KR20010075649A

KR20010075649A - 아미노아실라제 및 이를 사용한 디-아미노산의 제조방법

Info

Publication number: KR20010075649A
Application number: KR1020017004943A
Authority: KR
Inventors: 스테판 존 클리포드 테일러; 로버트 크리스토퍼 브라운
Original assignee: 마르크 젠너; 키로텍 테크놀로지 리미티드
Priority date: 1998-10-20
Filing date: 1999-10-20
Publication date: 2001-08-09
Also published as: WO2000023598A1; EP1121446A1; AU6222799A; CA2347079A1; JP2002527110A

Abstract

기질농도 10 g/ℓ에서 N-아세틸-D-트립토판을 가수분해할 수 있으며 (R)-N-아세틸-클로로페닐알라닌에 비해 (R)-N-아세틸-2-티에닐알라닌의 전환이 더 빠른 분리 효소. 이 효소는 D-아미노산의 제조에 유용하다.

Description

아미노아실라제 및 이를 사용한 디-아미노산의 제조방법{AMINOACYLASE AND ITS USE IN THE PRODUCTION OF D-AMINOACIDS}

D-아미노산은 여러가지 살충제, 항생제 및 기타 약물 제조에 있어서 상업적으로 중요한 중간체이다. 예를 들면, 페닐글리신과 p-히드록시페닐글리신은 반-합성 페니실린 및 세팔로스포린의 합성에 사용된다. 또한, 새로운 약 물질을 위한 구성단위로서의 신규 D-아미노산이 많이 요구되고 있다.

D-아미노산은, 예를 들면 염의 결정화에 의한 물리적 분리, 또는 엔아미드 전구체의 수소화반응에 의한 비대칭 화학촉매반응에 의해 접근될 수 있다. 화학촉매반응은 예를 들면, 인공 아미노산등에 다양한 응용가능성을 갖는 일반적인 방법을 제공하지만, 종종 종래의 화학적 가수분해는 제품의 부분적 라세미화를 일으키므로, 그 후 N-디아실화 반응을 필요로 한다. 또한, 예를 들면 D-특이 히단토이나제를 사용한 히단토인의 가수분해에 의한 생체촉매법이 있다. 그러나, 생성된 D-카바모닐 아미노산은 여전히 아미노산으로의 효소적 또는 화학적 탈보호를 필요로 한다.

라세미 N-아세틸아미노산의 L-특이 아미노아실라제-촉매화 가수분해에 의한 L-아미노산의 제조는 잘 확립된 기술이다. 이것은 누룩곰팡이로부터의 효소를 사용하며, L-메티오닌, L-발린 및 L-페닐알라닌을 생산하기 위해 매우 큰 규모의 상업적 기반에서 운영된다. 비록 슈도모나스속, 스트렙토마이세스속, 알칼리게네스속의 몇몇 미생물 균주에서 D-아미노아실라제 작용이 확인되고 있으나, D-아미노산의 제조에는 이와 같은 큰 규모의 기술이 존재하지 않는다.(Sugie and Suzuki, Agric. Biol. Chem.44:1089-1095(1980); Daicel Chemical Industries, JP 64-5488(1989); Moriguchi and Ideta, Appl. Env. Microbiol.54: 2767-2770(1988); Sakaiet al, Agric. Biol. Chem.54:841-844(1990); Sakaiet al, J. Ferm.Bioeng.71:79-82(1991); Sakaiet al, Appl. Env. Microbiol.57:2540-2543(1991); Yanget al, Appl. Env. Microbiol.57:1259-1260(1991);and Kamedaet al, Nature169:1016 (1952) 참조)

이들 균주로부터 효소를 분리하고 특성화하였다. 이론적으로는 N-아세틸 아미노산의 분해 또는 탈보호에 이와 같은 균주를 전체세포(whole cell) 형태로 사용하는 것이 비교적 쉬워야 하지만, 세포는 또한 L-아미노아실라제를 함유하므로, 입체선택성이 감소된다. 그밖에, 낮은 활성은 유도배지에서의 성장 후에도, 전체세포로부터의 효소의 정화 및 사용하는데 있어서 경제적 이점을 없앤다. 해결책으로 효소의 클론화 방법이 예견되었으며, 비록 알칼리게네스속 종 D-아미노아실라제와 같은 효소가 기질 농도가 높은 곳에서 작업한다고 예상되지도 않고, 그의 기질 특이성에서 야생-타입 효소와 큰 차이도 없지만, 최근 알칼리게네스속 종 D-아미노아실라제에서 이 방법이 보고된 바 있다.(Moriguchiet al, Biosci. Biotech. Biochem.57 (7): 1149-1152(1993); Wakayamaet al, Bisci. Biotech. Biochem.59 (11):2115-2119(1995); 및 Wakayamaet al, Prot. Express.Pur.7:395-399(1996) 참조)

알칼리게네스 크실로스옥시단스 subsp. 크실로스옥시단스("알칼리게네스 A-6")로부터 얻은 효소, NCIMB 10771는 N-아세틸-D-트립토판을 가수분해하지 않는다. D-아미노아실라제의 활성은 D-페닐알라닌 및 N-아세틸-D-알로이솔로이신에 의해 2 mM의 매우 낮은 농도에서 37 % 및 40 %까지 억제된다는 것이 보고 되었다. 이것은 효소가 제품 및 기질 억제를 강하게 받기 쉽다는 것을 말한다.

US-A-5206162는 알칼리대변균, CCRC 14817로부터 얻어진 D-아미노아실라제를 기재하고 있다.

EP-A-0896057(본출원에서 주장한 최초우선일 이후 출판)은 아미콜라톱시스 오리엔탈리스(Amycolatopsis orientalis), IFO 12806로부터 얻은 D-아미노아실라제를 기재하고 있다.

본 발명은 D-아미노아실라제 활성을 갖는 효소, 및 이 효소를 사용한 N-아실 아미노산의 라세미 혼합물의 분해 및 광학적으로 풍부한 N-아실 아미노산의 탈보호에 의한, D-아미노산의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 박테리아 집합체에서 실시된 D-아미노아실라제 활성에 관하여 선별하고, 선별된 것에서 몇몇이 D-아미노아실라제를 가지고 있음을 확인하는 것으로이루어졌다. 이들 균주중 다섯을 게놈성 DNA를 제조하는데 사용하였다. 그 후, 공지의 문헌서열을 조사함으로써 올리고뉴클레오티드 프라이머를 고안하였고, D-아미노아실라제 활성을 갖는 1.4 kb 단편을 생성하기 위해 PCR 실험에 이들을 사용하 였다. 재조합형 단편을 pTrc99C 발현벡터로 서브-클론하였다. D-아미노아실라제 단편를 전달하는 재조합형 플라즈미드는 그 후 과발현을 위해 대장균 DH5로 형질전환되었다. 숙주를 발효시킨 후, 양호한 D-아미노아실라제 활성을 갖는 세포를 얻었다.

효소의 서열화는 효소가 공지의 클론된 알칼리게네스속 D-아미노아실라제의 공개 서열과 6개의 차이를 갖는다는 것을 나타낸다. 이들 차이는 Ser²대 Ala; Gln³대 Glu; Ala¹⁴대 Val; Gly¹²⁶대 Arg; Gly²⁴⁰대 Arg; Glu²⁴²대 Lys이다. 이들 차이는 개별적으로 또는 연합하여, 효소의 특성에 있어서 외관상 현저하고 놀라운 차이를 가져온다. 예를 들면, 신규 효소는 N-아세틸-D-트립토판을 가수분해 하지만, 공지의 효소는 가수분해하지 않는다. 놀랍게도, 이 효소는 높은 기질 농도에서 활성이다; 공지의 문헌은 20 mM 부근의 낮은 기질 농도의 예만을 제공할 뿐이다. 이런 농도에서는 용적효율이 낮고, 이것은 제품의 회수비용을 증가시키고 공정의 경제적 생존능력을 감소시킨다. 그러므로, 효소가 기질 100 g/ℓ에서 유효하며; 200 g/ℓ에서도 양호한 활성을 나타낸다는 것은 놀라운 일이다. 이것은 약 100 g/ℓ의 높은 용적 효율에서 몇몇 (D)-N-아세틸아미노산의 탈보호에 유용하다. 이것은 경제적인 공정 개발을 허용한다.

더욱 일반적으로, 본 발명에 따라 분리된 효소는 기질농도 10 g/ℓ에서 D-아세틸-N-트립토판의 가수분해를 가능하게 한다. 그러므로, 주어진 농도에서, 및 더높은 농도에서도 원하는 활성이 가능하다. 그 밖에, US-A-5206162 및 EP-A-0896057에 기재된 효소와는 달리, 본 발명의 효소는 (R)-N-아세틸-2-티에닐알라닌을 전환시킬 수 있고, 또한 이것을 (R)-N-아세틸-4-클로로페닐알라닌에 비해 빠르게 전환시킬 수 있다.

일반적으로, 본 발명에서 사용되는 기질은 (L)- 및 (D)-N-아실아미노산 혼합물의 일부분일 수 있다. 선택적으로, (D)-N-아실아미노산이 거울상이성질로서 풍부할 수 있고, 근본적으로 광학적으로 순수하다.

신규의 효소는 천연 또는 인공 아미노산을 제조하는데 사용될 수 있다. 인공 아미노산의 한 종류는 아릴/헤테로아릴-치환 아미노산이다.

몇몇 경우에, 특히 소수특성의 기질의 경우, 효소는 기질 억제를 겪는다. 이런 경우, 예를 들면 N-아세틸-D-스티릴알라닌 또는 N-아세틸-D-2-나프틸알라닌의 경우, 높은 기질농도는 단순히 생성물로의 전환을 낮춤으로써 용적 효율 반응이 불가능하다. 그러나, 이 효과는 생체형질전환의 과정에 걸쳐 기질을 여러번 배치식으로 첨가하는 단순한 방법에 의해 극복될 수 있고, 낮은 농도가 유지된다면 생성물을 많이 축적할 수 있다. 예를 들면, 효소가 20 g/ℓ초과의 N-아세틸-D-2-나프틸알라민에 노출된다면, 기질의 가수분해는 불량하다. 그러나, 효소는 기질을 여러번 첨가 첨가시킴으로써 15 g/ℓ효율로 가수분해시킬 수 있고, 이것은 약 75 g/ℓ의 D-2-나프틸알라닌을 축적시킬 수 있다.

효소는 전체세포 또는 유리형태로 사용될 수 있다. 원한다면, 효소는 당업자에게 알려진 방법으로 고정될 수 있다.

효소는 침전 유기체로부터 제조할 수 있다(이하 상세히 제공된다). 선택적으로, 효소는 재조합 기술로 제조할 수 있다.

본 명세서에 기재된 DNA 및 아미노산 서열을 사용하여, 당업자들은 본 명세서에 기재된 유전자 및 효소의 단편 또는 돌연변이를 쉽게 제조할 수 있다. 이들 단편 및 돌연변이는 예시된 효소의 활성을 보유하며, 본 발명의 범위에 속한다. 또한, 유전적 암호의 풍부함으로 인해, 다양한 여러가지 DNA 서열을 본 명세서에 기재된 아미노산 서열에 암호화할 수 있다. 선택적으로 동일 또는 유사한 효소를 암호화하는 DNA 서열을 생성하는 것은 본 분야의 일반적인 기술 중 하나이다. 이들 DNA 서열은 본 발명의 범위에 속한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "본질적으로 동일한" 서열이라는 것은 활성에 크게 영향을 미치지 않는 아미노산 치환, 삭제, 첨가 또는 삽입을 갖는 서열을 말한다. 또한, 활성을 보유하는 단편도 상기 정의에 포함된다.

본 발명의 유전자는 공지의 과정에 의해 분리될 수 있고, 여러 종류의 미생물 숙주로 도입될 수 있다. 유전의 발현은 직접 또는 간접적으로 효소의 세포내 제조 및 유지를 일으킨다. 유전자는 적당한 벡터에 의해 미생물 숙주에 도입될 것이다.

유전자의 안정한 유지 및 발현을 허용하는 조건하에서 유전자를 미생물 숙주로 도입하기 위한 방법은 다양하게 변형될 수 있다. DNA 구성에는 유전자 발현을 위한 전사 및 번역 조절 신호, 조절 제어(regulatory control)하의 유전자 및, 그것에 의해 통합이 발생하는 숙주 유기물 내의 서열과 동일한 DNA 서열, 및/또는 그것에 의해 통합 또는 적당한 유지를 일으키는 숙주내에서 작용하는 복제 시스템을 포함할 수 있다.

전사방향으로, 즉 서열의 암호 또는 센스서열의 5'에서 3' 방향으로, 구성은 전사조절영역 및 어떠한 촉진자를 포함하며, 여기서 조절영역은 촉진자, 리보소말 결합위치, 개시코돈, 개시코돈을 갖는 상에서 개방번역격자를 갖는 구조 유전자, 정지코돈, 얼마라도 있다면, 폴리아데닐화 신호서열, 얼마라도 있다면, 종료 영역의 5' 또는 3' 일 수 있다. 이중나선인 이 서열은 미생물 숙주의 형질전환을 위해 그 자체로 사용될 수 있으나, 대부분 표지를 포함하는 DNA 서열을 함께 포함한다.

유전자는 개시영역의 조절제어에 속하도록 전사/번역 개시 및 종료 영역 사이에 도입될 것이다. 이 구조는 플라즈미드에 포함될 수 있고, 적어도 하나의 복제 시스템을 포함하지만, 하나 이상을 포함할 수 있고, 여기서 하나의 복제 시스템은 플라즈미드의 전개 동안 암호화에 사용되고 두번째 복제 시스템은 최종숙주에서의 작용에 필요하다. 그밖에, 상기와 같이, 하나 이상의 표지가 존재할 수 있다. 통합이 필요한 경우, 플라즈미드는 숙주 게놈과 동일한 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

형질 전환체는, 비변형 유기체 또는 전이 유기체에 비해, 존재하는 경우, 원하는 유기체의 선택을 허용하는 선택술을 사용하는 종래의 방법에 따라 분리될 수 있다. 그 다음, 형질전환체를 활성에 대해 시험할 수 있다.

적당한 숙주세포에는 원핵 세포 또는 진핵 세포가 포함된다. 대장균은 한 예이다.

다음의 실시예는 본 발명을 설명한다.

실시예 1 D-아미노아실라제 제조

게놈성 DNA를 키로텍 배양 조합이 보유하고 있는 5개의 알칼리게네스 균주로부터 제조하였다: CMC3352, 3353, 2916, 3378, 3823. 이들 게놈제품으로부터, Wakayama et al(1995)에 의해 보고된 D-아미노아실라제를 증폭시키기 위해 PCR을 실시하였다. 프라이머를 알칼리게네스 A-6으로부터 단(dan) 유전자의 공개 서열에 따라 합성하였다. 5'PCR 프라이머는 SEQ ID NO.1이고; 3'PCR 프라이머는 SEQ ID NO.2이다.

1.4 kb PCR 단편을 균주 CMC3352 및 3353으로부터 증폭시켰다. 이들 단편을층유전자(Stratagene), pCR-스크립트로부터 PCR 클로닝 벡터로 클론시키고 대장균으로 형질전환 시켰다. 생성된 클론은 1.4 kb 아실라제 단편의 존재를 확인하기 위해 제한지도작성으로 분석하였다. 이 단편을 가리우는 클론을 서열화하여 추정 아밀라제가 보고된 서열과 동질성을 갖는다는 것을 증명하였다. DNA 서열 분석은 클론된 단편의 대부분이 SEQ ID NO.3.에 포함된다는 것을 나타낸다.

유도된 아미노산 서열은 SEQ ID NO.4로서 아래에 주어진다. 재조합형 D-아실라제 잔류물은 공지서열과 다음과 같이 다르다; Ser²대 Ala; Gln³대 Glu; Ala¹⁴대 Val; Gly¹²⁶대 Arg; Gly²⁴⁰대 Arg; Glu²⁴²대 Lys.

재조합형 단편은 5'NcoI 및 3'BamHI 엔지니어된 제한위치를 통해 pTrc99C 발현벡터로 서브-클론된다. D-아미노 아실라제 단편을 전달하는 재조합형 플라즈미드는 과발현을 위해 대장균 DH5로 형질전환된다.

재조합형 세포, 대장균 균주 CMC 4406은 NCIMB(스코틀랜드, 애버딘 AB24 3RY, 마샤 드라이브 23 가)에 기탁되었다. 접수번호는 NCIMB 40965이다.

재조합형 세포를 글루코스, 펩티트 및 염을 함유하는 배지에서 발효에 의해 성장시켰다. 종자 배양은 플레이트로부터 접목하였고, 앰피실린 0.1 g/ℓ를 함유하는 TSB 배지에서 37℃ 에서 철야로 배양하였다.

접종재료(5 ml, OD 5.0)를 다음의 배지 1.5ℓ에서 성장시켰다.(언급이 없을 때는 g.ℓ^-1의 양으로)

KH₂PO₄8

K₂HPO₄7

(NH₄)₂SO₄1

MgSO₄7H₂O 1

이스트 추출물 15

미량원소 용액 1 ㎕ℓ^-1

글루코스 10

폴리프로필렌글리콜 1 ㎕ℓ^-1

Hycase SF 15

미량원소는 다음과 같이 구성되었다.(언급이 없을 때는 g.ℓ^-1의 양으로)

CaCl₂ㆍ2H₂O 3.6

CoCl₂ㆍ6H₂O 2.4

CuCl₂ㆍ2H₂O 0.85

FeCl₃ㆍ6H₂O 5.4

H₃BO₄0.3

HCl 333 ㎕ℓ^-1

MnCl₂ㆍ4H₂O 2.0

Na₂MoO₄ㆍ2H₂O 4.8

ZnO 2.0

NaOH 용액을 첨가하여 pH를 6.9-7.2로 조절하였고, 온도는 30 ℃를 유지시켰다. 육종 후, IPTG(0.24 g/ℓ)를 첨가하였다. 24 시간 후, 생체물질의 OD가 34에 달하였다. 그 후, 세포를 원심분리하여 얻고 -15 ℃에서 보관하고, 그 후 필요에 따라 생체형질전환에 사용하였다.

실시예 2 (D)-N-아세틸-(1-브로모비닐)알라닌의 탈보호

KH₂PO₄(0.8g, 10 mmol)를 2 리터 보온용기에서 물(800 ml)에 용해시켰다.(D)-N-아세틸-(1-브로모비닐)알라닌(100g, 0.42몰, ~95% ee_R)을 첨가하고 NaOH(46-48%)를 사용하여 pH를 8.0로 조정하였다. 보온용기의 온도를 40 ℃까지 올리고 용액을 pH 8을 유지하면서 10분간 교반시켰다. D-아미노아실라제 효소 전체세포(9g)를 한번에 첨가하고 NaOH를 계속 첨가하여 pH 8.0을 유지하면서 40 ℃에서 반응 혼합물을 교반하였다. 반응을 다음과 같이 키랄 GC로 모니터 하였다: 반응 혼합물 0.5 ml를 취하고 진한 HCl로 pH 2.0으로 산성화 시켰다. 수층을 EtOAc로 추출하고 건조시키고(MgSO₄), 여과시키고, TMS-디아조메탄 0.1 ml로 처리했다. 유도된 제품을 키랄 GC(Chrompack Chirasil L-Val, 25 m, 20 psi He, 10 분간 60 ℃, 200 ℃까지 5℃/분, 10분간 유지, FID 검출)로 분석하였다. 1시간 후, 기질의 ee가 68 %로 감소하였고, 2시간 후 24 % 및 22시간 후 7%로 감소하였다. 그 후, 반응 혼합물을 진한 염산 용액을 사용하여 pH 2.0으로 산성화한 다음, 셀라이트 패드로 여과시키고, EtOAc(3 x 300 ml)로 세척하였다.

그 후, 용액을 NaOH(46-48%)를 사용하여 pH 6.5로 맞추고 용액이 약 200 ml 남을 때까지 감압하에 농축하였다. 용액에서 백색 고체가 부서져져 나왔고, 여과시킨 후 아세톤으로 세척하였다. 이와 같이 투명 백색 고체의 제품 (D)-(1-브로모비닐)알라닌을 얻었다(60 g, ee_R>99%). 거울상이성질체 과잉물을 HPLC(25 cm 키로바이오틱 T 칼럼, 70:30 MeOH:물, 1 ml/분, 210 nm)로 분석하였다. 기타 아미노산을 동일한 방법 또는 MeOH:물 이동상 조성물을 변화시켜 결정하였다.

실시예 3 (D)-N-아세틸프로파르길글리신의 탈보호

KH₂PO₄(2.1 g)를 2 리터 보온용기에서 물(2.5 ℓ)에 용해시켰다. (D)-N-아세틸프로파르길글리신(232 g, 1.50 몰, ~95% ee_R)을 첨가하고 NaOH(46-48%)를 사용하여 pH를 8.0에 맞추었다. 보온용기의 온도를 40 ℃까지 올리고 용액을 pH 8을 유지하면서 10분간 교반하였다. D-아미노아실라제 효소 전체세포(7 g)를 한번에 첨가하고 NaOH를 계속 첨가하여 pH 8.0을 유지하면서 40 ℃에서 반응 혼합물을 교반하였다. 88 시간 후, 남은 ee_(R)-N-Ac는 25.8 % 였고, 16 시간 후의 것보다 최소한 낮았을 뿐이다. 또 다른 3 %/중량의 세포를 첨가하고 104 시간 후 ee_(R)-N-Ac는 17.8 %였다. 제품 전환의 99 % ee가 85 %라고 예상될 때까지 생체형질전환이 계속되었다.

실시예 2와 같은 워크업 및 분리에 의해 갈색 고체(271 g)를 얻었고, 이것을 MeOH에서 10분 동안 슬러리로 만들어, 99% 초과의 ee(R)-프로파르길글리신의 투명 백색 고체(171g)를 얻었다.

실시예 4 (D)-N-아세틸-2-푸릴알라닌의 탈보호

(D)-N-아세틸-2-푸릴알라닌(18 g, ee_R>99%)을 KH₂PO₄10 m몰을 함유하는 물 (200 ml)에 첨가하고 보온용기의 온도를 40 ℃까지 올렸다. 현탁액의 pH를 NaOH로 pH 8.0으로 맞추고 10분간 교반하였다. D-아미노아실라제 전체세포 0.72 g(4 중량%)을 첨가하고 반응물을 NaOH를 첨가하여 pH 8.0으로 유지하면서 격렬히 교반시켰다. 반응물을 키랄 GC로 상기 방법과 같이 조사하고, 2시간 후 종료하였다. 수층을 진한 HCl로 pH 2.0으로 산성화 시키고, 셀라이트 패드로 여과하였다. 여액을EtOAc로 세척하고 NaOH로 pH 7로 맞추었다. 용액을 Na₂CO₃(100 % 전환된다는 가정하에 2 당량)로 처리하고, 약 10 ℃로 냉각시키고 그 후 THF(300 ml) 중에서 Fmoc-OSu(1 당량) 용액을 첨가하였다. 워크업 후, 제품을 백색 고체로 분리하였고 메탄올/물로 재결정하여 99% 초과의 ee(D)-2-푸릴알라닌 18.4 g을 얻었다.

실시예 5 (D)-N-아세틸-알릴글리신의 탈보호

(D)-N-아세틸알릴글리신(40 g, ee_R89%)를 KH₂PO₄10 m몰을 함유하는 물(200 ml)에 첨가하고 보온용기의 온도를 40 ℃까지 올렸다. 현탁액의 pH를 NaOH로 pH 8.0으로 맞추고 10분간 교반하였다. D-아미노아실라제 전체세포 1.0 g(2.5 중량%)을 첨가하고 반응물을 NaOH를 첨가하여 pH 8.0으로 유지하면서 격렬히 교반하였다. 3시간 후 HPLC는 30%의 전환을 나타내었다. 16시간 후, 반응은 더 이상 진행하지 않았고, 추가로 전체세포 2.5 중량%를 첨가하였다. 60시간 후, 30 % 이상으로 더 이상 진행하지 않았고 용액에 물을 첨가하여 용액을 10 %까지 희석시켰다. 또 2 시간 후, 반응은 44 % 전환에 도달하였고, 88시간 후 82 % 전환하였다.

실시예 6 (D)-N-아세틸-2-나프틸알라닌의 탈보호

(D)-N-아세틸-2-나프틸알라닌(0.75 g)을 50 ml 트리스 완충용액(0.1 M, pH 7.5, 30 ℃)에 첨가하였다. 현탁액을 NaOH로 pH 8.0으로 맞추고 10분간 교반하였다. D-아미노아실라제의 원용해질(3 ml, 165 U, 1U=N-아세틸-D-트립토판 1 μ몰/분의 가수분해, 25℃, pH 7.5, 0.1 M 트리스 완충용액)을 첨가하고 반응물을 NaOH를 첨가하여 pH 8.0으로 유지하면서 격렬히 교반하였다. 기질(0.75 g) 및 효소(165 U)를 22, 46, 96, 173 및 218 시간에 더 첨가하였다. HPLC에 의한 최종 전환은 피크 면적에 의하면 95% 였다.

실시예 7 (D)-N-아세틸-3-피리딜알라닌의 탈보호

(D)-N-아세틸-3-피리딜알라닌(50 g)을 750 ml 트리스 완충용액(0.1 M, pH 7.5, 30 ℃)에 첨가하였다. 현탁액을 NaOH로 pH 8.0으로 맞추고 10분간 교반하였다. D-아미노아실라제의 원용해질(20 ml, 1100 U, 1U는 25℃, pH 7.5, 0.1 M 트리스 완충용액에서 1분 당 1 μ몰의 N-아세틸-D-트립토판이 가수분해되는 것을 의미함)을 첨가하고 반응물을 NaOH를 첨가하여 pH 8.0으로 유지하면서 격렬히 교반하였다. 15시간 후, 반응은 HPLC 피크 면적에 의하면 약 80 % 전환에 도달하였다.

실시예 8 - 20 D-아실라제 반응

표 1은 일련의 인공 (R)-N-Ac-페닐알라닌 및 (R)-N-Ac-알라닌 유도체, 및 (R)-N-Ac-4-플루오로페닐글리신을 사용한 D-아실라제 반응을 나타낸다.

실시예	기질(N-아세틸-)	기질농도	효소(U/m몰)	pH^b	온도(℃)	시간^c	수득률^d(%)	전환율^e(%)
		g/L	몰/L
8	4-클로로-Phe-Ala	20	0.083	1.0^g	8.0	40	72시간	67	61
9	4-브로모-Phe-Ala	30	0.104	50.2	8.6	40	>3일	73	90
10	4-플루오로-Phe-Ala	84	0.373	26.5	7.5	30	4일	73	98
11	4-시아노-Phe-Ala	15	0.069	18.5	7.7-8.0	30	>3일	45	75
12	2-플루오로-Phe-Ala	100	0.440	2.2	8.0	40	24시간	79	90
13	스티릴-Ala	13	0.056	160	8.5	30	3일	84	90
14	2-티에닐-Ala	70	0.330	21.3	7.7	30	3일	56	95
15	5-Br-2-티에닐-Ala	44.4	0.152	14.6	8.2	40	48시간	86	>95
16	3-티에닐-Ala	100	0.470	24.3	8.5	30	48시간	87	94
17	3-푸릴-Ala	30	0.152	105	8.5	40	24시간	n/a	90
18	2-나프틸-Ala	15	0.062	3.80^g	8.5	40	7일	n/a	90
19	TAZ	112	0.525	69.1	7.5	30	3일	n/a	90
20	4-플루오로-Phe-Gly	85.7	0.406	21.6	8.1	35	24시간	88	n/a

^b모든 반응은 NaOH/KH₂PO₄완충용액에서 실시되었다.^c반응의 완료/정지에 도달한 시간.^d분리된 수득률.^e원생체전환 반응 혼합물 중의 전환.^fN-아세틸 기질중 90 %에서 아미노산중의 96.5% 까지 증가한 %ee.^g전체세포를 사용한 반응.

TAZ = 4-티아조닐알리닌.

비교시험

신규 효소와 공지의 D-아밀라제의 특징을 평가하기 위해 비교시험을 실행하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다. 각 조의 3개의 결과에서, 각각의 효소는 IFO 12806(104470) 및 CCRC(14817)로서 기탁된 효소 및 실시예 1의 효소(D-Ace)이다. 결과(U/U)는, 적당한 수정이 이루어졌을 때, 신규 효소가 특정 인공 아미노산, 즉 (R)-N-티에닐알라닌으로, 비록 (R)-N-Ac-4-클로로페닐알라닌에 대해서는 느리지만, CCRC 14817보다 빠르게 전환된다.

실시예 21 전체세포 고정

재조합형 D-아실라제를 함유하는 대장균 CMC4406의 전체세포를 반응성 가용성 폴리머(RSP)에 고정시켰다. RSP는 폴리에틸렌이민(0.8 g)과 수성 25 %w/v 글루타르알데히드(1.6 ㎖)와 반응시켜 총부피 20 ml H₂O로 제조하였다. 그 후, RSP를 H₂O 20 ml 중에 재현탁시킨 세포 10g과 혼합하였다. 이것을 30 분간 격렬히 교반시킨 다음 발포고무의 밀도를 갖는 고정 세포를 여과하여 회수하였다. 최종 제품(20 g)의 비활성(specific activity)은 20.55 U/g 이고 활성회복율은 고정에 사용된 전체세포의 43 %였다. 활성의 1 단위는 25 ℃, pH 7.5 및 기질 농도 10 mM에서 1분당 1μ몰의 N-Ac-D-트립토판이 D-트립토판으로 가수분해되는 것으로 정의된다.

실시예 22 전체세포 고정

대장균 CMC4406 세포의 수성 현탁액(물 20 ml 중 10 g)을 PEI 0.8 g과 완전히 혼합시키고, 25% w/v 글루타르알데히드 1.6 ml를 첨가하였다. 이 혼합물을 교반시켜 구슬형 집합체가 형성된 후 여과 하였다. 최종 제품(13.5 g)의 비활성은 20.39 U/g 이고 출발 활성의 25 %를 회복하였다.

표 2

표 2 (계속)

Claims

기질농도 10 g/ℓ에서 N-아세틸-D-트립토판을 가수분해할 수 있고, (R)-N-아세틸-클로로페닐알라닌 전환에 비해 더 빠른 (R)-N-아세틸-2-티에닐알라닌 전환을 나타내는 분리 효소.
SEQ ID NO:4의 아미노산 서열, 또는 기질농도 10 g/ℓ에서 N-아세틸-D-트립토판을 가수분해할 수 있는 단편을 갖는 효소.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 기질 농도가 30 g/ℓ인 효소.
제 3항에 있어서, 상기 기질 농도가 100 g/ℓ인 효소.
상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 고정된 형태인 효소.
제 2항에 따른 효소를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
제 6항에 있어서, SEQ ID No.3에 나타나는 서열 일부 또는 전부를 갖는 폴리뉴클레오티드.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 하나의 항에 따른 효소를 발현하기 위해 형질전환된 미생물.
NCIMB 40965의 특성을 갖는 미생물.
제 8항 또는 제 9항에 따른 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 1항 내지 제 5항 중 어느 하나의 항에 따른 효소를 제조하는 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 하나의 항에 따른 효소, 또는 제 8항 또는 제 9항에 따른 미생물을 사용한 대응 (D)-N-아실아미노산의 전환을 포함하는, (D)-아미노산의 제조방법.
제 11항에 있어서, N-아실아미노산의 농도가 적어도 30 g/ℓ인 방법.
제 11항에 있어서, N-아실아미노산의 농도가 적어도 100 g/ℓ인 방법.
제 11항 내지 제 13항 중 어느 하나의 항에 있어서, (D)-N-아실아미노산이 (L)- 및 (D)-N-아실아미노산의 혼합물의 일부분인 방법.
제 11항 내지 제 13항 중 어느 하나의 항에 있어서, (D)-N-아실아미노산이거울상이성질적으로 풍부한 방법.
제 11항 내지 제 13항 중 어느 하나의 항에 있어서, (D)-N-아실아미노산이 본질적으로 단일 거울상이성질체인 방법.
제 11항 내지 제 16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 아미노산이 인공아미노산인 방법.
제 11항 내지 제 15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 기질이 소수성으로, 기질억제가 있고, 전환 중 기질은 배치식으로 첨가되는 것으로 이루어지는 방법.
제 11항 내지 제 18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 축적된 D-아미노산의 농도가 적어도 30 g/ℓ인 방법.