile Ile Asp Ser 210 215 220 Ser Val Met Ser Lys Asn Ala Leu Arg Asn Phe Ile Ala Ala Glu Ile 225 230 235 240 Glu Asp Ala Lys Lys Gln Gly Val Leu Leu Ser Val His Leu Lys Ala 245 250 255 Thr Met Met Lys Val Ser Asp Pro Ile Met Phe Gly Gln Ile Val Ser 260 265 270 Glu Phe Tyr Lys Asp Ala Leu Thr Lys His Ala Glu Val Leu Lys Gln 275 280 285 Ile Gly Phe Asp Val Asn Asn Gly Ile Gly Asp Leu Tyr Ala Arg Ile 290 295 300 Lys Thr Leu Pro Glu Ala Lys Gln Lys Glu Ile Glu Ala Asp Ile Gln 305 310 315 320 Ala Val Tyr Ala Gln Arg Pro Gln Leu Ala Met Val Asn Ser Asp Lys 325 330 335 Gly Ile Thr Asn Leu His Val Pro Ser Asp Val Ile Val Asp Ala Ser 340 345 350 Met Pro Ala Met Ile Arg Asp Ser Gly Lys Met Trp Gly Pro Asp Gly 355 360 365 Lys Leu His Asp Thr Lys Ala Val Ile Pro Asp Arg Cys Tyr Ala Gly 370 375 380 Val Tyr Gln Val Val Ile Glu Asp Cys Lys Gln His Gly Ala Phe Asp 385 390 395 400 Pro Thr Thr Met Gly Ser Val Pro Asn Val Gly Leu Met Ala Gln Lys 405 410 415 Ala Glu Glu Tyr Gly Ser His Asp Lys Thr Phe Gln Ile Pro Ala Asp 420 425 430 Gly Val Val Arg Val Thr Asp Glu Ser Gly Lys Leu Leu Leu Glu Gln 435 440 445 Ser Val Glu Ala Gly Asp Ile Trp Arg Met Cys Gln Ala Lys Asp Ala 450 455 460 Pro Ile Gln Asp Trp Val Lys Leu Ala Val Asn Arg Ala Arg Ala Thr 465 470 475 480 Asn Thr Pro Ala Val Phe Trp Leu Asp Pro Ala Arg Ala His Asp Ala 485 490 495 Gln Val Ile Ala Lys Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Tyr Asp Thr Ser 500 505 510 Gly Leu Asp Ile Arg Ile Leu Ser Pro Val Glu Ala Thr Arg Phe Ser 515 520 525 Leu Ala Arg Ile Arg Glu Gly Lys Asp Thr Ile Ser Val Thr Gly Asn 530 535 540 Val Leu Arg Asp Tyr Leu Thr Asp Leu Phe Pro Ile Met Glu Leu Gly 545 550 555 560 Thr Ser Ala Lys Met Leu Ser Ile Val Pro Leu Met Ser Gly Gly Gly 565 570 575 Leu Phe Glu Thr Gly Ala Gly Gly Ser Ala Pro Lys His Val Gln Gln 580 585 590 Phe Leu Glu Glu Gly Tyr Leu Arg Trp Asp Ser Leu Gly Glu Phe Leu 595 600 605 Ala Leu Ala Ala Ser Leu Glu His Leu Gly Asn Ala Tyr Lys Asn Pro 610 615 620 Lys Ala Leu Val Leu Ala Ser Thr Leu Asp Gln Ala Thr Gly Lys Ile 625 630 635 640 Leu Asp Asn Asn Lys Ser Pro Ala Arg Lys Val Gly Glu Ile Asp Asn 645 650 655 Arg Gly Ser His Phe Tyr Leu Ala Leu Tyr Trp Ala Gln Ala Leu Ala 660 665 670 Ala Gln Thr Glu Asp Lys Glu Leu Gln Ala Gln Phe Thr Gly Ile Ala 675 680 685 Lys Ala Leu Thr Asp Asn Glu Thr Lys Ile Val Gly Glu Leu Ala Ala 690 695 700 Ala Gln Gly Lys Pro Val Asp Ile Ala Gly Tyr Tyr His Pro Asn Thr 705 710 715 720 Asp Leu Thr Ser Lys Ala Ile Arg Pro Ser Ala Thr Phe Asn Ala Ala 725 730 735 Leu Ala Pro Leu Ala Leu Glu His His His His His His 740 745 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CgIDH infusion F <400> 3 gaaggagata tacatatggc taagatcatc tggacccg 38 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CgIDH infusion R <400> 4 gtggtggtgg tgctcgagct tcttcagtgc gtcaacgatc tc 42 <210> 5 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AvIDH infusion F <400> 5 gaaggagata tacatatgtc cacaccgaag attatctata cgc 43 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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1560 acccagctct ccatcgaccg catccgccgt ggcgaggaca ccatctctgt caccggtaac 1620 gttctgcgtg actacaacac cgacctcttc ccaatcctgg agctgggcac ctctgcaaag 1680 atgctgtctg tcgttccttt gatggctggc ggcggactgt tcgagaccgg tgctggtgga 1740 tctgctccta agcacgtcca gcaggttcag gaagaaaacc acctgcgttg ggattccctc 1800 ggtgagttcc tcgcactggc tgagtccttc cgccacgagc tcaacaacaa cggcaacacc 1860 aaggccggcg ttctggctga cgctctggac aaggcaactg agaagctgct gaacgaagag 1920 aagtccccat cccgcaaggt tggcgagatc gacaaccgtg gctcccactt ctggctgacc 1980 aagttctggg ctgacgagct cgctgctcag accgaggacg cagatctggc tgctaccttc 2040 gcaccagtcg cagaagcact gaacacaggc gctgcagaca tcgatgctgc actgctcgca 2100 gttcagggtg gagcaactga ccttggtggc tactactccc ctaacgagga gaagctcacc 2160 aacatcatgc gcccagtcgc acagttcaac gagatcgttg acgcactgaa gaagctcgag 2220 caccaccacc accaccactg a 2241 <210> 8 <211> 2250 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AvIDH polynucleotide <400> 8 atgtccacac cgaagattat ctatacgctc actgatgaag cacccgcact ggcgacttac 60 tctctgcttc 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Claims (22)

  1. 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 또는 아조토박터 비네란디(Azotobacter vinelandii) 유래의 단량체 이소시트레이트 디하이드로게나아제(isocitrate dehydrogenase, IDH) 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, NADPH 재생용 재조합 발현 벡터.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 재조합 발현 벡터는 NADPH 의존적 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는, NADPH 재생용 재조합 발현 벡터.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 아조토박터 비네란디 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 것인, NADPH 재생용 재조합 발현 벡터.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 NADPH 의존적 효소는 디하이드로게나아제(dehydrogenase), 리덕타아제(reductase), 옥시도리덕타아제(oxidoreductase), 트랜스하이드로게나아제(transhydrogenase), 퍼옥시다아제(peroxidase), 옥시게나아제(oxygenase), 모노옥시게나아제(monooxygenase), 플라보독신(flavodoxin) 및 디할로게나아제(dehalogenase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인, NADPH 재생용 재조합 발현 벡터.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 NADPH 의존적 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에 재조합되어 융합되거나, 화학적 링커의 첨가에 의해 연결되는 것인, NADPH 재생용 재조합 발현 벡터.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 화학적 링커는 BS(PEG)5(PEGylated bis(sulfosuccinimidyl) suberate), BS(PEG)9(PEGylated bis(sulfosuccinimidyl) suberate), BS2G-d0(bis(sulfosuccinimidyl) glutarate-d0), BS2G-d4(bis(sulfosuccinimidyl) 2,2,4,4-glutarate-d4), DSBU(disuccinimidyl dibutyric urea), DFDNB(1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene), DMP(dimethyl pimelimidate), DMS(dimethyl suberimidate), DSG(disuccinimidyl glutarate), DSP(dithiobis(succinimidyl) propionate), DSS(disuccinimidyl suberate), DSSO(disuccinimidyl sulfoxide), DST(disuccinimidyl tartarate), DTBP(dimethyl-3,3-dithiobis propionimidate), EGS(ethylene glycol bis(succinimidyl) succinate), TSAT(tris-(succinimidyl) aminotriacetate) 및 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, NADPH 재생용 재조합 발현 벡터.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 NADPH 재생용 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 형질전환체.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli)인, 형질전환체.
  9. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 NADPH 재생용 재조합 발현 벡터를 제작하는 단계;
    상기 재조합 발현 벡터를 형질전환하여 형질전환체를 제작하는 단계;
    상기 형질전환체를 배양하여 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제 또는 아조토박터 비네란디 유래의 이소시트레이트 디하이드로게나아제를 과발현하는 단계; 및
    과발현된 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질의 제조방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 배양은 28 내지 32℃에서 수행되는 것인, 재조합 단백질의 제조방법.
  11. 제 9항의 재조합 단백질의 제조방법을 통해 제조된, 재조합 단백질.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 재조합 단백질은 단량체 형태로 가용성 발현되며, NADPH 의존적 효소와 함께 사용 가능한 것인, 재조합 단백질.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 NADPH 의존적 효소는 디하이드로게나아제, 리덕타아제, 옥시도리덕타아제, 트랜스하이드로게나아제, 퍼옥시다아제, 옥시게나아제, 모노옥시게나아제, 플라보독신 및 디할로게나아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인, 재조합 단백질.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 NADPH 의존적 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에 재조합되어 융합되거나, 화학적 링커에 의해 연결되는 것인, 재조합 단백질.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 화학적 링커는 BS(PEG)5, BS(PEG)9, BS2G-d0, BS2G-d4, DSBU, DFDNB, DMP, DMS, DSG, DSP, DSS, DSSO, DST, DTBP, EGS, TSAT 및 EDC로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 재조합 단백질.
  16. 제 11항의 재조합 단백질을 포함하는, NADPH 재생용 조성물.
  17. 제 11항의 재조합 단백질을 NADPH 의존적 효소 반응계에 첨가하여 NADPH를 재생하는 단계를 포함하는, NADPH 재생방법.
  18. 제 11항의 재조합 단백질을 포함하는, NADPH 재생용 키트.
  19. 제 11항의 재조합 단백질; 및
    시토크롬 P450(cytochrome P450) 단백질을 포함하는,
    기질 하이드록실화용 조성물.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 기질은 오메프라졸, 오메프라졸 설파이드, 에톡시쿠마린 및 니트로페놀로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 기질 하이드록실화용 조성물.
  21. 제 19항의 기질 하이드록실화용 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내(in vitro) 독성검사 방법.
  22. 제 11항의 재조합 단백질과 NADPH 의존적 효소를 동시 발현 또는 융합 발현하여, 목적 기질을 전환하는 방법.
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