JP4081124B2 - Ｄ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸の製造法 - Google Patents
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Description
本発明は、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸の製造法、特に、５−置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解して対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する酵素（以下、ヒダントイナーゼという）に関与する遺伝子を有する新規形質転換体を使用したＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸の製造法に関する。
光学活性なＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸は、対応する光学活性なＤ−α−アミノ酸に変換することができ、光学活性なＤ−α−アミノ酸は医薬中間体として重要な化合物である。特に、半合成ペニシリン類や半合成セファロスポリン類の製造中間体としての、Ｄ−フェニルグリシン、Ｄ−パラヒドロキシフェニルグリシンなどが工業的に有用な化合物として挙げられる。
Ｄ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸の製造法としては、５−置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解して対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に、微生物の酵素作用を利用して変換する方法が知られており、特許文献１−４に記載されている。
また、５−置換ヒダントインを対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する酵素であるヒダントイナーゼに関与する遺伝子を、高温菌より取得して、これを中温菌に導入することにより、ヒダントイナーゼ活性を有する組換え体微生物を製造する方法については、特許文献５に記載されている。また、特許文献６にはアグロバクテリウムに属する菌からヒダントイナーゼ遺伝子断片を分離し、エシェリヒア・コリまたはアグロバクテリウム属細菌に導入して活性を発現させている。
上記の、微生物の酵素作用を利用する方法は、酵素の供給源として知られる微生物ではいずれも酵素生産量が十分でなく、さらに、培養培地が高価である等の欠点を有していた。
また、特許文献５に示される組換え体微生物については、ヒダントイナーゼ活性を有する胞子形成高温菌と比較して数倍程度しか酵素活性が向上しておらず酵素の生産量は十分とはいいがたい。
また、上記組換え体微生物を用いて、５−置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解して対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸を生成蓄積させた例は全く示されていない。
本発明は、このような問題を解決すべく、酵素の生産性が極めて高い微生物を創製するとともに、このようにして得られた酵素源を使用して、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸を効率よく生産することを目的とする。
組換えＤＮＡ手法を用いて、ヒダントイナーゼを生産する微生物を取得する方法については、特許文献５および６に示されているが、ヒダントイナーゼ遺伝子の供給源となる微生物は、本発明でヒダントイナーゼ遺伝子を取得した微生物とは全く異なるものである。さらにヒダントイナーゼ遺伝子の塩基配列や、アミノ酸配列も、本発明のものとはかなり相違がある。
本発明は、下記を提供する：
１． バチルス（Bacillus） ｓｐ．ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６３）、アグロバクテリウム（Agrobacterium） ｓｐ．ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９００）またはシュードモナス（Pseudomonas） ｓｐ．ＫＮＫ００３Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−３１８１）に由来するヒダントイナーゼに関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用いエシェリヒア属、シュードモナス属、フラボバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、アグロバクテリウム属、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物のような宿主菌体を形質転換して得られる形質転換体の生産する当該酵素を、水性媒体中で５−置換ヒダントインに作用させるＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸の製造法。
２．宿主微生物が、エシェリヒア属、シュードモナス属、フラボバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、アグロバクテリウム属、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物から選ばれる、１記載の形質転換微生物。
３．形質転換微生物がエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１ pＴＨ１０２、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１ pＴＨ１０３、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１ pＴＨ１０４（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６４）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１ pＡＨ１０４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６５）またはエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１ pＰＨＤ３０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６６）である、２記載の形質転換微生物。
４．１〜３いずれか１項記載の形質転換微生物を使用することを特徴とする、５−置換ヒダントインを不斉的に加水分解して対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する酵素の製造法。
５．４記載の製造法で得られた酵素を使用することを特徴とする５−置換ヒダントインからＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸の製造法。
６．５−置換ヒダントインが一般式（１）：
(式中、Ｒはフェニル基、水酸基で置換されたフェニル基、アルキル基、置換アルキル基、アラルキル基またはチエニル基を示す。)で表わされる化合物である５記載の製造法。
７．バチルス ｓｐ．ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６３）由来のヒダントイナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片と、プラスミド（pＵＣＮＴ）との組換えにより得られ、図２〜４のいずれかに示す制限酵素切断地図を有する組換えプラスミド。
８．組換えプラスミドが、pＴＨ１０２、pＴＨ１０３またはpＴＨ１０４である７記載の組換プラスミド。
９．アグロバクテリウム ｓｐ．ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９００）由来のヒダントイナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断面とプラスミドpＵＣ１８との組換えによって得られ、図１の制限酵素地図を有する組換えプラスミド。
１０．組換えプラスミドがpＡＨ１０４３である９記載の組換えプラスミド。
１１．シュードモナス ｓｐ．ＫＮＫ００３Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−３１８１）由来のヒダントイナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片と、プラスミドpＵＣ１８の組換えによって得られ、図５の制限酵素地図を有する組換えプラスミド。
１２．組換えプラスミドがpＰＨＤ３０１である１１記載の組換えプラスミド。
１３．配列表配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜４５７のアミノ酸配列の全部または一部をコードする５−置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解して、対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する酵素活性を示す蛋白質の遺伝子。
１４．配列表配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜４５７のアミノ酸配列の全部または一部を含み、５−置換ヒダントインを不斉的に加水分解して対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する活性を有する酵素蛋白質。
１５．配列表配列番号３のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜４８５のアミノ酸配列の全部または一部をコードする５−置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解して、対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する酵素活性を示す蛋白質の遺伝子。
１６．配列表配列番号１の塩基番号１〜２５１８の塩基配列の全部または一部もしくはこれと等価の塩基配列を持ち、５−置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解して、対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する酵素活性を示す蛋白質の遺伝子を含むＤＮＡ断片。
１７．配列表配列番号３の塩基番号１〜１５６９の塩基配列の全部または一部もしくはこれと等価の塩基配列を持ち、５−置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解して、対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する酵素活性を示す蛋白質の遺伝子を含むＤＮＡ断片。
１８．配列表配列番号３のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜４８５のアミノ酸配列の全部または一部を含み、５−置換ヒダントインを不斉的に加水分解して対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する活性を有する酵素蛋白質。
１． バチルス（Bacillus） ｓｐ．ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６３）、アグロバクテリウム（Agrobacterium） ｓｐ．ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９００）またはシュードモナス（Pseudomonas） ｓｐ．ＫＮＫ００３Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−３１８１）に由来するヒダントイナーゼに関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用いエシェリヒア属、シュードモナス属、フラボバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、アグロバクテリウム属、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物のような宿主菌体を形質転換して得られる形質転換体の生産する当該酵素を、水性媒体中で５−置換ヒダントインに作用させるＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸の製造法。
２．宿主微生物が、エシェリヒア属、シュードモナス属、フラボバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、アグロバクテリウム属、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物から選ばれる、１記載の形質転換微生物。
３．形質転換微生物がエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１ pＴＨ１０２、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１ pＴＨ１０３、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１ pＴＨ１０４（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６４）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１ pＡＨ１０４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６５）またはエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１ pＰＨＤ３０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６６）である、２記載の形質転換微生物。
４．１〜３いずれか１項記載の形質転換微生物を使用することを特徴とする、５−置換ヒダントインを不斉的に加水分解して対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する酵素の製造法。
５．４記載の製造法で得られた酵素を使用することを特徴とする５−置換ヒダントインからＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸の製造法。
６．５−置換ヒダントインが一般式（１）：
７．バチルス ｓｐ．ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６３）由来のヒダントイナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片と、プラスミド（pＵＣＮＴ）との組換えにより得られ、図２〜４のいずれかに示す制限酵素切断地図を有する組換えプラスミド。
８．組換えプラスミドが、pＴＨ１０２、pＴＨ１０３またはpＴＨ１０４である７記載の組換プラスミド。
９．アグロバクテリウム ｓｐ．ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９００）由来のヒダントイナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断面とプラスミドpＵＣ１８との組換えによって得られ、図１の制限酵素地図を有する組換えプラスミド。
１０．組換えプラスミドがpＡＨ１０４３である９記載の組換えプラスミド。
１１．シュードモナス ｓｐ．ＫＮＫ００３Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−３１８１）由来のヒダントイナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片と、プラスミドpＵＣ１８の組換えによって得られ、図５の制限酵素地図を有する組換えプラスミド。
１２．組換えプラスミドがpＰＨＤ３０１である１１記載の組換えプラスミド。
１３．配列表配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜４５７のアミノ酸配列の全部または一部をコードする５−置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解して、対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する酵素活性を示す蛋白質の遺伝子。
１４．配列表配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜４５７のアミノ酸配列の全部または一部を含み、５−置換ヒダントインを不斉的に加水分解して対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する活性を有する酵素蛋白質。
１５．配列表配列番号３のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜４８５のアミノ酸配列の全部または一部をコードする５−置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解して、対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する酵素活性を示す蛋白質の遺伝子。
１６．配列表配列番号１の塩基番号１〜２５１８の塩基配列の全部または一部もしくはこれと等価の塩基配列を持ち、５−置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解して、対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する酵素活性を示す蛋白質の遺伝子を含むＤＮＡ断片。
１７．配列表配列番号３の塩基番号１〜１５６９の塩基配列の全部または一部もしくはこれと等価の塩基配列を持ち、５−置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解して、対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する酵素活性を示す蛋白質の遺伝子を含むＤＮＡ断片。
１８．配列表配列番号３のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜４８５のアミノ酸配列の全部または一部を含み、５−置換ヒダントインを不斉的に加水分解して対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する活性を有する酵素蛋白質。
本発明により得られるようなヒダントイナーゼの生産性が極めて高い形質転換体はこれまで知られておらず、この形質転換体の酵素を作用させることにより非常に効率良く経済的にＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸を製造することが可能になった。
本発明に用いる遺伝子を含むＤＮＡ断片は、バチルス ｓｐ．ＫＮＫ２４５ アグロバクテリウム ｓｐ．ＫＮＫ７１２またはシュードモナス ｓｐ．ＫＮＫ００３Ａから得ることができる。アグロバクテリウム ｓｐ．ＫＮＫ７１２およびシュードモナス ｓｐ．ＫＮＫ００３Ａは、各々、ＦＥＲＭ ＢＰ−１９００およびＦＥＲＭ ＢＰ−３１８１の受託番号の下、本出願人により既に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、また、ＷＯ９２／１０５７９にその詳細が記載されている公知株である。また、バチルス ｓｐ．ＫＮＫ２４５は、この度、本発明者らにより、新たに見いだされた菌株で、１９９４年１１月１２日より、ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６３の受託番号の下、同研究所に寄託されている。
つぎに、バチルス ｓｐ．ＫＮＫ２４５の菌学的性質を示す。
かかる菌株からヒダントイナーゼ遺伝子を得るには、通常以下の様に行う。
まず、微生物の菌体より染色体ＤＮＡを抽出し、つぎに、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えば、Ｓau３ＡＩ等で部分加水分解した後に、ベクターＤＮＡと結合させて、種々の染色体ＤＮＡの断片をもつ組換え体ＤＮＡを遺伝子ライブラリーとして得る(特開昭５８−１２６７８９号および米国特許第４,２３７,２２４号明細書参照)。
そして、この遺伝子ライブラリーから目的とする遺伝子を含む組換え菌を選択するが、これは発現した蛋白を酵素活性等を指標として検出したり、蛋白のＮ末端配列を解析してそれに対応するＤＮＡプローブを合成してコロニーハイブリダイゼーション等で遺伝子の存在を検出すること等によって行うことができる。また、既知のヒダントイナーゼの塩基配列をもとに適当な部分の配列を合成したＤＮＡプライマーを用い、コロニーハイブリダイゼーションやポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法によって遺伝子を取得することもできる。遺伝子が取得できると、その塩基配列を解析する。また、ヒダントイナーゼを生産する微生物および、この酵素遺伝子を導入した組換え微生物を培養して、生産した酵素を精製し、その蛋白の分子量を決定するとともに、アミノ末端付近のアミノ酸配列を気相プロテインシークエンサーなどで決定する。
ついで、これらのＤＮＡ塩基配列と蛋白のアミノ末端配列とを比較し、ヒダントイナーゼ蛋白をコードした塩基配列部分の蛋白への翻訳開始部位を決定し、この部位より翻訳終止コドンまでの遺伝子部分に酵素蛋白がコードされていることを蛋白の分子量との関係も考慮して確かめ、目的とする遺伝子であることを確認する（Molecular Cloning, A LaboratoryManual, 2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press 第４章、第１３章)。これにより、アグロバクテリウム ｓｐ．ＫＮＫ７１２およびシュードモナス ｓｐ．ＫＮＫ００３Ａより配列表の配列番号１および３のＤＮＡ断片を得た。また、バチルス ｓｐ． ＫＮＫ２４５からもヒダントイナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。よく知られているごとく、こうして得られた当該酵素をコードした遺伝子および／またはこれを含むＤＮＡ断片は、通常、１つのアミノ酸に複数の塩基コドンが対応していることから、当該遺伝子および／またはＤＮＡ断片に対応するアミノ酸配列をコードした他の塩基配列を持つＤＮＡ断片と等価である。
本発明に用いるベクターとしては、エシェリヒア属、シュードモナス属、フラボバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する細菌の細胞内で自律複製できる微生物由来のプラスミド、ファージまたはその誘導体が使用出来る。
例えば、「組換えＤＮＡ実験指針 −解説・Ｑ＆Ａ−」（組換えＤＮＡ実験指針研究会編、科学技術庁ライフサイエンス課監修、第一法規出版(株)、平成３年９月２４日改訂）２５〜２７頁および３６〜３８頁に記載の宿主−ベクター系を用いることが出来る。また、強力な構造プロモーターをもつように改質したベクターを使用して、ベクター上の適切な位置に翻訳開始部位を連結した組換えＤＮＡを使用することにより酵素の生産量を上昇させることができる。これらの断片の両端を制限酵素で切断して、適当なベクターとの組換え体ＤＮＡを作製して、エシェリヒア属、シュードモナス属、フラボバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、アグロバクテリウム属、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物を直接形質転換してヒダントイナーゼを生産する組換え体微生物を取得することができる。
上記の属の菌種を直接形質転換しないで、例えば、エシェリヒア・コリのような他の微生物の宿主ベクター系にて目的遺伝子を一旦クローン化し、しかる後に適当なベクターとの組換え体ＤＮＡを作製してから、上記の属の菌種を形質転換しても、同様にヒダントイナーゼを生産する組換え体微生物を取得することができる。
組換え体製造のためには、Ｓ．Ｎ．Ｃohen et al．米国特許第４,２３７,２２４号明細書、遺伝子操作実験法[高木康敬編著、講談社サイエンティフィック(１９８０)、Method in Enzymology,68,Recombinant DNA[Ray Mv編、Academic Press(1979)]、特開昭５８−１２６７８９号明細書などの文献の記載が広く応用できる。
クローンした目的遺伝子の不要なＤＮＡを取り除き、強力なプロモーターを持つように改質したベクターを使用して、ベクター上の適切な位置に翻訳開始部位を連結した組換えＤＮＡを使用して上記の宿主菌を形質転換し、得られる形質転換株を用いることにより、目的酵素の生産量を上昇させることができる。
形質転換株は、通常の栄養培地に培養することにより、導入した組換え体ＤＮＡの形質を発現させることができる。組換え体ＤＮＡに遺伝子ＤＮＡまたはベクターＤＮＡ由来の性質が付与されている場合は、その性質にあわせて培地に薬剤を補ってもよい。
このようにして得られた形質転換株を酵素源として得るには、通常の培地を用いて培養を行なえばよいが、必要に応じて、ヒダントイン化合物、ウラシル、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトサイド(ＩＰＴＧ)などの添加、温度上昇など、酵素誘導のための処理を行なうこともできる。形質転換株の培養のために用いられる培地は、通常、炭素源、窒素源および無機イオンを含有する普通の培地であってよい。これにビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。炭素源としては、グルコースやシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類などが適宜使用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩などが用いられる。無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、銅イオン、アルミニウムイオン、モリブデンイオンなどが使用されてよい。
培養は、好気的条件下にpＨ４〜８、温度２５〜６０℃の適当な範囲に制御しつつ、１〜１０日間培養を行なえば、望ましい結果が得られる。
形質転換株の産生する酵素を作用する態様としては、当該転換株の培養液、菌体、菌体処理物、菌体から抽出した酵素、固定化菌体などを挙げることができる。
菌体としては、培養終了後の培養液そのまま、培養液より分離された菌、洗浄された菌体などいずれも使用可能である。菌体処理物としては凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、トルエンや界面活性剤と接触させた菌体、リゾチームで処理した菌体、超音波処理した菌体、機械的に摩砕した菌体などの他、これら菌体の処理物から得られたヒダントイナーゼ活性を有する酵素抽出液、さらには、これらの菌体の固定化物、菌体処理物の不溶化物、酵素蛋白の固定化用担体（例えば、陰イオン交換樹脂）への固定化物などが使用出来る。なお、固定化法については、例えば、特開昭６３−１８５３８２号明細書が参考になる。
固定化に使用される支持体としては、デュオライト(Duolite)Ａ５６８またはＤＳ１７１８６(ローム・アンド・ハース社:登録商標)などのフェノールホルムアルデヒド陰イオン交換樹脂、アンバーライト(Amberlite)ＩＲＡ９３５、ＩＲＡ９４５、ＩＲＡ９０１(ローム・アンド・ハース社:登録商標)、レワタイト(Lewatit)ＯＣ１０３７(バイエル社:登録商標)、ダイアイオン(Diaion)ＥＸ−０５(三菱化成工業:登録商標)などのポリスチレン樹脂のような各種アミンやアンモニウム塩あるいはジエタノールアミン型の官能基を持つ各種の陰イオン交換樹脂が適している。その他ＤＥＡＥ−セルロースなどの支持体も使用することができる。
さらに、酵素の吸着をより強固かつ安定にするため、通常、架橋剤を用いるが、好適な例として、グルタルアルデヒトを挙げることができる。使用する酵素は、精製酵素だけでなく、部分精製酵素、菌体破砕液、無細胞抽出液など種々の精製度のものが使用できる。固定化酵素の調製は支持体に酵素を吸着後、架橋処理をする等の通常の調製法が使用できる。
本発明における酵素反応の基質となる、５−置換ヒダントインは特に限定するものではなく、通常この種の反応に使用されるもの、いずれでもよい。例えば、一般式（１）：
で表わされる化合物が挙げられる。
一般式（１）の化合物における置換基Ｒは広範囲にわたることができるが、特に、医薬中間体のように産業上有用な化合物を与えるためには、Ｒがフェニル基、水酸基で置換されたフェニル基、アルキル基、置換アルキル基、アラルキル基、またはチエニル基であるのが好ましい。水酸基で置換されたフェニル基の場合、水酸基は１つもしくはそれ以上であって、o−、m−、p−いづれの位置に置換していてもよいが、p−ヒドロキシフェニル基が代表的である。アルキル基は炭素数１〜４であって、対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸がＤ−Ｎ−カルバモイル−アラニン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−バリン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−ロイシン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−イソロイシンなどとなる基である。置換アルキル基は炭素数１〜４のアルキル基が水酸基、アルキルチオ基、カルボキシル基、アミノ基、フェニル基、水酸基で置換されたフェニル基、アミド基などで置換されたものであって、対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−アミノ酸がＤ−Ｎ−カルバモイル−セリン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−スレオニン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−メチオニン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−システイン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−アスパラギン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−グルタミン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−チロシン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−トリプトファン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−アスパラギン酸、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−グルタミン酸、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−ヒスチジン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−リジン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−アルギニン、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−シトルリンなどとなる基である。アラルキル基は炭素数７〜８のたとえばベンジル、フェネチル基であって、対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸がＤ−Ｎ−カルバモイル−フェニルアラニンなどとなる基である。
水性媒体としては、水、緩衝液、エタノールのような有機溶媒を含むものが使用される。さらに必要に応じて、微生物の成育に必要な栄養素、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、ヒドロキシルアミン、金属などを水性媒体に添加することもできる。
上記微生物の菌体を水溶性媒体中で培養しながら、菌体と５−置換ヒダントインを接触せしめて作用させる場合には、５−置換ヒダントインを含み、かつ微生物の生育に必要な炭素源、窒素源、無機イオンなどの栄養素を含む水性媒体が用いられる。さらにビタミン、アミノ酸などの有機・微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。炭素源としては、グルコース、シュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類などが適宜に使用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩などが用いられる。無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、銅イオン、アルミニウムイオン、モリブデンイオンなどが使用されてよい。
培養は好気的条件下に、pＨ４〜８、温度２５〜６０℃の適当な範囲に制御しつつ行う。１〜１０日間程度培養を行なえば、５−置換ヒダントインはＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸のみに効率よく交換される。
一方、上記微生物の培養液をそのまま、培養菌体、菌体処理物、酵素抽出液、菌体の固定化物、菌体の不溶化物あるいは酵素蛋白質の固定化物と、５−置換ヒダントインを溶解または懸濁した水性媒体中で反応を行う場合は、１０〜８０℃の適当な温度に調節し、pＨを４〜９．５に保ちつつ暫時静置または撹拌すればよい。かくして、５〜１００時間程度経過すれば、ヒダントイナーゼによる基質がＤ−特異的加水分解反応と、基質の化学的なラセミ化が同時に進行して、Ｄ型、ＤＬ型あるいは、Ｌ型の５−置換ヒダントインはすべて対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換され、水性媒体中に多量に蓄積される。また、５−置換ヒダントインは反応の進行に伴って分割して添加してもよい。
生成したＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸は、常套の分離方法により分離、精製することができる。
以上述べた方法により得られる分離、精製したＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸、あるいはヒダントイナーゼ反応により得られた反応液をそのまま用いて、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸を化学的に、もしくは脱カルバモイル活性を有する酵素の作用により変換して、Ｄ−α−アミノ酸を容易に取得することができる。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明する。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明する。
ヒダントイナーゼ活性菌の土壌からの分離
土壌サンプル０．５gを生理食塩水２mlに懸濁後、放置して上澄液を１滴、分離用寒天平板培地（肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム０．３％、寒天２．０％；pＨ７．５）に塗布した。これを５０℃で２日間培養し、得られたコロニーを、同分離用平板培地にウラシル０．１％および塩化マンガン２０ppmを添加した平板培地に移植して、さらに５０℃で１日培養した。こうして得られた菌体を、反応基質液（ＤＬ−（パラヒドロキシフェニル）ヒダントイン３０mＭ、亜硫酸ナトリウム０．１％、炭酸緩衝液５０mＭ）１００μlに懸濁し、５０℃で２時間反応させた。つぎに、反応液をＴＬＣプレートにスポットし、ブタノール：酢酸：水（４：１：１）の展開溶媒で展開後、１０％p−ジメチルアミノベンズアルデヒドの濃塩酸溶液を用いて黄色スポットを検出することにより、Ｎ−カルバモイルパラヒドロキシフェニルグリシンを生成する菌株を選択した。このようにして２７４０個のコロニーからヒダントイナーゼ高活性菌であるバチルス ｓｐ． ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６３）を分離した。
土壌サンプル０．５gを生理食塩水２mlに懸濁後、放置して上澄液を１滴、分離用寒天平板培地（肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム０．３％、寒天２．０％；pＨ７．５）に塗布した。これを５０℃で２日間培養し、得られたコロニーを、同分離用平板培地にウラシル０．１％および塩化マンガン２０ppmを添加した平板培地に移植して、さらに５０℃で１日培養した。こうして得られた菌体を、反応基質液（ＤＬ−（パラヒドロキシフェニル）ヒダントイン３０mＭ、亜硫酸ナトリウム０．１％、炭酸緩衝液５０mＭ）１００μlに懸濁し、５０℃で２時間反応させた。つぎに、反応液をＴＬＣプレートにスポットし、ブタノール：酢酸：水（４：１：１）の展開溶媒で展開後、１０％p−ジメチルアミノベンズアルデヒドの濃塩酸溶液を用いて黄色スポットを検出することにより、Ｎ−カルバモイルパラヒドロキシフェニルグリシンを生成する菌株を選択した。このようにして２７４０個のコロニーからヒダントイナーゼ高活性菌であるバチルス ｓｐ． ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６３）を分離した。
バチルス ｓｐ． ＫＮＫ２４５由来のヒダントイナーゼのＮ末端アミノ酸配列の決定
バチルス ｓｐ． ＫＮＫ２４５株一白金耳を５００ml坂口フラスコ中の種母培地（肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、イーストエキス０．５％；pＨ７．５）１００mlに植菌し、５５℃で１９時間培養した。ついで、その２％を２リットル坂口フラスコの本培養培地（肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、イーストエキス０．５％、ウラシル０．１％、塩化マンガン４水和物２０ppm；pＨ７．５）５００mlに植菌して５５℃で１９時間培養した。得られた９リットルの培養ブロスから菌体を遠心分離により集菌した。これを０．２ＭＴris−ＨＣl(pＨ８．０)２０mＭ硫酸マンガンに懸濁し、超音波粉砕した後、遠心分離を行い。無細胞抽出液を得た。つぎに、硫安沈殿による分画、ＤＥＡＥ−Ｓepharose、フェニル−Ｓepharoseを用いて３２倍まで精製した。さらに、硫安を用いてヒダントイナーゼの結晶を取得した。この結晶を水に溶解して、４７０Ａ型気相プロテイン・シーケンサー（アプライド・バイオシステムズ社製）により解析したことろ、ヒダントイナーゼはＮ末端に、
Ｍet−Ｌys−Ｌys−Ｉle−Ｉle−Ｌys−Ａsn−Ｇly−Ｔhr−Ｉle−Ｖal−Ｔhr−
なるアミノ酸配列を持つことが判った。
バチルス ｓｐ． ＫＮＫ２４５株一白金耳を５００ml坂口フラスコ中の種母培地（肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、イーストエキス０．５％；pＨ７．５）１００mlに植菌し、５５℃で１９時間培養した。ついで、その２％を２リットル坂口フラスコの本培養培地（肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、イーストエキス０．５％、ウラシル０．１％、塩化マンガン４水和物２０ppm；pＨ７．５）５００mlに植菌して５５℃で１９時間培養した。得られた９リットルの培養ブロスから菌体を遠心分離により集菌した。これを０．２ＭＴris−ＨＣl(pＨ８．０)２０mＭ硫酸マンガンに懸濁し、超音波粉砕した後、遠心分離を行い。無細胞抽出液を得た。つぎに、硫安沈殿による分画、ＤＥＡＥ−Ｓepharose、フェニル−Ｓepharoseを用いて３２倍まで精製した。さらに、硫安を用いてヒダントイナーゼの結晶を取得した。この結晶を水に溶解して、４７０Ａ型気相プロテイン・シーケンサー（アプライド・バイオシステムズ社製）により解析したことろ、ヒダントイナーゼはＮ末端に、
Ｍet−Ｌys−Ｌys−Ｉle−Ｉle−Ｌys−Ａsn−Ｇly−Ｔhr−Ｉle−Ｖal−Ｔhr−
なるアミノ酸配列を持つことが判った。
アグロバクテリウム ｓｐ．ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９００)由来のヒダントイナーゼに関与する遺伝子を含むプラスミドの取得
ヒダントイナーゼ遺伝子は、ＷＯ９２／１０５７９に記載されているプラスミドpＡＨＤ１０１にクローン化されたＤＮＡ断片上に存在していることを以下の方法で検討することにより見出した。pＡＨＤ１０１を常法によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００mg／リットルのアンピシリンを含むＬ−ブロス（ペプトン１０g／リットル、イーストエキス５g／リットル、塩化ナトリウム５g／リットル；pＨ７．０)５０mlに植菌し、３７℃で１６時間培養した。ついで、培養液５０mlを集菌し、上澄液を取り除き、５０mlの基質溶液（０．５％ ５−（パラヒドロキシフェニル）ヒダントイン、０．０５％Ｔriton Ｘ−１００、０．０５Ｍリン酸緩衝液；pＨ８．７）に菌体を懸濁し、窒素気流下、３７℃で３時間反応を行った。この反応液をＴＬＣにスポットし、展開後、p−ジメチルアミノベンズアルデヒドの塩酸溶液で発色したところ、標準品と一致するＤ−Ｎ−カルバモイル−（パラヒドロキシフェニル）グリシンのスポットを示した。以上のことから、pＡＨＤ１０１の形質転換株はヒダントイナーゼをコードする遺伝子を発現していることが確認できた。
プラスミドpＡＨＤ１０１をＳacＩおよびＳalＩで切断して、挿入断片を短縮化して得られた２．１kbpの断片を、pＵＣ１８のＳacＩ,ＳalＩ切断フラグメントと連結してプラスミドpＡＨ１０４３を得た（図１参照)。
また、ＤＮＡシークエンスキット(アプライド・バイオシステムズ社製)を用いて、ヒダントイナーゼ遺伝子の塩基配列の決定を行なった。この結果を配列表配列番号１に示した。
プラスミドpＡＨ１０４３でエシェリヒア・コリ ＨＢ１０１を形質転換し形質転換株エシェリヒア・コリ ＨＢ１０１ pＡＨ１０４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６５）を得た。
ヒダントイナーゼ遺伝子は、ＷＯ９２／１０５７９に記載されているプラスミドpＡＨＤ１０１にクローン化されたＤＮＡ断片上に存在していることを以下の方法で検討することにより見出した。pＡＨＤ１０１を常法によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９に形質転換し、１００mg／リットルのアンピシリンを含むＬ−ブロス（ペプトン１０g／リットル、イーストエキス５g／リットル、塩化ナトリウム５g／リットル；pＨ７．０)５０mlに植菌し、３７℃で１６時間培養した。ついで、培養液５０mlを集菌し、上澄液を取り除き、５０mlの基質溶液（０．５％ ５−（パラヒドロキシフェニル）ヒダントイン、０．０５％Ｔriton Ｘ−１００、０．０５Ｍリン酸緩衝液；pＨ８．７）に菌体を懸濁し、窒素気流下、３７℃で３時間反応を行った。この反応液をＴＬＣにスポットし、展開後、p−ジメチルアミノベンズアルデヒドの塩酸溶液で発色したところ、標準品と一致するＤ−Ｎ−カルバモイル−（パラヒドロキシフェニル）グリシンのスポットを示した。以上のことから、pＡＨＤ１０１の形質転換株はヒダントイナーゼをコードする遺伝子を発現していることが確認できた。
プラスミドpＡＨＤ１０１をＳacＩおよびＳalＩで切断して、挿入断片を短縮化して得られた２．１kbpの断片を、pＵＣ１８のＳacＩ,ＳalＩ切断フラグメントと連結してプラスミドpＡＨ１０４３を得た（図１参照)。
また、ＤＮＡシークエンスキット(アプライド・バイオシステムズ社製)を用いて、ヒダントイナーゼ遺伝子の塩基配列の決定を行なった。この結果を配列表配列番号１に示した。
プラスミドpＡＨ１０４３でエシェリヒア・コリ ＨＢ１０１を形質転換し形質転換株エシェリヒア・コリ ＨＢ１０１ pＡＨ１０４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６５）を得た。
バチルス ｓｐ．ＫＮＫ２４５の染色体ＤＮＡとベクターＤＮＡの組換え体ＤＮＡの創製
２リットルの液体培地（肉エキス１０g／リットル、ペプトン１０g／リットル、イーストエキス５g／リットル；pＨ７．５）でバチルス ｓｐ．ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６３）を４５℃で２４時間培養した後、集菌し、菌体を得た。得られた菌体よりＭarmur法に従って染色体ＤＮＡを抽出した。この染色体ＤＮＡ１μgにＢamＨＩを１０Ｕ添加し、３７℃で１６時間反応させて完全分解を行なった。
一方、別にプラスミドpＵＣ１９をＢamＨＩで完全切断し、これを先に得られた染色体からのＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼによって連結し、多種の組換え体プラスミドの混液を得た。
２リットルの液体培地（肉エキス１０g／リットル、ペプトン１０g／リットル、イーストエキス５g／リットル；pＨ７．５）でバチルス ｓｐ．ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６３）を４５℃で２４時間培養した後、集菌し、菌体を得た。得られた菌体よりＭarmur法に従って染色体ＤＮＡを抽出した。この染色体ＤＮＡ１μgにＢamＨＩを１０Ｕ添加し、３７℃で１６時間反応させて完全分解を行なった。
一方、別にプラスミドpＵＣ１９をＢamＨＩで完全切断し、これを先に得られた染色体からのＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼによって連結し、多種の組換え体プラスミドの混液を得た。
バチルス ｓｐ．ＫＮＫ２４５由来のヒダントイナーゼ遺伝子の取得
実施例３に示したアグロバクテリウム ｓｐ．ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９００）および特開昭６２−８７０８９号に示されたＬu１２２０株由来のヒダントイナーゼ遺伝子の塩基配列をもとに、これらの配列の１１５５bpの長さの塩基をはさみ、各相補鎖の配列を有する逆向きの２種類のプライマー１および２（表２）を合成した。実施例４で調製した、バチルス ｓｐ．ＫＮＫ２４５由来の染色体ＤＮＡを鋳型として合成した２種類のプライマーを用いてポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）を行なったところ、１．２kbp程度のフラグメントを得ることができた。このフラグメントの塩基配列の決定を、ＤＮＡシークエンスキット（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いて決定したところ、既知のヒダントイナーゼ遺伝子の塩基配列と相同性が高く、得られたＰＣＲフラグメントはヒダントイナーゼ遺伝子の一部であることがわかった。つぎに、このフラグメントの各相補鎖の配列を有する２種類の逆向きのプライマー３および４（表２）を合成した。
さらに、実施例４の組換え体ＤＮＡのベクター部分の配列を有するプライマー５（表２）を合成して、先に合成したプライマーと、このプライマーを用いて、実施例１の組換え体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行ない、ヒダントイナーゼ遺伝子の前半部分と後半部分を含む２種類のＤＮＡ断片を得た。そしてこれらのＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。実施例２で示したヒダントイナーゼ蛋白質のＮ末端アミノ酸配列から予想される塩基配列から翻訳開始コドンを決定して、先に決定した塩基配列の結果と合わせてヒダントイナーゼをコードする遺伝子の全塩基配列を決定した。
つぎに、このようにして得られた塩基配列をもとに、ヒダントイナーゼ遺伝子の開始コドンの付近の配列に制限酵素ＮdeＩの切断配列をもつプライマー６（表２）とヒダントイナーゼ遺伝子内のＰstＩ切断部位の配列をもつプライマー７（表２）を合成して、これらのプライマーを用い、実施例１の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ない、１．２kbのフラグメント１を得た。つぎに、先のＰstＩ切断部位で逆向きのプライマー８（表２）と、終止コドンの後の配列を有し、ＨindＩＩＩ切断部位の配列をもつプライマー９（表２）を合成して、実施例１の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ない、０．２５kbのフラグメント２を得た。フラグメント１を、ＮdeＩとＰstＩで、フラグメント２を、ＰstＩとＨindＩＩＩで、ＷＯ９４／０３６１３に示されるpＵＣ１９の改良ベクタープラスミドpＵＣＮＴをＮdeＩとＨindＩＩＩで、それぞれ切断した断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結することによりヒダントイナーゼ遺伝子を含むプラスミドpＴＨ１０２を得た（図２参照）。
実施例３に示したアグロバクテリウム ｓｐ．ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９００）および特開昭６２−８７０８９号に示されたＬu１２２０株由来のヒダントイナーゼ遺伝子の塩基配列をもとに、これらの配列の１１５５bpの長さの塩基をはさみ、各相補鎖の配列を有する逆向きの２種類のプライマー１および２（表２）を合成した。実施例４で調製した、バチルス ｓｐ．ＫＮＫ２４５由来の染色体ＤＮＡを鋳型として合成した２種類のプライマーを用いてポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）を行なったところ、１．２kbp程度のフラグメントを得ることができた。このフラグメントの塩基配列の決定を、ＤＮＡシークエンスキット（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いて決定したところ、既知のヒダントイナーゼ遺伝子の塩基配列と相同性が高く、得られたＰＣＲフラグメントはヒダントイナーゼ遺伝子の一部であることがわかった。つぎに、このフラグメントの各相補鎖の配列を有する２種類の逆向きのプライマー３および４（表２）を合成した。
さらに、実施例４の組換え体ＤＮＡのベクター部分の配列を有するプライマー５（表２）を合成して、先に合成したプライマーと、このプライマーを用いて、実施例１の組換え体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行ない、ヒダントイナーゼ遺伝子の前半部分と後半部分を含む２種類のＤＮＡ断片を得た。そしてこれらのＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。実施例２で示したヒダントイナーゼ蛋白質のＮ末端アミノ酸配列から予想される塩基配列から翻訳開始コドンを決定して、先に決定した塩基配列の結果と合わせてヒダントイナーゼをコードする遺伝子の全塩基配列を決定した。
つぎに、このようにして得られた塩基配列をもとに、ヒダントイナーゼ遺伝子の開始コドンの付近の配列に制限酵素ＮdeＩの切断配列をもつプライマー６（表２）とヒダントイナーゼ遺伝子内のＰstＩ切断部位の配列をもつプライマー７（表２）を合成して、これらのプライマーを用い、実施例１の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ない、１．２kbのフラグメント１を得た。つぎに、先のＰstＩ切断部位で逆向きのプライマー８（表２）と、終止コドンの後の配列を有し、ＨindＩＩＩ切断部位の配列をもつプライマー９（表２）を合成して、実施例１の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ない、０．２５kbのフラグメント２を得た。フラグメント１を、ＮdeＩとＰstＩで、フラグメント２を、ＰstＩとＨindＩＩＩで、ＷＯ９４／０３６１３に示されるpＵＣ１９の改良ベクタープラスミドpＵＣＮＴをＮdeＩとＨindＩＩＩで、それぞれ切断した断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結することによりヒダントイナーゼ遺伝子を含むプラスミドpＴＨ１０２を得た（図２参照）。
バチルス ｓｐ．ＫＮＫ２４５ヒダントイナーゼ遺伝子の発現用組換え体ＤＮＡの創製
実施例５のフラグメント２を得るのと同様の方法でＰＣＲを行ない、０．２５kbのフラグメント３を得た。ただし、この時使用した合成プライマーは、フラグメント２を得る時に使用したＰstＩ切断部位をもつプライマーの代わりに、ＰstＩ切断部位近くのＮdeＩ切断部位を１塩基置換して、ＮdeＩで切断できなくしたプライマー１０（表２）と、終止コドン付近のプライマーのかわりに、終止コドン以降の塩基の数をさらに減少させたプライマー１１（表２）を使用した。つぎに、実施例５のpＴＨ１０２を取得するのと同じ方法でフラグメント１と３とpＵＣＮＴからプラスミドpＴＨ１０３を得た（図３参照）。
さらに、pＴＨ１０３を得るのと同様の方法で、ただし、終止コドン付近のプライマー１１の終止コドンＴＡＧをＴＡＡに変異させたプライマー１２（表２）を使用して、pＴＨ１０４を得た（図４参照)。
pＴＨ１０４で形質転換されたエシェリヒア・コリＨＢ１０１をエシェリヒア・コリＨＢ１０１ pＴＨ１０４とした。この菌株は、生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４８６４の寄託番号の下、１９９４年１１月２日より寄託してある。
実施例５のフラグメント２を得るのと同様の方法でＰＣＲを行ない、０．２５kbのフラグメント３を得た。ただし、この時使用した合成プライマーは、フラグメント２を得る時に使用したＰstＩ切断部位をもつプライマーの代わりに、ＰstＩ切断部位近くのＮdeＩ切断部位を１塩基置換して、ＮdeＩで切断できなくしたプライマー１０（表２）と、終止コドン付近のプライマーのかわりに、終止コドン以降の塩基の数をさらに減少させたプライマー１１（表２）を使用した。つぎに、実施例５のpＴＨ１０２を取得するのと同じ方法でフラグメント１と３とpＵＣＮＴからプラスミドpＴＨ１０３を得た（図３参照）。
さらに、pＴＨ１０３を得るのと同様の方法で、ただし、終止コドン付近のプライマー１１の終止コドンＴＡＧをＴＡＡに変異させたプライマー１２（表２）を使用して、pＴＨ１０４を得た（図４参照)。
pＴＨ１０４で形質転換されたエシェリヒア・コリＨＢ１０１をエシェリヒア・コリＨＢ１０１ pＴＨ１０４とした。この菌株は、生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４８６４の寄託番号の下、１９９４年１１月２日より寄託してある。
シュードモナス ｓｐ．ＫＮＫ００３Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−３１８１）由来の、ヒダントイナーゼに関与する遺伝子を含むプラスミドの取得
実施例３と同様の方法によって、ＷＯ９２／１０５７９に記載されているプラスミドpＰＨＤ３０１にヒダントイナーゼ遺伝子が存在することを見出した。
エシェリヒア・コリＨＢ１０１をpＰＨＤ３０１で形質転換してエシェリヒア・コリＨＢ１０１pＰＨＤ３０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６６）を得た。また、pＰＨＤ３０１の制限酵素地図を図５に示す。
また、実施例３と同様に、ヒダントイナーゼ遺伝子の塩基配列の決定を行い、その結果を配列表の配列番号３に示した。
実施例３と同様の方法によって、ＷＯ９２／１０５７９に記載されているプラスミドpＰＨＤ３０１にヒダントイナーゼ遺伝子が存在することを見出した。
エシェリヒア・コリＨＢ１０１をpＰＨＤ３０１で形質転換してエシェリヒア・コリＨＢ１０１pＰＨＤ３０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６６）を得た。また、pＰＨＤ３０１の制限酵素地図を図５に示す。
また、実施例３と同様に、ヒダントイナーゼ遺伝子の塩基配列の決定を行い、その結果を配列表の配列番号３に示した。
形質転換株から得られた酵素による５−（パラヒドロキシフェニル）ヒダントインのＤ−Ｎ−カルバモイル−（パラヒドロキシフェニル）グリシンへの変換
実施例６で得られた形質転換株のエシェリヒア・コリＨＢ１０１pＴＨ１０４を、アンピシリン１００μg／mlと塩化マンガン４水和物４００ppmを含む２ＹＴ・ブロス（ポリペプトン１６g／リットル、イーストエキス１０g／リットル、塩化ナトリウム５g／リットル；pＨ７．０）５０mlに植菌し、３７℃で２４時間培養した。この培養液５０mlから菌体を集菌し、０．０５Ｍ炭酸緩衝液pＨ８．７に懸濁して５０mlとした。これにＴritonＸ−１００を終濃度０．０５％となるように加えた後、５−（パラヒドロキシフェニル）ヒダントインを１．５g加えて、６Ｎ苛性ソーダでpＨ８．７にpＨコントロールしながら、窒素気流下、４０℃に保温しながら３時間撹拌して反応を行なった。反応後の反応液を遠心分離して上清の生成Ｄ−Ｎ−カルバモイル−（パラヒドロキシフェニル）グリシンの比色定量を、１０％パラジメチルアミノベンズアルデヒドの濃塩酸溶液による発色で行ったところ変換収率９７．５％でＤ−Ｎ−カルバモイル−（パラヒドロキシフェニル）グリシンが生成していた。
この反応液を塩酸でpＨ５に調整し、遠心分離した後、上澄液を濃縮して、塩酸でpＨ２に調整した後、４℃に保存して析出した結晶を濾集した。水−エタノールより再結して、９７０mgのＤ−Ｎ−カルバモイル−（パラヒドロキシフェニル）グリシンを得た。融点１７６〜１７７℃、[α]Ｄ２０＝−１７７．０°(Ｃ＝０．５、５％エタノール)。
実施例６で得られた形質転換株のエシェリヒア・コリＨＢ１０１pＴＨ１０４を、アンピシリン１００μg／mlと塩化マンガン４水和物４００ppmを含む２ＹＴ・ブロス（ポリペプトン１６g／リットル、イーストエキス１０g／リットル、塩化ナトリウム５g／リットル；pＨ７．０）５０mlに植菌し、３７℃で２４時間培養した。この培養液５０mlから菌体を集菌し、０．０５Ｍ炭酸緩衝液pＨ８．７に懸濁して５０mlとした。これにＴritonＸ−１００を終濃度０．０５％となるように加えた後、５−（パラヒドロキシフェニル）ヒダントインを１．５g加えて、６Ｎ苛性ソーダでpＨ８．７にpＨコントロールしながら、窒素気流下、４０℃に保温しながら３時間撹拌して反応を行なった。反応後の反応液を遠心分離して上清の生成Ｄ−Ｎ−カルバモイル−（パラヒドロキシフェニル）グリシンの比色定量を、１０％パラジメチルアミノベンズアルデヒドの濃塩酸溶液による発色で行ったところ変換収率９７．５％でＤ−Ｎ−カルバモイル−（パラヒドロキシフェニル）グリシンが生成していた。
この反応液を塩酸でpＨ５に調整し、遠心分離した後、上澄液を濃縮して、塩酸でpＨ２に調整した後、４℃に保存して析出した結晶を濾集した。水−エタノールより再結して、９７０mgのＤ−Ｎ−カルバモイル−（パラヒドロキシフェニル）グリシンを得た。融点１７６〜１７７℃、[α]Ｄ２０＝−１７７．０°(Ｃ＝０．５、５％エタノール)。
固定化ヒダントイナーゼの調製
実施例７と同様の方法で得られたエシェリヒア・コリＨＢ１０１pＴＨ１０４の培養液１リットルを集菌後、１mＭ硫酸マンガン水溶液に懸濁後、６０mlにしてpＨ８．５に調整し、超音波により菌体の破砕を行なった。このようにして得られた酵素液にpＨ８．５に平衡化した陰イオン交換樹脂Duolite Ａ−５６８を２０g加え、１５℃で２０時間撹拌して、酵素を吸着させた。この液に終濃度０．１％となるようにグルタールアルデヒドを加え、１時間撹拌し、架橋処理を行なった。この後、樹脂を濾集、洗浄して固定化ヒダントイナーゼ２０gを得た。
実施例７と同様の方法で得られたエシェリヒア・コリＨＢ１０１pＴＨ１０４の培養液１リットルを集菌後、１mＭ硫酸マンガン水溶液に懸濁後、６０mlにしてpＨ８．５に調整し、超音波により菌体の破砕を行なった。このようにして得られた酵素液にpＨ８．５に平衡化した陰イオン交換樹脂Duolite Ａ−５６８を２０g加え、１５℃で２０時間撹拌して、酵素を吸着させた。この液に終濃度０．１％となるようにグルタールアルデヒドを加え、１時間撹拌し、架橋処理を行なった。この後、樹脂を濾集、洗浄して固定化ヒダントイナーゼ２０gを得た。
固定化酵素による５−（パラヒドロキシフェニル）ヒダントインのＤ−Ｎ−カルバモイル−（パラヒドロキシフェニル）グリシンへの変換
実施例９で得た固定化ヒダントイナーゼ５gを、窒素通気した４０℃の１mＭ硫酸マンガン水溶液１００mlに加えた後、５−（パラヒドロキシフェニル）ヒダントイン３gを添加して６Ｎ水酸化ナトリウムでpＨ８．７にコントロールしながら、４０℃、窒素通気下３時間撹拌して反応を行なった。反応後、静置して反応液を吸引採取した後、実施例８と同様の方法で生成カルバモイルアミノ酸を精製し、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−（パラヒドロキシフェニル）グリシンを２．２g得た。
実施例９で得た固定化ヒダントイナーゼ５gを、窒素通気した４０℃の１mＭ硫酸マンガン水溶液１００mlに加えた後、５−（パラヒドロキシフェニル）ヒダントイン３gを添加して６Ｎ水酸化ナトリウムでpＨ８．７にコントロールしながら、４０℃、窒素通気下３時間撹拌して反応を行なった。反応後、静置して反応液を吸引採取した後、実施例８と同様の方法で生成カルバモイルアミノ酸を精製し、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−（パラヒドロキシフェニル）グリシンを２．２g得た。
バチルス ｓｐ．ＫＮＫ２４５ヒダントイナーゼ遺伝子のバチルス・サブチルスでの発現
実施例５に記載の方法に準じて、バチルス ｓｐ．ＫＮＫ２４５由来の染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマー１２および１３（表２）を用いてＰＣＲを行い、１．７kbのフラグメントを得た。これをＢamＨＩおよびＨindＩＩＩで切断し、同様に切断したプラスミドpＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造）とライゲートしてプラスミドpＴＨＢ３０１を得た。その制限酵素地図を図６に示す。
このプラスミドpＴＨＢ３０１をバチルス・サブチルスＩＳＷ１２１４（宝酒造より入手）、バチルス・サブチルスＹＳ−１１（ＩＡＭ１２０１９）またはバチルス・サブチルス３１１５（ＩＡＭ１２０２０）に、電気穿孔法（島津製作所製ＧＴＥ−１０型使用、１０ＫＶ／cm，２ms）で導入し、実施例４に示す培地に、ＭnＣl２・４Ｈ２Ｏを０．０２g／リットル添加した培地で、３７℃、２０時間培養した。菌体を集めて、超音波により破砕することにより、無細胞抽出液を調製したところ、バチルス ｓｐ．ＫＮＫ２４５を同条件で培養したときと比較して、ヒダントイナーゼの比活性は、いずれも約２．２倍高かった。
実施例５に記載の方法に準じて、バチルス ｓｐ．ＫＮＫ２４５由来の染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマー１２および１３（表２）を用いてＰＣＲを行い、１．７kbのフラグメントを得た。これをＢamＨＩおよびＨindＩＩＩで切断し、同様に切断したプラスミドpＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造）とライゲートしてプラスミドpＴＨＢ３０１を得た。その制限酵素地図を図６に示す。
このプラスミドpＴＨＢ３０１をバチルス・サブチルスＩＳＷ１２１４（宝酒造より入手）、バチルス・サブチルスＹＳ−１１（ＩＡＭ１２０１９）またはバチルス・サブチルス３１１５（ＩＡＭ１２０２０）に、電気穿孔法（島津製作所製ＧＴＥ−１０型使用、１０ＫＶ／cm，２ms）で導入し、実施例４に示す培地に、ＭnＣl２・４Ｈ２Ｏを０．０２g／リットル添加した培地で、３７℃、２０時間培養した。菌体を集めて、超音波により破砕することにより、無細胞抽出液を調製したところ、バチルス ｓｐ．ＫＮＫ２４５を同条件で培養したときと比較して、ヒダントイナーゼの比活性は、いずれも約２．２倍高かった。
バチルス ｓｐ．ＫＮＫ２４５ヒダントイナーゼ遺伝子の好熱菌での発現
実施例１１で作製したプラスミドpＴＨＢ３０１をプロトプラスト法
（Ｊ．Ｂacteriol.，１４９，８２４（１９８２）に準じる）でバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）ＩＦＯ１２５５０に形質転換し、実施例１１と同様の方法で培養し、無細胞抽出液を調製した。同条件で調製したバチルス ｓｐ．ＫＮＫ２４５の無細胞抽出液と比較して、ヒダントイナーゼの比活性は約３．６倍高かった。
以上記載したとおり、本発明によれば、ヒダントイナーゼの生産性が極めて高い微生物が創製でき、これを酵素源として使用することにより、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸が効率よく生産できる。
実施例１１で作製したプラスミドpＴＨＢ３０１をプロトプラスト法
（Ｊ．Ｂacteriol.，１４９，８２４（１９８２）に準じる）でバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）ＩＦＯ１２５５０に形質転換し、実施例１１と同様の方法で培養し、無細胞抽出液を調製した。同条件で調製したバチルス ｓｐ．ＫＮＫ２４５の無細胞抽出液と比較して、ヒダントイナーゼの比活性は約３．６倍高かった。
以上記載したとおり、本発明によれば、ヒダントイナーゼの生産性が極めて高い微生物が創製でき、これを酵素源として使用することにより、Ｄ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸が効率よく生産できる。
Claims (14)
- バチルス（Bacillus）ｓｐ．ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６３）の染色体ＤＮＡを鋳型として、下記に示すプライマー６とプライマー７のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、得られたフラグメントをＮｄｅＩとＰｓｔＩで切断したＤＮＡ断片と、
バチルス（Bacillus）ｓｐ．ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６３）の染色体ＤＮＡを鋳型として、下記に示すプライマー８とプライマー９のプライマーセット、プライマー１０とプライマー１１のプライマーセット、およびプライマー１０とプライマー１２のプライマーセットからなる群から選択されるプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、得られたフラグメントをＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したＤＮＡ断片を、
ベクタープラスミドｐＵＣＮＴをＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したものへＴ４ＤＮＡリガーゼで連結して得られる、
５−置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解して対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する酵素（以下、ヒダントイナーゼという）をコードする遺伝子を含む組み換えＤＮＡの、ｌａｃプロモーター直後のＮｄｅＩサイトからＨｉｎｄＩＩＩサイトまでに含まれる、ヒダントイナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片と、
ベクターＤＮＡとの組換体ＤＮＡを用いて宿主微生物を形質転換して得られる形質転換微生物。
- ベクターＤＮＡがｐＵＣＮＴであり、組み換えプラスミドが下記
- 宿主微生物が、エシェリヒア属、シュードモナス属、フラボバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、アグロバクテリウム属、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物から選ばれる請求項１または２記載の形質転換微生物。
- 形質転換微生物がエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１ pＴＨ１０４（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６４）である、請求項３記載の形質転換微生物。
- 請求項１〜４いずれかに記載の形質転換微生物、またはシュードモナス（Pseudomonas） ｓｐ．ＫＮＫ００３Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−３１８１）に由来し、かつ、配列表配列番号３のアミノ酸配列からなる、５−置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解して対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する酵素（以下、ヒダントイナーゼという）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとの組換体ＤＮＡを用いて、宿主微生物を形質転換して得られる形質転換微生物を使用することを特徴とする５−置換ヒダントインを不斉的に加水分解して対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する酵素の製造法。
- 宿主微生物が、エシェリヒア属、シュードモナス属、フラボバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、アグロバクテリウム属、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物から選ばれる請求項５記載の製造法。
- エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１ pＴＨ１０４（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６４）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１ pＡＨ１０４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６５）またはエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１ pＰＨＤ３０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６６）である形質転換微生物を使用することを特徴とする５−置換ヒダントインを不斉的に加水分解して対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する酵素の製造法。
- 請求項５〜７いずれかに記載の製造法で得られた酵素を使用することを特徴とする５−置換ヒダントインからＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸の製造法。
- ５−置換ヒダントインが一般式（１）：
- バチルス（Bacillus）ｓｐ．ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６３）の染色体ＤＮＡを鋳型として、下記に示すプライマー６とプライマー７のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、得られたフラグメントをＮｄｅＩとＰｓｔＩで切断したＤＮＡ断片と、
バチルス（Bacillus）ｓｐ．ＫＮＫ２４５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８６３）の染色体ＤＮＡを鋳型として、下記に示すプライマー８とプライマー９のプライマーセット、プライマー１０とプライマー１１のプライマーセット、およびプライマー１０とプライマー１２のプライマーセットからなる群から選択されるプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、得られたフラグメントをＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したＤＮＡ断片を、
ベクタープラスミドｐＵＣＮＴをＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したものへＴ４ＤＮＡリガーゼで連結して得られる、５−置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解して対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する酵素（以下、ヒダントイナーゼという）をコードする遺伝子を含む組み換えＤＮＡの、ｌａｃプロモーター直後のＮｄｅＩサイトからＨｉｎｄＩＩＩサイトまでに含まれる、ヒダントイナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片と、
ベクタープラスミドとの組み換えプラスミド。
- ベクタープラスミドがｐＵＣＮＴであり、下記
- 請求項１０記載のプラスミドであって、下記
- 配列表配列番号３のアミノ酸配列からなる、５−置換ヒダントインを不斉的に開裂加水分解して、対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する酵素活性を示す蛋白質の遺伝子。
- 配列表配列番号３のアミノ酸配列からなる、５−置換ヒダントインを不斉的に加水分解して対応するＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸に変換する活性を有する酵素蛋白質。
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