CN112375751B - 脂肪酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂肪酶突变体及其应用。其中，该脂肪酶突变体具有SEQ ID NO:1所示序列发生氨基酸突变的序列，发生氨基酸突变的位点包括V154L位点。本发明的脂肪酶突变体实现了蛋白质结构和功能的改变，其在大肠杆菌中表达的可溶性得到了明显的改善、极大提高了酶的催化活性。在实际应用时大大降低了酶的用量、减少了反应体积、降低了后处理的难度，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种脂肪酶突变体及其应用。
背景技术
不少手性酸类、醇类化合物（例如α-取代丙酸类化合物）是具有活性的，是手性药物合成中重要的手性单元。酸、醇和酯类手性药物的拆分一般是首先用化学方法合成相应的甲酯、乙酯或丙酯等的消旋体，然后利用脂肪酶或酯酶进行立体选择性水解从而获得单一对映体构型的手性单元。例如除草剂（R）-α-苯氧基丙酯、抗炎药（S）-苯基丙醇都是通过脂肪酶的立体选择性转化成单一的活性异构体。
脂肪酶具有高度的立体选择性，可以催化手性拆分、制备单一手性醇类、胺类和酯类等有机合成中间体（脂肪酶的固定化及其手性拆分的研究进展[J].应用化工,2011,40(10):1823-1827）。在手性药物合成中，常用的脂肪酶包括猪胰脂肪酶、假丝酵母属脂肪酶、假单胞杆菌属脂肪酶和毛霉属脂肪酶(生物催化剂在手性药物合成中的应用[J].氨基酸和生物资源,2013,35(4):39-42)。
例如：申请公布号为 CN 108642025 A的发明专利申请公开了来源于华根霉脂肪酶的突变体M8A，L10A，D11A，L12A，P17G的比酶活性较野生型酶的比活性提高了1.1-2.4倍，M8A、L10A、T9A的1,3-位置选择性较野生型的酶提高了4.75-5倍。
再如： 申请公布号为CN 109750013 A的发明专利申请公开了一个来源于华根霉脂肪酶的突变体V131N，该突变体具有理想的耐热特性，在50 ℃耐受120 min其相对酶活性大约还有66.12%，而野生型脂肪酶仅仅剩余28.24%，在60 ℃野生脂肪酶相对酶活性剩余一半时的时间大约为60 min，相应突变体仅为25 min。
在工业化生产时，大多数野生型的脂肪酶催化效率低、立体选择性差、稳定性弱，利用基因工程手段将其在常见的工程菌中表达时存在目标蛋白表达量低、可溶性差、催化活性弱等缺点，因此能够真正被广泛应用的脂肪酶并不多。
发明内容
本发明旨在提供一种脂肪酶突变体及其应用，以提高酶的活性。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种脂肪酶突变体。该脂肪酶突变体具有SEQ ID NO: 1所示序列发生氨基酸突变的序列，发生氨基酸突变的位点包括V154L位点。
进一步地，发生氨基酸突变的位点还包括如下任意一个或多个：Q11L、T40S、T44S、Q23L、M72A、W113A、D134H/T/N、T138R、L140V/W/M/A/I、A141I/L/Q/T/V、P143A/G/I、L144G/H/P/R/S/T/D/A、L147P、S150N、P152L、S153P/T、V154K、T186A、I189L、V190I/T/Y/A、V221A、T256A、T259A、E269D、A281P、I285M/V/L/A、G307C、C311L、T316A，其中“/”表示“或”。
进一步地，发生氨基酸突变的位点包括如下任一种组合突变位点：V154L+I189L、V154L+L144G+L140V、V154L+P143A+L147P、V154L+I189L+L144G、V154L+I189L+L144G+L140V、V154L+I189L+L144G+L140W、V154L+I189L+L144G+L140M、V154L+I189L+L144G+I285M、V154L+I189L+L144G+I285V、V154L+I189L+L144G+L140V+I285M、V154L+I189L+L144G+L140V+I285V、V154L+I189L+L144G+P143A+L147P、V154L+I189L+L144G+L140V+P143A+L147P、V154L+I189L+L144G+T259A+V221A、V154L+I189L+L144G+Q23L+S150N、V154L+I189L+L144H、V154L+I189L+L144H+L140V、V154L+I189L+L144H+L140V+P143A+L147P、V154L+I189L+L144R+L140V、V154L+I189L+L144R+L140V+P143A+L147P、V154L+I189L+L144G+T40S、V154L+I189L+L144G+M72A、V154L+I189L+L144G+W113A、V154L+I189L+L144G+T138R、V154L+I189L+L144G+L140A、V154L+I189L+L144G+L140I、V154L+I189L+L144G+A141I 、V154L+I189L+L144G+A141L 、V154L+I189L+L144G+A141Q、V154L+I189L+L144G+A141T、V154L+I189L+L144G+A141V、V154L+I189L+L144G+S153P、V154L+I189L+L144G+S153T、V154L+I189L+L144G+P143G、V154L+I189L+L144G+P143I、V154L+I189L+L144H 、V154L+I189L+L144P、V154L+I189L+L144R、V154L+I189L+L144S、V154L+I189L+L144T、V154K+I189L+L144G、V154M+I189L+L144G、V154L+I189L+L144G+I285L、V154L+I189L+L144G+I285A、V154L+I189L+L144G+D134H+T138R、V154L+I189L+L144T+A141L、V154L+I189L+L144G+S153P+L154K、V154L+I189L+S153T、V154L+I189L+S153P、V154L+I189L+D134T+T138R、V154L+I189L+D134N+T138R、V154L+I189L+D134+T138R、V154L+I189L+V190I、V154L+I189L+V190T、V154L+I189L+V190Y、V154L+I189L+V190A、V154L+I189L+A141L+L144T、V154L+I189L+A141V+L144D、V154L+I189L+A141Q+L144P、V154L+I189L+A141I+L144G、V154L+I189L+A141I+L144H、V154L+I189L+L144A、V154L+I189L+A281P、V154L+I189L+L144G+T256A、V154L+I189L+L144G+T186A、V154L+I189L+L144G+E269D、V154L+I189L+L144G+G307C+C311L+T316A、V154L+I189L+L144G+T44S、V154L+I189L+L144G+P152L、V154L+I189L+L144G+Q11L+Q73H、V154L+I189L+L144G+T259A+V221A或V154L+I189L+L144R+P143A+L147P。
根据本发明的另一个方面，提供一种DNA分子。该DNA分子编码上述任一种脂肪酶突变体。
根据本发明的再一个方面，提供一种重组质粒。该重组质粒连接有上述任一种DNA分子。
进一步地，重组质粒所用的载体为pET-22a（+）、pET-22b（+）、pET-3a（+）、pET-3d（+）、pET-11a（+）、pET-12a（+）、pET-14b、pET-15b（+）、pET-16b（+）、pET-17b（+）、pET-19b（+）、pET-20b（+）、pET-21a（+）、pET-23a（+）、pET-23b（+）、pET-24a（+）、pET-25b（+）、pET-26b（+）、pET-27b（+）、pET-28a（+）、pET-29a（+）、pET-30a（+）、pET-31b（+）、pET-32a（+）、pET-35b（+）、pET-38b（+）、pET-39b（+）、pET-40b（+）、pET-41a（+）、pET-41b（+）、pET-42a（+）、pET-43a（+）、pET-43b（+）、pET-44a（+）、pET-49b（+）、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-8、pUC-18或pUC-19。
根据本发明的又一个方面，提供一种宿主细胞。该宿主细胞含有上述任一种重组质粒。
进一步地，宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；优选原核细胞为大肠杆菌BL21（DE3）细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞，真核细胞为酵母。
根据本发明的再一个方面，提供一种生产手性酸的方法。该方法包括采用脂肪酶对酯类化合物进行催化水解反应的步骤，脂肪酶为上述任一种脂肪酶突变体。
进一步地，酯类化合物为
，经脂肪酶突变体水解为酸类化合物
和醇类化合物
，其中，R1代表CH3、CH2CH3、CH2-CH2CH3或CHCH3CH3，R2、R3、R4、R5分别独立的代表H、F、Cl、Br、CH3 或CH2CH3；优选的，酯类化合物为
、
、
、
、
或
。
进一步地，脂肪酶突变体催化水解反应的pH为6.5~8.5，反应温度为20~37℃，反应体积为10~50倍底物用量体积，单位为mg:μL；优选的，脂肪酶突变体催化水解反应的pH为8.5，反应温度为30℃，反应体积为10倍底物用量体积（mg:μL）。
本发明的脂肪酶突变体实现了蛋白质结构和功能的改变，其在大肠杆菌中表达的可溶性得到了明显的改善、极大提高了酶的催化活性。在实际应用时大大降低了酶的用量、减少了反应体积、降低了后处理的难度，适合工业化生产。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
本发明通过定向进化的方法提高脂肪酶的特异性，降低脂肪酶的使用量。本发明的模板氨基酸（Pseudomonas putida）的序列为SEQ ID NO：1（MLPSGSDPAFSQPKSVLDAG LTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLGYTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSIRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTTNLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSALRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLMPYARPFAVGKRTCSGIVTP），对应的核苷酸序列为SEQ ID NO：2（ATGCTGCCGAGTGGCAGTGACCCGGCGTTTAGTCAGCCG AAGAGCGTGCTCGATGCCGGTCTGACGTGTCAAGGCGCCAGTCCAAGCAGCGTTAGCAAACCGATTCTGCTGGTTCCGGGCACCGGTACCACGGGCCCGCAGAGCTTCGACAGCAACTGGATTCCGCTGAGTACCCAACTGGGCTACACGCCGTGCTGGATCAGTCCACCACCGTTCATGCTGAACGACACCCAAGTTAACACGGAGTACATGGTGAATGCGATCACCGCGCTGTACGCCGGCAGTGGTAACAATAAACTGCCGGTGCTCACGTGGAGTCAAGGCGGTCTGGTGGCCCAATGGGGTCTGACCTTCTTCCCGAGTATCCGCAGCAAAGTGGACCGTCTGATGGCGTTCGCCCCGGACTACAAAGGCACCGTTCTGGCCGGTCCACTGGATGCGCTGGCCGTTAGTGCCCCGAGCGTTTGGCAGCAGACGACCGGTAGTGCGCTGACCACCGCCCTCCGTAATGCGGGTGGTCTGACCCAAATCGTGCCGACGACCAATCTGTATAGCGCCACGGACGAGATTGTGCAGCCACAAGTTAGCAATAGCCCGCTGGACAGCAGCTACCTCTTCAATGGCAAAAACGTGCAAGCCCAAGCCGTTTGTGGTCCGCTGTTCGTTATCGATCACGCCGGTAGTCTGACGAGCCAGTTCAGCTATGTGGTTGGTCGCAGTGCGCTGCGTAGCACCACCGGTCAAGCCCGTAGCGCCGATTACGGCATTACCGACTGCAACCCGCTGCCAGCCAACGATCTGACCCCAGAACAGAAAGTTGCGGCCGCGGCGCTGCTGGCGCCAGCCGCGGCCGCCATTGTTGCCGGCCCGAAACAGAATTGCGAACCGGATCTGATGCCGTACGCGCGTCCATTCGCCGTGGGCAAACGCACGTGCAGCGGTATTGTTACCCCGTAA）。
首先通过定点突变的方式在脂肪酶上引入突变位点，对突变体进行特异性检测，挑选特异性提高的突变体。其中突变体V154L相较于起始模板特异性提高幅度较大。后续，以V154L为模板继续进行突变，以期得到催化活性提高的突变体。
其中，定点突变：是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
利用全质粒 PCR 引入定点突变的方法简单有效，是目前使用比较多的手段。其原理是，一对包含突变位点的引物（正、反向），和模板质粒退火后用聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物 5’ 端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。Dpn I酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对 Dpn I敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。将突变质粒转化至大肠杆菌细胞内，然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶。
上述得将突变质粒转化至大肠杆菌细胞内，在大肠杆菌中过量表达。然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶。脂肪酶诱导表达最佳条件：25 oC，0.1 mM IPTG 诱导16 h。
通过采用软件对脂肪酶的三维结构进行计算机模拟分析，发现本发明进行突变的位点均是位于底物结合位点附近的。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种脂肪酶突变体。该脂肪酶突变体具有SEQ ID NO: 1所示序列发生氨基酸突变的序列，发生氨基酸突变的位点包括V154L位点。
优选的，发生氨基酸突变的位点还包括如下任意一个或多个：Q11L、T40S、T44S、Q23L、M72A、W113A、D134H/T/N、T138R、L140V/W/M/A/I、A141I/L/Q/T/V、P143A/G/I、L144G/H/P/R/S/T/D/A、L147P、S150N、P152L、S153P/T、V154K、T186A、I189L、V190I/T/Y/A、V221A、T256A、T259A、E269D、A281P、I285M/V/L/A、G307C、C311L、T316A，其中“/”表示“或”。
更优选的，发生氨基酸突变的位点包括如下任一种组合突变位点：V154L+I189L、V154L+L144G+L140V、V154L+P143A+L147P、V154L+I189L+L144G、V154L+I189L+L144G+L140V、V154L+I189L+L144G+L140W、V154L+I189L+L144G+L140M、V154L+I189L+L144G+I285M、V154L+I189L+L144G+I285V、V154L+I189L+L144G+L140V+I285M、V154L+I189L+L144G+L140V+I285V、V154L+I189L+L144G+P143A+L147P、V154L+I189L+L144G+L140V+P143A+L147P、V154L+I189L+L144G+T259A+V221A、V154L+I189L+L144G+Q23L+S150N、V154L+I189L+L144H、V154L+I189L+L144H+L140V、V154L+I189L+L144H+L140V+P143A+L147P、V154L+I189L+L144R+L140V、V154L+I189L+L144R+L140V+P143A+L147P、V154L+I189L+L144G+T40S、V154L+I189L+L144G+M72A、V154L+I189L+L144G+W113A、V154L+I189L+L144G+T138R、V154L+I189L+L144G+L140A、V154L+I189L+L144G+L140I、V154L+I189L+L144G+A141I 、V154L+I189L+L144G+A141L 、V154L+I189L+L144G+A141Q、V154L+I189L+L144G+A141T、V154L+I189L+L144G+A141V、V154L+I189L+L144G+S153P、V154L+I189L+L144G+S153T、V154L+I189L+L144G+P143G、V154L+I189L+L144G+P143I、V154L+I189L+L144H 、V154L+I189L+L144P、V154L+I189L+L144R、V154L+I189L+L144S、V154L+I189L+L144T、V154K+I189L+L144G、V154M+I189L+L144G、V154L+I189L+L144G+I285L、V154L+I189L+L144G+I285A、V154L+I189L+L144G+D134H+T138R、V154L+I189L+L144T+A141L、V154L+I189L+L144G+S153P+L154K、V154L+I189L+S153T、V154L+I189L+S153P、V154L+I189L+D134T+T138R、V154L+I189L+D134N+T138R、V154L+I189L+D134+T138R、V154L+I189L+V190I、V154L+I189L+V190T、V154L+I189L+V190Y、V154L+I189L+V190A、V154L+I189L+A141L+L144T、V154L+I189L+A141V+L144D、V154L+I189L+A141Q+L144P、V154L+I189L+A141I+L144G、V154L+I189L+A141I+L144H、V154L+I189L+L144A、V154L+I189L+A281P、V154L+I189L+L144G+T256A、V154L+I189L+L144G+T186A、V154L+I189L+L144G+E269D、V154L+I189L+L144G+G307C+C311L+T316A、V154L+I189L+L144G+T44S、V154L+I189L+L144G+P152L、V154L+I189L+L144G+Q11L+Q73H、V154L+I189L+L144G+T259A+V221A或V154L+I189L+L144R+P143A+L147P。
本发明的脂肪酶突变体实现了蛋白质结构和功能的改变，其在大肠杆菌中表达的可溶性得到了明显的改善、极大提高了酶的催化活性。在实际应用时大大降低了酶的用量、减少了反应体积、降低了后处理的难度，适合工业化生产。
本发明的脂肪酶突变体是在SEQ ID NO：1所示的脂肪酶的基础上，通过定点突变的方法进行突变，从而改变其氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到具有上述突变位点的脂肪酶，因此这些脂肪酶突变体具有酶特异性大幅度提高的优势，并且酶活性也有相应提高，从而大幅度降低了酶的使用量，降低了工业生产中的成本。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种DNA分子。上述DNA编码得到的脂肪酶，提高了酶活性和酶的稳定性，在氨基酸的工业生产中可以减少加入的酶量，降低后处理难度。
本发明的上述DNA分子还可以以“表达盒”的形式存在。“表达盒”是指线性或环状的核酸分子，涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的DNA和RNA序列。一般而言，包括与目标核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋白，但在正义或反义方向也编码目标功能RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目标多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但以用于异源表达的有效重组形成获得的。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种重组质粒。该重组质粒含有上述任一种DNA分子。上述重组质粒中的DNA分子置于重组质粒的适当位置，使得上述DNA分子能够正确地、顺利地复制、转录或表达。
虽然本发明在限定上述DNA分子时所用限定语为“含有”，但其并不意味着可以在DNA序列的两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在DNA序列的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定将不能真实地覆盖这些情形。
本发明中所使用的术语“质粒”包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，优选为重组表达质粒，可以是原核表达质粒也可以是真核表达质粒，但优选原核表达质粒，在某些实施方案中，重组质粒所用的载体选自pET-22a（+）、pET-22b（+）、pET-3a（+）、pET-3d（+）、pET-11a（+）、pET-12a（+）、pET-14b、pET-15b（+）、pET-16b（+）、pET-17b（+）、pET-19b（+）、pET-20b（+）、pET-21a（+）、pET-23a（+）、pET-23b（+）、pET-24a（+）、pET-25b（+）、pET-26b（+）、pET-27b（+）、pET-28a（+）、pET-29a（+）、pET-30a（+）、pET-31b（+）、pET-32a（+）、pET-35b（+）、pET-38b（+）、pET-39b（+）、pET-40b（+）、pET-41a（+）、pET-41b（+）、pET-42a（+）、pET-43a（+）、pET-43b（+）、pET-44a（+）、pET-49b（+）、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-8、pUC-18或pUC-19。更优选，上述重组质粒是pET-22b（+）。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种宿主细胞，宿主细胞含有上述任一种重组质粒。适用于本发明的宿主细胞包括但不仅限于原核细胞或真核细胞。优选原核细胞为大肠杆菌BL21（DE3）细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞，真核细胞为酵母。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种生产手性酸的方法。该方法包括采用脂肪酶对酯类化合物进行催化水解反应的步骤，脂肪酶为上述任一种脂肪酶突变体。由于本发明的上述脂肪酶具有更好的特异性，甚至更高的酶催化活性，因而利用本发明的脂肪酶突变体制备手性酸不仅能够降低生产成本，而且所获得的氨基酸ee值更高。
酯类化合物为
，经脂肪酶突变体水解为酸类化合物
和醇类化合物
，其中，R1代表CH3、CH2CH3、CH2-CH2CH3或CHCH3CH3，R2、R3、R4、R5分别独立的代表H、F、Cl、Br、CH3 或CH2CH3。
根据本发明一种典型的实施方式，酯类化合物为
、
、
、
、
或
。
突变体催化酯类反应，在不同的反应条件下的转化率各不相同，突变体pH在包含但不限于pH6.5、pH7.5和pH8.5下均有较好的催化反应，优选的pH8.5是突变体最适的pH条件；随着反应温度的升高，突变体在20℃、30℃、37℃下催化活性是逐渐提高的，鉴于该类反应底物大多数在37℃时可能具有明显挥发，因此优选的30 ℃是较为适宜的反应温度；突变体在不同的反应体积，包含但不限于50体积/25体积/10体积下酶催化活性差异不大，但体积越小越有利于后处理，越符合工业化生产的需求，因此优选的10 V是更合理的反应体积。
下面将结合具体的实施例进一步说明本发明的有益效果。
底物1 底物2 底物3
底物4 底物5 底物6
实施例1
各自取20 mg底物1/底物2/底物3，向反应体系中依次加入2 mg重悬的脂肪酶或其突变体的菌泥、0.1 M pH 8.5 Tris-Cl Buffer补充至体系500μL，200 rpm，在30 ℃下恒温反应16 h。向体系中加入2倍体积（1 mL）的乙腈，充分均匀，12000 rpm离心3 min，观察是否有分层，如有分层，需要补加乙腈：纯化水=1：1的混合液直至无分层，最后取200μL离心的上清到400μL的乙腈：纯化水=1：1的混合液中，混匀后送样HPLC检测转化率。部分突变体反应特性如下表1（同时附有蛋白表达的可溶性情况）：
表1
与母本（-）为对照，活性提高的倍数用+表示，+表示提高10-50倍，++表示提高50-100倍，+++表示提高了100-200倍及以上。
“*”表示蛋白在大肠杆菌中表达的可溶性，菌体超声破碎后蛋白在离心的上清和沉淀中的分布比例：*表示比例在1：10到1：5；**表示比例在1：4到1：1；***表示比例在1：1到2：1；****表示比例在2：1到4：1。
实施例2
各自取20 mg底物1/底物4，向反应体系中依次加入2 mg重悬的脂肪酶或其突变体的菌泥、0.1 M pH 8.5 Tris-Cl Buffer补充至体系500μL，200 rpm，在30 ℃下恒温反应16h。向体系中加入2倍体积（1 mL）的乙腈，充分均匀，12000 rpm离心3 min，观察是否有分层，如有分层，需要补加乙腈：纯化水=1：1的混合液直至无分层，最后取200μL离心的上清到400μL的乙腈：纯化水=1：1的混合液中，混匀后送样HPLC检测转化率。部分突变体反应特性如下表2：
表2
与母本（-）为对照，活性提高的倍数用+表示，+表示提高50-100倍，++表示提高100-200倍，+++表示提高了200-400倍，++++表示提高了400倍以上。
实施例3
各自取20 mg底物1/底物2/底物3/底物4/底物5/底物6，向反应体系中依次加入2mg重悬的脂肪酶或一部分突变体的菌泥、0.1 M pH 8.5 Tris-Cl Buffer补充至体系500μL，200 rpm，在30 ℃下恒温反应16 h。向体系中加入2倍体积（1 mL）的乙腈，充分均匀，12000 rpm离心3 min，观察是否有分层，如有分层，需要补加乙腈：纯化水=1：1的混合液直至无分层，最后取200μL离心的上清到400μL的乙腈：纯化水=1：1的混合液中，混匀后送样HPLC检测转化率。部分突变体反应特性如下表3：
表3
与母本（-）为对照，活性提高的倍数用+表示，+表示提高50-100倍，++表示提高100-200倍，+++表示提高了200-400倍，++++表示提高了400倍以上。
实施例4
各自取20 mg/100 mg/1 g的底物2/底物5/底物6，向反应体系中依次加入相当于0.1 wt（质量比）脂肪酶或其突变体的菌泥、0.1 M pH 8.5 Tris-Cl Buffer补充至体系25V，200 rpm，在30 ℃下恒温反应16 h。向体系中加入2倍反应体积的乙腈，充分均匀，12000rpm离心3 min，观察是否有分层，如有分层，需要补加乙腈：纯化水=1：1的混合液直至无分层，最后取200μL离心的上清到400μL的乙腈：纯化水=1：1的混合液中，混匀后送样HPLC检测转化率。选择较好的3个突变体从20 mg到100 mg再到1 g逐级放大，其转化活性与母本相比均得到了明显的提升，具体反应特性如下表4：
表4
与母本（-）为对照，活性提高的倍数用+表示，+表示提高50-100倍，++表示提高100-200倍，+++表示提高了200-400倍，++++表示提高了400倍以上。
实施例5
各自取20 mg的底物2/底物5，向反应体系中依次加入相当于2 mg的重悬的脂肪酶或其突变体的菌泥、加0.1 M的不同pH Tris-Cl Buffer（pH 6.6/7.5/8.5）、做了不同的反应体积50 V/25 V/10 V 以及设置了20 ℃/30 ℃/37 ℃等不同温度，200 rpm反应16 h。向体系中加入2倍体积的乙腈，充分均匀，12000 rpm离心3 min，观察是否有分层，如有分层，需要补加乙腈：纯化水=1：1的混合液直至无分层，最后取200μL离心的上清到400μL的乙腈：纯化水=1：1的混合液中，混匀后送样HPLC检测转化率。从这3个突变体在不同反应条件下对2种底物的转化结果来看：pH8.5是较好的反应pH值；催化反应随着温度的增加在加快，但鉴于该类反应底物大多数在37 ℃时可能具有明显挥发，因此30 ℃是较为适宜的反应温度；不同的反应体积（50 V/25 V/10 V）转化活性差异不大，体积越小越有利于后处理，越符合工业化生产的需求。具体反应特性如下表5：
表5
与母本（-）为对照，活性提高的倍数用+表示，+表示提高50-100倍，++表示提高100-200倍，+++表示提高了200-400倍，++++表示提高了400倍以上。
实施例6
各自取20 mg底物1/底物2/底物3/底物4/底物5/底物6，向反应体系中依次加入2mg重悬的脂肪酶或一部分突变体的菌泥、0.1 M pH 8.5 Tris-Cl Buffer补充至体系500μL，200 rpm，在30 ℃下恒温反应16 h。向反应体系中加入6 M 盐酸调pH在2-3之间，加入1mL乙酸乙酯（EA）充分萃取反应，12000 rpm离心10 min，上清用无水硫酸镁除水后，12000rpm离心10min，再取上清，送GC检测。产品的ee值是工业化生产过程中非常重要的指标，本专利在对蛋白的氨基酸序列进行改造、大幅度提高活性的同时应最大限度的保证了产品的ee值，而且ee值在保持稳定的同时还略有提升，至少没有下降。一些突变体具体反应特性如下表6：
表6
*表示ee值在97%-99%，**表示ee值＞99%。
本发明经过了大量的实验验证，底物的用量逐步增大，最终证明了本发明的脂肪酶突变体催化反应的转化率由最初的＜0.5%提高至96%甚至达到了99%，而且产品的ee值绝大部分保持＞99%（少量ee值在97%-99%之间），极大的缩短了生产的周期、降低了人力和物力成本。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 凯莱英生命科学技术（天津）有限公司
<120> 脂肪酶突变体及其应用
<130> PN142100KLY
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 318
<212> PRT
<213> Pseudomonas putida
<400> 1
Met Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val
1 5 10 15
Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser
20 25 30
Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser
35 40 45
Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Thr Pro
50 55 60
Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn
65 70 75 80
Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Gly Ser Gly
85 90 95
Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala
100 105 110
Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg
115 120 125
Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro
130 135 140
Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr
145 150 155 160
Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln
165 170 175
Ile Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln
180 185 190
Pro Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly
195 200 205
Lys Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp
210 215 220
His Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser
225 230 235 240
Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile
245 250 255
Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys
260 265 270
Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala
275 280 285
Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro
290 295 300
Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro
305 310 315
<210> 2
<211> 957
<212> DNA
<213> Pseudomonas putida
<400> 2
atgctgccga gtggcagtga cccggcgttt agtcagccga agagcgtgct cgatgccggt 60
ctgacgtgtc aaggcgccag tccaagcagc gttagcaaac cgattctgct ggttccgggc 120
accggtacca cgggcccgca gagcttcgac agcaactgga ttccgctgag tacccaactg 180
ggctacacgc cgtgctggat cagtccacca ccgttcatgc tgaacgacac ccaagttaac 240
acggagtaca tggtgaatgc gatcaccgcg ctgtacgccg gcagtggtaa caataaactg 300
ccggtgctca cgtggagtca aggcggtctg gtggcccaat ggggtctgac cttcttcccg 360
agtatccgca gcaaagtgga ccgtctgatg gcgttcgccc cggactacaa aggcaccgtt 420
ctggccggtc cactggatgc gctggccgtt agtgccccga gcgtttggca gcagacgacc 480
ggtagtgcgc tgaccaccgc cctccgtaat gcgggtggtc tgacccaaat cgtgccgacg 540
accaatctgt atagcgccac ggacgagatt gtgcagccac aagttagcaa tagcccgctg 600
gacagcagct acctcttcaa tggcaaaaac gtgcaagccc aagccgtttg tggtccgctg 660
ttcgttatcg atcacgccgg tagtctgacg agccagttca gctatgtggt tggtcgcagt 720
gcgctgcgta gcaccaccgg tcaagcccgt agcgccgatt acggcattac cgactgcaac 780
ccgctgccag ccaacgatct gaccccagaa cagaaagttg cggccgcggc gctgctggcg 840
ccagccgcgg ccgccattgt tgccggcccg aaacagaatt gcgaaccgga tctgatgccg 900
tacgcgcgtc cattcgccgt gggcaaacgc acgtgcagcg gtattgttac cccgtaa 957
Claims (12)
1.一种脂肪酶突变体，其特征在于，所述脂肪酶突变体与SEQ ID NO: 1相比仅在如下位点发生突变，所述位点为V154L、V154L+I189L、V154L+L144G+L140V、V154L+P143A+L147P、V154L+I189L+L144G、V154L+I189L+L144G+L140V、V154L+I189L+L144G+L140W、V154L+I189L+L144G+L140M、V154L+I189L+L144G+I285M、V154L+I189L+L144G+I285V、V154L+I189L+L144G+L140V+I285M、V154L+I189L+L144G+L140V+I285V、V154L+I189L+L144G+P143A+L147P、V154L+I189L+L144G+L140V+P143A+L147P、V154L+I189L+L144G+T259A+V221A、V154L+I189L+L144G+Q23L+S150N、V154L+I189L+L144H、V154L+I189L+L144H+L140V、V154L+I189L+L144H+L140V+P143A+L147P、V154L+I189L+L144R+L140V、V154L+I189L+L144R+L140V+P143A+L147P、V154L+I189L+L144G+T40S、V154L+I189L+L144G+M72A、V154L+I189L+L144G+W113A、V154L+I189L+L144G+T138R、V154L+I189L+L144G+L140A、V154L+I189L+L144G+L140I、V154L+I189L+L144G+A141I 、V154L+I189L+L144G+A141L 、V154L+I189L+L144G+A141Q、V154L+I189L+L144G+A141T、V154L+I189L+L144G+A141V、V154L+I189L+L144G+S153P、V154L+I189L+L144G+S153T、V154L+I189L+L144G+P143G、V154L+I189L+L144G+P143I、V154L+I189L+L144H 、V154L+I189L+L144P、V154L+I189L+L144R、V154L+I189L+L144S、V154L+I189L+L144T、V154K+I189L+L144G、V154M+I189L+L144G、V154L+I189L+L144G+I285L、V154L+I189L+L144G+I285A、V154L+I189L+L144G+D134H+T138R、V154L+I189L+L144T+A141L、V154L+I189L+L144G+S153P+L154K、V154L+I189L+S153T、V154L+I189L+S153P、V154L+I189L+D134T+T138R、V154L+I189L+D134N+T138R、V154L+I189L+D134+T138R、V154L+I189L+V190I、V154L+I189L+V190T、V154L+I189L+V190Y、V154L+I189L+V190A、V154L+I189L+A141L+L144T、V154L+I189L+A141V+L144D、V154L+I189L+A141Q+L144P、V154L+I189L+A141I+L144G、V154L+I189L+A141I+L144H、V154L+I189L+L144A、V154L+I189L+A281P、V154L+I189L+L144G+T256A、V154L+I189L+L144G+T186A、V154L+I189L+L144G+E269D、V154L+I189L+L144G+G307C+C311L+T316A、V154L+I189L+L144G+T44S、V154L+I189L+L144G+P152L、V154L+I189L+L144G+Q11L+Q73H、V154L+I189L+L144G+T259A+V221A或V154L+I189L+L144R+P143A+L147P。
2.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1所述的脂肪酶突变体。
3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒连接有权利要求2所述的DNA分子。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒所用的载体为pET-22a（+）、pET-22b（+）、pET-3a（+）、pET-3d（+）、pET-11a（+）、pET-12a（+）、pET-14b、pET-15b（+）、pET-16b（+）、pET-17b（+）、pET-19b（+）、pET-20b（+）、pET-21a（+）、pET-23a（+）、pET-23b（+）、pET-24a（+）、pET-25b（+）、pET-26b（+）、pET-27b（+）、pET-28a（+）、pET-29a（+）、pET-30a（+）、pET-31b（+）、pET-32a（+）、pET-35b（+）、pET-38b（+）、pET-39b（+）、pET-40b（+）、pET-41a（+）、pET-41b（+）、pET-42a（+）、pET-43a（+）、pET-43b（+）、pET-44a（+）、pET-49b（+）、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-8、pUC-18或pUC-19。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3或4所述的重组质粒。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述原核细胞为大肠杆菌BL21（DE3）细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞，所述真核细胞为酵母。
8.一种生产手性酸的方法，包括采用脂肪酶对酯类化合物进行催化水解反应的步骤，其特征在于，所述脂肪酶为权利要求1所述的脂肪酶突变体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述酯类化合物为
，经所述脂肪酶突变体水解为酸类化合物
和醇类化合物
，其中，R1代表CH3、CH2CH3、CH2-CH2CH3或CHCH3CH3，R2、R3、R4、R5分别独立的代表H、F、Cl、Br、CH3 或CH2CH3。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述酯类化合物为
、
、
、
、
或
。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶突变体催化水解反应的pH为6.5~8.5，反应温度为20~37℃，反应体积为10~50倍底物用量体积，单位为mg:μL。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶突变体催化水解反应的pH为8.5，反应温度为30℃，反应体积为10倍底物用量体积，单位为mg:μL。
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