JPH09275982A - エステル分解酵素遺伝子およびそれを用いるエステル分解酵素の製造法 - Google Patents
エステル分解酵素遺伝子およびそれを用いるエステル分解酵素の製造法Info
- Publication number
- JPH09275982A JPH09275982A JP8091571A JP9157196A JPH09275982A JP H09275982 A JPH09275982 A JP H09275982A JP 8091571 A JP8091571 A JP 8091571A JP 9157196 A JP9157196 A JP 9157196A JP H09275982 A JPH09275982 A JP H09275982A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- esterase
- enzyme
- gene
- amino acid
- mutation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
(57)【要約】
【課題】 Klebsiella oxytoca SNSM-87株の、高い光学
選択性能をもつエステル分解酵素を、安価で大量に供給
できる方法を提供すること 【解決手段】 新規エステル分解酵素遺伝子をクローニ
ングし、このエステル分解酵素を発現する発現ベクター
を構築し、これを微生物に導入することによって、組換
え微生物にエステル分解酵素を大量生産させ、高い光学
選択性能をもつエステル分解酵素を安価に生産する。
選択性能をもつエステル分解酵素を、安価で大量に供給
できる方法を提供すること 【解決手段】 新規エステル分解酵素遺伝子をクローニ
ングし、このエステル分解酵素を発現する発現ベクター
を構築し、これを微生物に導入することによって、組換
え微生物にエステル分解酵素を大量生産させ、高い光学
選択性能をもつエステル分解酵素を安価に生産する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本願発明は、新規なエステル
分解酵素、特に光学異性体を有するエステルを選択的に
加水分解する新規酵素、このエステル分解酵素をコード
する遺伝子、このエステル分解酵素を発現する発現ベク
ター、およびこのエステル分解酵素の製造方法に関す
る。
分解酵素、特に光学異性体を有するエステルを選択的に
加水分解する新規酵素、このエステル分解酵素をコード
する遺伝子、このエステル分解酵素を発現する発現ベク
ター、およびこのエステル分解酵素の製造方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】生物学的に活性な多くの化合物に光学異
性体が存在することは広く知られている。また生物学的
活性は、通常一方の光学異性体のみに存在し、他方の光
学異性体は所望の生物学的活性を発現しないか、あるい
は毒性を発現するなどの好ましくない生理作用をもつこ
とが知られている。従って、特定の光学異性体が生物学
的に活性な場合、通常、その有用な特定の光学異性体を
分離し、単離して使用する。しかし、特定の光学異性体
のみを選択的に分割する適切な方法がない場合、その光
学異性体の混合物を分割することなく農業及び医薬品な
どの用途に用いられているのが現状である。この場合、
混合物の生物学的活性は半減したり、混合物が毒性を発
現し、望ましくない生理作用をもつことがある。
性体が存在することは広く知られている。また生物学的
活性は、通常一方の光学異性体のみに存在し、他方の光
学異性体は所望の生物学的活性を発現しないか、あるい
は毒性を発現するなどの好ましくない生理作用をもつこ
とが知られている。従って、特定の光学異性体が生物学
的に活性な場合、通常、その有用な特定の光学異性体を
分離し、単離して使用する。しかし、特定の光学異性体
のみを選択的に分割する適切な方法がない場合、その光
学異性体の混合物を分割することなく農業及び医薬品な
どの用途に用いられているのが現状である。この場合、
混合物の生物学的活性は半減したり、混合物が毒性を発
現し、望ましくない生理作用をもつことがある。
【０００３】この問題を克服するために、光学異性体の
分割法が種々検討されている。それらの方法の一つとし
て、光学異性体の混合物の各種エステル誘導体を調製
し、該エステル誘導体に対して光学選択的にエステルを
加水分解する酵素を作用させ、反応系の溶媒に対する溶
解度の差を利用して分離する方法がある。このエステル
化した光学異性体を高い光学選択性で加水分解するエス
テル分解酵素を生産するKlebsiella oxytoca SNSM-87株
が選抜されている（特開平6-14772）。しかし、この菌
株のエステル分解酵素生産能力は低く、工業規模での利
用は、コスト、純度などの点で困難であった。従って、
光学選択性の高いエステル分解酵素を大量に供給し、特
定の光学異性体を効率よく生産する方法が望まれてい
る。
分割法が種々検討されている。それらの方法の一つとし
て、光学異性体の混合物の各種エステル誘導体を調製
し、該エステル誘導体に対して光学選択的にエステルを
加水分解する酵素を作用させ、反応系の溶媒に対する溶
解度の差を利用して分離する方法がある。このエステル
化した光学異性体を高い光学選択性で加水分解するエス
テル分解酵素を生産するKlebsiella oxytoca SNSM-87株
が選抜されている（特開平6-14772）。しかし、この菌
株のエステル分解酵素生産能力は低く、工業規模での利
用は、コスト、純度などの点で困難であった。従って、
光学選択性の高いエステル分解酵素を大量に供給し、特
定の光学異性体を効率よく生産する方法が望まれてい
る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本願発明は上記の問題
を解決するためのものであり、その目的とするところ
は： （１）エステル分解酵素をコードする遺伝子をクローン
化した後、高発現可能な発現ベクターに挿入したもの
を、微生物などの適切な宿主に導入することにより、上
記エステル分解酵素を生産する組換え体を得ること； （２）得られた組換え体を適切な条件で培養して、上記
エステル分解酵素の生産効率を向上させること；およ
び、 （３）組換え体培養液から効率良く、高純度でエステル
分解酵素を精製して、同酵素を安価にかつ大量に供給す
ること；にある。
を解決するためのものであり、その目的とするところ
は： （１）エステル分解酵素をコードする遺伝子をクローン
化した後、高発現可能な発現ベクターに挿入したもの
を、微生物などの適切な宿主に導入することにより、上
記エステル分解酵素を生産する組換え体を得ること； （２）得られた組換え体を適切な条件で培養して、上記
エステル分解酵素の生産効率を向上させること；およ
び、 （３）組換え体培養液から効率良く、高純度でエステル
分解酵素を精製して、同酵素を安価にかつ大量に供給す
ること；にある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本願発明は、配列表の配
列番号１で示されるアミノ酸配列中の１またはそれ以上
のアミノ酸の欠失、置換、あるいは付加による変異を含
むアミノ酸配列を有するエステル分解酵素であって、該
変異を含むエステル分解酵素が、該変異を含まないエス
テル分解酵素と同等またはそれ以上の比活性を有する、
エステル分解酵素に関する。
列番号１で示されるアミノ酸配列中の１またはそれ以上
のアミノ酸の欠失、置換、あるいは付加による変異を含
むアミノ酸配列を有するエステル分解酵素であって、該
変異を含むエステル分解酵素が、該変異を含まないエス
テル分解酵素と同等またはそれ以上の比活性を有する、
エステル分解酵素に関する。
【０００６】本願発明は、また配列表の配列番号２で示
されるアミノ酸配列中の１またはそれ以上のアミノ酸の
欠失、置換、あるいは付加による変異を含むアミノ酸配
列を有するエステル分解酵素であって、該変異を含むエ
ステル分解酵素が、該変異を含まないエステル分解酵素
と同等またはそれ以上の比活性を有する、エステル分解
酵素に関する。
されるアミノ酸配列中の１またはそれ以上のアミノ酸の
欠失、置換、あるいは付加による変異を含むアミノ酸配
列を有するエステル分解酵素であって、該変異を含むエ
ステル分解酵素が、該変異を含まないエステル分解酵素
と同等またはそれ以上の比活性を有する、エステル分解
酵素に関する。
【０００７】本願発明は、配列表の配列番号１で示され
るアミノ酸をコードするエステル分解酵素遺伝子に関す
る。
るアミノ酸をコードするエステル分解酵素遺伝子に関す
る。
【０００８】本願発明は、また配列表の配列番号１で示
されるアミノ酸配列中の１またはそれ以上のアミノ酸の
欠失、置換、あるいは付加による変異を含むアミノ酸配
列をコードするエステル分解酵素であって、該変異を含
む遺伝子によって発現されるエステル分解酵素が、該変
異を含まない遺伝子によって発現されるエステル分解酵
素と同等またはそれ以上の比活性を有する、エステル分
解酵素遺伝子に関する。
されるアミノ酸配列中の１またはそれ以上のアミノ酸の
欠失、置換、あるいは付加による変異を含むアミノ酸配
列をコードするエステル分解酵素であって、該変異を含
む遺伝子によって発現されるエステル分解酵素が、該変
異を含まない遺伝子によって発現されるエステル分解酵
素と同等またはそれ以上の比活性を有する、エステル分
解酵素遺伝子に関する。
【０００９】さらに本願発明は、配列表の配列番号２で
示されるアミノ酸をコードするエステル分解酵素遺伝子
に関する。
示されるアミノ酸をコードするエステル分解酵素遺伝子
に関する。
【００１０】本願発明は、配列表の配列番号２で示され
るアミノ酸配列中の１またはそれ以上のアミノ酸の欠
失、置換、あるいは付加による変異を含むアミノ酸配列
をコードするエステル分解酵素であって、該変異を含む
遺伝子によって発現されるエステル分解酵素が、該変異
を含まない遺伝子によって発現されるエステル分解酵素
と同等またはそれ以上の比活性を有する、エステル分解
酵素遺伝子に関する。
るアミノ酸配列中の１またはそれ以上のアミノ酸の欠
失、置換、あるいは付加による変異を含むアミノ酸配列
をコードするエステル分解酵素であって、該変異を含む
遺伝子によって発現されるエステル分解酵素が、該変異
を含まない遺伝子によって発現されるエステル分解酵素
と同等またはそれ以上の比活性を有する、エステル分解
酵素遺伝子に関する。
【００１１】本願発明は、配列表の配列番号３の1127位
のＡから2335位のＡまでの塩基配列を有するエステル分
解酵素遺伝子に関する。
のＡから2335位のＡまでの塩基配列を有するエステル分
解酵素遺伝子に関する。
【００１２】本願発明は、配列表の配列番号３の1193位
のＧから2335位のＡまでの塩基配列を有するエステル分
解酵素遺伝子に関する。
のＧから2335位のＡまでの塩基配列を有するエステル分
解酵素遺伝子に関する。
【００１３】本願発明は、前記エステル分解酵素遺伝子
を含有する発現ベクターに関する。
を含有する発現ベクターに関する。
【００１４】好適な実施態様においては、前記発現ベク
ターは、ラクトース誘導性プロモーターを有する発現ベ
クターである。
ターは、ラクトース誘導性プロモーターを有する発現ベ
クターである。
【００１５】好適な実施態様においては、前記発現ベク
ターは、シグナル配列を有し、エステル分解酵素を分泌
する発現ベクターである。
ターは、シグナル配列を有し、エステル分解酵素を分泌
する発現ベクターである。
【００１６】本願発明は、前記発現ベクターで形質転換
されれた微生物に関する。
されれた微生物に関する。
【００１７】好適な実施態様においては、前記形質転換
された微生物は原核生物である。
された微生物は原核生物である。
【００１８】好適な実施態様においては、前記形質転換
された原核生物はEscherichia coliである。
された原核生物はEscherichia coliである。
【００１９】好適な実施態様においては、前記形質転換
された微生物は真核生物である。
された微生物は真核生物である。
【００２０】好適な実施態様においては、前記形質転換
された真核生物はSaccharomyces cerevisiaeおよび/ま
たはAspergillus nidulansである。
された真核生物はSaccharomyces cerevisiaeおよび/ま
たはAspergillus nidulansである。
【００２１】好適な実施態様においては、前記形質転換
された真核生物は昆虫細胞である。
された真核生物は昆虫細胞である。
【００２２】好適な実施態様においては、前記形質転換
された昆虫細胞は蚕細胞である。
された昆虫細胞は蚕細胞である。
【００２３】本願発明は、前記形質転換された微生物を
培養する工程、および該培養により生産されたエステル
分解酵素を回収する工程を含む、エステル分解酵素の製
造方法に関する。
培養する工程、および該培養により生産されたエステル
分解酵素を回収する工程を含む、エステル分解酵素の製
造方法に関する。
【００２４】好適な実施態様においては、前記製造方法
で用いる形質転換された微生物はEscherichia coliであ
る。
で用いる形質転換された微生物はEscherichia coliであ
る。
【００２５】好適な実施態様においては、前記製造方法
で、Escherichia coliは、培地にプロモーターの誘導物
質を添加しないで培養される。
で、Escherichia coliは、培地にプロモーターの誘導物
質を添加しないで培養される。
【００２６】好適な実施態様においては、前記製造方法
で、Escherichia coliは、デンプン類を加水分解して得
られる糖類を含む培地で培養される。
で、Escherichia coliは、デンプン類を加水分解して得
られる糖類を含む培地で培養される。
【００２７】好適な実施態様においては、前記製造方法
は、Escherichia coliが60℃以上の温度で熱処理される
工程を含む。
は、Escherichia coliが60℃以上の温度で熱処理される
工程を含む。
【００２８】
【発明の実施の形態】以下、本願発明を詳しく説明す
る。
る。
【００２９】本願発明は、配列表の配列番号１または２
で示されるアミノ酸配列中の１またはそれ以上のアミノ
酸の欠失、置換、あるは付加による変異を含むエステル
分解酵素であって、この変異を含むエステル分解酵素が
変異を含まないエステル分解酵素と同等またはそれ以上
の活性を有するエステル分解酵素に関する。このような
変異は、天然に生じるか、あるいは変異原物質の作用ま
たは人為的に部位特異的突然変異導入を用いて生じさせ
得る。また変異の導入の結果、酵素タンパク質の性質に
変化がない場合、または高次構造の変化を生じて基質に
対する反応性または酵素タンパク質の安定性が上昇する
場合に、変異を含まないエステル分解酵素と同等または
それ以上の活性を有し得る。
で示されるアミノ酸配列中の１またはそれ以上のアミノ
酸の欠失、置換、あるは付加による変異を含むエステル
分解酵素であって、この変異を含むエステル分解酵素が
変異を含まないエステル分解酵素と同等またはそれ以上
の活性を有するエステル分解酵素に関する。このような
変異は、天然に生じるか、あるいは変異原物質の作用ま
たは人為的に部位特異的突然変異導入を用いて生じさせ
得る。また変異の導入の結果、酵素タンパク質の性質に
変化がない場合、または高次構造の変化を生じて基質に
対する反応性または酵素タンパク質の安定性が上昇する
場合に、変異を含まないエステル分解酵素と同等または
それ以上の活性を有し得る。
【００３０】また本願発明は、エステル分解酵素をコー
ドする遺伝子、このエステル分解酵素を発現する発現ベ
クター、発現ベクターで形質転換された微生物、形質転
換された微生物を培養した後エステル分解酵素を回収す
る方法に関する。
ドする遺伝子、このエステル分解酵素を発現する発現ベ
クター、発現ベクターで形質転換された微生物、形質転
換された微生物を培養した後エステル分解酵素を回収す
る方法に関する。
【００３１】本明細書で用いられる用語「エステル分解
酵素」は、エステルを加水分解する酵素をいう。従っ
て、エステル分解酵素としてはリパーゼ、エステラー
ゼ、ホスファターゼ、スルファターゼなどが挙げられ
る。特に好ましくは、光学異性体選択性を有するエステ
ル分解酵素が挙げられる。
酵素」は、エステルを加水分解する酵素をいう。従っ
て、エステル分解酵素としてはリパーゼ、エステラー
ゼ、ホスファターゼ、スルファターゼなどが挙げられ
る。特に好ましくは、光学異性体選択性を有するエステ
ル分解酵素が挙げられる。
【００３２】組換えによる生産能力の向上は、目的の遺
伝子のクローン化およびクローン化された遺伝子の発現
により達成される。
伝子のクローン化およびクローン化された遺伝子の発現
により達成される。
【００３３】目的の遺伝子のクローン化は、本願発明の
目的の物質であるエステル分解酵素をコードする遺伝子
を含有するライブラリーの作製および目的の遺伝子につ
いてのライブラリーのスクリーニングにより達成され得
る。
目的の物質であるエステル分解酵素をコードする遺伝子
を含有するライブラリーの作製および目的の遺伝子につ
いてのライブラリーのスクリーニングにより達成され得
る。
【００３４】本明細書で用いられる用語「ライブラリ
ー」は、目的の遺伝子を含有するゲノム（染色体）DN
A、およびその断片、cDNAなどの核酸を、プラスミドま
たはファージなどの適切なベクターに結合したものをい
う。ライブラリーの種類が用いられるスクリーニングの
方法に応じて変わり得ることは、当業者に周知である。
特に好ましくは、エステル分解酵素生産微生物であるKl
ebsiella oxytoca SNSM-87株から抽出した染色体DNA
を、制限酵素PstIで消化した後、プラスミドベクターpB
luescript SK+に結合することにより作製され得る。
ー」は、目的の遺伝子を含有するゲノム（染色体）DN
A、およびその断片、cDNAなどの核酸を、プラスミドま
たはファージなどの適切なベクターに結合したものをい
う。ライブラリーの種類が用いられるスクリーニングの
方法に応じて変わり得ることは、当業者に周知である。
特に好ましくは、エステル分解酵素生産微生物であるKl
ebsiella oxytoca SNSM-87株から抽出した染色体DNA
を、制限酵素PstIで消化した後、プラスミドベクターpB
luescript SK+に結合することにより作製され得る。
【００３５】本明細書で用いられる用語「スクリーニン
グ」は、ライブラリーから、既に得られている情報に基
づいて目的の遺伝子を単離することをいう。例えば、精
製されたタンパク質から推定された塩基配列に基づいて
合成されたオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブ
リダイゼーション、目的のタンパク質に対する標識した
抗体を用いる方法などで実施される。特に好ましくは、
ノイゲンＨＣ（第一工業製薬製）で乳化したトリブチリ
ンを含む寒天培地を用い、形質転換株の中から寒天培地
上でクリアーゾーンを形成する株を分離することによ
り、エステル分解酵素遺伝子を含む形質転換株を選択分
離し得る。あるいは、解析されたタンパク質のアミノ酸
配列をもとに合成されたプライマーを用い、エステル分
解酵素生産微生物の染色体DNAなどを鋳型に、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（PCR）により直接増幅し得る。
グ」は、ライブラリーから、既に得られている情報に基
づいて目的の遺伝子を単離することをいう。例えば、精
製されたタンパク質から推定された塩基配列に基づいて
合成されたオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブ
リダイゼーション、目的のタンパク質に対する標識した
抗体を用いる方法などで実施される。特に好ましくは、
ノイゲンＨＣ（第一工業製薬製）で乳化したトリブチリ
ンを含む寒天培地を用い、形質転換株の中から寒天培地
上でクリアーゾーンを形成する株を分離することによ
り、エステル分解酵素遺伝子を含む形質転換株を選択分
離し得る。あるいは、解析されたタンパク質のアミノ酸
配列をもとに合成されたプライマーを用い、エステル分
解酵素生産微生物の染色体DNAなどを鋳型に、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（PCR）により直接増幅し得る。
【００３６】クローン化された遺伝子の発現は、クロー
ン化DNAを挿入した適切な微生物宿主に適合する発現ベ
クターの構築、発現ベクターの微生物宿主への導入、な
らびに組換え微生物の培養および生産物の回収により達
成される。
ン化DNAを挿入した適切な微生物宿主に適合する発現ベ
クターの構築、発現ベクターの微生物宿主への導入、な
らびに組換え微生物の培養および生産物の回収により達
成される。
【００３７】本願発明で用いられる用語「微生物」は、
原核生物および真核生物のいずれをも含む。例えば、原
核生物としてはEscherichia coli、Pseudomonas putid
a、またはBacillus subtilisなどが、真核生物としては
Saccharomyces cerevisiae、Aspergillus属（例えばAsp
ergillus nidulans）、Pichia pastoris、昆虫細胞、好
ましくは蚕細胞、または哺乳動物細胞などが挙げられる
が、本願エステル分解酵素遺伝子を発現するものであれ
ばこれに限定されない。特に好ましい微生物としてEsch
erichia coliが挙げられる。
原核生物および真核生物のいずれをも含む。例えば、原
核生物としてはEscherichia coli、Pseudomonas putid
a、またはBacillus subtilisなどが、真核生物としては
Saccharomyces cerevisiae、Aspergillus属（例えばAsp
ergillus nidulans）、Pichia pastoris、昆虫細胞、好
ましくは蚕細胞、または哺乳動物細胞などが挙げられる
が、本願エステル分解酵素遺伝子を発現するものであれ
ばこれに限定されない。特に好ましい微生物としてEsch
erichia coliが挙げられる。
【００３８】本願発明で用いられる用語「発現ベクタ
ー」は、目的遺伝子が、その転写および翻訳に必要な要
素と作動可能に連結されており、さらに微生物宿主内で
の複製および組換え体の選択に必要な因子を備えた媒体
をいう。また、発現産物の分泌生産が意図される場合
は、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列が、目
的のタンパク質をコードするDNAの上流に正しいリーデ
ィングフレームで結合される。発現ベクターの種類が、
使用する微生物宿主に応じて変わり得ることは、当業者
に周知である。
ー」は、目的遺伝子が、その転写および翻訳に必要な要
素と作動可能に連結されており、さらに微生物宿主内で
の複製および組換え体の選択に必要な因子を備えた媒体
をいう。また、発現産物の分泌生産が意図される場合
は、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列が、目
的のタンパク質をコードするDNAの上流に正しいリーデ
ィングフレームで結合される。発現ベクターの種類が、
使用する微生物宿主に応じて変わり得ることは、当業者
に周知である。
【００３９】好ましい発現ベクターとしては、Escheric
hia coli用のpET-21(+)（ノバジェン社製）、グラム陰
性細菌（Escherichia coli、Pseudomonas putidaなど）
用のpJAJ7（ATCC37648）、Bacillus subtilis用のpPL60
8（ATCC37108）、Saccharomyces cerevisiae用のpYES2
（インビトロジェン社製）、Aspergillus nidulans用の
pAB366（ATCC77134）、Pichia pastoris用のpHIL-D2
（インビトロジェン社製）、昆虫細胞用のpAc360（イン
ビトロジェン社製）、哺乳動物細胞用のpDR2（クロンテ
ック社製）などが挙げられる。
hia coli用のpET-21(+)（ノバジェン社製）、グラム陰
性細菌（Escherichia coli、Pseudomonas putidaなど）
用のpJAJ7（ATCC37648）、Bacillus subtilis用のpPL60
8（ATCC37108）、Saccharomyces cerevisiae用のpYES2
（インビトロジェン社製）、Aspergillus nidulans用の
pAB366（ATCC77134）、Pichia pastoris用のpHIL-D2
（インビトロジェン社製）、昆虫細胞用のpAc360（イン
ビトロジェン社製）、哺乳動物細胞用のpDR2（クロンテ
ック社製）などが挙げられる。
【００４０】特に好ましい発現ベクターとしては、 Esc
herichia coliでの転写および翻訳に必要な、強力なラ
クトース誘導性tacプロモーター、リボゾーム結合部
位、およびrrnBターミネーター、ならびにマルチクロー
ニング部位、アンピシリン耐性選択マーカー、およびpB
R322複製起点を有するpKK223-3（ファルマシアバイオテ
ック社製）が挙げられる。
herichia coliでの転写および翻訳に必要な、強力なラ
クトース誘導性tacプロモーター、リボゾーム結合部
位、およびrrnBターミネーター、ならびにマルチクロー
ニング部位、アンピシリン耐性選択マーカー、およびpB
R322複製起点を有するpKK223-3（ファルマシアバイオテ
ック社製）が挙げられる。
【００４１】上記発現ベクター内の転写および翻訳に必
要な因子に作動可能に連結するために、目的のエステル
分解酵素遺伝子を加工しなければならない場合がある。
これらは例えばプロモーターとコード領域との間が長す
ぎて転写効率の低下が予想されたり、リボゾーム結合部
位と翻訳開始コドンとの間隔が適切でない場合などであ
る。加工の手段としては、制限酵素による消化、Bal3
1、ExoIIIなどのエキソヌクレアーゼによる消化、ある
いはM13などの一本鎖DNAまたはPCRを使用した部位特異
的突然変異の導入が挙げられる。
要な因子に作動可能に連結するために、目的のエステル
分解酵素遺伝子を加工しなければならない場合がある。
これらは例えばプロモーターとコード領域との間が長す
ぎて転写効率の低下が予想されたり、リボゾーム結合部
位と翻訳開始コドンとの間隔が適切でない場合などであ
る。加工の手段としては、制限酵素による消化、Bal3
1、ExoIIIなどのエキソヌクレアーゼによる消化、ある
いはM13などの一本鎖DNAまたはPCRを使用した部位特異
的突然変異の導入が挙げられる。
【００４２】発現ベクターを導入してエステル分解酵素
生産能力を獲得した形質転換株による目的酵素の生産
は、使用する微生物および発現ベクター内の発現を調節
する因子の種類、ならびに発現される物質に応じて適切
な条件が選択される。例えば次の方法で実施し得る。通
常の静置培養、振とう培養、通気撹拌培養などにより連
続的あるいは、間歇的に行うことができる。
生産能力を獲得した形質転換株による目的酵素の生産
は、使用する微生物および発現ベクター内の発現を調節
する因子の種類、ならびに発現される物質に応じて適切
な条件が選択される。例えば次の方法で実施し得る。通
常の静置培養、振とう培養、通気撹拌培養などにより連
続的あるいは、間歇的に行うことができる。
【００４３】用いる培地は、使用される微生物の生育す
るものであれば特に限定はなく、窒素源としては、例え
ば、ポリペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粉、コ
ーンスチープリカー、コーンミール等の有機窒素源の
他、硫安、塩安、硝安、リン安等の無機窒素源が必要に
応じて、適宜混合して、または単独で用いられる。
るものであれば特に限定はなく、窒素源としては、例え
ば、ポリペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粉、コ
ーンスチープリカー、コーンミール等の有機窒素源の
他、硫安、塩安、硝安、リン安等の無機窒素源が必要に
応じて、適宜混合して、または単独で用いられる。
【００４４】また、炭素源としては、例えば、デンプ
ン、デンプンの加水分解物、デキストリン、廃糖蜜、転
化糖等の他、資化し得る炭水化物、油脂、脂肪酸等が必
要に応じて、適宜混合して、または単独で用いられる。
デンプンの加水分解物としては、カラスムギデンプン、
甘藷デンプン、小麦デンプン、コメデンプン、サゴヤシ
デンプン、サトイモデンプン、タピオカデンプン、トウ
モロコシデンプン、または馬鈴薯デンプンの加水分解物
が用いられる。
ン、デンプンの加水分解物、デキストリン、廃糖蜜、転
化糖等の他、資化し得る炭水化物、油脂、脂肪酸等が必
要に応じて、適宜混合して、または単独で用いられる。
デンプンの加水分解物としては、カラスムギデンプン、
甘藷デンプン、小麦デンプン、コメデンプン、サゴヤシ
デンプン、サトイモデンプン、タピオカデンプン、トウ
モロコシデンプン、または馬鈴薯デンプンの加水分解物
が用いられる。
【００４５】培地には炭素源、窒素源の他、無機塩例え
ば、リン酸、Mg2+、Ca2+ 、Mn2+、Fe2+ 、Fe3+ 、Z
n2+、Co2+、Ni2+、Na+、K+ 等の塩が必要に応じて、適
宜混合して、または単独で用いられる。また、その他必
要に応じて微生物の生育、酵素の生産に必要な各種無機
物、有機物を添加することもできる。
ば、リン酸、Mg2+、Ca2+ 、Mn2+、Fe2+ 、Fe3+ 、Z
n2+、Co2+、Ni2+、Na+、K+ 等の塩が必要に応じて、適
宜混合して、または単独で用いられる。また、その他必
要に応じて微生物の生育、酵素の生産に必要な各種無機
物、有機物を添加することもできる。
【００４６】培養の温度は用いる微生物の生育に適した
温度を選択すればよく、通常15℃〜60℃、好ましくは25
℃〜40℃で培養するのが適当である。また、培養の時間
は微生物の生育および目的のエステル分解酵素酵素の生
産に十分な時間続行されるが、通常24〜120時間を要す
る。
温度を選択すればよく、通常15℃〜60℃、好ましくは25
℃〜40℃で培養するのが適当である。また、培養の時間
は微生物の生育および目的のエステル分解酵素酵素の生
産に十分な時間続行されるが、通常24〜120時間を要す
る。
【００４７】誘導性のプロモーターを有する発現ベクタ
ーを使用する場合は、誘導物質の添加、培養温度の変
更、培地成分の調整などにより発現を制御し得る。例え
ば、ラクトース誘導性プロモーターを有する発現ベクタ
ーを使用する場合は、イソプロピル-β-Ｄ-チオガラク
トピラノシド（IPTG）を添加することにより発現を誘導
し得る。
ーを使用する場合は、誘導物質の添加、培養温度の変
更、培地成分の調整などにより発現を制御し得る。例え
ば、ラクトース誘導性プロモーターを有する発現ベクタ
ーを使用する場合は、イソプロピル-β-Ｄ-チオガラク
トピラノシド（IPTG）を添加することにより発現を誘導
し得る。
【００４８】このようにして培養した後、培養物を遠心
分離または濾過することによって微生物細胞を分離して
上清を得る。この上清から通常の手段、例えば、塩析
法、溶媒沈澱（例えばエタノール、アセトン等）によっ
てタンパクを沈澱させる、あるいは、限外濾過（例えば
ダイヤフローメンブレンＹＣ、アミコン社製）により濃
縮させることにより、本願発明のエステル分解酵素を含
む画分を得る。この画分に更に沈澱、濾過あるいは遠心
分離、脱塩処理などの処理を行い粗酵素を得る。更にこ
の粗酵素を、凍結乾燥、等電点沈澱、電気泳動、イオン
交換クロマトグラフィー、晶出等の通常の酵素の精製手
段を適宜組み合わせることによって、比活性の向上した
粗酵素および精製酵素とし得る。
分離または濾過することによって微生物細胞を分離して
上清を得る。この上清から通常の手段、例えば、塩析
法、溶媒沈澱（例えばエタノール、アセトン等）によっ
てタンパクを沈澱させる、あるいは、限外濾過（例えば
ダイヤフローメンブレンＹＣ、アミコン社製）により濃
縮させることにより、本願発明のエステル分解酵素を含
む画分を得る。この画分に更に沈澱、濾過あるいは遠心
分離、脱塩処理などの処理を行い粗酵素を得る。更にこ
の粗酵素を、凍結乾燥、等電点沈澱、電気泳動、イオン
交換クロマトグラフィー、晶出等の通常の酵素の精製手
段を適宜組み合わせることによって、比活性の向上した
粗酵素および精製酵素とし得る。
【００４９】好ましい実施態様において、培養終了後の
培養液を60℃〜100℃、好ましくは70℃〜90℃、より好
ましくは75℃〜85℃で加熱することにより、エステル分
解酵素を高い比活性で含有する培養液を調製し得る。加
熱処理により、比較的高い熱安定性を有する本願発明の
エステル分解酵素を、細胞画分から培養液中に放出させ
得、また比較的熱に不安定な他のタンパク質を変性させ
て分離し得る。
培養液を60℃〜100℃、好ましくは70℃〜90℃、より好
ましくは75℃〜85℃で加熱することにより、エステル分
解酵素を高い比活性で含有する培養液を調製し得る。加
熱処理により、比較的高い熱安定性を有する本願発明の
エステル分解酵素を、細胞画分から培養液中に放出させ
得、また比較的熱に不安定な他のタンパク質を変性させ
て分離し得る。
【００５０】以上のように本願発明者らは、目的のエス
テル分解酵素を発現する遺伝子を挿入した発現ベクター
を構築し、これを微生物に導入することによって、微生
物にエステル分解酵素を大量生産させることに成功し、
高い光学選択性能をもつエステル分解酵素を安価に大量
に生産する方法を確立して、本願発明を完成するに至っ
た。
テル分解酵素を発現する遺伝子を挿入した発現ベクター
を構築し、これを微生物に導入することによって、微生
物にエステル分解酵素を大量生産させることに成功し、
高い光学選択性能をもつエステル分解酵素を安価に大量
に生産する方法を確立して、本願発明を完成するに至っ
た。
【００５１】
【実施例】以下に実施例でエステル分解酵素遺伝子をク
ローン化する方法、このエステル分解酵素を発現する遺
伝子を挿入した発現ベクターを構築する方法、これを微
生物に導入し、組換え微生物にエステル分解酵素を大量
生産させる方法について説明するが、本願発明はこれら
の実施例に限定されるものではない。
ローン化する方法、このエステル分解酵素を発現する遺
伝子を挿入した発現ベクターを構築する方法、これを微
生物に導入し、組換え微生物にエステル分解酵素を大量
生産させる方法について説明するが、本願発明はこれら
の実施例に限定されるものではない。
【００５２】（実施例１：エステル分解酵素遺伝子のク
ローニング） （１）染色体ＤＮＡの調製 エステル分解酵素生産株である、Klebsiella oxytoca S
NSM-87株（微工研寄託番号第12953号）を、100 mlのLB
培地で37℃にて16時間好気的に振とう培養（300rpm、レ
シプロ）を行い、遠心分離（15,000 rpm、５分間、４
℃）により集菌した。菌体を10 mlのＡ溶液（50 mM Tri
s-HCl, pH8.0、50 mM EDTA）で洗浄し、３mlの15％ショ
糖を含むＡ溶液に懸濁した。懸濁液を37℃にて30分保温
後、さらに１％Ｎ-ラウリルサルコシンを含むＡ溶液３m
lを添加した。この液に5.4 gの塩化セシウムと臭化エチ
ジウム溶液（10 mg/ml）300 μlを添加し、55,000 rp
m、16時間、20℃にて超遠心分離を行い、染色体DNAを分
画した。得られた染色体DNA画分からｎ-ブタノール抽出
により臭化エチジウムを除去した後、TE溶液（10 mM Tr
is-HCl,pH8.0、0.1 mM EDTA）に対して16時間、４℃に
て透析し、染色体DNA約１mｇを得た。
ローニング） （１）染色体ＤＮＡの調製 エステル分解酵素生産株である、Klebsiella oxytoca S
NSM-87株（微工研寄託番号第12953号）を、100 mlのLB
培地で37℃にて16時間好気的に振とう培養（300rpm、レ
シプロ）を行い、遠心分離（15,000 rpm、５分間、４
℃）により集菌した。菌体を10 mlのＡ溶液（50 mM Tri
s-HCl, pH8.0、50 mM EDTA）で洗浄し、３mlの15％ショ
糖を含むＡ溶液に懸濁した。懸濁液を37℃にて30分保温
後、さらに１％Ｎ-ラウリルサルコシンを含むＡ溶液３m
lを添加した。この液に5.4 gの塩化セシウムと臭化エチ
ジウム溶液（10 mg/ml）300 μlを添加し、55,000 rp
m、16時間、20℃にて超遠心分離を行い、染色体DNAを分
画した。得られた染色体DNA画分からｎ-ブタノール抽出
により臭化エチジウムを除去した後、TE溶液（10 mM Tr
is-HCl,pH8.0、0.1 mM EDTA）に対して16時間、４℃に
て透析し、染色体DNA約１mｇを得た。
【００５３】（２）ショットガンクローニングによる本
願発明のエステル分解酵素遺伝子を含むDNA断片の検
索。
願発明のエステル分解酵素遺伝子を含むDNA断片の検
索。
【００５４】約１μgのベクターpBluescript II SK+プ
ラスミドDNA（ストラタジーン社製）及び（１）項で調
製したK. oxytoca SNSM-87株染色体DNA約10μgを、制限
酵素PstIで消化した後、混合し、DNAライゲーションキ
ット（宝酒造社製）を用いて両者を連結させることによ
り、 K. oxytoca SNSM-87株染色体DNA断片を挿入した組
換えプラスミドライブラリーを構築した。次に上記組換
えプラスミドDNAを、E.coli JM109株のコンピテントセ
ル懸濁液200μlに添加し、氷中に40分間放置した後、42
℃で45秒間保温した。このコンピテントセル／DNA混合
液を５mlのLB培地に接種して、37℃で２時間振とうし
た。振とう後、液をアンピシリン100μg/ml、５-ブロモ
-４-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-ガラクトピラノシド
（X-gal ）40μg/ml 、イソプロピル-β-Ｄ-チオガラク
トピラノシド（IPTG）24μg/ml 、トリブチリン10 mg/m
l、ノイゲンＨＣ５mg/mlを含むLB寒天培地に塗抹し、３
７℃にて１２〜７２時間保温した。生育したコロニー群
の中からアンピシリン耐性で白色かつ、クリアーゾーン
を形成する（すなわち、エステル分解酵素活性を有す
る）コロニー１株を選抜し、E. coli JM109（pBps-1）
株と命名した。
ラスミドDNA（ストラタジーン社製）及び（１）項で調
製したK. oxytoca SNSM-87株染色体DNA約10μgを、制限
酵素PstIで消化した後、混合し、DNAライゲーションキ
ット（宝酒造社製）を用いて両者を連結させることによ
り、 K. oxytoca SNSM-87株染色体DNA断片を挿入した組
換えプラスミドライブラリーを構築した。次に上記組換
えプラスミドDNAを、E.coli JM109株のコンピテントセ
ル懸濁液200μlに添加し、氷中に40分間放置した後、42
℃で45秒間保温した。このコンピテントセル／DNA混合
液を５mlのLB培地に接種して、37℃で２時間振とうし
た。振とう後、液をアンピシリン100μg/ml、５-ブロモ
-４-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-ガラクトピラノシド
（X-gal ）40μg/ml 、イソプロピル-β-Ｄ-チオガラク
トピラノシド（IPTG）24μg/ml 、トリブチリン10 mg/m
l、ノイゲンＨＣ５mg/mlを含むLB寒天培地に塗抹し、３
７℃にて１２〜７２時間保温した。生育したコロニー群
の中からアンピシリン耐性で白色かつ、クリアーゾーン
を形成する（すなわち、エステル分解酵素活性を有す
る）コロニー１株を選抜し、E. coli JM109（pBps-1）
株と命名した。
【００５５】（３）クローン化DNA断片の確認 （２）項で得られたE. coli JM109（pBps-1）株から、
次の方法によってプラスミドDNAを抽出した。すなわ
ち、 E. coli JM109（pBps-1）株をLB培地に接種し、37
℃で16時間振とう培養（300 rpm、レシプロ）した後、
培養液１mlを12,000 rpmにおいて５分間遠心分離するこ
とにより集菌した。この菌体を緩衝液（50mMグルコー
ス、25 mM Tris-HCl,pH8.0、10 mM EDTA）100μlに懸濁
して氷中で５分間静置し、次いでSDS溶液（0.2N NaOH、
１％SDS）200μlを加えてよく混和し、３M酢酸カリウム
（pH4.8 ）150μlを加え、氷中に５分間静置した後、1
2,000rpmにおいて５分間遠心分離することにより上澄を
採取した。この上澄からフェノール抽出、エタノール沈
澱でプラスミドDNAを回収した。回収したプラスミドDNA
を20μlのTE溶液に溶解し、プラスミドDNA 20μgを得
た。得られたプラスミドDNAをPstIで消化し、その消化
液をλ/Hind III digest-φX174/Hae III digest（東洋
紡績社製）をサイズマーカーとして、アガロースゲル電
気泳動（ゲル濃度１％）し、プラスミドDNA内の挿入断
片の大きさを確認したところ、約5.5 kbpであった。
次の方法によってプラスミドDNAを抽出した。すなわ
ち、 E. coli JM109（pBps-1）株をLB培地に接種し、37
℃で16時間振とう培養（300 rpm、レシプロ）した後、
培養液１mlを12,000 rpmにおいて５分間遠心分離するこ
とにより集菌した。この菌体を緩衝液（50mMグルコー
ス、25 mM Tris-HCl,pH8.0、10 mM EDTA）100μlに懸濁
して氷中で５分間静置し、次いでSDS溶液（0.2N NaOH、
１％SDS）200μlを加えてよく混和し、３M酢酸カリウム
（pH4.8 ）150μlを加え、氷中に５分間静置した後、1
2,000rpmにおいて５分間遠心分離することにより上澄を
採取した。この上澄からフェノール抽出、エタノール沈
澱でプラスミドDNAを回収した。回収したプラスミドDNA
を20μlのTE溶液に溶解し、プラスミドDNA 20μgを得
た。得られたプラスミドDNAをPstIで消化し、その消化
液をλ/Hind III digest-φX174/Hae III digest（東洋
紡績社製）をサイズマーカーとして、アガロースゲル電
気泳動（ゲル濃度１％）し、プラスミドDNA内の挿入断
片の大きさを確認したところ、約5.5 kbpであった。
【００５６】（４）エステル分解酵素遺伝子塩基配列の
解析 エステル分解酵素遺伝子を含むと考えられる約5.5 kbp
のDNA断片を各制限酵素により切断し、各DNA断片をpBlu
escript II SK+にサブクローニングしてE. coliJM109株
を形質転換した後、（２）項の記載と同様にしてトリブ
チリン含有のLB寒天培地におけるクリアーゾーンの有無
を調べることにより、エステル分解酵素活性を発現する
ために必要な断片を限定した。その結果、プラスミドpB
pb-1に挿入されたPstI−BamHI断片がエステル分解酵素
活性の発現能力を有することが判明したので、挿入断片
の全塩基配列をA.L.F.DNAシーケンサー（ファルマシア
バイオテック社製）を使用して決定した。決定した2712
bp（配列番号３の４位〜2715位）中の最大のオープン
リーディングフレームは1209 bpの長さを有し、403アミ
ノ酸のタンパク質をコードすることが推定された。この
推定アミノ酸配列の中には、 K. oxytoca SNSM-87株か
ら精製したエステル分解酵素タンパク質のＮ末端アミノ
酸配列が見出されたので（下記の実施例３で詳細に記載
する）、このオープンリーディングフレームが目的のエ
ステル分解酵素をコードする構造遺伝子であると判断
し、以下の操作に使用した。
解析 エステル分解酵素遺伝子を含むと考えられる約5.5 kbp
のDNA断片を各制限酵素により切断し、各DNA断片をpBlu
escript II SK+にサブクローニングしてE. coliJM109株
を形質転換した後、（２）項の記載と同様にしてトリブ
チリン含有のLB寒天培地におけるクリアーゾーンの有無
を調べることにより、エステル分解酵素活性を発現する
ために必要な断片を限定した。その結果、プラスミドpB
pb-1に挿入されたPstI−BamHI断片がエステル分解酵素
活性の発現能力を有することが判明したので、挿入断片
の全塩基配列をA.L.F.DNAシーケンサー（ファルマシア
バイオテック社製）を使用して決定した。決定した2712
bp（配列番号３の４位〜2715位）中の最大のオープン
リーディングフレームは1209 bpの長さを有し、403アミ
ノ酸のタンパク質をコードすることが推定された。この
推定アミノ酸配列の中には、 K. oxytoca SNSM-87株か
ら精製したエステル分解酵素タンパク質のＮ末端アミノ
酸配列が見出されたので（下記の実施例３で詳細に記載
する）、このオープンリーディングフレームが目的のエ
ステル分解酵素をコードする構造遺伝子であると判断
し、以下の操作に使用した。
【００５７】（実施例２：エステル分解酵素遺伝子の発
現） （１）構造遺伝子の発現ベクターへの挿入 実施例１で取得した2712 bpのPstI-BamHI DNA断片から
5'非翻訳領域を除去する目的で以下の操作を実施した。
まず挿入断片をBal-31で部分消化し、得られた種々の大
きさのDNA断片を、EcoRIリンカー（pEcoRI 4740P、宝酒
造社製）と連結した後、あらかじめEcoRIで消化した強
力なラクトース誘導性tacプロモーターを有するE. coli
用発現ベクターであるpKK223-3（ファルマシアバイオテ
ック社製）に連結して、E. coli JM105株を形質転換し
た。形質転換細胞について、実施例１と同様にしてトリ
ブチリン含有のLB寒天培地におけるクリアーゾーンの形
成を調べ、最大のクリアーゾーンを示す株であるKM-1株
を選抜した。KM-1株の保有するプラスミドDNAを抽出し
て塩基配列を決定したところ、目的のオープンリーディ
ングフレームが、pKK223-3内のリボゾーム結合部位の下
流に適切に連結されていることが判明した。
現） （１）構造遺伝子の発現ベクターへの挿入 実施例１で取得した2712 bpのPstI-BamHI DNA断片から
5'非翻訳領域を除去する目的で以下の操作を実施した。
まず挿入断片をBal-31で部分消化し、得られた種々の大
きさのDNA断片を、EcoRIリンカー（pEcoRI 4740P、宝酒
造社製）と連結した後、あらかじめEcoRIで消化した強
力なラクトース誘導性tacプロモーターを有するE. coli
用発現ベクターであるpKK223-3（ファルマシアバイオテ
ック社製）に連結して、E. coli JM105株を形質転換し
た。形質転換細胞について、実施例１と同様にしてトリ
ブチリン含有のLB寒天培地におけるクリアーゾーンの形
成を調べ、最大のクリアーゾーンを示す株であるKM-1株
を選抜した。KM-1株の保有するプラスミドDNAを抽出し
て塩基配列を決定したところ、目的のオープンリーディ
ングフレームが、pKK223-3内のリボゾーム結合部位の下
流に適切に連結されていることが判明した。
【００５８】（２）エステル分解酵素の生産 （１）で得られたエステル分解酵素遺伝子を含むE. col
i KM-1株を、LB培地５mlを含む試験管（24 mm径×200 m
m長）で37℃、16時間、振とう培養（300 rpm、レシプ
ロ）し、下記の方法で活性測定を行ったところ、12 U/m
lのエステル分解活性を有する培養液が得られた。IPTG
による誘導では、生産能を効果的に向上させることは出
来なかった。
i KM-1株を、LB培地５mlを含む試験管（24 mm径×200 m
m長）で37℃、16時間、振とう培養（300 rpm、レシプ
ロ）し、下記の方法で活性測定を行ったところ、12 U/m
lのエステル分解活性を有する培養液が得られた。IPTG
による誘導では、生産能を効果的に向上させることは出
来なかった。
【００５９】エステル分解酵素活性のアッセーは以下の
方法に従って実施した。0.5 mM酪酸ｐ−ニトロフェニル
水溶液1.5 mlに酵素溶液0.5 mlを加え、37℃にて10分間
反応後、0.5％トリクロロ酢酸を0.1 ml加えて反応を停
止し、反応液に200 mMリン酸緩衝液（pH7）を2.8 mlを
加え、400 nmにおける吸光度を測定する。ブランクは、
酵素液の代わりに酵素を溶解あるいは希釈した緩衝液を
用いて同様に測定する。１単位（U）は１分間に１μmol
のｐ−ニトロフェノールを遊離する酵素量とした。
方法に従って実施した。0.5 mM酪酸ｐ−ニトロフェニル
水溶液1.5 mlに酵素溶液0.5 mlを加え、37℃にて10分間
反応後、0.5％トリクロロ酢酸を0.1 ml加えて反応を停
止し、反応液に200 mMリン酸緩衝液（pH7）を2.8 mlを
加え、400 nmにおける吸光度を測定する。ブランクは、
酵素液の代わりに酵素を溶解あるいは希釈した緩衝液を
用いて同様に測定する。１単位（U）は１分間に１μmol
のｐ−ニトロフェノールを遊離する酵素量とした。
【００６０】（実施例３：組換えエステル分解酵素の性
質の検討） （１）熱安定性の確認 pH8.0、80℃にて90分間熱処理後の残存活性を測定した
結果は親株同様100％であった。
質の検討） （１）熱安定性の確認 pH8.0、80℃にて90分間熱処理後の残存活性を測定した
結果は親株同様100％であった。
【００６１】(２）（Ｒ，Ｓ）-２-（４-ヨードフェニ
ル）プロピオン酸メチルの加水分解反応に対する基質特
異性 （Ｒ，Ｓ）-２-（４-ヨードフェニル）プロピオン酸メ
チル116.0 mg（0.4 mM）と上記のKM-1株の12 U/mlのエ
ステル分解活性を有する培養液160μlを0.6 Mリン酸カ
リウム緩衝液（pH8）160μlに加えた。反応液を45℃で2
4時間振とう撹拌した後、５Ｎ硫酸100μl、酢酸エチル
１mlを加えて撹拌し、エステルと生成した酸の混合物を
反応液から抽出した。この酢酸エチル相５μlをHPLCに
より分析したところ、親株と同様に（Ｓ）-２-（４-ヨ
ードフェニル）プロピオン酸が99％以上の光学純度で得
られた。HPLCは以下の分析条件で実施した。カラム：OP
TIPAC TA（ウォーターズ社製）；移動相：ヘキサン／イ
ソプロピルアルコール=97.5／2.5； 流速：１ml／min；
検出：UV、235 nm。 (３）Ｎ末端アミノ酸配列の確認 親株K. oxytoca SNSM-87株の生産するエステル分解酵素
を公知技術（特開平6-14772に記された方法）で精製
し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度８
％）により分離した後、このゲルからメンブレンフィル
ター（イモビロン、ミリポア社製）にブロッティング
後、473A-プロテインシークエンサー（パーキン−エル
マー社製）を用いてＮ末端アミノ酸配列を決定した。ま
た、組換え体KM-1株の生産するエステル分解酵素につい
ても同様にＮ末端アミノ酸配列を決定したところ、両者
において分析し得た17個のアミノ酸のすべてが同一であ
った。
ル）プロピオン酸メチルの加水分解反応に対する基質特
異性 （Ｒ，Ｓ）-２-（４-ヨードフェニル）プロピオン酸メ
チル116.0 mg（0.4 mM）と上記のKM-1株の12 U/mlのエ
ステル分解活性を有する培養液160μlを0.6 Mリン酸カ
リウム緩衝液（pH8）160μlに加えた。反応液を45℃で2
4時間振とう撹拌した後、５Ｎ硫酸100μl、酢酸エチル
１mlを加えて撹拌し、エステルと生成した酸の混合物を
反応液から抽出した。この酢酸エチル相５μlをHPLCに
より分析したところ、親株と同様に（Ｓ）-２-（４-ヨ
ードフェニル）プロピオン酸が99％以上の光学純度で得
られた。HPLCは以下の分析条件で実施した。カラム：OP
TIPAC TA（ウォーターズ社製）；移動相：ヘキサン／イ
ソプロピルアルコール=97.5／2.5； 流速：１ml／min；
検出：UV、235 nm。 (３）Ｎ末端アミノ酸配列の確認 親株K. oxytoca SNSM-87株の生産するエステル分解酵素
を公知技術（特開平6-14772に記された方法）で精製
し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度８
％）により分離した後、このゲルからメンブレンフィル
ター（イモビロン、ミリポア社製）にブロッティング
後、473A-プロテインシークエンサー（パーキン−エル
マー社製）を用いてＮ末端アミノ酸配列を決定した。ま
た、組換え体KM-1株の生産するエステル分解酵素につい
ても同様にＮ末端アミノ酸配列を決定したところ、両者
において分析し得た17個のアミノ酸のすべてが同一であ
った。
【００６２】以上の結果により、実施例１で得られたク
ローンのオープンリーディングフレームが目的のエステ
ル分解酵素をコードすることが確認され、またE. coli
KM-1株の生産する組換えエステル分解酵素が、親株であ
るK. oxytoca SNSM-87株の生産するエステル分解酵素性
質を有することが示された。さらに、塩基配列から推定
された403アミノ酸のアミノ酸配列を、既知のタンパク
質と比較したところ（GENESEQ21.5データベース使
用）、有意な相同性を示すものは無く、本願発明のエス
テル分解酵素が新規であることが明らかとなった。
ローンのオープンリーディングフレームが目的のエステ
ル分解酵素をコードすることが確認され、またE. coli
KM-1株の生産する組換えエステル分解酵素が、親株であ
るK. oxytoca SNSM-87株の生産するエステル分解酵素性
質を有することが示された。さらに、塩基配列から推定
された403アミノ酸のアミノ酸配列を、既知のタンパク
質と比較したところ（GENESEQ21.5データベース使
用）、有意な相同性を示すものは無く、本願発明のエス
テル分解酵素が新規であることが明らかとなった。
【００６３】（実施例４：培地の改良によるエステル分
解酵素の生産性の向上）実施例２で得たE. coli KM-1株
の生産能力を向上させるために、生産条件の検討を実施
した。甘藷デンプンの加水分解物１％、ペプトン0.8
％、酵母エキス0.3％、KH2PO4 0.52％、K2HPO4 1.08％
よりなる液体培地20リットルを含む30リットルジャーフ
ァーメンターに植菌し、37℃、３日間通気撹拌培養（20
0 rpm、0.5v/v/m）した後、80℃、20分間加熱し、エス
テル分解酵素活性60 U/mlの培養液を得た。この酵素生
産能は、親株K. oxytoca SNSM-87株のエステル分解酵素
生産能の約600倍であり、またE. coli KM-1株のLB培地
中での生産能の約５倍であった。
解酵素の生産性の向上）実施例２で得たE. coli KM-1株
の生産能力を向上させるために、生産条件の検討を実施
した。甘藷デンプンの加水分解物１％、ペプトン0.8
％、酵母エキス0.3％、KH2PO4 0.52％、K2HPO4 1.08％
よりなる液体培地20リットルを含む30リットルジャーフ
ァーメンターに植菌し、37℃、３日間通気撹拌培養（20
0 rpm、0.5v/v/m）した後、80℃、20分間加熱し、エス
テル分解酵素活性60 U/mlの培養液を得た。この酵素生
産能は、親株K. oxytoca SNSM-87株のエステル分解酵素
生産能の約600倍であり、またE. coli KM-1株のLB培地
中での生産能の約５倍であった。
【００６４】（実施例５：エステル分解酵素粉末の製
法）実施例４で得られたエステル分解酵素活性60 U/ml
の培養液を、10,000×gで連続遠心分離することによっ
てエステル分解酵素活性50 U/mlの上清液を得た。次に
マイクローザーPMV-313（旭化成工業社製）により完全
に除菌した後、限外濾過膜FS10-FS-FUYO3A1（ダイセル
化学工業社製）による膜濃縮を行い、8,000 U/ml、100
mlの濃縮酵素液を得た。これに賦型剤としてカゼインを
67 g添加し、凍結乾燥することにより、73 gの酵素粉末
（13,300 U/g）を得た。
法）実施例４で得られたエステル分解酵素活性60 U/ml
の培養液を、10,000×gで連続遠心分離することによっ
てエステル分解酵素活性50 U/mlの上清液を得た。次に
マイクローザーPMV-313（旭化成工業社製）により完全
に除菌した後、限外濾過膜FS10-FS-FUYO3A1（ダイセル
化学工業社製）による膜濃縮を行い、8,000 U/ml、100
mlの濃縮酵素液を得た。これに賦型剤としてカゼインを
67 g添加し、凍結乾燥することにより、73 gの酵素粉末
（13,300 U/g）を得た。
【００６５】
【発明の効果】本願発明は、自然界より得られたKlebsi
ella oxytoca SNSM-87株の生産する、広いpH領域で安定
であり、耐熱性にすぐれ、高い光学選択性をもつ新しい
エステル分解酵素を、コードする遺伝子をクローン化
し、この遺伝子を発現ベクターに挿入し、微生物を形質
転換した後、形質転換株を培養して本願発明の方法によ
り処理することにより、エステル分解酵素を安価で大量
に提供することができる。
ella oxytoca SNSM-87株の生産する、広いpH領域で安定
であり、耐熱性にすぐれ、高い光学選択性をもつ新しい
エステル分解酵素を、コードする遺伝子をクローン化
し、この遺伝子を発現ベクターに挿入し、微生物を形質
転換した後、形質転換株を培養して本願発明の方法によ
り処理することにより、エステル分解酵素を安価で大量
に提供することができる。
【００６６】
配列番号：１ 配列の長さ：４０３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 配列 Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｉｌ
ｅ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｃｙｓ １ ５
１０ １５ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｔｈ
ｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｖａｌ ２０
２５ ３０ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌ
ｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｓｅｒ ３５
４０ ４５ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓ
ｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｈｅ ５０
５５ ６０ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｒ
ｏ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｓｎ ６５
７０ ７５ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｖａ
ｌ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ ８０
８５ ９０ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅ
ｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ ９５
１００ １０５ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｙ
ｒ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｙｒ １１０
１１５ １２０ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒ
ｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ １２５
１３０ １３５ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ １４０
１４５ １５０ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａ
ｌ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ １５５
１６０ １６５ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌ
ｎ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｌｅｕ １７０
１７５ １８０ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｈｉ
ｓ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ １８５
１９０ １９５ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ｇｌ
ｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｍｅｔ ２００
２０５ ２１０ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｖａ
ｌ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ ２１５
２２０ ２２５ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓ
ｐ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｎ ２３０
２３５ ２４０ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｐｈ
ｅ Ａｓｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ ２４５
２５０ ２５５ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｌ
ａ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ ２６０
２６５ ２７０ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅ
ｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｇｌｕ ２７５
２８０ ２８５ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｇｌ
ｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ ２９０
２９５ ３００ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌ
ｅ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ ３０５
３１０ ３１５ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｙ
ｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ ３２０
３２５ ３３０ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｙｒ ３３５
３４０ ３４５ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｔｈ
ｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｍｅｔ ３５０
３５５ ３６０ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｇｌ
ｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ ３６５
３７０ ３７５ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｈ
ｒ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｌａ ３８０
３８５ ３９０ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｒ
ｐ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙｓ ３９５
４００ 配列番号：２ 配列の長さ：３８１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 配列 Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｎ
Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ 1 5 10 15 Tyr Gln Leu Ile Tyr Arg Trp Ser Ser Glu Arg Leu Asn Gln Ile ２０ ２５
３０ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｌ
ａ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｙｒ ３５
４０ ４５ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｌｅ
ｕ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｈｉｓ ５０
５５ ６０ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａｒ
ｇ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ ６５
７０ ７５ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｌ
ｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｖａｌ ８０
８５ ９０ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｇｌ
ｙ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ ９５
１００ １０５ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌ
ｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈｅ １１０
１１５ １２０ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ １２５
１３０ １３５ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｙ
ｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｈｉｓ １４０
１４５ １５０ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｖａ
ｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ １５５
１６０ １６５ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｒ
ｇ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｒｐ １７０
１７５ １８０ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ａｌ
ａ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ １８５
１９０ １９５ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈ
ｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ ２００
２０５ ２１０ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌ
ｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｒｇ ２１５
２２０ ２２５ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅ
ｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ ２３０
２３５ ２４０ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｉｌ
ｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｌａ ２４５
２５０ ２５５ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｖａ
ｌ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｕ ２６０
２６５ ２７０ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｉｌ
ｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｙｓ ２７５
２８０ ２８５ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｐｒ
ｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｎ Ｓｅｒ ２９０
２９５ ３００ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｌ
ａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｖａｌ ３０５
３１０ ３１５ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｙ
ｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ ３２０
３２５ ３３０ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｌ
ａ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ ３３５
３４０ ３４５ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌ
ｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ ３５０
３５５ ３６０ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｈ
ｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｌｙｓ ３６５
３７０ ３７５ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙｓ ３８０ 配列番号：３ 配列の長さ：２７１８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 ＣＴＧＣＡＧＣＡＡＣ ＡＡＡＴＣＧＧＣＧＡ ＡＴＴＴＧＣＴＣＴＡ ＴＡＴ
ＧＴＴＧＣＧＧ ＧＣＣＧＴＡＡＧＣＧ ＣＡＣＴＧＣＣＣＧＡ ６０ ＣＴＴＣＧＡＴＣＴＴ ＣＧＧＴＴＴＧＴＴＧ ＣＧＣＣＣＡＴＧＧＡ ＡＡＴ
ＣＧＣＴＧＣＣ ＧＣＡＧＧＴＡＡＣＧ ＡＡＴＧＣＣＧＣＧＣ １２０ ＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣ ＡＡＡＡＴＣＡＴＡＣ ＡＡＣＴＧＡＣＧＡＧ ＣＣＡ
ＧＴＴＣＣＧＧ ＣＣＣＡＴＧＧＴＡＡ ＣＴＧＧＡＧＡＡＴＡ １８０ ＣＴＴＣＡＡＣＣＣＣ ＣＡＴＣＡＣＣＣＣＴ ＧＣＴＴＴＣＡＧＣＡ ＴＡＣ
ＧＣＴＣＡＡＴ ＣＡＣＣＴＧＡＧＴＧ ＴＧＡＴＣＣＴＧＣＴ ２４０ ＴＡＡＣＧＴＴＧＧＣ ＡＣＣＧＡＴＡＴＧＣ ＧＣＣＡＣＧＡＴＣＧ ＧＧＡ
ＴＧＣＣＡＣＣ ＡＴＴＣＴＧＧＣＧＧ ＡＴＣＡＣＣＴＣＡＡ ３００ ＣＣＡＴＧＴＣＧＣＴ ＣＡＴＧＧＣＣＧＧＧ ＴＡＧＧＴＴＡＣＣＧ ＧＣＡ
ＴＧＴＡＧＣＡ ＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴ ＧＧＣＣＣＡＡＡＡＡ ３６０ ＡＡＴＣＣＣＡＧＴＡ ＡＡＡＧＴＴＧＡＴＣ ＡＡＡＧＧＣＡＴＡＴ ＣＣＧ
ＣＴＣＴＧＧＣ ＧＣＣＡＣＣＧＧＣＡ ＣＧＡＴＡＡＧＧＡＡ ４２０ ＣＣＡＡＣＡＧＣＧＧ ＡＴＧＣＴＣＧＴＣＡ ＴＴＧＣＧＣＴＣＡＴ ＣＴＴ
ＣＣＡＧＴＡＴ ＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣ ＡＴＣＴＧＣＴＣＴＴ ４８０ ＣＣＴＧＴＧＧＡＡＧ ＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡ ＣＡＣＡＧＣＴＧＣＴ ＧＣＡ
ＡＣＣＧＣＴＧ ＴＴＣＡＴＣＣＡＧＡ ＴＡＧＡＡＡＴＴＣＡ ５４０ ＧＴＴＣＡＣＧＣＡＧ ＣＴＴＴＴＣＧＡＡＣ ＴＴＴＣＴＴＧＧＣＧ ＴＣＡ
ＡＣＴＣＣＣＧ ＣＴＧＧＡＴＣＧＣＡ ＣＴＡＡＡＡＴＴＣＴ ６００ ＧＧＴＧＧＡＴＣＧＣ ＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴ ＴＣＡＣＴＧＧＧＧＧ ＴＡＡ
ＡＡＣＣＡＴＡ ＴＣＣＣＡＧＣＡＧＡ ＴＧＡＴＡＧＴＴＧＣ ６６０ ＧＣＣＣＣＴＣＡＡＡ ＧＧＴＧＣＡＧＴＣＡ ＡＴＣＴＣＡＡＴＡＣ ＣＧＧ
ＡＣＡＡＣＡＣ ＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧ ＧＡＴＧＡＧＧＣＴＡ ７２０ ＡＧＧＣＴＴＴＧＧＣ ＴＧＣＴＧＣＴＡＣＣ ＧＡＡＴＡＡＧＣＧＣ ＴＧＴ
ＴＡＴＧＧＴＣ ＧＧＴＴＡＣＧＧＣＣ ＡＧＴＧＴＧＣＴＧＡ ７８０ ＴＣＣＣＣＴＧＣＴＣ ＣＴＧＧＣＡＡＣＧＣ ＧＣＧＡＴＣＡＧＣＡ ＣＧＴ
ＣＡＡＣＣＧＧ ＧＡＡＧＴＣＣＧＣＡ ＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴ ８４０ ＡＧＴＴＧＧＡＡＴＧ ＣＡＴＧＴＧＣＡＧＡ ＴＣＡＡＴＣＴＴＴＴ ＣＣＡ
ＴＣＴＴＡＴＣ ＴＣＣＴＣＧＧＴＴＣ ＣＴＧＣＴＡＴＣＴＧ ９００ ＡＴＴＣＧＣＡＣＣＡ ＴＴＧＡＴＴＡＴＧＣ ＴＧＧＴＴＴＴＡＴＣ ＡＣＡ
ＧＧＣＣＣＡＴ ＴＴＧＧＴＣＴＴＴＴ ＴＧＡＣＣＡＡＡＧＣ ９６０ ＡＣＡＣＴＡＴＧＴＴ ＴＡＡＣＣＴＧＣＡＡ ＴＴＧＡＡＧＣＡＣＴ ＧＣＧ
ＣＴＧＧＣＣＴ ＧＡＴＧＡＡＴＴＴＡ ＡＴＡＴＣＣＡＴＴＧ １０２０ ＴＡＴＴＡＣＧＡＧＡ ＣＴＡＡＣＡＡＧＣＣ ＣＧＴＣＧＧＴＧＡＡ ＧＴＡ
ＣＡＴＣＴＣＡ ＧＣＧＡＴＡＧＣＡＣ ＡＴＣＡＴＣＣＧＣＡ １０８０ ＡＧＧＣＣＣＡＴＣＴ ＧＣＧＧＴＴＣＴＡＣ ＡＣＧＡＴＧＡＴＴＡ ＴＡＴ
ＴＧＡＧＧＧＡ ＡＣＡＴＣＡＡＴＧＣ ＴＡＡＡＡＡＣＴＣＴ １１４０ ＴＣＡＣＧＣＴＴＴＣ ＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴ ＴＧＣＴＧＡＴＴＴＧ ＣＴＧ
ＧＣＴＧＧＴＴ ＣＣＴＧＣＣＡＣＧＧ ＣＧＧＡＧＡＣＣＡＡ １２００ ＴＡＡＣＡＡＣＣＣＴ ＣＡＡＧＴＴＣＡＧＧ ＴＡＡＧＣＧＡＣＡＧ ＣＧＴ
ＴＴＣＴＴＡＴ ＣＡＧＴＴＧＡＴＣＴ ＡＣＣＧＣＴＧＧＡＧ １２６０ ＣＡＧＴＧＡＧＣＧＧ ＴＴＡＡＡＣＣＡＧＡ ＴＴＣＴＣＡＡＴＧＴ ＣＧＡ
ＴＡＣＣＣＣＴ ＡＡＡＴＴＴＧＣＣＧ ＧＡＧＴＧＡＣＧＧＴ １３２０ ＴＡＡＡＴＡＴＡＣＣ ＣＣＧＧＣＣＣＡＣＡ ＡＣＧＣＣＧＴＴＡＡ ＣＣＴ
ＧＴＡＴＣＧＣ ＧＴＡＡＣＴＴＡＴＣ ＡＴＴＣＧＧＴＧＡＴ １３８０ ＣＣＣＧＧＡＧＣＴＣ ＧＧＣＡＡＣＣＧＧＣ ＣＡＡＣＧＧＴＣＧＣ ＴＴＣ
ＡＧＧＣＣＴＧ ＣＴＧＧＣＧＡＴＣＣ ＣＡＧＡＴＡＣＣＧＣ １４４０ ＡＧＧＴＡＡＡＡＣＡ ＴＴＣＣＣＡＣＴＣＧ ＴＧＴＣＴＴＡＣＣＡ ＧＣＡ
ＣＧＧＣＡＣＧ ＧＴＣＴＡＴＧＧＡＡ ＡＡＴＡＴＣＡＧＧＴ １５００ ＴＣＣＣＴＣＡＴＴＣ ＣＣＧＧＡＡＣＡＧＴ ＣＡＣＣＧＧＡＡＡＣ ＣＣＡ
ＧＴＴＧＡＴＧ ＡＴＣＧＣＧＣＡＧＴ ＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡ １５６０ ＡＧＧＣＴＡＴＧＴＧ ＧＴＴＡＴＴＧＧＴＧ ＣＴＧＡＣＴＡＴＴＴ ＴＧＧ
ＣＴＴＡＧＧＴ ＧＴＴＴＣＴＡＣＡＧ ＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧ １６２０ ＣＴＡＣＡＴＧＧＴＧ ＡＡＡＧＧＣＡＧＣＣ ＡＣＣＡＧＣＡＧＧＣ ＣＡＣ
ＴＴＡＴＧＡＣ ＡＴＧＣＴＧＧＴＣＧ ＣＣＧＣＣＣＡＡＡＧ １６８０ ＣＧＴＧＣＴＣＡＡＧ ＣＡＣＡＴＧＧＧＧＣ ＴＧＡＧＣＡＡＣＧＡ ＴＣＧ
ＴＣＴＧＴＴＣ ＣＴＴＴＣＣＧＧＣＴ ＧＧＴＣＡＣＡＧＧＧ １７４０ ＣＧＧＴＴＴＴＧＴＧ ＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡ ＴＧＣＴＴＧＡＧＡＡ ＧＣＴ
ＧＧＡＧＡＧＴ ＧＴＣＧＧＣＡＴＣＡ ＡＡＣＣＴＣＡＧＧＧ １８００ ＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣ ＧＣＣＡＧＣＧＣＣＣ ＣＣＧＴＴＧＡＣＧＴ ＧＴＴ
ＴＧＣＴＴＴＧ ＡＴＧＡＡＣＧＧＴＴ ＴＴＣＴＡＴＴＴＴＴ １８６０ ＣＣＣＧＣＧＣＡＡＡ ＴＴＴＧＡＣＧＣＡＡ ＧＴＴＧＧＴＴＧＡＡ ＣＡＧ
ＣＡＴＣＧＴＧ ＡＴＣＣＴＡＴＣＧＧ ＣＴＴＴＣＧＣＴＴＡ １９２０ ＣＧＡＧＡＡＴＴＡＣ ＴＡＣＧＧＧＡＴＴＣ ＣＡＧＧＧＡＴＧＧＣ ＣＣＧ
ＣＧＣＡＴＴＧ ＣＴＣＡＡＴＧＡＣＧ ＡＡＴＡＴＴＡＣＧＡ １９８０ ＧＧＴＣＧＣＣＡＡＧ ＡＡＡＧＣＣＴＡＴＧ ＡＧＣＧＣＣＡＡＣＣ ＧＴＴ
ＣＡＡＴＣＣＡ ＧＡＣＧＡＴＡＴＴＣ ＣＴＡＣＣＧＡＴＣＴ ２０４０ ＧＣＡＣＡＡＡＣＴＧ ＡＴＡＣＧＧＣＣＧＧ ＡＡＴＡＴＴＴＣＡＡ ＣＣＣ
ＧＣＡＡＴＡＣ ＴＴＴＧＣＣＡＡＣＴ ＣＧＧＣＣＴＡＣＧＧ ２１００ ＣＡＡＧＣＴＧＡＴＣ ＧＣＴＡＣＡＧＣＣＣ ＡＡＧＣＣＴＡＴＣＧ ＣＴＧ
ＧＧＴＧＡＴＣ ＣＡＡＴＣＡＣＣＧＧ ＴＴＣＧＴＡＡＣＴＡ ２１６０ ＴＴＡＣＧＧＣＧＡＡ ＡＣＡＧＡＣＧＡＡＧ ＣＣＡＴＣＡＣＧＧＴ ＴＧＧ
ＣＧＴＴＧＧＣ ＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡ ＴＧＡＣＣＴＡＣＧＣ ２２２０ ＡＣＡＡＧＣＧＡＴＧ ＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡ ＡＴＡＣＣＡＡＧＧＴ ＴＧＡ
ＧＧＣＧＡＴＣ ＴＣＣＡＣＧＧＧＧＧ ＡＴＡＣＣＡＣＧＣＡ ２２８０ ＣＣＧＧＧＧＣＡＣＣ ＴＴＴＧＣＧＡＣＣＧ ＣＣＧＴＧＣＣＧＣＡ ＧＴＧ
ＧＡＡＡＴＴＧ ＴＧＧＴＴＣＧＡＴＡ ＧＣＡＡＡＴＡＡＴＧ ２３４０ ＣＧＣＡＴＴＡＡＧＣ ＣＧＴＴＴＧＧＣＴＴ ＴＣＣＴＧＣＴＡＡＡ ＣＡＣ
ＡＡＧＧＣＣＣ ＣＧＧＴＡＡＡＧＧＧ ＧＣＣＴＴＧＴＡＧＣ ２４００ ＧＡＴＡＴＧＧＡＡＡ ＧＡＣＧＴＴＧＡＧＣ ＴＧＡＴＴＡＣＴＣＡ ＧＡＣ
ＡＴＣＧＣＣＴ ＧＡＴＡＧＧＣＧＧＴ ＡＧＴＧＡＣＣＴＴＣ ２４６０ ＣＡＡＡＧＡＴＡＧＣ ＧＣＧＧＴＧＣＣＴＧ ＧＧＧＴＧＣＣＧＧＧ ＴＧＣ
ＴＴＣＴＴＣＴ ＧＧＡＴＡＴＧＴＴＴ ＧＴＡＡＡＡＣＴＣＡ ２５２０ ＴＣＣＧＧＧＣＴＣＡ ＴＣＴＧＧＴＴＡＡＴ ＡＣＧＧＴＴＴＡＣＣ ＧＣＴ
ＡＣＧＣＧＣＴ ＴＡＴＣＧＧＡＴＧＡ ＧＡＡＴＧＴＧＣＧＣ ２５８０ ＡＧＣＡＴＣＧＣＣＣ ＣＧＧＣＧＣＣＡＴＴ ＧＡＣＡＴＡＧＧＡＡ ＡＣＡ
ＡＴＧＧＴＧＧ ＣＡＴＡＧＣＧＡＡＧ ＣＧＴＴＴＧＴＧＧＡ ２６４０ ＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣ ＣＧＧＣＴＡＧＣＴＧ ＣＴＧＧＣＴＴＴＧＡ ＡＧＡ
ＡＴＡＴＴＧＡ ＴＡＴＡＧＧＣＣＧＴ ＴＣＣＣＡＧＡＴＣＡ ２７００ ＡＴＡＴＴＡＡＣＣＧ ＣＣＧＧＡＴＣＣ
ｅ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｃｙｓ １ ５
１０ １５ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｔｈ
ｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｖａｌ ２０
２５ ３０ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌ
ｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｓｅｒ ３５
４０ ４５ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓ
ｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｈｅ ５０
５５ ６０ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｒ
ｏ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｓｎ ６５
７０ ７５ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｖａ
ｌ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ ８０
８５ ９０ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅ
ｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ ９５
１００ １０５ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｙ
ｒ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｙｒ １１０
１１５ １２０ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｒ
ｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ １２５
１３０ １３５ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ １４０
１４５ １５０ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｖａ
ｌ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ １５５
１６０ １６５ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌ
ｎ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｌｅｕ １７０
１７５ １８０ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｈｉ
ｓ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ １８５
１９０ １９５ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ｇｌ
ｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｍｅｔ ２００
２０５ ２１０ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｖａ
ｌ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ ２１５
２２０ ２２５ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓ
ｐ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｎ ２３０
２３５ ２４０ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｐｈ
ｅ Ａｓｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ ２４５
２５０ ２５５ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｌ
ａ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ ２６０
２６５ ２７０ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅ
ｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｇｌｕ ２７５
２８０ ２８５ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｇｌ
ｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ ２９０
２９５ ３００ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌ
ｅ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ ３０５
３１０ ３１５ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｙ
ｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ ３２０
３２５ ３３０ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｙｒ ３３５
３４０ ３４５ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｔｈ
ｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｍｅｔ ３５０
３５５ ３６０ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｇｌ
ｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ ３６５
３７０ ３７５ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｈ
ｒ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｌａ ３８０
３８５ ３９０ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｒ
ｐ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙｓ ３９５
４００ 配列番号：２ 配列の長さ：３８１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 配列 Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｎ
Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ 1 5 10 15 Tyr Gln Leu Ile Tyr Arg Trp Ser Ser Glu Arg Leu Asn Gln Ile ２０ ２５
３０ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｌ
ａ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｙｒ ３５
４０ ４５ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｌｅ
ｕ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｈｉｓ ５０
５５ ６０ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａｒ
ｇ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ ６５
７０ ７５ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｌ
ｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｖａｌ ８０
８５ ９０ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｇｌ
ｙ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ ９５
１００ １０５ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌ
ｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈｅ １１０
１１５ １２０ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ １２５
１３０ １３５ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｙ
ｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｈｉｓ １４０
１４５ １５０ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｖａ
ｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ １５５
１６０ １６５ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｒ
ｇ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｒｐ １７０
１７５ １８０ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ａｌ
ａ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ １８５
１９０ １９５ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈ
ｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ ２００
２０５ ２１０ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌ
ｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｒｇ ２１５
２２０ ２２５ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅ
ｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ ２３０
２３５ ２４０ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｉｌ
ｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｌａ ２４５
２５０ ２５５ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｖａ
ｌ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｕ ２６０
２６５ ２７０ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｉｌ
ｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｙｓ ２７５
２８０ ２８５ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｐｒ
ｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｎ Ｓｅｒ ２９０
２９５ ３００ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｌ
ａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｖａｌ ３０５
３１０ ３１５ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｙ
ｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ ３２０
３２５ ３３０ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｌ
ａ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ ３３５
３４０ ３４５ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌ
ｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ ３５０
３５５ ３６０ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｈ
ｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｌｙｓ ３６５
３７０ ３７５ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙｓ ３８０ 配列番号：３ 配列の長さ：２７１８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 ＣＴＧＣＡＧＣＡＡＣ ＡＡＡＴＣＧＧＣＧＡ ＡＴＴＴＧＣＴＣＴＡ ＴＡＴ
ＧＴＴＧＣＧＧ ＧＣＣＧＴＡＡＧＣＧ ＣＡＣＴＧＣＣＣＧＡ ６０ ＣＴＴＣＧＡＴＣＴＴ ＣＧＧＴＴＴＧＴＴＧ ＣＧＣＣＣＡＴＧＧＡ ＡＡＴ
ＣＧＣＴＧＣＣ ＧＣＡＧＧＴＡＡＣＧ ＡＡＴＧＣＣＧＣＧＣ １２０ ＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣ ＡＡＡＡＴＣＡＴＡＣ ＡＡＣＴＧＡＣＧＡＧ ＣＣＡ
ＧＴＴＣＣＧＧ ＣＣＣＡＴＧＧＴＡＡ ＣＴＧＧＡＧＡＡＴＡ １８０ ＣＴＴＣＡＡＣＣＣＣ ＣＡＴＣＡＣＣＣＣＴ ＧＣＴＴＴＣＡＧＣＡ ＴＡＣ
ＧＣＴＣＡＡＴ ＣＡＣＣＴＧＡＧＴＧ ＴＧＡＴＣＣＴＧＣＴ ２４０ ＴＡＡＣＧＴＴＧＧＣ ＡＣＣＧＡＴＡＴＧＣ ＧＣＣＡＣＧＡＴＣＧ ＧＧＡ
ＴＧＣＣＡＣＣ ＡＴＴＣＴＧＧＣＧＧ ＡＴＣＡＣＣＴＣＡＡ ３００ ＣＣＡＴＧＴＣＧＣＴ ＣＡＴＧＧＣＣＧＧＧ ＴＡＧＧＴＴＡＣＣＧ ＧＣＡ
ＴＧＴＡＧＣＡ ＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴ ＧＧＣＣＣＡＡＡＡＡ ３６０ ＡＡＴＣＣＣＡＧＴＡ ＡＡＡＧＴＴＧＡＴＣ ＡＡＡＧＧＣＡＴＡＴ ＣＣＧ
ＣＴＣＴＧＧＣ ＧＣＣＡＣＣＧＧＣＡ ＣＧＡＴＡＡＧＧＡＡ ４２０ ＣＣＡＡＣＡＧＣＧＧ ＡＴＧＣＴＣＧＴＣＡ ＴＴＧＣＧＣＴＣＡＴ ＣＴＴ
ＣＣＡＧＴＡＴ ＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣ ＡＴＣＴＧＣＴＣＴＴ ４８０ ＣＣＴＧＴＧＧＡＡＧ ＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡ ＣＡＣＡＧＣＴＧＣＴ ＧＣＡ
ＡＣＣＧＣＴＧ ＴＴＣＡＴＣＣＡＧＡ ＴＡＧＡＡＡＴＴＣＡ ５４０ ＧＴＴＣＡＣＧＣＡＧ ＣＴＴＴＴＣＧＡＡＣ ＴＴＴＣＴＴＧＧＣＧ ＴＣＡ
ＡＣＴＣＣＣＧ ＣＴＧＧＡＴＣＧＣＡ ＣＴＡＡＡＡＴＴＣＴ ６００ ＧＧＴＧＧＡＴＣＧＣ ＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴ ＴＣＡＣＴＧＧＧＧＧ ＴＡＡ
ＡＡＣＣＡＴＡ ＴＣＣＣＡＧＣＡＧＡ ＴＧＡＴＡＧＴＴＧＣ ６６０ ＧＣＣＣＣＴＣＡＡＡ ＧＧＴＧＣＡＧＴＣＡ ＡＴＣＴＣＡＡＴＡＣ ＣＧＧ
ＡＣＡＡＣＡＣ ＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧ ＧＡＴＧＡＧＧＣＴＡ ７２０ ＡＧＧＣＴＴＴＧＧＣ ＴＧＣＴＧＣＴＡＣＣ ＧＡＡＴＡＡＧＣＧＣ ＴＧＴ
ＴＡＴＧＧＴＣ ＧＧＴＴＡＣＧＧＣＣ ＡＧＴＧＴＧＣＴＧＡ ７８０ ＴＣＣＣＣＴＧＣＴＣ ＣＴＧＧＣＡＡＣＧＣ ＧＣＧＡＴＣＡＧＣＡ ＣＧＴ
ＣＡＡＣＣＧＧ ＧＡＡＧＴＣＣＧＣＡ ＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴ ８４０ ＡＧＴＴＧＧＡＡＴＧ ＣＡＴＧＴＧＣＡＧＡ ＴＣＡＡＴＣＴＴＴＴ ＣＣＡ
ＴＣＴＴＡＴＣ ＴＣＣＴＣＧＧＴＴＣ ＣＴＧＣＴＡＴＣＴＧ ９００ ＡＴＴＣＧＣＡＣＣＡ ＴＴＧＡＴＴＡＴＧＣ ＴＧＧＴＴＴＴＡＴＣ ＡＣＡ
ＧＧＣＣＣＡＴ ＴＴＧＧＴＣＴＴＴＴ ＴＧＡＣＣＡＡＡＧＣ ９６０ ＡＣＡＣＴＡＴＧＴＴ ＴＡＡＣＣＴＧＣＡＡ ＴＴＧＡＡＧＣＡＣＴ ＧＣＧ
ＣＴＧＧＣＣＴ ＧＡＴＧＡＡＴＴＴＡ ＡＴＡＴＣＣＡＴＴＧ １０２０ ＴＡＴＴＡＣＧＡＧＡ ＣＴＡＡＣＡＡＧＣＣ ＣＧＴＣＧＧＴＧＡＡ ＧＴＡ
ＣＡＴＣＴＣＡ ＧＣＧＡＴＡＧＣＡＣ ＡＴＣＡＴＣＣＧＣＡ １０８０ ＡＧＧＣＣＣＡＴＣＴ ＧＣＧＧＴＴＣＴＡＣ ＡＣＧＡＴＧＡＴＴＡ ＴＡＴ
ＴＧＡＧＧＧＡ ＡＣＡＴＣＡＡＴＧＣ ＴＡＡＡＡＡＣＴＣＴ １１４０ ＴＣＡＣＧＣＴＴＴＣ ＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴ ＴＧＣＴＧＡＴＴＴＧ ＣＴＧ
ＧＣＴＧＧＴＴ ＣＣＴＧＣＣＡＣＧＧ ＣＧＧＡＧＡＣＣＡＡ １２００ ＴＡＡＣＡＡＣＣＣＴ ＣＡＡＧＴＴＣＡＧＧ ＴＡＡＧＣＧＡＣＡＧ ＣＧＴ
ＴＴＣＴＴＡＴ ＣＡＧＴＴＧＡＴＣＴ ＡＣＣＧＣＴＧＧＡＧ １２６０ ＣＡＧＴＧＡＧＣＧＧ ＴＴＡＡＡＣＣＡＧＡ ＴＴＣＴＣＡＡＴＧＴ ＣＧＡ
ＴＡＣＣＣＣＴ ＡＡＡＴＴＴＧＣＣＧ ＧＡＧＴＧＡＣＧＧＴ １３２０ ＴＡＡＡＴＡＴＡＣＣ ＣＣＧＧＣＣＣＡＣＡ ＡＣＧＣＣＧＴＴＡＡ ＣＣＴ
ＧＴＡＴＣＧＣ ＧＴＡＡＣＴＴＡＴＣ ＡＴＴＣＧＧＴＧＡＴ １３８０ ＣＣＣＧＧＡＧＣＴＣ ＧＧＣＡＡＣＣＧＧＣ ＣＡＡＣＧＧＴＣＧＣ ＴＴＣ
ＡＧＧＣＣＴＧ ＣＴＧＧＣＧＡＴＣＣ ＣＡＧＡＴＡＣＣＧＣ １４４０ ＡＧＧＴＡＡＡＡＣＡ ＴＴＣＣＣＡＣＴＣＧ ＴＧＴＣＴＴＡＣＣＡ ＧＣＡ
ＣＧＧＣＡＣＧ ＧＴＣＴＡＴＧＧＡＡ ＡＡＴＡＴＣＡＧＧＴ １５００ ＴＣＣＣＴＣＡＴＴＣ ＣＣＧＧＡＡＣＡＧＴ ＣＡＣＣＧＧＡＡＡＣ ＣＣＡ
ＧＴＴＧＡＴＧ ＡＴＣＧＣＧＣＡＧＴ ＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡ １５６０ ＡＧＧＣＴＡＴＧＴＧ ＧＴＴＡＴＴＧＧＴＧ ＣＴＧＡＣＴＡＴＴＴ ＴＧＧ
ＣＴＴＡＧＧＴ ＧＴＴＴＣＴＡＣＡＧ ＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧ １６２０ ＣＴＡＣＡＴＧＧＴＧ ＡＡＡＧＧＣＡＧＣＣ ＡＣＣＡＧＣＡＧＧＣ ＣＡＣ
ＴＴＡＴＧＡＣ ＡＴＧＣＴＧＧＴＣＧ ＣＣＧＣＣＣＡＡＡＧ １６８０ ＣＧＴＧＣＴＣＡＡＧ ＣＡＣＡＴＧＧＧＧＣ ＴＧＡＧＣＡＡＣＧＡ ＴＣＧ
ＴＣＴＧＴＴＣ ＣＴＴＴＣＣＧＧＣＴ ＧＧＴＣＡＣＡＧＧＧ １７４０ ＣＧＧＴＴＴＴＧＴＧ ＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡ ＴＧＣＴＴＧＡＧＡＡ ＧＣＴ
ＧＧＡＧＡＧＴ ＧＴＣＧＧＣＡＴＣＡ ＡＡＣＣＴＣＡＧＧＧ １８００ ＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣ ＧＣＣＡＧＣＧＣＣＣ ＣＣＧＴＴＧＡＣＧＴ ＧＴＴ
ＴＧＣＴＴＴＧ ＡＴＧＡＡＣＧＧＴＴ ＴＴＣＴＡＴＴＴＴＴ １８６０ ＣＣＣＧＣＧＣＡＡＡ ＴＴＴＧＡＣＧＣＡＡ ＧＴＴＧＧＴＴＧＡＡ ＣＡＧ
ＣＡＴＣＧＴＧ ＡＴＣＣＴＡＴＣＧＧ ＣＴＴＴＣＧＣＴＴＡ １９２０ ＣＧＡＧＡＡＴＴＡＣ ＴＡＣＧＧＧＡＴＴＣ ＣＡＧＧＧＡＴＧＧＣ ＣＣＧ
ＣＧＣＡＴＴＧ ＣＴＣＡＡＴＧＡＣＧ ＡＡＴＡＴＴＡＣＧＡ １９８０ ＧＧＴＣＧＣＣＡＡＧ ＡＡＡＧＣＣＴＡＴＧ ＡＧＣＧＣＣＡＡＣＣ ＧＴＴ
ＣＡＡＴＣＣＡ ＧＡＣＧＡＴＡＴＴＣ ＣＴＡＣＣＧＡＴＣＴ ２０４０ ＧＣＡＣＡＡＡＣＴＧ ＡＴＡＣＧＧＣＣＧＧ ＡＡＴＡＴＴＴＣＡＡ ＣＣＣ
ＧＣＡＡＴＡＣ ＴＴＴＧＣＣＡＡＣＴ ＣＧＧＣＣＴＡＣＧＧ ２１００ ＣＡＡＧＣＴＧＡＴＣ ＧＣＴＡＣＡＧＣＣＣ ＡＡＧＣＣＴＡＴＣＧ ＣＴＧ
ＧＧＴＧＡＴＣ ＣＡＡＴＣＡＣＣＧＧ ＴＴＣＧＴＡＡＣＴＡ ２１６０ ＴＴＡＣＧＧＣＧＡＡ ＡＣＡＧＡＣＧＡＡＧ ＣＣＡＴＣＡＣＧＧＴ ＴＧＧ
ＣＧＴＴＧＧＣ ＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡ ＴＧＡＣＣＴＡＣＧＣ ２２２０ ＡＣＡＡＧＣＧＡＴＧ ＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡ ＡＴＡＣＣＡＡＧＧＴ ＴＧＡ
ＧＧＣＧＡＴＣ ＴＣＣＡＣＧＧＧＧＧ ＡＴＡＣＣＡＣＧＣＡ ２２８０ ＣＣＧＧＧＧＣＡＣＣ ＴＴＴＧＣＧＡＣＣＧ ＣＣＧＴＧＣＣＧＣＡ ＧＴＧ
ＧＡＡＡＴＴＧ ＴＧＧＴＴＣＧＡＴＡ ＧＣＡＡＡＴＡＡＴＧ ２３４０ ＣＧＣＡＴＴＡＡＧＣ ＣＧＴＴＴＧＧＣＴＴ ＴＣＣＴＧＣＴＡＡＡ ＣＡＣ
ＡＡＧＧＣＣＣ ＣＧＧＴＡＡＡＧＧＧ ＧＣＣＴＴＧＴＡＧＣ ２４００ ＧＡＴＡＴＧＧＡＡＡ ＧＡＣＧＴＴＧＡＧＣ ＴＧＡＴＴＡＣＴＣＡ ＧＡＣ
ＡＴＣＧＣＣＴ ＧＡＴＡＧＧＣＧＧＴ ＡＧＴＧＡＣＣＴＴＣ ２４６０ ＣＡＡＡＧＡＴＡＧＣ ＧＣＧＧＴＧＣＣＴＧ ＧＧＧＴＧＣＣＧＧＧ ＴＧＣ
ＴＴＣＴＴＣＴ ＧＧＡＴＡＴＧＴＴＴ ＧＴＡＡＡＡＣＴＣＡ ２５２０ ＴＣＣＧＧＧＣＴＣＡ ＴＣＴＧＧＴＴＡＡＴ ＡＣＧＧＴＴＴＡＣＣ ＧＣＴ
ＡＣＧＣＧＣＴ ＴＡＴＣＧＧＡＴＧＡ ＧＡＡＴＧＴＧＣＧＣ ２５８０ ＡＧＣＡＴＣＧＣＣＣ ＣＧＧＣＧＣＣＡＴＴ ＧＡＣＡＴＡＧＧＡＡ ＡＣＡ
ＡＴＧＧＴＧＧ ＣＡＴＡＧＣＧＡＡＧ ＣＧＴＴＴＧＴＧＧＡ ２６４０ ＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣ ＣＧＧＣＴＡＧＣＴＧ ＣＴＧＧＣＴＴＴＧＡ ＡＧＡ
ＡＴＡＴＴＧＡ ＴＡＴＡＧＧＣＣＧＴ ＴＣＣＣＡＧＡＴＣＡ ２７００ ＡＴＡＴＴＡＡＣＣＧ ＣＣＧＧＡＴＣＣ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/18 9/18 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (24)
- 【請求項１】配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配
列中の１またはそれ以上のアミノ酸の欠失、置換、ある
いは付加による変異を含むアミノ酸配列を有するエステ
ル分解酵素であって、該変異を含むエステル分解酵素
が、該変異を含まないエステル分解酵素と同等またはそ
れ以上の比活性を有する、エステル分解酵素。 - 【請求項２】配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配
列中の１またはそれ以上のアミノ酸の欠失、置換、ある
いは付加による変異を含むアミノ酸配列を有するエステ
ル分解酵素であって、該変異を含むエステル分解酵素
が、該変異を含まないエステル分解酵素と同等またはそ
れ以上の比活性を有する、エステル分解酵素。 - 【請求項３】配列表の配列番号１で示されるアミノ酸を
コードするエステル分解酵素遺伝子。 - 【請求項４】配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配
列中の１またはそれ以上のアミノ酸の欠失、置換、ある
いは付加による変異を含むアミノ酸配列をコードするエ
ステル分解酵素であって、該変異を含む遺伝子によって
発現されるエステル分解酵素が、該変異を含まない遺伝
子によって発現されるエステル分解酵素と同等またはそ
れ以上の比活性を有する、エステル分解酵素遺伝子。 - 【請求項５】配列表の配列番号２で示されるアミノ酸を
コードするエステル分解酵素遺伝子。 - 【請求項６】配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配
列中の１またはそれ以上のアミノ酸の欠失、置換、ある
いは付加による変異を含むアミノ酸配列をコードするエ
ステル分解酵素であって、該変異を含む遺伝子によって
発現されるエステル分解酵素が、該変異を含まない遺伝
子によって発現されるエステル分解酵素と同等またはそ
れ以上の比活性を有する、エステル分解酵素遺伝子。 - 【請求項７】配列表の配列番号３の1127位のＡから2335
位のＡまでの塩基配列を有するエステル分解酵素遺伝
子。 - 【請求項８】配列表の配列番号３の1193位のＧから2335
位のＡまでの塩基配列を有するエステル分解酵素遺伝
子。 - 【請求項９】請求項３ないし８いずれかの項に記載のエ
ステル分解酵素遺伝子を含有する発現ベクター。 - 【請求項１０】前記発現ベクターが、ラクトース誘導性
プロモーターを有する請求項９に記載の発現ベクター。 - 【請求項１１】前記発現ベクターが、シグナル配列を有
し、エステル分解酵素を分泌する請求項１０に記載の発
現ベクター。 - 【請求項１２】請求項９ないし１１いずれかの項に記載
の発現ベクターで形質転換された微生物。 - 【請求項１３】前記微生物が原核生物である、請求項１
２に記載の形質転換された微生物。 - 【請求項１４】前記原核生物がEscherichia coliであ
る、請求項１３に記載の形質転換された微生物。 - 【請求項１５】前記微生物が真核生物である、請求項１
２に記載の形質転換された微生物。 - 【請求項１６】前記真核生物がSaccharomyces cerevisi
aeである、請求項１５に記載の形質転換された微生物。 - 【請求項１７】前記真核生物がAspergillus nidulansで
ある、請求項１５に記載の形質転換された微生物。 - 【請求項１８】前記真核生物が昆虫細胞である、請求項
１５に記載の形質転換された微生物。 - 【請求項１９】前記昆虫細胞が蚕細胞である、請求項１
８に記載の形質転換された微生物。 - 【請求項２０】請求項１２ないし１９いずれかの項に記
載の形質転換された微生物を培養する工程、および該培
養により生産されたエステル分解酵素を回収する工程を
含む、エステル分解酵素の製造方法。 - 【請求項２１】前記形質転換された微生物がEscherichi
a coliである、請求項２０に記載の方法。 - 【請求項２２】前記Escherichia coliが、培地にプロモ
ーターの誘導物質を添加しないで培養される、請求項２
１に記載の方法。 - 【請求項２３】前記Escherichia coliが、デンプン類を
加水分解して得られる糖類を含む培地で培養される、請
求項２１に記載の方法。 - 【請求項２４】前記Escherichia coliが60℃以上の温度
で熱処理される工程を含む、請求項２１ないし２３いず
れかの項に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8091571A JPH09275982A (ja) | 1996-04-12 | 1996-04-12 | エステル分解酵素遺伝子およびそれを用いるエステル分解酵素の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8091571A JPH09275982A (ja) | 1996-04-12 | 1996-04-12 | エステル分解酵素遺伝子およびそれを用いるエステル分解酵素の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09275982A true JPH09275982A (ja) | 1997-10-28 |
Family
ID=14030224
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8091571A Pending JPH09275982A (ja) | 1996-04-12 | 1996-04-12 | エステル分解酵素遺伝子およびそれを用いるエステル分解酵素の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09275982A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110951711A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-04-03 | 齐鲁工业大学 | 一种具有降解手性酯活性的酯酶及其编码基因和应用 |
| CN112226422A (zh) * | 2020-11-04 | 2021-01-15 | 上海绅道生物科技有限公司 | 一种活性提高的EstWY酶突变体 |
| CN112553179A (zh) * | 2020-12-04 | 2021-03-26 | 北京理工大学 | 一种耐热型聚酯塑料降解酶及其应用 |
-
1996
- 1996-04-12 JP JP8091571A patent/JPH09275982A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110951711A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-04-03 | 齐鲁工业大学 | 一种具有降解手性酯活性的酯酶及其编码基因和应用 |
| CN110951711B (zh) * | 2019-12-27 | 2022-06-21 | 齐鲁工业大学 | 一种具有降解手性酯活性的酯酶及其编码基因和应用 |
| CN112226422A (zh) * | 2020-11-04 | 2021-01-15 | 上海绅道生物科技有限公司 | 一种活性提高的EstWY酶突变体 |
| CN112553179A (zh) * | 2020-12-04 | 2021-03-26 | 北京理工大学 | 一种耐热型聚酯塑料降解酶及其应用 |
| CN112553179B (zh) * | 2020-12-04 | 2022-07-01 | 北京理工大学 | 一种耐热型聚酯塑料降解酶及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH09131180A (ja) | バチルス属細菌由来のトランスグルタミナーゼ | |
| JP2000505291A (ja) | トランスアミナーゼ及びアミノトランスフェラーゼ | |
| US6465233B1 (en) | Nucleic acid molecule encoding a cephalosporin acetylesterase | |
| JPH09173078A (ja) | 分子シャペロンを用いる蛋白質の製造方法 | |
| JPH10210981A (ja) | ハロヒドリンより光学活性ジオールへの変換を触媒する新規なタンパク質 | |
| JPH09275982A (ja) | エステル分解酵素遺伝子およびそれを用いるエステル分解酵素の製造法 | |
| CN110951711B (zh) | 一种具有降解手性酯活性的酯酶及其编码基因和应用 | |
| JP4437170B2 (ja) | 微生物、該微生物より得られるラクタマーゼ酵素、およびその使用 | |
| JPH05317066A (ja) | ハロヒドリンエポキシダ−ゼ遺伝子を有する組換え体プラ スミドにより形質転換された微生物による３−ヒドロキシ ニトリル化合物の製造法 | |
| JP2679031B2 (ja) | アミノ酸の製造法及びアミノ酸生産菌 | |
| JPH1198980A (ja) | ヌクレオシド誘導体の製造方法 | |
| JP2001292772A (ja) | ロドコッカス属細菌由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子およびアミダーゼ遺伝子 | |
| JP3427984B2 (ja) | 新規耐熱性シュクロオリゴ糖生成酵素およびその用途 | |
| US6403357B1 (en) | Thermostable D-hydantoinase and the application thereof | |
| JPH07222587A (ja) | 新規セファロスポリンｃアシラーゼ及びその製造方法 | |
| JP3113947B2 (ja) | 胆汁酸硫酸サルファターゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び胆汁酸硫酸サルファターゼの製造法 | |
| WO2000008170A1 (fr) | Gene participant a la production d'acide homoglutamique, et utilisation associee | |
| JPH0556787A (ja) | エステル不斉加水分解酵素遺伝子 | |
| JPH06303981A (ja) | ホルムアルデヒド脱水素酵素活性を有する蛋白質の遺伝情報を有するｄｎａ並びにホルムアルデヒド脱水素酵素の製造法 | |
| JP2002253256A (ja) | 改変型アミノ酸アミダーゼとそれを用いたｄ−アミノ酸の製造方法 | |
| JP2002153285A (ja) | 新規耐熱性アミノトランスフェラーゼ | |
| JPH07143881A (ja) | クレアチニンデイミナーゼ活性を有する蛋白質の遺伝情報を有するｄｎａ並びにクレアチニンデイミナーゼの製造法 | |
| JPH06253854A (ja) | 組換えｄｎａ手法によるヌクレオシド・ホスホリラーゼの製造法 | |
| JPH06133779A (ja) | 新規ｄｎａ化合物及びそれを用いて得られる組換体による３−メチル−７−アルキルキサンチンの製造法 | |
| JP2000342273A (ja) | β−フラクトフラノシダーゼ遺伝子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20051202 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060331 |