JPH10210981A

JPH10210981A - ハロヒドリンより光学活性ジオールへの変換を触媒する新規なタンパク質

Info

Publication number: JPH10210981A
Application number: JP9031400A
Authority: JP
Inventors: Fujio To; 不二夫湯; Masami Kato; 眞美加藤
Original assignee: Nitto Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Nitto Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1997-01-31
Filing date: 1997-01-31
Publication date: 1998-08-11
Anticipated expiration: 2017-01-31
Also published as: JP3728045B2

Abstract

(57)【要約】【解決手段】エポキシ加水分解活性を持つ酵素タンパ
ク質、およびハロヒドリンをエポキシドに変換する触媒
活性およびその逆反応の触媒活性を持つ酵素タンパク
質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子をベク
タープラスミドに連結した組換え体プラスミド、該組換
え体プラスミドを宿主微生物に導入した形質転換体。【効果】遺伝子組換えの方法でクローン化された遺伝
子が菌体内に多数存在する形質転換微生物の使用によ
り、光学活性エピハロヒドリンおよび光学活性ジオール
を効率よく製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ハロヒドリンをエ
ポキシドに変換する触媒活性およびその逆反応の触媒活
性を有する酵素（以下、ハロヒドリンエポキシダーゼと
略す）タンパク質およびエポキシ加水分解酵素タンパク
質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子の一方
または両方をベクタープラスミドに連結した組換え体プ
ラスミド、該組換え体プラスミドを宿主微生物に導入し
た形質転換体ならびに該形質転換体によるハロヒドリン
からの光学活性エピハロヒドリンや光学活性ジオールの
製造方法に関する。光学活性エピハロヒドリンや光学活
性ジオールは種々の医薬品や生理活性物質の合成原料と
して有用である。

【０００２】

【従来の技術】ハロヒドリンやエピハロヒドリンを光学
活性ジオールへと変換する能力を有する微生物を用いる
ことによる新規な光学活性ジオールの製造法が提案され
ている。例えば、１，３−ジハロ−２−プロパノールま
たはエピハロヒドリンを、コリネバクテリウム属、ミク
ロバクテリウム属およびオウレオバクテリウム属に属す
る微生物が（Ｒ）−３−ハロ−１，２−プロパンジオー
ルに（特開平2-291280号、同2-283295号および同5-2199
65号公報参照）、また、アグロバクテリウム属およびシ
ュードモナス属に属する微生物が（Ｓ）−３−ハロ−
１，２−プロパンジオールに（特開平4-94689 号および
同4-94690 号公報参照）変換することが見い出されてい
る。さらに、１，３−ジハロ−２−プロパノールを
（Ｒ）−エピハロヒドリンに変換する微生物からはハロ
ヒドリンエポキシダーゼ遺伝子がクローン化され、高活
性な組換え体が作製されている（特開平4-278089号公報
参照）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、１，３
−ジハロ−２−プロパノールを（Ｓ）−３−ハロ−１，
２−プロパンジオールに変換する酵素系については、い
まだ単離されておらず、その性質も全く不明であるが、
（Ｓ）−３−ハロ−１，２−プロパンジオールに変換す
る微生物についても、クローン化した遺伝子を有する組
換え体を作製することにより活性の飛躍的向上が期待で
きる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは本酵素系遺伝子のクローニングを試み、組換え
体を用いた本酵素系の高発現化に成功し、本発明を完成
した。

【０００５】すなわち、本発明は、(1) エポキシ加水分
解活性を持ち、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
列で表されることを特徴とするタンパク質、(2) ハロヒ
ドリンをエポキシドに変換する触媒活性およびその逆反
応の触媒活性を持ち、配列表の配列番号２に記載のアミ
ノ酸配列で表されることを特徴とするタンパク質、(3)
上記(1) 記載のタンパク質をコードする遺伝子、(4) 上
記(2) 記載のタンパク質をコードする遺伝子、(5) 配列
表の配列番号３に記載の塩基配列を有する上記(3) 記載
の遺伝子、(6) 配列表の配列番号４に記載の塩基配列を
有する上記(4)記載の遺伝子、(7) 上記(3) または(5)
記載の遺伝子をベクタープラスミドに連結した組換え体
プラスミド、(8) 上記(4) または(6) 記載の遺伝子をベ
クタープラスミドに連結した組換え体プラスミド、(9)
上記(3) または(5) 記載の遺伝子と上記(4) または(6)
記載の遺伝子を共にベクタープラスミドに連結した組換
え体プラスミド、(10)上記(7) 記載の組換え体プラスミ
ドを宿主微生物に導入した形質転換体、(11)上記(8) 記
載の組換え体プラスミドを宿主微生物に導入した形質転
換体、(12)上記(9) 記載の組換え体プラスミドを宿主微
生物に導入した形質転換体、(13)上記(10)記載の形質転
換体を培養して上記(1) 記載のタンパク質を産生させる
方法、(14)上記(11)記載の形質転換体を培養して上記
(2) 記載のタンパク質を産生させる方法、(15)上記(12)
記載の形質転換体を培養して上記(1) および(2) 記載の
タンパク質を産生させる方法、(16)上記(10)記載の形質
転換体または上記(1) 記載のタンパク質をエピハロヒド
リンに作用させて（Ｓ）−３−ハロ−１，２−プロパン
ジオールを得ることを特徴とする（Ｓ）−３−ハロ−
１，２−プロパンジオールの製造法、(17)上記(11)記載
の形質転換体または上記(2)記載のタンパク質を１，３
−ジハロ−２−プロパノールに作用させて（Ｓ）−エピ
ハロヒドリンを得ることを特徴とする（Ｓ）−エピハロ
ヒドリンの製造法、ならびに(18)上記(12)記載の形質転
換体または上記(1) および(2) 記載のタンパク質を１，
３−ジハロ−２−プロパノールに作用させて（Ｓ）−３
−ハロ−１，２−プロパンジオールを得ることを特徴と
する（Ｓ）−３−ハロ−１，２−プロパンジオールの製
造法、に関する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明で例示した遺伝子供与体微
生物はアグロクテリウムラジオバクター（Agrobacter
ium radiobacter)ＤＨ０９４株であるが、その他にアグ
ロクテリウム（Agrobacterium) sp.ＤＨ０７９株などが
用いられる。これらは FERM P-15959（ＤＨ０９４株）
および FERM P-11651 （ＤＨ０７９株）として生命工学
工業技術研究所に寄託されている。ＤＨ０７９株の菌学
的性質は特開平4-94689 号公報に記載されており、ＤＨ
０９４株の菌学的性質は以下のとおりである。ＤＨ０９
４株は Bergey's Manual of Systematic Bacteriology,
volume 1 (1984)に従って検索すると、Agrobacterium
radiobacter と同定された。

【０００７】形態桿菌グラム染色性 − 芽胞 − 運動性＋鞭毛周毛集落の色調ＮＰオキシダーゼ＋カタラーゼ＋ＯＦＯ３−ケトラクトースの生成＋硝酸還元 − 亜硝酸還元 − キノン系Ｑ−１０３５℃での生育 − 酸の産生 meso−エリスリトール − メレチトース＋エタノール＋グルコース＋アルカリの産生マロン酸ナトリウム − Ｌ−酒石酸ナトリウム − プロピオン酸ナトリウム＋リトマスミルクアルカリ化＋酸化 − カゼイン分解 − ゼラチン液化 − デオキシリボヌクレアーゼ − 尿素分解＋ β−ガラクトシダーゼ＋硫化水素産生ＴＳＩ寒天培地 − 酢酸鉛寒天＋蛍光色素の産生 − グルコースからのガス産生 − 資化性Ｌ−ソルボース − Ｌ−オルニチン＋Ｌ−リジン＋ β−ヒドロキシ酪酸＋安息香酸ナトリウム − ヒマワリの茎に対する腫瘤形成 −

【０００８】本発明で用いられるベクターとしては、プ
ラスミドベクター（例えば pUC18、pUC19 、pUC118、pU
C119等）、ファージベクター（例えばλgt11等）の何れ
もが用いられる。また、形質転換に用いる宿主微生物と
しては E. coli JM109株あるいは E. coli JM105株が用
いられるが、特にこれらに限定されるものではなく、他
の宿主微生物を用いることができる。

【０００９】本発明の形質転換微生物は、これを含む培
養液、分離した菌体または菌体処理物として用いられ
る。これら形質転換微生物の培養は、通常は液体培養で
行われるが、固体培養によっても行うことができる。培
地としては、例えば、LB培地が用いられる。培養は10〜
50℃の温度で、pH２〜11の範囲で行われる。微生物の生
育を促進させるために通気撹はんを行ってもよい。

【００１０】本発明におけるハロヒドリンは１，３−ジ
ハロ−２−プロパノール、具体的には１，３−ジクロロ
−２−プロパノール、１，３−ジブロモ−２−プロパノ
ール等、エピハロヒドリンはエピクロロヒドリン、エピ
ブロモヒドリン等の光学活性体、ジオールは３−ハロ−
１，２−プロパンジオール、具体的には３−クロロ−
１，２−プロパンジオール、３−ブロモ−１，２−プロ
パンジオール等の光学活性体である。

【００１１】また、本発明におけるエピハロヒドリンや
３−ハロ−１，２−プロパンジオールを得る方法として
は、上記のように培養して得た微生物の培養液あるいは
遠心分離などにより得た菌体の懸濁液に基質を添加する
方法、菌体処理物（例えば菌体破砕物、粗酵素・精製酵
素等）あるいは常法により固定化した菌体または菌体処
理物等の懸濁液に基質を添加する方法、微生物の培養時
に基質を培養液に添加して培養と同時に反応を行う方法
等がある。

【００１２】反応液中の基質濃度は特に限定するもので
はないが、 0.1〜10 (W/V)％が好ましく、基質は反応液
に一括して加えるかあるいは分割添加することができ
る。反応温度は５〜50℃、反応pHは４〜10の範囲で行う
ことが好ましい。反応時間は基質等の濃度、菌体濃度あ
るいはその他の反応条件等によって変わるが、通常１〜
120 時間で終了するように条件を設定するのが好まし
い。

【００１３】かくして、反応液中に生成、蓄積したエピ
ハロヒドリンまたは３−ハロ−１，２−プロパンジオー
ルは公知の方法を用いて採取および生成することができ
る。例えば、反応液から遠心分離などの方法を用いて菌
体を除いた後、酢酸エチルなどの溶媒で抽出を行い、滅
菌下に溶媒を除去することによりシロップを得ることが
できる。また、このシロップを減圧下に蒸留することに
よりさらに精製することもできる。

【００１４】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらの例のみに限定されるものでは
ない。実施例１ (1) Agrobacterium radiobacter ＤＨ０９４株染色体Ｄ
ＮＡの調製とＤＮＡライブラリーの作成：Agrobacteriu
m radiobacter ＤＨ０９４株から Saito and Miuraの方
法〔Biochim. Biophys. Acta 72, 619 (1963) 参照〕に
より染色体ＤＮＡを分離し、これを制限酵素 Sau3AI で
部分分解後、６kb以上の断片をアガロースゲル電気泳動
により分離、取得した。これを BamHIで切断したベクタ
ープラスミド pUC118 に挿入し組換え体ＤＮＡのライブ
ラリーを作成した。

【００１５】(2) 形質転換体の作成および組換え体ＤＮ
Ａの選別：工程(1) で調製した組換え体ライブラリーに
よる形質転換体を作成した。形質転換は、宿主微生物と
して E. coli JM109株を用い、塩化カルシウム法〔J. M
ol. Biol. 53, 154 (1970)〕により行った。その中から
ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を示すようになったも
のを選別した。選別は以下のようにして行った。アンピ
シリン(100μg/ml) と IPTG(1mM)を含む LB 寒天培地
（１％バクトトリプトン、 0.5％バクトイーストエキ
ス、 0.5％NaCl、 1.5％寒天）にコロニーを形成させ
た。10mMトリス−塩酸緩衝液(pH 7.5)、0.02％ブロモク
レゾールパープル、１％１，３−ジクロロ−２−プロパ
ノールを染み込ませたロ紙にコロニーを移し室温にて数
時間放置した。ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を持つ
コロニーは塩酸を遊離しコロニー付近のpHは低下し、pH
指示薬であるブロモクレゾールパープルは青紫色から黄
色に変化するため、肉眼観察によりハロヒドリンエポキ
シダーゼ遺伝子を持つ株を選別することができる。こう
して得られた形質転換株から再びプラスミドＤＮＡを取
り出し、選別された目的のプラスミドを得た。このプラ
スミドを pDHD001と名付けた。

【００１６】(3) pDHD001〜003 の制限酵素地図の作成
とハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の位置：工程(2)
で得られたプラスミド pDHD001について制限酵素地図を
作成した（図１）。その後、数種の制限酵素で切断し、
より小さなＤＮＡ断片を持つプラスミドを作成した。こ
れらのプラスミドによって形質転換された組換え体のハ
ロヒドリンエポキシダーゼ活性の有無により目的遺伝子
の含まれている領域を調べた。これらのプラスミドのう
ちの一つ pDHD002は pDHD001を制限酵素 SacI による切
断後、セルフライゲーションにより得られた。pDH002の
制限酵素地図を作成し、上記と同様により小さな断片を
持つプラスミドを作製した。これらのプラスミドのうち
の一つ pDHD003は pDHD002を制限酵素 PstI による切断
後、セルフライゲーションにより得られた（図２）。な
お、ここで得られた形質転換体 JM109/pDHD003は FERM
P-15960 として生命工学工業技術研究所に寄託されてい
る。

【００１７】実施例２アンピシリン (50μg/ml) と IPTG(1mM)を含むLB培地
（１％バクトトリプトン、 0.5％バクトイーストエキ
ス、 0.5％NaCl) に JM109/pDHD003を植菌し37℃にて16
時間振盪培養を行った。こうして得られた培養液から遠
心分離により菌体を回収し、50mM Tris-硫酸緩衝液(pH
8.0)50mlで２回洗浄後50mlの1M Tris-塩酸緩衝液(pH 8.
0)に懸濁し菌体懸濁液を調製した。得られた菌体懸濁液
に50mMとなるように１，３−ジクロロ−２−プロパノー
ルを添加し20℃にて４時間反応させた。反応終了後、基
質および生成物をガスクロマトグラフィーで定量した。
予想されたエピクロロヒドリンは検出されず、３−クロ
ロ−１，２−プロパンジオールが5.3mM 生成していた。
一方、菌体懸濁液にエピクロロヒドリンおよび塩化ナト
リウムをそれぞれ50mMとなるように添加し、同様にして
2.5 時間反応させたところ、１，３−ジクロロ−２−プ
ロパノールは検出されず、基質は消失し、全量が３−ク
ロロ−１，２−プロパンジオールに変換された。

【００１８】実施例３実施例２と同様にして得られた菌体懸濁液に50mMとなる
ように１，３−ジクロロ−２−プロパノールを添加し20
℃にて2.5 時間反応させた（菌体懸濁液濃度：OD630=3
3）ところ、37.8 mM の３−クロロ−１，２−プロパン
ジオールが生成した。反応上清より酢酸エチルにより
１，３−ジクロロ−２−プロパノールを抽出後、抽出液
を無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下で溶媒除去し
た。ｐ−トルエンスルホン酸クロライドを用いて誘導体
を作製し、高速液体クロマトグラフィー（ウォーターズ
社製カラム Opti-pak PC) により光学異性体の分析を行
った。その結果、生成した３−クロロ−１，２−プロパ
ンジオールは光学純度94.4％e.e.の（Ｓ）体であった。
一方、エピクロロヒドリンとして30分間反応させた場合
には20mMの３−クロロ−１，２−プロパンジオールが生
成した。上記と同様にして光学純度を求めた結果、 3.6
％e.e.（Ｓ）体であった。

【００１９】実施例４実施例１〜３の結果より、１，３−ジクロロ−２−プロ
パノールより（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジ
オールが生成する反応はエピクロロヒドリンを経由した
反応であると考えられた。すなわち、１，３−ジクロロ
−２−プロパノールより（Ｒ）−３−クロロ−１，２−
プロパンジオールが生成する反応と同様に、２種の酵素
が関与することが推定された。そこで、プラスミド pDH
D003より欠失プラスミドを作製し、このことを検証し
た。欠失プラスミドの作製は各制限酵素切断部位を利用
して、もしくは、TAKARAデレーションキット（宝酒造
（株））を利用して行った。これらのプラスミドに含ま
れるＤＨ０９４株由来の領域を図３に示した。これらの
プラスミドをJM109 株に導入し、実施例２と同様にして
培養を行った。エポキシ加水分解活性は実施例３と同様
にしてエピクロロヒドリンを基質として測定した。ハロ
ヒドリンエポキシダーゼ活性は１，３−ジクロロ−２−
プロパノールを基質として反応を行い、pH指示薬の変化
により活性の有無を確認した。その結果、この断片中に
エポキシ加水分解酵素、ハロヒドリンエポキシダーゼの
順に遺伝子がならんでいることが推定された（図３）。
実施例１で得られたプラスミドpDHD003 のＤＨ０９４株
由来のＤＮＡの塩基配列をファルマシア社蛍光シーケン
サー ALF II を用いて決定した。その結果、配列番号５
に示される塩基配列が得られ、配列番号６に示されるよ
うに２つのオープンリーディングフレームが見いだされ
た。この２つのオープンリーディングフレームの塩基配
列は配列番号３および４、対応するアミノ酸配列は配列
番号１および２で示した。

【００２０】実施例５実施例２と同様にして得られた JM109/pDHD050菌体懸濁
液に50mMとなるように１，３−ジクロロ−２−プロパノ
ールを添加し20℃にて24時間反応させた（菌体懸濁液濃
度：OD630=30）ところ、10.5 mM のエピクロロヒドリン
が生成した。反応上清から酢酸エチルによりエピクロロ
ヒドリンを抽出後、ｐ−トルエンスルホン酸を用いて誘
導体を作製し、高速液体クロマトグラフィー（ウォータ
ーズ社製カラム Opti-pak PC) により光学異性体の分析
を行った。その結果、生成したエピクロロヒドリンは光
学純度35.5％e.e.の（Ｓ）体であった。

【００２１】

【発明の効果】遺伝子組換えの方法でクローン化された
エポキシ加水分解酵素および／またはハロヒドリンエポ
キシダーゼ遺伝子が菌体内に多数存在する形質転換微生
物の使用により、光学活性エピハロヒドリンおよび光学
活性ジオールを効率よく製造することができる。

【００２２】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：294 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源生物名：Agrobacterium radiobacter 株名：ＤＨ０９４配列： MetThrIleArgArgProGluAspPheLysHisTyrGluValGln 15 LeuProAspValLysIleHisTyrValArgGluGlyAlaGlyPro 30 ThrLeuLeuLeuLeuHisGlyTrpProGlyPheTrpTrpGluTrp 45 SerLysValIleGlyProLeuAlaGluHisTyrAspValIleVal 60 ProAspLeuArgGlyPheGlyAspSerGluLysProAspLeuAsn 75 AspLeuSerLysTyrSerLeuAspLysAlaAlaAspAspGlnAla 90 AlaLeuLeuAspAlaLeuGlyIleGluLysAlaTyrValValGly 105 HisAspPheAlaAlaIleValLeuHisLysPheIleArgLysTyr 120 SerAspArgValIleLysAlaAlaIlePheAspProIleGlnPro 135 AspPheGlyProValTyrPheGlyLeuGlyHisValHisGluSer 150 TrpTyrSerGlnPheHisGlnLeuAspMetAlaValGluValVal 165 GlySerSerArgGluValCysLysLysTyrPheLysHisPhePhe 180 AspHisTrpSerTyrArgAspGluLeuLeuThrGluGluGluLeu 195 GluValHisValAspAsnCysMetLysProAspAsnIleHisGly 210 GlyPheAsnTyrTyrArgAlaAsnIleArgProAspAlaAlaLeu 225 TrpThrAspLeuAspHisThrMetSerAspLeuProValThrMet 240 IleTrpGlyLeuGlyAspThrCysValProTyrAlaProLeuIle 255 GluPheValProLysTyrTyrSerAsnTyrThrMetGluThrIle 270 GluAspCysGlyHisPheLeuMetValGluLysProGluIleAla 285 IleAspArgIleLysThrAlaPheArg 294

【００２３】配列番号：２配列の長さ：259 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源生物名：Agrobacterium radiobacter 株名：ＤＨ０９４配列： MetSerThrAlaIleValThrAsnValLysHisPheGlyGlyMet 15 GlySerAlaLeuArgLeuSerGluAlaGlyHisThrValAlaCys 30 HisAspGluSerPheLysGlnLysAspGluLeuGluAlaPheAla 45 GluThrTyrProGlnLeuLysProMetSerGluGlnGluProAla 60 GluLeuIleGluAlaValThrSerAlaTyrGlyGlnValAspVal 75 LeuValSerAsnAspIlePheAlaProGluPheGlnProIleAsp 90 LysTyrAlaValGluAspTyrArgGlyAlaValGluAlaLeuGln 105 IleArgProPheAlaLeuValAsnAlaValAlaSerGlnMetLys 120 LysArgLysSerGlyHisIleIlePheIleThrSerAlaThrPro 135 PheGlyProTrpLysGluLeuSerThrTyrThrSerAlaArgAla 150 GlyAlaCysThrLeuAlaAsnAlaLeuSerLysGluLeuGlyGlu 165 TyrAsnIleProValPheAlaIleGlyProAsnTyrLeuHisSer 180 GluAspSerProTyrPheTyrProThrGluProTrpLysThrAsn 195 ProGluHisValAlaHisValLysLysValThrAlaLeuGlnArg 210 LeuGlyThrGlnLysGluLeuGlyGluLeuValAlaPheLeuAla 225 SerGlySerCysAspTyrLeuThrGlyGlnValPheTrpLeuAla 240 GlyGlyPheProMetIleGluArgTrpProGlyMetProGlu 259

【００２４】配列番号：３配列の長さ：885 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状起源生物名：Agrobacterium radiobacter 株名：ＤＨ０９４配列： ATG ACT ATC AGA AGA CCC GAA GAC TTT AAA CAC TAC GAA GTG CAG 45 TTA CCA GAC GTG AAA ATC CAC TAC GTC CGC GAG GGA GCG GGT CCG 90 ACA CTG TTG CTG TTG CAC GGC TGG CCC GGG TTC TGG TGG GAG TGG 135 AGC AAG GTC ATA GGC CCG CTC GCA GAG CAC TAC GAT GTC ATT GTT 180 CCC GAC CTG CGC GGC TTC GGT GAC TCC GAA AAG CCG GAC TTA AAC 225 GAC TTG TCC AAG TAC TCG CTC GAC AAA GCG GCC GAC GAC CAA GCA 270 GCC CTT CTC GAC GCA CTA GGG ATT GAA AAG GCG TAC GTC GTT GGC 315 CAT GAC TTC GCG GCC ATC GTC CTC CAT AAA TTC ATT CGA AAG TAC 360 AGC GAT CGA GTC ATC AAA GCA GCG ATC TTT GAT CCT ATC CAG CCC 405 GAC TTT GGG CCG GTC TAC TTC GGC TTG GGG CAC GTC CAC GAG TCG 450 TGG TAC TCG CAA TTC CAT CAA CTA GAT ATG GCC GTT GAG GTC GTG 495 GGC TCG AGT CGC GAG GTG TGC AAG AAG TAC TTC AAA CAC TTC TTC 540 GAT CAC TGG TCA TAC CGG GAT GAG TTG CTC ACT GAG GAA GAA CTT 585 GAG GTT CAC GTC GAT AAC TGT ATG AAG CCT GAC AAC ATT CAC GGA 630 GGC TTC AAC TAC TAT CGT GCC AAC ATA AGG CCC GAT GCC GCT CTG 675 TGG ACA GAC CTC GAT CAT ACG ATG AGC GAC CTT CCA GTA ACA ATG 720 ATA TGG GGT TTG GGA GAT ACT TGC GTG CCC TAT GCT CCA CTC ATT 765 GAA TTC GTT CCT AAG TAC TAT TCG AAC TAT ACG ATG GAG ACG ATC 810 GAA GAC TGC GGT CAC TTC TTG ATG GTC GAA AAA CCT GAA ATT GCC 855 ATC GAT CGA ATC AAA ACC GCG TTC CGC TGA 885

【００２５】配列番号：４配列の長さ：765 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状起源生物名：Agrobacterium radiobacter 株名：ＤＨ０９４配列： ATG TCA ACC GCA ATT GTA ACA AAC GTT AAG CAT TTT GGG GGA ATG 45 GGG TCT GCA CTT CGT CTC TCG GAA GCA GGA CAT ACA GTG GCT TGC 90 CAC GAT GAA AGC TTC AAA CAA AAG GAC GAA CTT GAA GCC TTT GCC 135 GAA ACC TAT CCA CAA CTC AAA CCA ATG TCG GAA CAA GAA CCA GCG 180 GAA CTC ATC GAG GCA GTT ACC TCC GCT TAT GGT CAA GTT GAT GTA 225 CTT GTG AGC AAC GAC ATA TTC GCA CCA GAG TTC CAA CCC ATA GAT 270 AAA TAC GCT GTA GAG GAC TAT CGC GGT GCG GTC GAG GCG CTA CAA 315 ATT AGA CCA TTT GCA CTG GTC AAC GCC GTT GCA AGT CAA ATG AAG 360 AAG CGC AAA AGC GGA CAT ATT ATC TTT ATT ACC TCT GCA ACG CCC 405 TTC GGG CCT TGG AAG GAA CTT TCT ACC TAC ACG TCA GCC CGA GCA 450 GGT GCA TGC ACC TTG GCA AAT GCC CTT TCG AAG GAA CTC GGT GAA 495 TAC AAC ATT CCG GTG TTC GCA ATA GGA CCC AAT TAT CTT CAC AGT 540 GAA GAT AGT CCC TAC TTC TAC CCC ACA GAA CCG TGG AAA ACG AAT 585 CCA GAA CAC GTT GCC CAT GTC AAA AAA GTC ACT GCG CTC CAG CGG 630 TTA GGT ACA CAG AAA GAA TTG GGA GAA CTC GTC GCG TTT CTC GCG 675 TCT GGT AGT TGT GAC TAT CTG ACC GGC CAG GTG TTC TGG TTG GCC 720 GGC GGA TTC CCA ATG ATC GAG CGT TGG CCT GGT ATG CCC GAG TAG 765

【００２６】配列番号：５配列の長さ：2356 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状起源生物名：Agrobacterium radiobacter 株名：ＤＨ０９４配列： GAGCTCTGCG GTTTACATCC GCGTCCACGG ATTATCGCAA GGAATCTGAG 50 CGGCCCAAGC CCATACACGG CTGAGATTTT TCATTGCGAG GCCCAAACTT 100 AGGCCGGCAC AGAAGCCGTT TGCCCTGCTT CGAACGCTCA CGCGCCGAAG 150 AAATTCGAAA CAGCTTTGCC CAACCGACAA GAGCTTGCTG TTTGACCAAA 200 CTCACAAAGA GGAGACGCCT ATGACTATCA GAAGACCCGA AGACTTTAAA 250 CACTACGAAG TGCAGTTACC AGACGTGAAA ATCCACTACG TCCGCGAGGG 300 AGCGGGTCCG ACACTGTTGC TGTTGCACGG CTGGCCCGGG TTCTGGTGGG 350 AGTGGAGCAA GGTCATAGGC CCGCTCGCAG AGCACTACGA TGTCATTGTT 400 CCCGACCTGC GCGGCTTCGG TGACTCCGAA AAGCCGGACT TAAACGACTT 450 GTCCAAGTAC TCGCTCGACA AAGCGGCCGA CGACCAAGCA GCCCTTCTCG 500 ACGCACTAGG GATTGAAAAG GCGTACGTCG TTGGCCATGA CTTCGCGGCC 550 ATCGTCCTCC ATAAATTCAT TCGAAAGTAC AGCGATCGAG TCATCAAAGC 600 AGCGATCTTT GATCCTATCC AGCCCGACTT TGGGCCGGTC TACTTCGGCT 650 TGGGGCACGT CCACGAGTCG TGGTACTCGC AATTCCATCA ACTAGATATG 700 GCCGTTGAGG TCGTGGGCTC GAGTCGCGAG GTGTGCAAGA AGTACTTCAA 750 ACACTTCTTC GATCACTGGT CATACCGGGA TGAGTTGCTC ACTGAGGAAG 800 AACTTGAGGT TCACGTCGAT AACTGTATGA AGCCTGACAA CATTCACGGA 850 GGCTTCAACT ACTATCGTGC CAACATAAGG CCCGATGCCG CTCTGTGGAC 900 AGACCTCGAT CATACGATGA GCGACCTTCC AGTAACAATG ATATGGGGTT 950 TGGGAGATAC TTGCGTGCCC TATGCTCCAC TCATTGAATT CGTTCCTAAG 1000 TACTATTCGA ACTATACGAT GGAGACGATC GAAGACTGCG GTCACTTCTT 1050 GATGGTCGAA AAACCTGAAA TTGCCATCGA TCGAATCAAA ACCGCGTTCC 1100 GCTGAATCAA AAGAGCATTC TCGTAGCAGA CGCCGTTTGC GCCGACGGGG 1150 AGAAAGTCTC CTCGTCGGAG TGGGGCTAAG CATAGCGGAA AGCCAAAATC 1200 GTCTATCGCC GCCCAAGTAT CGGCGAAACA GCGCTCAGAA ATGATGGAAG 1250 GTTTCTGATG GCAAAAAACG CCCTCAGATG ACAATCGGAG CCGAGTTCTC 1300 AGCGCCCTAC TGGTTTTGAG AAGCTACTCA AGAAAACCTT CTGTTCACAT 1350 CGGCGCTTGG TAGCAATAAA AGCCGGAGTT ACGCAGCTTT ACTGAAAGAA 1400 ATAAAATCTC GGCAAATATC TAGCGATCAT AGGATATAAA GGATCTGAGT 1450 ATGTCAACCG CAATTGTAAC AAACGTTAAG CATTTTGGGG GAATGGGGTC 1500 TGCACTTCGT CTCTCGGAAG CAGGACATAC AGTGGCTTGC CACGATGAAA 1550 GCTTCAAACA AAAGGACGAA CTTGAAGCCT TTGCCGAAAC CTATCCACAA 1600 CTCAAACCAA TGTCGGAACA AGAACCAGCG GAACTCATCG AGGCAGTTAC 1650 CTCCGCTTAT GGTCAAGTTG ATGTACTTGT GAGCAACGAC ATATTCGCAC 1700 CAGAGTTCCA ACCCATAGAT AAATACGCTG TAGAGGACTA TCGCGGTGCG 1750 GTCGAGGCGC TACAAATTAG ACCATTTGCA CTGGTCAACG CCGTTGCAAG 1800 TCAAATGAAG AAGCGCAAAA GCGGACATAT TATCTTTATT ACCTCTGCAA 1850 CGCCCTTCGG GCCTTGGAAG GAACTTTCTA CCTACACGTC AGCCCGAGCA 1900 GGTGCATGCA CCTTGGCAAA TGCCCTTTCG AAGGAACTCG GTGAATACAA 1950 CATTCCGGTG TTCGCAATAG GACCCAATTA TCTTCACAGT GAAGATAGTC 2000 CCTACTTCTA CCCCACAGAA CCGTGGAAAA CGAATCCAGA ACACGTTGCC 2050 CATGTCAAAA AAGTCACTGC GCTCCAGCGG TTAGGTACAC AGAAAGAATT 2100 GGGAGAACTC GTCGCGTTTC TCGCGTCTGG TAGTTGTGAC TATCTGACCG 2150 GCCAGGTGTT CTGGTTGGCC GGCGGATTCC CAATGATCGA GCGTTGGCCT 2200 GGTATGCCCG AGTAGGACCG GAGTGAGAAC TCTCTTCAAG ACTGCTTGCA 2250 GTTTTGGATT GGCCGCGGGA CAGACGTTTT GCGGTCGATC CGAGCTGAAA 2300 CCACAACAAG TGAAATAGGG CCGTGTCTAT CCGGTTACCA TCCGAAGTCT 2350 CTGCAG 2356

【００２７】配列番号：６配列の長さ：2356 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状起源生物名：Agrobacterium radiobacter 株名：ＤＨ０９４配列： GAGCTCTGCGGTTTACATCCGCGTCCACGGATTATCGCAAGGAATCTGAGCGGCCCAAGC 60 CCATACACGGCTGAGATTTTTCATTGCGAGGCCCAAACTTAGGCCGGCACAGAAGCCGTTTGCC 124 CTGCTTCGAACGCTCACGCGCCGAAGAAATTCGAAACAGCTTTGCCCAACCGACAAGAGCTTGC 188 TGTTTGACCAAACTCACAAAGAGGAGACGCCT ATG ACT ATC AGA AGA CCC GAA GAC 244 Met Thr Ile Arg Arg Pro Glu Asp TTT AAA CAC TAC GAA GTG CAG TTA CCA GAC GTG AAA ATC CAC TAC GTC 292 Phe Lys His Tyr Glu Val Gln Leu Pro Asp Val Lys Ile His Tyr Val CGC GAG GGA GCG GGT CCG ACA CTG TTG CTG TTG CAC GGC TGG CCC GGG 340 Arg Glu Gly Ala Gly Pro Thr Leu Leu Leu Leu His Gly Trp Pro Gly TTC TGG TGG GAG TGG AGC AAG GTC ATA GGC CCG CTC GCA GAG CAC TAC 388 Phe Trp Trp Glu Trp Ser Lys Val Ile Gly Pro Leu Ala Glu His Tyr GAT GTC ATT GTT CCC GAC CTG CGC GGC TTC GGT GAC TCC GAA AAG CCG 436 Asp Val Ile Val Pro Asp Leu Arg Gly Phe Gly Asp Ser Glu Lys Pro GAC TTA AAC GAC TTG TCC AAG TAC TCG CTC GAC AAA GCG GCC GAC GAC 484 Asp Leu Asn Asp Leu Ser Lys Tyr Ser Leu Asp Lys Ala Ala Asp Asp CAA GCA GCC CTT CTC GAC GCA CTA GGG ATT GAA AAG GCG TAC GTC GTT 532 Gln Ala Ala Leu Leu Asp Ala Leu Gly Ile Glu Lys Ala Tyr Val Val GGC CAT GAC TTC GCG GCC ATC GTC CTC CAT AAA TTC ATT CGA AAG TAC 580 Gly His Asp Phe Ala Ala Ile Val Leu His Lys Phe Ile Arg Lys Tyr AGC GAT CGA GTC ATC AAA GCA GCG ATC TTT GAT CCT ATC CAG CCC GAC 628 Ser Asp Arg Val Ile Lys Ala Ala Ile Phe Asp Pro Ile Gln Pro Asp TTT GGG CCG GTC TAC TTC GGC TTG GGG CAC GTC CAC GAG TCG TGG TAC 676 Phe Gly Pro Val Tyr Phe Gly Leu Gly His Val His Glu Ser Trp Tyr TCG CAA TTC CAT CAA CTA GAT ATG GCC GTT GAG GTC GTG GGC TCG AGT 724 Ser Gln Phe His Gln Leu Asp Met Ala Val Glu Val Val Gly Ser Ser CGC GAG GTG TGC AAG AAG TAC TTC AAA CAC TTC TTC GAT CAC TGG TCA 772 Arg Glu Val Cys Lys Lys Tyr Phe Lys His Phe Phe Asp His Trp Ser TAC CGG GAT GAG TTG CTC ACT GAG GAA GAA CTT GAG GTT CAC GTC GAT 820 Tyr Arg Asp Glu Leu Leu Thr Glu Glu Glu Leu Glu Val His Val Asp AAC TGT ATG AAG CCT GAC AAC ATT CAC GGA GGC TTC AAC TAC TAT CGT 868 Asn Cys Met Lys Pro Asp Asn Ile His Gly Gly Phe Asn Tyr Tyr Arg GCC AAC ATA AGG CCC GAT GCC GCT CTG TGG ACA GAC CTC GAT CAT ACG 916 Ala Asn Ile Arg Pro Asp Ala Ala Leu Trp Thr Asp Leu Asp His Thr ATG AGC GAC CTT CCA GTA ACA ATG ATA TGG GGT TTG GGA GAT ACT TGC 964 Met Ser Asp Leu Pro Val Thr Met Ile Trp Gly Leu Gly Asp Thr Cys GTG CCC TAT GCT CCA CTC ATT GAA TTC GTT CCT AAG TAC TAT TCG AAC 1012 Val Pro Tyr Ala Pro Leu Ile Glu Phe Val Pro Lys Tyr Tyr Ser Asn TAT ACG ATG GAG ACG ATC GAA GAC TGC GGT CAC TTC TTG ATG GTC GAA 1060 Tyr Thr Met Glu Thr Ile Glu Asp Cys Gly His Phe Leu Met Val Glu AAA CCT GAA ATT GCC ATC GAT CGA ATC AAA ACC GCG TTC CGC TGA ATCA 1109 Lys Pro Glu Ile Ala Ile Asp Arg Ile Lys Thr Ala Phe Arg *** AAAGAGCATTCTCGTAGCAGACGCCGTTTGCGCCGACGGGGAGAAAGTCTCCTCGTCGGAGTGG 1173 GGCTAAGCATAGCGGAAAGCCAAAATCGTCTATCGCCGCCCAAGTATCGGCGAAACAGCGCTCA 1237 GAAATGATGGAAGGTTTCTGATGGCAAAAAACGCCCTCAGATGACAATCGGAGCCGAGTTCTCA 1301 GCGCCCTACTGGTTTTGAGAAGCTACTCAAGAAAACCTTCTGTTCACATCGGCGCTTGGTAGCA 1365 ATAAAAGCCGGAGTTACGCAGCTTTACTGAAAGAAATAAAATCTCGGCAAATATCTAGCGATCA 1429 TAGGATATAAAGGATCTGAGT ATG TCA ACC GCA ATT GTA ACA AAC GTT AAG 1480 Met Ser Thr Ala Ile Val Thr Asn Val Lys CAT TTT GGG GGA ATG GGG TCT GCA CTT CGT CTC TCG GAA GCA GGA CAT 1528 His Phe Gly Gly Met Gly Ser Ala Leu Arg Leu Ser Glu Ala Gly His ACA GTG GCT TGC CAC GAT GAA AGC TTC AAA CAA AAG GAC GAA CTT GAA 1576 Thr Val Ala Cys His Asp Glu Ser Phe Lys Gln Lys Asp Glu Leu Glu GCC TTT GCC GAA ACC TAT CCA CAA CTC AAA CCA ATG TCG GAA CAA GAA 1624 Ala Phe Ala Glu Thr Tyr Pro Gln Leu Lys Pro Met Ser Glu Gln Glu CCA GCG GAA CTC ATC GAG GCA GTT ACC TCC GCT TAT GGT CAA GTT GAT 1672 Pro Ala Glu Leu Ile Glu Ala Val Thr Ser Ala Tyr Gly Gln Val Asp GTA CTT GTG AGC AAC GAC ATA TTC GCA CCA GAG TTC CAA CCC ATA GAT 1720 Val Leu Val Ser Asn Asp Ile Phe Ala Pro Glu Phe Gln Pro Ile Asp AAA TAC GCT GTA GAG GAC TAT CGC GGT GCG GTC GAG GCG CTA CAA ATT 1768 Lys Tyr Ala Val Glu Asp Tyr Arg Gly Ala Val Glu Ala Leu Gln Ile AGA CCA TTT GCA CTG GTC AAC GCC GTT GCA AGT CAA ATG AAG AAG CGC 1816 Arg Pro Phe Ala Leu Val Asn Ala Val Ala Ser Gln Met Lys Lys Arg AAA AGC GGA CAT ATT ATC TTT ATT ACC TCT GCA ACG CCC TTC GGG CCT 1864 Lys Ser Gly His Ile Ile Phe Ile Thr Ser Ala Thr Pro Phe Gly Pro TGG AAG GAA CTT TCT ACC TAC ACG TCA GCC CGA GCA GGT GCA TGC ACC 1912 Trp Lys Glu Leu Ser Thr Tyr Thr Ser Ala Arg Ala Gly Ala Cys Thr TTG GCA AAT GCC CTT TCG AAG GAA CTC GGT GAA TAC AAC ATT CCG GTG 1960 Leu Ala Asn Ala Leu Ser Lys Glu Leu Gly Glu Tyr Asn Ile Pro Val TTC GCA ATA GGA CCC AAT TAT CTT CAC AGT GAA GAT AGT CCC TAC TTC 2008 Phe Ala Ile Gly Pro Asn Tyr Leu His Ser Glu Asp Ser Pro Tyr Phe TAC CCC ACA GAA CCG TGG AAA ACG AAT CCA GAA CAC GTT GCC CAT GTC 2056 Tyr Pro Thr Glu Pro Trp Lys Thr Asn Pro Glu His Val Ala His Val AAA AAA GTC ACT GCG CTC CAG CGG TTA GGT ACA CAG AAA GAA TTG GGA 2104 Lys Lys Val Thr Ala Leu Gln Arg Leu Gly Thr Gln Lys Glu Leu Gly GAA CTC GTC GCG TTT CTC GCG TCT GGT AGT TGT GAC TAT CTG ACC GGC 2152 Glu Leu Val Ala Phe Leu Ala Ser Gly Ser Cys Asp Tyr Leu Thr Gly CAG GTG TTC TGG TTG GCC GGC GGA TTC CCA ATG ATC GAG CGT TGG CCT 2200 Gln Val Phe Trp Leu Ala Gly Gly Phe Pro Met Ile Glu Arg Trp Pro GGT ATG CCC GAG TAG GACCGGAGTGAGAACTCTCTTCAAGACTGCTTGCAGTTTTGGAT 2259 Gly Met Pro Glu *** TGGCCGCGGGACAGACGTTTTGCGGTCGATCCGAGCTGAAACCACAACAAGTGAAATAGGGCCG 2323 TGTCTATCCGGTTACCATCCGAAGTCTCTGCAG 2356

【００２８】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は組換え体プラスミド pDHD001の制限酵素
地図を示す。

【図２】図２は組換え体プラスミド pDHD002およびpDHD
003 の制限酵素地図を示す。

【図３】図３は pDHD003より作製された欠失プラスミ
ド、およびそれらにより形質転換された組換え体の酵素
活性を示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成９年１２月１６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１３

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１４

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１５

【補正方法】変更

【補正内容】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】エポキシ加水分解活性を持ち、配列表の
配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されることを特徴
とするタンパク質。
【請求項２】ハロヒドリンをエポキシドに変換する触
媒活性およびその逆反応の触媒活性を持ち、配列表の配
列番号２に記載のアミノ酸配列で表されることを特徴と
するタンパク質。
【請求項３】請求項１記載のタンパク質をコードする
遺伝子。
【請求項４】請求項２記載のタンパク質をコードする
遺伝子。
【請求項５】配列表の配列番号３に記載の塩基配列を
有する請求項３記載の遺伝子。
【請求項６】配列表の配列番号４に記載の塩基配列を
有する請求項４記載の遺伝子。
【請求項７】請求項３または５記載の遺伝子をベクタ
ープラスミドに連結した組換え体プラスミド。
【請求項８】請求項４または６記載の遺伝子をベクタ
ープラスミドに連結した組換え体プラスミド。
【請求項９】請求項３または５記載の遺伝子と請求項
４または６記載の遺伝子を共にベクタープラスミドに連
結した組換え体プラスミド。
【請求項１０】請求項７記載の組換え体プラスミドを
宿主微生物に導入した形質転換体。
【請求項１１】請求項８記載の組換え体プラスミドを
宿主微生物に導入した形質転換体。
【請求項１２】請求項９記載の組換え体プラスミドを
宿主微生物に導入した形質転換体。
【請求項１３】請求項７記載の形質転換体を培養して
請求項１記載のタンパク質を産生させる方法。
【請求項１４】請求項８記載の形質転換体を培養して
請求項２記載のタンパク質を産生させる方法。
【請求項１５】請求項９記載の形質転換体を培養して
請求項１および２記載のタンパク質を産生させる方法。
【請求項１６】請求項１０記載の形質転換体または請
求項１記載のタンパク質をエピハロヒドリンに作用させ
て（Ｓ）−３−ハロ−１，２−プロパンジオールを得る
ことを特徴とする（Ｓ）−３−ハロ−１，２−プロパン
ジオールの製造法。
【請求項１７】請求項１１記載の形質転換体または請
求項２記載のタンパク質を１，３−ジハロ−２−プロパ
ノールに作用させて（Ｓ）−エピハロヒドリンを得るこ
とを特徴とする（Ｓ）−エピハロヒドリンの製造法。
【請求項１８】請求項１２記載の形質転換体または請
求項１および２記載のタンパク質を１，３−ジハロ−２
−プロパノールに作用させて（Ｓ）−３−ハロ−１，２
−プロパンジオールを得ることを特徴とする（Ｓ）−３
−ハロ−１，２−プロパンジオールの製造法。