JP4139773B2 - 新規なアミド加水分解酵素遺伝子 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、熱安定性に優れ、かつ、α−アミノ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミド加水分解酵素、該酵素タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む新規な組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該形質転換体を利用したＬ−α−アミノ酸の製造方法に関する。
背景技術
微生物あるいは微生物由来の酵素をα−アミノ酸アミドと接触させることにより光学活性Ｌ−α−アミノ酸を製造する方法が知られている（特開昭５９−１５９７８９号公報、特開昭６１−１１９１９９号公報、特開昭６２−５５０９７号公報、特開平１−２７７４９９号公報、特開平５−３０９９２号公報参照）。上記の方法は、いずれも微生物が有するアミド加水分解酵素による反応を利用するものである。アミド加水分解酵素は、アミダーゼとも称され、酸アミド基を加水分解してカルボン酸とアミン又はアンモニアを生ずる反応を触媒する加水分解酵素である。微生物由来のアミド加水分解酵素は、α−アミノ酸アミドを立体選択的に加水分解して光学活性なＬ−α−アミノ酸を産生することを特徴とする。「光学活性なＬ−α−アミノ酸」とは、左旋性の鏡像異性体が他方の鏡像異性体より多く含まれているアミノ酸のこと、又は、左旋性の鏡像異性体のみからなるアミノ酸のことをいう。
しかしながら、これら微生物あるいは微生物由来の酵素を工業的物質生産に用いる場合、コスト面をクリアーするため、使用するアミド加水分解酵素の安定性および活性が十分に高められている必要がある。上記製法において使用される微生物は、何れも５５℃以上の高温では増殖できない中温菌であるため、これらの微生物が有するアミド加水分解酵素は、常温以上の温度域では安定性が低い。従って、高温で反応を行うと酵素が不安定となり反応速度が停止又は低下するという問題があった。
発明の開示
本発明の目的は、熱安定性に優れたアミド加水分解酵素をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を任意の宿主に導入した形質転換体を作製することによって、光学活性Ｌ−α−アミノ酸の効率的な製造方法を提供することである。
本発明者らは、鋭意検討を行った結果、５５℃以上で生育可能な微生物から、熱安定性に優れたアミド加水分解酵素をコードする遺伝子を単離した。さらに、遺伝子組換え手法を用いて、任意の宿主に該遺伝子を多コピー存在させることにより、該酵素活性が向上した生体触媒を製造し得る技術の開発に成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつアミド加水分解酵素活性を有するタンパク質
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするアミド加水分解酵素遺伝子。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつアミド加水分解酵素活性を有するタンパク質
（３）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミド加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（４）（２）又は（３）記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
（５）（４）記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（６）（５）記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からアミド加水分解酵素タンパク質を採取することを特徴とするアミド加水分解酵素の製造方法。
（７）（５）記載の形質転換体を培養し、得られる培養物又はその処理物とα−アミノ酸アミドを接触させることを特徴とする光学活性Ｌ−α−アミノ酸の製造方法。
（８）５５℃以上で生育可能で、熱安定性に優れたアミド加水分解酵素を産生する、Ｔｈｅｒｍｕｓ属又はＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物。
（９）（８）に記載の微生物を培養し、得られる培養物又はその処理物とα−アミノ酸アミドを接触させることを特徴とする光学活性Ｌ−α−アミノ酸の製造方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願第２００１−２５７７３６号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
以下に、本発明を詳細に説明する。
１．天然の好熱菌による光学活性Ｌ−α−アミノ酸の製造
本発明者らは、５５℃以上で生育可能で、熱安定性に優れたアミド加水分解酵素を産生する微生物を培養し、得られる培養物又はその処理物とα−アミノ酸アミドを接触させることより光学活性Ｌ−α−アミノ酸が効率的に製造できることを見出した。
この反応を媒介するアミド加水分解酵素は、生育上限温度が５５℃以上の好熱菌に属する微生物由来のものであり、α−アミノ酸アミドを立体選択的に加水分解して光学活性Ｌ−α−アミノ酸を生成する能力があれば特に制限されるものではない。そのような酵素は、自然界から分離された菌株又はタイプカルチャーコレクションから入手される菌株から広く見いだされる。例えば、バチルス属やサーマス属に属する細菌、具体的には、例えば、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＩＭＢ８９２３やサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＮＣＩＭＢ１１２４３、が挙げられる。これらの菌株は、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩＭＢ）から容易に入手することができる。
本発明のアミド加水分解酵素は、α−アミノ酸アミドを立体選択的に加水分解して、Ｌ−α−アミノ酸を生成する能力を有するものであり、その様な能力を有する酵素としては、種々のアミダーゼあるいはアミノペプチダーゼ等が知られている。
上記微生物を培養するための培地組成としては、通常これらの微生物が生育しうるものであれば何れのものでも使用できる。炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロースやマルトース等の糖類、酢酸やクエン酸等の有機酸あるいはその塩、エタノールやグリセロール等のアルコール類等を使用できる。窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキスやアミノ酸等の一般天然窒素源の他、各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。その他、無機塩、微量金属塩、ビタミン等が必要に応じて適宜添加される。
上記微生物の培養は常法によればよく、例えば、ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ５〜９、温度２０〜８０℃、好ましくは５０〜７０℃の範囲にて１〜１００時間培養する。
本発明においては、上記微生物を培地中で培養して得られる培養物をそのままか、該培養物から遠心分離などの集菌操作によって得られる菌体、培養上清又はそれらの処理物を用いることができる。該処理物としては、菌体破砕物、菌体破砕物又は培養上清から調製した粗酵素、精製酵素等が挙げられる。また、常法により担体に固定化した菌体、該処理物、酵素等を用いることができる。
アミド加水分解反応は、通常、アミノ酸アミドを０．５〜５０％（反応基質溶液はスラリー状であってもよい）の濃度になるように水性媒体・酵素源と混合して行う。酵素源である培養物、菌体、菌体処理物等の添加量は特に制限されないが、通常、乾燥菌体質量換算で０．０１〜１０％の範囲で添加すればよい。反応は通常、０〜８０℃、好ましくは２０〜７０℃において、ｐＨ４〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０の範囲で行われる。
このようにして反応液中に生成、蓄積したＬ−α−アミノ酸は、イオン交換法、晶析法等、公知の方法を組み合わせて分離、精製し取得することができる。
本発明において、アミノ酸アミドとは、アミノ酸分子中のカルボキシル基が酸アミドになったもの意味し、式Ｉ：
で表される。式中、Ｒは、炭素数１〜４の直鎖状もしくは分岐状のアルキル基、フェニル基又はハロゲンである。該アルキル基又はフェニル基は、メルカプト基、ヒロドキシル基、アミノ基、カルボキシル基、フェニル基、インドリル基、メチルチオ基、カルバモイル基、イミダゾリル基から選ばれる１個以上の基で置換されていてもよい。あるいは、ＲはＮＨ２基と結合して環を形成していてもよい。α−アミノ酸アミドの具体例としては、フェニルアラニンアミド、トリプトファンアミド、ロイシンアミド、ｔｅｒｔ−ロイシンアミド、バリンアミド、メチオニンアミド、セリンアミド、ヒスチジンアミド、プロリンアミド等を挙げることができる。
本発明において、産生されるＬ−α−アミノ酸の具体例としては、例えば、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン等を挙げることができる。また、反応に用いるアミノ酸アミドの光学純度に関しては特に制限はない。
２．アミド加水分解酵素遺伝子のクローニング
さらに本発明者らは、５５℃以上で生育可能で、熱安定性に優れたアミド加水分解酵素を産生する微生物のうち、岐阜県の温泉水よりサーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．）Ｏ−３−１株（以下、Ｏ−３−１株と称する）を単離し、該菌株からアミド加水分解酵素タンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子を単離した。本菌株は、ブタペスト条約に基づき、平成１４年８月５日付けで、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１３９として寄託されている。Ｏ−３−１株の菌学的な性質は以下に示される。
形態 桿菌（０．５×２μｍ）、鎖状、伸長型あり グラム染色 −
胞子 −
運動性 −
コロニー形態 円形、周縁糸状、低凸状、光沢有り、淡
いクリーム色
生育の範囲
８０℃ −
７０℃ ＋
５５℃ ＋
４０℃ ＋（ｗｅａｋ）
３０℃ −
酸素に対する態度
嫌気的生育 −
カタラーゼ ＋
オキシダーゼ ＋
Ｏ／Ｆ試験 −
炭水化物からの酸産生
グリセロール −
エリスリトール −
Ｄ−アラビノース ±
Ｌ−アラビノース −
リボース ＋
Ｄ−キシロース −
Ｌ−キシロース −
アドニトール −
β−メチル−Ｄ−キシロース −
ガラクトース −
グルコース −
フラクトース −
マンノース −
ソルボース −
ラムノース −
ズルシトール −
イノシトール −
マンニトール −
ソルビトール −
α−メチル−Ｄ−マンノース −
α−メチル−Ｄ−グルコース −
Ｎ−アセチルグルコサミン −
アミグダリン −
アルブチン −
エスクリン ＋
サリシン −
セロビオース −
マルトース −
乳糖 −
メリビオース −
白糖 −
トレハロース −
イヌリン −
メレチトース −
ラフィノース −
澱粉 −
グリコーゲン −
キシリトール −
ゲンチオビオース −
Ｄ−ツラノース −
Ｄ−リキソース −
Ｄ−タガトース −
Ｄ−フコース −
Ｌ−フコース −
Ｄ−アラビトール −
Ｌ−アラビトール −
グルコネート −
２−ケトグルコン酸 −
５−ケトグルコン酸 ＋
培養的性質
肉汁液体培養 皮膜形成
リトマスミルク 不変
生理学的性質
硝酸塩還元 ＋
脱窒反応 −
ＭＲテスト −
ＶＰテスト −
インドールの生成 −
硫化水素の生成 −
でん粉加水分解 ＋
クエン酸の利用
Ｋｏｓｅｒ −
Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ −
無機窒素源の利用
ＮａＮＯ３ −
（ＮＨ４）２ＳＯ４ −
ウレアーゼ −
加水分解性
皮革末（ａｚｕｒｅ） −
エラスチン −
カゼイン −
ＤＮａｓｅ ＋
α−ガラクトシダーゼ −
β−ガラクトシダーゼ ＋
炭素源利用性
酢酸ナトリウム −
グルタミン酸ナトリウム −
コハク酸ナトリウム −
ピルビン酸ナトリウム −
プロリン −
（１）Ｏ−３−１株の培養
Ｏ−３−１株を培養するための培地組成としては、通常これらの微生物が生育しうるものであれば何れのものでも使用できる。炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロースやマルトース等の糖類、酢酸やクエン酸等の有機酸又はその塩、あるいはエタノールやグリセロール等のアルコール等を使用できる。窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキスやアミノ酸等の一般天然窒素源の他、各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。その他、無機塩、微量金属塩、ビタミン等が必要に応じて適宣添加される。また、Ｏ−３−１株の培養は常法に従えばよく、好気又は嫌気培養装置を用いて、例えば、ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ５〜９、温度２０〜８０℃、好ましくは５０〜７０℃の範囲にて１〜１００時間培養する。
（２）染色体ＤＮＡの調製
Ｏ−３−１株より染色体ＤＮＡを分離、調製する。染色体ＤＮＡの分離及び調製は、公知の方法の何れをも用いることができる。例えば、Ｓａｉｔｏ ａｎｄ Ｍｉｕｒａの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３））が挙げられる。
（３）ＤＮＡライブラリーの作製
工程（２）で得られたＯ−３−１株染色体ＤＮＡを適当な制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＭｂｏＩ、ＰｓｔＩ等）で部分分解する。これを、制限酵素（例えばＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ等）で切断し、アルカリホスファターゼ処理を行い脱リン酸化したベクターとライゲーションを行い、ライブラリーを作製する。用いることができるベクターとしては、宿主細胞で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、コスミドＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、例えばｐＢＲ３２２、ｐＳＣ１０１、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＡＣＹＣ１１７、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）等が挙げられ、ファージＤＮＡとしては、例えばλｇｔ１０、Ｃｈａｒｏｎ ４Ａ、ＥＭＢＬ−、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９等が挙げられる。例えば大腸 菌を宿主とする場合、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）などが挙げられる。
（４）形質転換体の作製
ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後連結させ、組換えベクターを作製する。形質転換の宿主は特に限定されるものではなく、例えば大腸菌を用いる場合、大腸菌ＤＨ１株、ＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＭＶ１１８４株、ＴＨ２株、Ｋ１２株、ＪＭ１０９株、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株などを挙げることができる。宿主に組換えベクターを導入するには、公知の方法により行うことができる。例えば大腸菌を宿主として用いる場合は、塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５４（１９７０））やエレクトロポレーション法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，１８４（１９９４））を採用することができ、ファージの場合はインビトロ・パッケージング法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，５７１（１９９４））等を採用することができる。
（５）アミド加水分解酵素遺伝子を含む組換えＤＮＡの選別
工程（４）で得られた形質転換体をα−アミノ酸アミドを唯一窒素源とする寒天培地上に接種する。α−アミノ酸アミドとしては、上記式Ｉで表されるものを使用できる。該寒天培地上で大きく出現したコロニーを選択し、適切な培地で液体培養を行う。培養に用いる培地としては、特に制限されないが、形質転換体の宿主として大腸菌を用いる場合、例えば、酵母エキス、トリプトン、ポリペプトン、コーンスティープリカー、大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄若しくは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宣添加したものが用いられる。また、必要に応じて、ベクターＤＮＡを安定に維持させるための抗生物質や、遺伝子発現のための誘導剤を添加する。なお、培地の初発ｐＨは７〜９に調整するのが適当である。また、培養は、２５〜４２℃で６〜２４時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。得られた培養物から遠心分離などによって集菌を行い、適当な緩衝液に懸濁する。この菌体懸濁液をα−アミノ酸アミド（例えば、ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド等）を含む緩衝液に懸濁し、反応を行う。一定時間後、高速液体クロマトグラフィー等の分析手段により、対応するα−アミノ酸の生成量を定量する。α−アミノ酸を生成していた形質転換体をアミド加水分解酵素遺伝子保有候補株として選別する。
（６）制限酵素地図の作成とサブクローニング
工程（５）で選択された形質転換体より常法に従ってプラスミドを調製する。得られたプラスミドを種々の制限酵素を用いて切断し、電気泳動により分析を行う。泳動パターンから制限酵素地図を作成し、必要に応じて、より短い断片を有するサブクローンを作製する。
（７）サブクローンのアミド加水分解酵素活性確認
工程（６）で得られたサブクローンについて形質転換体を作製した後、工程（５）の培養および反応操作を行い、α−アミノ酸生成の有無によってプラスミド中にアミド加水分解酵素遺伝子が含まれているかどうかを判別する。
（８）塩基配列の決定とアミド加水分解酵素遺伝子の同定
得られたサブクローンのうち、なるべく挿入断片が小さく、かつ、アミド加水分解酵素活性を有する形質転換体よりプラスミドを調製し、該プラスミドの挿入断片について塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、公知の方法、例えば、蛍光標識または放射標識を用いたジデオキシ法、マキサム・ギルバート法等により行うことができる。決定された塩基配列中からオープンリーディングフレームを検索し、適宣、公開されている塩基配列およびアミノ酸配列データベースとの比較を行う。
配列番号１に本発明のアミド加水分解酵素のアミノ酸配列を、配列番号２に本発明のアミド加水分解酵素遺伝子の塩基配列を例示するが、これらのアミノ酸配列を含むタンパク質がアミド加水分解酵素活性を有する限り、当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１個、好ましくは、１０〜２０個、さらに好ましくは５〜１０個のアミノ酸が欠失してもよく、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列に１個、好ましくは、１０〜２０個、さらに好ましくは５〜１０個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１個、好ましくは、１０〜２０個、さらに好ましくは５〜１０個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。また、本発明のアミド加水分解酵素遺伝子の塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アミド加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も本発明の遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、すなわち、本発明のアミド加水分解酵素遺伝子に対し高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、このような条件は、０．５〜１ＭのＮａＣｌ存在下４２〜６８℃で、又は５０％ホルムアミド存在下４２℃で、又は水溶液中６５〜６８℃で、ハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液を用いて室温〜６８℃でフィルターを洗浄することにより達成できる。
ここで、「一部の配列」とは、上記アミド加水分解酵素遺伝子の塩基配列の一部分を含むＤＮＡの塩基配列であって、該ＤＮＡがアミド加水分解能を有するタンパク質をコードするものを指す。また「一部の配列」は、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせるのに十分な塩基配列の長さを有するもの、例えば、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも５０塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基の配列である。
なお、遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、Ｍｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて行うことができる。なお、上記手法により塩基配列が決定された後は、化学合成によって、又は染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。
３．組換えベクター及び形質転換体の作製
本発明の組換えベクターは本発明の遺伝子又はその一部を適当なベクターに連結することにより得ることができ、また、本発明の形質転換体は本発明の組換えベクターを本発明の遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。「一部」とは、宿主中に導入されて本発明のアミド加水分解酵素を発現することができるアミド加水分解酵素遺伝子の一部分を指す。
本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主細胞で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、コスミドＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、例えばｐＢＲ３２２、ｐＳＣ１０１、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＡＣＹＣ１１７、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）等が挙げられ、ファージＤＮＡとしては、例えばλｇｔ１０、Ｃｈａｒｏｎ ４Ａ、ＥＭＢＬ−、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９等が挙げられる。
宿主としては、目的とする遺伝子を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）などのラルストニア属に属する細菌、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）などのシュードモナス属に属する細菌、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などのエッシェリヒア属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）などのカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などの動物細胞、ＳＦ９細胞などの昆虫細胞などが挙げられる。
大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、本発明の組換えベクターが該宿主中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、本発明のＤＮＡ、転写終結配列を含む構成であることが好ましい。発現ベクターとしては、広範囲の宿主において複製・保持されるＲＫ２複製起点を有するｐＬＡ２９１７（ＡＴＣＣ ３７３５５）やＲＳＦ１０１０複製起点を有するｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ ３７５３３）等が挙げられる。
プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。細菌への組換えベクターの導入方法としては、特に限定されないが、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，１８１（１９９４））やエレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えばＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等が挙げられる。プロモーターとしては、例えばｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＧＡＰプロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、特に限定されないが、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２，９−１９３３（１９７８））、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３−１６８（１９８３））等が挙げられる。
動物細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社）等が用いられる。プロモーターとしては、例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等が挙げられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、特に限定されないが、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
４．アミド加水分解酵素の製造
本発明のアミド加水分解酵素は、本発明の形質転換体を培地で培養し、培養物（培養菌体又は培養上清）中に本発明のアミド加水分解酵素を生成蓄積させ、該培養物からアミド加水分解酵素を採取することにより行われる。本発明の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、完全培地又は合成培地、例えばＬＢ培地、Ｍ９培地等が挙げられる。また、培養温度は０〜７０℃の範囲で好気的に１〜８０時間培養することによりアミド加水分解酵素を菌体内に蓄積させ、回収する。培養期間中ｐＨは７付近に保持する。ｐＨの調整は、無機酸又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。
炭素源は微生物の増殖に必要であり、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、マルトース等の炭水化物が挙げられる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。また、無機物としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
培養中は、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、インデューサーを培地に添加することもできる。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加することができる。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えばＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地にウシ胎児血清を添加した培地が用いられる。培養は、通常５％ＣＯ２存在下、３０〜４０℃で１〜７日間行う。培養中はカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。アミド加水分解酵素の精製は、得られる培養物を遠心して回収し（細胞についてはソニケーターにて破砕する）、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン又は陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等を単独で又は適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的の酵素であることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウエスタンブロッティング等により行う。
５．形質転換体又はその処理物による光学活性Ｌ−α−アミノ酸の製造
上記において得られた形質転換体の培養物から遠心分離などによって集菌を行い、適当な緩衝液に懸濁する。この菌体懸濁液をα−アミノ酸アミドを含む緩衝液に懸濁し、反応を行うことによって、光学活性Ｌ−α−アミノ酸を製造することができる。反応の条件は、例えば、反応温度は０〜８０℃、好ましくは１０〜７０℃、反応時間は０．１〜１００時間、好ましくは０．５〜８０時間、ｐＨは４〜１１程度である。
また、該培養物の処理物を用いて反応を行うこともできる。該処理物としては、菌体破砕物、菌体破砕物又は培養上清から調製した粗酵素、精製酵素等が挙げられる。また、常法により担体に固定化した菌体、該処理物、酵素等を用いることができる。
生成したＬ−α−アミノ酸の細胞内含量及び光学純度は、遠心分離などの方法によって菌体又は酵素を除去した後、高速液体クロマトグラフィー、ＮＭＲなどに供試することにより測定・分析することができる。
本発明の形質転換体又はアミド加水分解酵素は高温でもアミド加水分解活性が維持されるとともに、従来の微生物又は微生物由来酵素を用いる場合に比べ、効率的に光学活性Ｌ−α−アミノ酸を合成できることが明らかとなった。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
〔実施例１〕
ポリペプトン０．８％、酵母エキス０．４％、ＮａＣｌ ０．２％、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．００５％、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．００８％からなる培地（ｐＨ７．５）１００ｍｌを三角フラスコ（５００ｍｌ容）に入れ、オートクレーブ滅菌した。この培地にＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＮＣＩＭＢ１１２４３株を接種して、７０℃にて３日間培養した。
培養終了後、培養物から菌体を遠心分離にて集菌し、培養物と同量の５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）にて１回菌体を洗浄した後、同緩衝液５ｍｌに菌体を懸濁した。
上記菌体懸濁液１．５ｍｌに２％のフェニルアラニンアミド溶液１．５ｍｌを添加して、７０℃にて１時間反応を行った。反応終了後、反応液から遠心分離にて菌体を除去後、高速液体クロマトグラフィーにて定量、光学純度を分析した。
結果、０．２８％のＬ−フェニルアラニンが生成していた。光学純度は１００％ｅｅであった。
〔ＨＰＬＣ分析条件〕
（定量分析）
カラム； イナートシルＯＤＳ−３Ｖ（４．６φ×２５０ｍｍ）
移動層； ０．１％リン酸水溶液：アセトニトリル（８０：２０）
流速； １ｍｌ／ｍｉｎ
検出； ＵＶ（２５４ｎｍ）
（光学純度分析）
カラム； ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ−５０００（４．６φ×１５０ｍｍ）
移動層； ２ｍＭ硫酸銅：メタノール（７０：３０）
流速； １ｍｌ／ｍｉｎ
検出； ＵＶ（２５４ｎｍ）
〔実施例２〕
ポリペプトン０．５％、肉エキス０．３％、ＮａＣｌ ０．８％からなる培地（ｐＨ７．３）１００ｍｌを三角フラスコ（５００ｍｌ容）に入れ、オートクレーブ滅菌した。この培地にＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＩＭＢ８９２３株を接種して、５５℃にて３日間培養した。
培養終了後、培養物から菌体を遠心分離にて集菌し、培養物と同量の５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）にて１回菌体を洗浄した後、同緩衝液５ｍｌに菌体を懸濁した。
上記菌体懸濁液１．５ｍｌに２％のフェニルアラニンアミド溶液１．５ｍｌを添加して、５５℃にて１時間反応を行った。反応液から遠心分離にて菌体を除去後、実施例１と同一条件で、高速液体クロマトグラフィーにて分析したところ、０．４９％のＬ−フェニルアラニンが生成していた。光学純度は１００％ｅｅであった。
〔実施例３〕
実施例１と同様に調製した菌体懸濁液１．５ｍｌに２％のｔｅｒｔ−ロイシンアミド溶液１．５ｍｌを添加して、７０℃にて７０時間反応を行った。反応液から遠心分離にて菌体を除去後、高速液体クロマトグラフィーにて分析したところ、０．３８％のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンが生成していた。光学純度は１００％ｅｅであった。
〔ＨＰＬＣ分析条件〕
（定量分析）
カラム； イナートシルＯＤＳ−３Ｖ（４．６φ×２５０ｍｍ）
移動層； ０．１％リン酸水溶液
流速； １ｍｌ／ｍｉｎ
検出； ＲＩ
（光学純度分析）
カラム； ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ−５０００（４．６φ×１５０ｍｍ）
移動層； ２ｍＭ硫酸銅：メタノール（８５：１５）
流速； １ｍｌ／ｍｉｎ
検出； ＵＶ（２５４ｎｍ）
〔実施例４〕
実施例２と同様に調製した菌体懸濁液１．５ｍｌに２％のｔｅｒｔ−ロイシンアミド溶液１．５ｍｌを添加して、７０℃にて７０時間反応を行った。反応液から遠心分離にて菌体を除去後、高速液体クロマトグラフィーにて分析したところ、０．３１％のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンが生成していた。光学純度は１００％ｅｅであった。
〔実施例５〕
（１）Ｏ−３−１株の培養
Ｏ−３−１株を１００ｍｌの栄養培地（０．２％ポリペプトン、０．１％酵母エキス、０．２％ ＮａＣｌ、０．００５％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００８％ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．５）に接種し、７０℃にて３日間培養した。
（２）染色体ＤＮＡの調製
培養終了後、遠心分離により集菌し、滅菌蒸留水にて洗浄した後、Ｓａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１Ｍ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）２ｍｌに懸濁した。リゾチーム１０ｍｇを加えて３７℃で１時間振盪した後、１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＳＤＳ液（１％ ＳＤＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０）を穏やかに振盪しながら加え、さらにプロテイナーゼＫ（メルク社製）を終濃度１ｍｇとなるように加え、３７℃で１時間振盪した。次に、等量のＴＥ飽和フェノール（ＴＥ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加えて撹拌後遠心し、上層を採り２倍量のエタノールを加えた後ガラス棒でＤＮＡを巻きとり、９０％、８０％、７０％のエタノールで順次フェノールを取り除いた。次に、ＤＮＡを５ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼＡ溶液（１００℃、１５分間の熱処理済み）を１０ｍｇ／ｍｌになるように加え３７℃で３０分間振盪した。さらにプロテイナーゼＫを終濃度１ｍｇとなるように加えて３７℃で３０分間振盪した後、等量のＴＥ飽和フェノールを加え遠心し上層と下層に分離させ上層を採取した（以後この操作をフェノール抽出と呼ぶ）。フェノール抽出を２回繰り返した後、同量のクロロフォルム（４％イソアミルアルコール含有）を加え同様の抽出操作を繰り返した（以後この操作をクロロホルム抽出と呼ぶ）。その後上層に２倍量のエタノールを加えガラス棒でＤＮＡを巻き取り回収し、滅菌水１ｍｌに溶解して染色体ＤＮＡ標品を得た。
（３）ＤＮＡライブラリーの作製
工程（２）で得られたＯ−３−１株染色体ＤＮＡ ２００μｌに１０倍濃度制限酵素反応用緩衝液４０μｌ、滅菌水１６０μｌ、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ ２μｌを加え、３７℃にて２分間インキュベートした後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。アガロースゲル電気泳動を行い、約４〜７ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出し、ＤＮＡ ＰＲＥＰ（ダイアトロン社製）を用いて回収した。このＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩ部位に挿入し、組換えＤＮＡライブラリーを作製した。ライゲーションに用いたｐＵＣ１１８断片は次のように作製した。ｐＵＣ１１８保存液２μｌに対し、１０倍濃度制限酵素用緩衝液５μｌ、滅菌水４０μｌ、制限酵素ＢａｍＨＩ ３μｌを加え、３７℃で２時間反応後、フェノール抽出およびクロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿させた後乾燥して５０μｌの滅菌水に溶解させた。さらにアルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）１μｌ、１０倍濃度緩衝液１０μｌ、滅菌水３９μｌを加え６５℃で反応後、フェノール抽出およびクロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿後乾燥して滅菌水に溶解させた。
（４）形質転換体の作製
大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢＡｍｐ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ ＮａＣｌ、０．０１％アンピシリン）１ｍｌに接種し３７℃、５時間好気的に前培養し、この培養物０．４ｍｌをＳＯＢ培地４０ｍｌ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）に加え、１８℃で２０時間培養した。この培養物を遠心分離により集菌した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．０）、２００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、４０ｍＭ ＭｎＣｌ２）を１３ｍｌ加え、０℃で１０分間放置後、再度遠心し、上澄を除いた後、沈殿した大腸菌を冷ＴＦ溶液３．２ｍｌに懸濁し、０．２２ｍｌのジメチルスルフォキシドを加え０℃で１０分間放置した。こうして作製したコンピテントセル２００μｌに工程（３）で作製した組換えプラスミドを含有する溶液（ＤＮＡライブラリー）を１０μｌ加え、０℃で３０分放置後、４２℃で３０秒間ヒートショックを与え、０℃で２分間冷却後、ＳＯＣ培地（２０ｍＭグルコース、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）１ｍｌを添加して３７℃にて１時間振盪培養した。これを２００μｌずつＬＢＡｍｐ寒天培地（１．５％寒天を含むＬＢＡｍｐ培地）にまき、３７℃で一晩培養し、形質転換体を得た。
（５）アミド加水分解酵素遺伝子を含む組換えＤＮＡの選別
工程（４）で得られた形質転換体コロニーを、乳酸アミド含有寒天培地に接種した。乳酸アミド含有寒天培地は、滅菌シャーレに２０ｍｌずつ固化させた寒天培地（０．２％グリセロール、０．０５％ ＮａＣｌ、０．００２％チアミン塩酸塩、０．６％ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％ ＫＨ２ＰＯ４、０．００１％ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００２５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００１％ ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ、０．０００１％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．５％寒天）に、フィルター除菌済みの２０％ ＤＬ−ラクトアミド溶液をプレート一枚あたり１００μｌ塗布して作製した。３７℃にて３日間培養した後、大きく出現したコロニー１２個を１ｍＭ ＩＰＴＧ含有ＬＢＡｍｐ培地１．５ｍｌに接種し、３７℃にて一晩培養した。培養後、遠心分離により集菌し、菌体を５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ４緩衝液（ｐＨ９．０）で洗浄し、０．７ｍｌの同緩衝液に懸濁した。この菌体懸濁液０．５ｍｌを７０℃で５〜１０分間前処理した後、２％ ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを含む５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ４緩衝液（ｐＨ９．０）０．５ｍｌと混合し、７０℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、遠心分離により菌体を除去した後、高速液体クロマトグラフィーにて分析を行った。分析条件を下記に記す。
（定量分析）
カラム； イナートシルＯＤＳ−３Ｖ（４．６φ×２５０ｍｍ）
移動層； ０．１％リン酸水溶液：アセトニトリル（８０：２０）
流速； １ｍｌ／ｍｉｎ
検出； ＵＶ（２５４ｎｍ）
（光学純度分析）
カラム； ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ−５０００（４．６φ×１５０ｍｍ）
移動層； ２ｍＭ硫酸銅：メタノール（７０：３０）
流速； １ｍｌ／ｍｉｎ
検出； ＵＶ（２５４ｎｍ）
その結果、５クローンについて０．４７〜０．６３％のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの生成が見られた。光学純度はいずれも１００％ｅｅであった。
（６）制限酵素地図の作成とサブクローニング
工程（５）で選別された５クローンのうちの一つ（Ｍ５と命名する）より、Ｆｌｅｘｉ Ｐｒｅｐ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてプラスミドを精製した。得られたプラスミド（ｐＭ５）を種々の制限酵素を用いて切断し、０．７％アガロースゲル電気泳動により解析を行った結果、図１に示される約８ｋｂの挿入断片の制限酵素地図が得られた。次いで、ｐＭ５の挿入断片中、約２ｋｂのＫｐｎＩ断片、および約３．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片を取り除いて自己連結させたサブクローンｐＭ５０１（図２）を作製した。さらに、挿入断片中のＮｃｏＩサイトおよびＰｓｔＩサイトを利用してサブクローニングを行った。すなわち、ｐＭ５０１をＮｃｏＩと挿入断片Ｃ末端側のＨｉｎｄＩＩＩで切断して、約０．７ｋｂのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を除去した後、両切断末端を平滑化して自己連結させ、ｐＭ５０１ＫＮとした（図３）。また、ＰｓｔＩと挿入断片Ｎ末端側マルチクローニングサイトのＥｃｏＲＩで切断して、約１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片を除去した後、両切断末端を平滑化して自己連結させたプラスミドｐＭ５０１ＰＨを作製した（図４）。
（７）サブクローンのアミド加水分解酵素活性確認
工程（６）にて作製されたプラスミド、ｐＭ５０１、ｐＭ５０１ＫＮ、ｐＭ５０１ＰＨ、およびポジティブコントロールとしてｐＭ５を用い、工程（４）の方法により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体（ＪＭ１０９／ｐＭ５０１、ＪＭ１０９／ｐＭ５０１ＫＮ、ＪＭ１０９／ｐＭ５０１ＰＨ、ＪＭ１０９／ｐＭ５）のコロニーを１ｍＭ ＩＰＴＧ含有ＬＢＡｍｐ培地１．５ｍｌに接種し、３７℃にて一晩培養した。培養後、遠心分離により集菌し、菌体を５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ４緩衝液（ｐＨ９．０）で洗浄し、０．７ｍｌの同緩衝液に懸濁した。この菌体懸濁液０．５ｍｌを７０℃で５〜１０分間前処理した後、２％ ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを含む５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ４緩衝液（ｐＨ９．０）０．５ｍｌと混合し、７０℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、遠心分離により菌体を除去した後、工程（５）に記載の高速液体クロマトグラフィー条件にて分析を行った。その結果、ＪＭ１０９／ｐＭ５０１、ＪＭ１０９／ｐＭ５０１ＫＮおよびＪＭ１０９／ｐＭ５では、ぞれぞれ０．１４％、０．１３％、０．１４％のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの生成が見られたが、ＪＭ１０９／ｐＭ５０１ＰＨではＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの生成はまったく見られなかった。従って、ｐＭ５０１ＫＮの約１．２ｋｂの挿入断片中に目的とするアミド加水分解酵素遺伝子が存在することが明らかになった。
（８）塩基配列の決定
工程（６）で得られたプラスミドｐＭ５０１ＫＮ挿入断片中のＫｐｎＩ−ＮｃｏＩ断片（約１．２ｋｂ）の塩基配列を、ジデオキシ法により蛍光シークエンサーＡＬＦＩＩ（ファルマシア社製）を用いて決定した。その結果、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム（配列番号２）が見出された。日本ＤＮＡデータバンクのＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ）により、配列番号１に示されるアミノ酸配列と相同性を持つ既知のアミノ酸配列を検索した結果、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｆａｔａｒｉｃｕｓの推定タンパク質（ｐｉｒＢ９０４５８）と４１％の相同性、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉの推定アセトアミド加水分解酵素（ｄａｄＡＰ０００９８１−１６５）と４２％の相同性、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘの推定アセトアミド加水分解酵素（ｄａｄＡＰ００００５９−２６８）と３６％の相同性をそれぞれ示したが、いずれもその相同性は低く、これら相同性を示したタンパク質はいずれもその機能が明らかになっていないこと、α−アミノ酸アミドを立体選択的に加水分解する作用を有していないことなどから、本アミド加水分解酵素は熱安定性に優れた新規なアミド加水分解酵素であると考えられた。
〔実施例６〕
（１）大腸菌ＪＭ１０９／ｐＭ５０１ＫＮを用いた光学活性Ｌ−α−アミノ酸の製造
ｐＭ５０１ＫＮを保持する大腸菌形質転換体を用いて光学活性Ｌ−α−アミノ酸の製造を行った。すなわち、ＪＭ１０９／ｐＭ５０１ＫＮをＬＢＡｍｐ培地１．５ｍｌに接種し、３７℃にて６時間培養した。得られた培養物を１ｍＭ ＩＰＴＧ含有ＬＢＡｍｐ培地４０ｍｌに接種し、３７℃にて１７時間振盪培養した。得られた培養物より５ｍｌを採取して遠心分離により集菌した後、菌体を５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ４緩衝液（ｐＨ９．０）で洗浄し、２ｍｌの同緩衝液に懸濁した。この菌体懸濁液を７０℃で３０分間熱処理した後０．５ｍｌを取り、２％ ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを含む５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ４緩衝液（ｐＨ９．０）０．５ｍｌと混合して、７０℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、遠心分離により菌体を除去した後、工程（５）に記載の高速液体クロマトグラフィー条件にて分析を行った。その結果、０．５５％のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの生成が見られ、光学純度は１００％ｅｅであった。なお、ｐＭ５０１ＫＮは、ブタペスト条約に基づき、平成１４年８月５日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１３８として寄託されている。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、そのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
産業上の利用可能性
本発明によれば、熱安定性に優れたアミド加水分解酵素を遺伝子組換えの手法によって宿主内に多数存在させることができるため、従来の方法に比較して飛躍的に熱安定性・活性を増大させた生体触媒の提供が可能となり、工業的に極めて効率的な光学活性Ｌ−α−アミノ酸の製造方法を提供することができる。
配列表フリーテキスト
配列番号１：ペプチド
配列番号２：ＤＮＡ
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、組換えプラスミドｐＭ５の制限酵素地図である。
図２は、組換えプラスミドｐＭ５０１の制限酵素地図である。
図３は、組換えプラスミドｐＭ５０１ＫＮの制限酵素地図である。
図４は、組換えプラスミドｐＭ５０１ＰＨの制限酵素地図である。
本発明は、熱安定性に優れ、かつ、α−アミノ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミド加水分解酵素、該酵素タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む新規な組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該形質転換体を利用したＬ−α−アミノ酸の製造方法に関する。
背景技術
微生物あるいは微生物由来の酵素をα−アミノ酸アミドと接触させることにより光学活性Ｌ−α−アミノ酸を製造する方法が知られている（特開昭５９−１５９７８９号公報、特開昭６１−１１９１９９号公報、特開昭６２−５５０９７号公報、特開平１−２７７４９９号公報、特開平５−３０９９２号公報参照）。上記の方法は、いずれも微生物が有するアミド加水分解酵素による反応を利用するものである。アミド加水分解酵素は、アミダーゼとも称され、酸アミド基を加水分解してカルボン酸とアミン又はアンモニアを生ずる反応を触媒する加水分解酵素である。微生物由来のアミド加水分解酵素は、α−アミノ酸アミドを立体選択的に加水分解して光学活性なＬ−α−アミノ酸を産生することを特徴とする。「光学活性なＬ−α−アミノ酸」とは、左旋性の鏡像異性体が他方の鏡像異性体より多く含まれているアミノ酸のこと、又は、左旋性の鏡像異性体のみからなるアミノ酸のことをいう。
しかしながら、これら微生物あるいは微生物由来の酵素を工業的物質生産に用いる場合、コスト面をクリアーするため、使用するアミド加水分解酵素の安定性および活性が十分に高められている必要がある。上記製法において使用される微生物は、何れも５５℃以上の高温では増殖できない中温菌であるため、これらの微生物が有するアミド加水分解酵素は、常温以上の温度域では安定性が低い。従って、高温で反応を行うと酵素が不安定となり反応速度が停止又は低下するという問題があった。
発明の開示
本発明の目的は、熱安定性に優れたアミド加水分解酵素をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を任意の宿主に導入した形質転換体を作製することによって、光学活性Ｌ−α−アミノ酸の効率的な製造方法を提供することである。
本発明者らは、鋭意検討を行った結果、５５℃以上で生育可能な微生物から、熱安定性に優れたアミド加水分解酵素をコードする遺伝子を単離した。さらに、遺伝子組換え手法を用いて、任意の宿主に該遺伝子を多コピー存在させることにより、該酵素活性が向上した生体触媒を製造し得る技術の開発に成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつアミド加水分解酵素活性を有するタンパク質
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするアミド加水分解酵素遺伝子。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつアミド加水分解酵素活性を有するタンパク質
（３）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミド加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（４）（２）又は（３）記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
（５）（４）記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（６）（５）記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からアミド加水分解酵素タンパク質を採取することを特徴とするアミド加水分解酵素の製造方法。
（７）（５）記載の形質転換体を培養し、得られる培養物又はその処理物とα−アミノ酸アミドを接触させることを特徴とする光学活性Ｌ−α−アミノ酸の製造方法。
（８）５５℃以上で生育可能で、熱安定性に優れたアミド加水分解酵素を産生する、Ｔｈｅｒｍｕｓ属又はＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物。
（９）（８）に記載の微生物を培養し、得られる培養物又はその処理物とα−アミノ酸アミドを接触させることを特徴とする光学活性Ｌ−α−アミノ酸の製造方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願第２００１−２５７７３６号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
以下に、本発明を詳細に説明する。
１．天然の好熱菌による光学活性Ｌ−α−アミノ酸の製造
本発明者らは、５５℃以上で生育可能で、熱安定性に優れたアミド加水分解酵素を産生する微生物を培養し、得られる培養物又はその処理物とα−アミノ酸アミドを接触させることより光学活性Ｌ−α−アミノ酸が効率的に製造できることを見出した。
この反応を媒介するアミド加水分解酵素は、生育上限温度が５５℃以上の好熱菌に属する微生物由来のものであり、α−アミノ酸アミドを立体選択的に加水分解して光学活性Ｌ−α−アミノ酸を生成する能力があれば特に制限されるものではない。そのような酵素は、自然界から分離された菌株又はタイプカルチャーコレクションから入手される菌株から広く見いだされる。例えば、バチルス属やサーマス属に属する細菌、具体的には、例えば、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＩＭＢ８９２３やサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＮＣＩＭＢ１１２４３、が挙げられる。これらの菌株は、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩＭＢ）から容易に入手することができる。
本発明のアミド加水分解酵素は、α−アミノ酸アミドを立体選択的に加水分解して、Ｌ−α−アミノ酸を生成する能力を有するものであり、その様な能力を有する酵素としては、種々のアミダーゼあるいはアミノペプチダーゼ等が知られている。
上記微生物を培養するための培地組成としては、通常これらの微生物が生育しうるものであれば何れのものでも使用できる。炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロースやマルトース等の糖類、酢酸やクエン酸等の有機酸あるいはその塩、エタノールやグリセロール等のアルコール類等を使用できる。窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキスやアミノ酸等の一般天然窒素源の他、各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。その他、無機塩、微量金属塩、ビタミン等が必要に応じて適宜添加される。
上記微生物の培養は常法によればよく、例えば、ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ５〜９、温度２０〜８０℃、好ましくは５０〜７０℃の範囲にて１〜１００時間培養する。
本発明においては、上記微生物を培地中で培養して得られる培養物をそのままか、該培養物から遠心分離などの集菌操作によって得られる菌体、培養上清又はそれらの処理物を用いることができる。該処理物としては、菌体破砕物、菌体破砕物又は培養上清から調製した粗酵素、精製酵素等が挙げられる。また、常法により担体に固定化した菌体、該処理物、酵素等を用いることができる。
アミド加水分解反応は、通常、アミノ酸アミドを０．５〜５０％（反応基質溶液はスラリー状であってもよい）の濃度になるように水性媒体・酵素源と混合して行う。酵素源である培養物、菌体、菌体処理物等の添加量は特に制限されないが、通常、乾燥菌体質量換算で０．０１〜１０％の範囲で添加すればよい。反応は通常、０〜８０℃、好ましくは２０〜７０℃において、ｐＨ４〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０の範囲で行われる。
このようにして反応液中に生成、蓄積したＬ−α−アミノ酸は、イオン交換法、晶析法等、公知の方法を組み合わせて分離、精製し取得することができる。
本発明において、アミノ酸アミドとは、アミノ酸分子中のカルボキシル基が酸アミドになったもの意味し、式Ｉ：
本発明において、産生されるＬ−α−アミノ酸の具体例としては、例えば、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン等を挙げることができる。また、反応に用いるアミノ酸アミドの光学純度に関しては特に制限はない。
２．アミド加水分解酵素遺伝子のクローニング
さらに本発明者らは、５５℃以上で生育可能で、熱安定性に優れたアミド加水分解酵素を産生する微生物のうち、岐阜県の温泉水よりサーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．）Ｏ−３−１株（以下、Ｏ−３−１株と称する）を単離し、該菌株からアミド加水分解酵素タンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子を単離した。本菌株は、ブタペスト条約に基づき、平成１４年８月５日付けで、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１３９として寄託されている。Ｏ−３−１株の菌学的な性質は以下に示される。
形態 桿菌（０．５×２μｍ）、鎖状、伸長型あり グラム染色 −
胞子 −
運動性 −
コロニー形態 円形、周縁糸状、低凸状、光沢有り、淡
いクリーム色
生育の範囲
８０℃ −
７０℃ ＋
５５℃ ＋
４０℃ ＋（ｗｅａｋ）
３０℃ −
酸素に対する態度
嫌気的生育 −
カタラーゼ ＋
オキシダーゼ ＋
Ｏ／Ｆ試験 −
炭水化物からの酸産生
グリセロール −
エリスリトール −
Ｄ−アラビノース ±
Ｌ−アラビノース −
リボース ＋
Ｄ−キシロース −
Ｌ−キシロース −
アドニトール −
β−メチル−Ｄ−キシロース −
ガラクトース −
グルコース −
フラクトース −
マンノース −
ソルボース −
ラムノース −
ズルシトール −
イノシトール −
マンニトール −
ソルビトール −
α−メチル−Ｄ−マンノース −
α−メチル−Ｄ−グルコース −
Ｎ−アセチルグルコサミン −
アミグダリン −
アルブチン −
エスクリン ＋
サリシン −
セロビオース −
マルトース −
乳糖 −
メリビオース −
白糖 −
トレハロース −
イヌリン −
メレチトース −
ラフィノース −
澱粉 −
グリコーゲン −
キシリトール −
ゲンチオビオース −
Ｄ−ツラノース −
Ｄ−リキソース −
Ｄ−タガトース −
Ｄ−フコース −
Ｌ−フコース −
Ｄ−アラビトール −
Ｌ−アラビトール −
グルコネート −
２−ケトグルコン酸 −
５−ケトグルコン酸 ＋
培養的性質
肉汁液体培養 皮膜形成
リトマスミルク 不変
生理学的性質
硝酸塩還元 ＋
脱窒反応 −
ＭＲテスト −
ＶＰテスト −
インドールの生成 −
硫化水素の生成 −
でん粉加水分解 ＋
クエン酸の利用
Ｋｏｓｅｒ −
Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ −
無機窒素源の利用
ＮａＮＯ３ −
（ＮＨ４）２ＳＯ４ −
ウレアーゼ −
加水分解性
皮革末（ａｚｕｒｅ） −
エラスチン −
カゼイン −
ＤＮａｓｅ ＋
α−ガラクトシダーゼ −
β−ガラクトシダーゼ ＋
炭素源利用性
酢酸ナトリウム −
グルタミン酸ナトリウム −
コハク酸ナトリウム −
ピルビン酸ナトリウム −
プロリン −
（１）Ｏ−３−１株の培養
Ｏ−３−１株を培養するための培地組成としては、通常これらの微生物が生育しうるものであれば何れのものでも使用できる。炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロースやマルトース等の糖類、酢酸やクエン酸等の有機酸又はその塩、あるいはエタノールやグリセロール等のアルコール等を使用できる。窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキスやアミノ酸等の一般天然窒素源の他、各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。その他、無機塩、微量金属塩、ビタミン等が必要に応じて適宣添加される。また、Ｏ−３−１株の培養は常法に従えばよく、好気又は嫌気培養装置を用いて、例えば、ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ５〜９、温度２０〜８０℃、好ましくは５０〜７０℃の範囲にて１〜１００時間培養する。
（２）染色体ＤＮＡの調製
Ｏ−３−１株より染色体ＤＮＡを分離、調製する。染色体ＤＮＡの分離及び調製は、公知の方法の何れをも用いることができる。例えば、Ｓａｉｔｏ ａｎｄ Ｍｉｕｒａの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３））が挙げられる。
（３）ＤＮＡライブラリーの作製
工程（２）で得られたＯ−３−１株染色体ＤＮＡを適当な制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＭｂｏＩ、ＰｓｔＩ等）で部分分解する。これを、制限酵素（例えばＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ等）で切断し、アルカリホスファターゼ処理を行い脱リン酸化したベクターとライゲーションを行い、ライブラリーを作製する。用いることができるベクターとしては、宿主細胞で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、コスミドＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、例えばｐＢＲ３２２、ｐＳＣ１０１、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＡＣＹＣ１１７、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）等が挙げられ、ファージＤＮＡとしては、例えばλｇｔ１０、Ｃｈａｒｏｎ ４Ａ、ＥＭＢＬ−、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９等が挙げられる。例えば大腸 菌を宿主とする場合、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）などが挙げられる。
（４）形質転換体の作製
ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後連結させ、組換えベクターを作製する。形質転換の宿主は特に限定されるものではなく、例えば大腸菌を用いる場合、大腸菌ＤＨ１株、ＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＭＶ１１８４株、ＴＨ２株、Ｋ１２株、ＪＭ１０９株、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株などを挙げることができる。宿主に組換えベクターを導入するには、公知の方法により行うことができる。例えば大腸菌を宿主として用いる場合は、塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５４（１９７０））やエレクトロポレーション法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，１８４（１９９４））を採用することができ、ファージの場合はインビトロ・パッケージング法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，５７１（１９９４））等を採用することができる。
（５）アミド加水分解酵素遺伝子を含む組換えＤＮＡの選別
工程（４）で得られた形質転換体をα−アミノ酸アミドを唯一窒素源とする寒天培地上に接種する。α−アミノ酸アミドとしては、上記式Ｉで表されるものを使用できる。該寒天培地上で大きく出現したコロニーを選択し、適切な培地で液体培養を行う。培養に用いる培地としては、特に制限されないが、形質転換体の宿主として大腸菌を用いる場合、例えば、酵母エキス、トリプトン、ポリペプトン、コーンスティープリカー、大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄若しくは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宣添加したものが用いられる。また、必要に応じて、ベクターＤＮＡを安定に維持させるための抗生物質や、遺伝子発現のための誘導剤を添加する。なお、培地の初発ｐＨは７〜９に調整するのが適当である。また、培養は、２５〜４２℃で６〜２４時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。得られた培養物から遠心分離などによって集菌を行い、適当な緩衝液に懸濁する。この菌体懸濁液をα−アミノ酸アミド（例えば、ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド等）を含む緩衝液に懸濁し、反応を行う。一定時間後、高速液体クロマトグラフィー等の分析手段により、対応するα−アミノ酸の生成量を定量する。α−アミノ酸を生成していた形質転換体をアミド加水分解酵素遺伝子保有候補株として選別する。
（６）制限酵素地図の作成とサブクローニング
工程（５）で選択された形質転換体より常法に従ってプラスミドを調製する。得られたプラスミドを種々の制限酵素を用いて切断し、電気泳動により分析を行う。泳動パターンから制限酵素地図を作成し、必要に応じて、より短い断片を有するサブクローンを作製する。
（７）サブクローンのアミド加水分解酵素活性確認
工程（６）で得られたサブクローンについて形質転換体を作製した後、工程（５）の培養および反応操作を行い、α−アミノ酸生成の有無によってプラスミド中にアミド加水分解酵素遺伝子が含まれているかどうかを判別する。
（８）塩基配列の決定とアミド加水分解酵素遺伝子の同定
得られたサブクローンのうち、なるべく挿入断片が小さく、かつ、アミド加水分解酵素活性を有する形質転換体よりプラスミドを調製し、該プラスミドの挿入断片について塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、公知の方法、例えば、蛍光標識または放射標識を用いたジデオキシ法、マキサム・ギルバート法等により行うことができる。決定された塩基配列中からオープンリーディングフレームを検索し、適宣、公開されている塩基配列およびアミノ酸配列データベースとの比較を行う。
配列番号１に本発明のアミド加水分解酵素のアミノ酸配列を、配列番号２に本発明のアミド加水分解酵素遺伝子の塩基配列を例示するが、これらのアミノ酸配列を含むタンパク質がアミド加水分解酵素活性を有する限り、当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１個、好ましくは、１０〜２０個、さらに好ましくは５〜１０個のアミノ酸が欠失してもよく、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列に１個、好ましくは、１０〜２０個、さらに好ましくは５〜１０個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１個、好ましくは、１０〜２０個、さらに好ましくは５〜１０個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。また、本発明のアミド加水分解酵素遺伝子の塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アミド加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も本発明の遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、すなわち、本発明のアミド加水分解酵素遺伝子に対し高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、このような条件は、０．５〜１ＭのＮａＣｌ存在下４２〜６８℃で、又は５０％ホルムアミド存在下４２℃で、又は水溶液中６５〜６８℃で、ハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液を用いて室温〜６８℃でフィルターを洗浄することにより達成できる。
ここで、「一部の配列」とは、上記アミド加水分解酵素遺伝子の塩基配列の一部分を含むＤＮＡの塩基配列であって、該ＤＮＡがアミド加水分解能を有するタンパク質をコードするものを指す。また「一部の配列」は、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせるのに十分な塩基配列の長さを有するもの、例えば、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも５０塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基の配列である。
なお、遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、Ｍｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて行うことができる。なお、上記手法により塩基配列が決定された後は、化学合成によって、又は染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。
３．組換えベクター及び形質転換体の作製
本発明の組換えベクターは本発明の遺伝子又はその一部を適当なベクターに連結することにより得ることができ、また、本発明の形質転換体は本発明の組換えベクターを本発明の遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。「一部」とは、宿主中に導入されて本発明のアミド加水分解酵素を発現することができるアミド加水分解酵素遺伝子の一部分を指す。
本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主細胞で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、コスミドＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、例えばｐＢＲ３２２、ｐＳＣ１０１、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＡＣＹＣ１１７、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）等が挙げられ、ファージＤＮＡとしては、例えばλｇｔ１０、Ｃｈａｒｏｎ ４Ａ、ＥＭＢＬ−、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９等が挙げられる。
宿主としては、目的とする遺伝子を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）などのラルストニア属に属する細菌、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）などのシュードモナス属に属する細菌、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などのエッシェリヒア属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）などのカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などの動物細胞、ＳＦ９細胞などの昆虫細胞などが挙げられる。
大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、本発明の組換えベクターが該宿主中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、本発明のＤＮＡ、転写終結配列を含む構成であることが好ましい。発現ベクターとしては、広範囲の宿主において複製・保持されるＲＫ２複製起点を有するｐＬＡ２９１７（ＡＴＣＣ ３７３５５）やＲＳＦ１０１０複製起点を有するｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ ３７５３３）等が挙げられる。
プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。細菌への組換えベクターの導入方法としては、特に限定されないが、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，１８１（１９９４））やエレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えばＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等が挙げられる。プロモーターとしては、例えばｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＧＡＰプロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、特に限定されないが、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２，９−１９３３（１９７８））、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３−１６８（１９８３））等が挙げられる。
動物細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社）等が用いられる。プロモーターとしては、例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等が挙げられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、特に限定されないが、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
４．アミド加水分解酵素の製造
本発明のアミド加水分解酵素は、本発明の形質転換体を培地で培養し、培養物（培養菌体又は培養上清）中に本発明のアミド加水分解酵素を生成蓄積させ、該培養物からアミド加水分解酵素を採取することにより行われる。本発明の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、完全培地又は合成培地、例えばＬＢ培地、Ｍ９培地等が挙げられる。また、培養温度は０〜７０℃の範囲で好気的に１〜８０時間培養することによりアミド加水分解酵素を菌体内に蓄積させ、回収する。培養期間中ｐＨは７付近に保持する。ｐＨの調整は、無機酸又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。
炭素源は微生物の増殖に必要であり、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、マルトース等の炭水化物が挙げられる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。また、無機物としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
培養中は、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、インデューサーを培地に添加することもできる。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加することができる。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えばＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地にウシ胎児血清を添加した培地が用いられる。培養は、通常５％ＣＯ２存在下、３０〜４０℃で１〜７日間行う。培養中はカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。アミド加水分解酵素の精製は、得られる培養物を遠心して回収し（細胞についてはソニケーターにて破砕する）、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン又は陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等を単独で又は適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的の酵素であることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウエスタンブロッティング等により行う。
５．形質転換体又はその処理物による光学活性Ｌ−α−アミノ酸の製造
上記において得られた形質転換体の培養物から遠心分離などによって集菌を行い、適当な緩衝液に懸濁する。この菌体懸濁液をα−アミノ酸アミドを含む緩衝液に懸濁し、反応を行うことによって、光学活性Ｌ−α−アミノ酸を製造することができる。反応の条件は、例えば、反応温度は０〜８０℃、好ましくは１０〜７０℃、反応時間は０．１〜１００時間、好ましくは０．５〜８０時間、ｐＨは４〜１１程度である。
また、該培養物の処理物を用いて反応を行うこともできる。該処理物としては、菌体破砕物、菌体破砕物又は培養上清から調製した粗酵素、精製酵素等が挙げられる。また、常法により担体に固定化した菌体、該処理物、酵素等を用いることができる。
生成したＬ−α−アミノ酸の細胞内含量及び光学純度は、遠心分離などの方法によって菌体又は酵素を除去した後、高速液体クロマトグラフィー、ＮＭＲなどに供試することにより測定・分析することができる。
本発明の形質転換体又はアミド加水分解酵素は高温でもアミド加水分解活性が維持されるとともに、従来の微生物又は微生物由来酵素を用いる場合に比べ、効率的に光学活性Ｌ−α−アミノ酸を合成できることが明らかとなった。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
〔実施例１〕
ポリペプトン０．８％、酵母エキス０．４％、ＮａＣｌ ０．２％、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．００５％、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．００８％からなる培地（ｐＨ７．５）１００ｍｌを三角フラスコ（５００ｍｌ容）に入れ、オートクレーブ滅菌した。この培地にＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＮＣＩＭＢ１１２４３株を接種して、７０℃にて３日間培養した。
培養終了後、培養物から菌体を遠心分離にて集菌し、培養物と同量の５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）にて１回菌体を洗浄した後、同緩衝液５ｍｌに菌体を懸濁した。
上記菌体懸濁液１．５ｍｌに２％のフェニルアラニンアミド溶液１．５ｍｌを添加して、７０℃にて１時間反応を行った。反応終了後、反応液から遠心分離にて菌体を除去後、高速液体クロマトグラフィーにて定量、光学純度を分析した。
結果、０．２８％のＬ−フェニルアラニンが生成していた。光学純度は１００％ｅｅであった。
〔ＨＰＬＣ分析条件〕
（定量分析）
カラム； イナートシルＯＤＳ−３Ｖ（４．６φ×２５０ｍｍ）
移動層； ０．１％リン酸水溶液：アセトニトリル（８０：２０）
流速； １ｍｌ／ｍｉｎ
検出； ＵＶ（２５４ｎｍ）
（光学純度分析）
カラム； ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ−５０００（４．６φ×１５０ｍｍ）
移動層； ２ｍＭ硫酸銅：メタノール（７０：３０）
流速； １ｍｌ／ｍｉｎ
検出； ＵＶ（２５４ｎｍ）
〔実施例２〕
ポリペプトン０．５％、肉エキス０．３％、ＮａＣｌ ０．８％からなる培地（ｐＨ７．３）１００ｍｌを三角フラスコ（５００ｍｌ容）に入れ、オートクレーブ滅菌した。この培地にＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＩＭＢ８９２３株を接種して、５５℃にて３日間培養した。
培養終了後、培養物から菌体を遠心分離にて集菌し、培養物と同量の５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）にて１回菌体を洗浄した後、同緩衝液５ｍｌに菌体を懸濁した。
上記菌体懸濁液１．５ｍｌに２％のフェニルアラニンアミド溶液１．５ｍｌを添加して、５５℃にて１時間反応を行った。反応液から遠心分離にて菌体を除去後、実施例１と同一条件で、高速液体クロマトグラフィーにて分析したところ、０．４９％のＬ−フェニルアラニンが生成していた。光学純度は１００％ｅｅであった。
〔実施例３〕
実施例１と同様に調製した菌体懸濁液１．５ｍｌに２％のｔｅｒｔ−ロイシンアミド溶液１．５ｍｌを添加して、７０℃にて７０時間反応を行った。反応液から遠心分離にて菌体を除去後、高速液体クロマトグラフィーにて分析したところ、０．３８％のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンが生成していた。光学純度は１００％ｅｅであった。
〔ＨＰＬＣ分析条件〕
（定量分析）
カラム； イナートシルＯＤＳ−３Ｖ（４．６φ×２５０ｍｍ）
移動層； ０．１％リン酸水溶液
流速； １ｍｌ／ｍｉｎ
検出； ＲＩ
（光学純度分析）
カラム； ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ−５０００（４．６φ×１５０ｍｍ）
移動層； ２ｍＭ硫酸銅：メタノール（８５：１５）
流速； １ｍｌ／ｍｉｎ
検出； ＵＶ（２５４ｎｍ）
〔実施例４〕
実施例２と同様に調製した菌体懸濁液１．５ｍｌに２％のｔｅｒｔ−ロイシンアミド溶液１．５ｍｌを添加して、７０℃にて７０時間反応を行った。反応液から遠心分離にて菌体を除去後、高速液体クロマトグラフィーにて分析したところ、０．３１％のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンが生成していた。光学純度は１００％ｅｅであった。
〔実施例５〕
（１）Ｏ−３−１株の培養
Ｏ−３−１株を１００ｍｌの栄養培地（０．２％ポリペプトン、０．１％酵母エキス、０．２％ ＮａＣｌ、０．００５％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００８％ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．５）に接種し、７０℃にて３日間培養した。
（２）染色体ＤＮＡの調製
培養終了後、遠心分離により集菌し、滅菌蒸留水にて洗浄した後、Ｓａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１Ｍ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）２ｍｌに懸濁した。リゾチーム１０ｍｇを加えて３７℃で１時間振盪した後、１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＳＤＳ液（１％ ＳＤＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０）を穏やかに振盪しながら加え、さらにプロテイナーゼＫ（メルク社製）を終濃度１ｍｇとなるように加え、３７℃で１時間振盪した。次に、等量のＴＥ飽和フェノール（ＴＥ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加えて撹拌後遠心し、上層を採り２倍量のエタノールを加えた後ガラス棒でＤＮＡを巻きとり、９０％、８０％、７０％のエタノールで順次フェノールを取り除いた。次に、ＤＮＡを５ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼＡ溶液（１００℃、１５分間の熱処理済み）を１０ｍｇ／ｍｌになるように加え３７℃で３０分間振盪した。さらにプロテイナーゼＫを終濃度１ｍｇとなるように加えて３７℃で３０分間振盪した後、等量のＴＥ飽和フェノールを加え遠心し上層と下層に分離させ上層を採取した（以後この操作をフェノール抽出と呼ぶ）。フェノール抽出を２回繰り返した後、同量のクロロフォルム（４％イソアミルアルコール含有）を加え同様の抽出操作を繰り返した（以後この操作をクロロホルム抽出と呼ぶ）。その後上層に２倍量のエタノールを加えガラス棒でＤＮＡを巻き取り回収し、滅菌水１ｍｌに溶解して染色体ＤＮＡ標品を得た。
（３）ＤＮＡライブラリーの作製
工程（２）で得られたＯ−３−１株染色体ＤＮＡ ２００μｌに１０倍濃度制限酵素反応用緩衝液４０μｌ、滅菌水１６０μｌ、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ ２μｌを加え、３７℃にて２分間インキュベートした後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。アガロースゲル電気泳動を行い、約４〜７ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出し、ＤＮＡ ＰＲＥＰ（ダイアトロン社製）を用いて回収した。このＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩ部位に挿入し、組換えＤＮＡライブラリーを作製した。ライゲーションに用いたｐＵＣ１１８断片は次のように作製した。ｐＵＣ１１８保存液２μｌに対し、１０倍濃度制限酵素用緩衝液５μｌ、滅菌水４０μｌ、制限酵素ＢａｍＨＩ ３μｌを加え、３７℃で２時間反応後、フェノール抽出およびクロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿させた後乾燥して５０μｌの滅菌水に溶解させた。さらにアルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）１μｌ、１０倍濃度緩衝液１０μｌ、滅菌水３９μｌを加え６５℃で反応後、フェノール抽出およびクロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿後乾燥して滅菌水に溶解させた。
（４）形質転換体の作製
大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢＡｍｐ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ ＮａＣｌ、０．０１％アンピシリン）１ｍｌに接種し３７℃、５時間好気的に前培養し、この培養物０．４ｍｌをＳＯＢ培地４０ｍｌ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）に加え、１８℃で２０時間培養した。この培養物を遠心分離により集菌した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．０）、２００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、４０ｍＭ ＭｎＣｌ２）を１３ｍｌ加え、０℃で１０分間放置後、再度遠心し、上澄を除いた後、沈殿した大腸菌を冷ＴＦ溶液３．２ｍｌに懸濁し、０．２２ｍｌのジメチルスルフォキシドを加え０℃で１０分間放置した。こうして作製したコンピテントセル２００μｌに工程（３）で作製した組換えプラスミドを含有する溶液（ＤＮＡライブラリー）を１０μｌ加え、０℃で３０分放置後、４２℃で３０秒間ヒートショックを与え、０℃で２分間冷却後、ＳＯＣ培地（２０ｍＭグルコース、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）１ｍｌを添加して３７℃にて１時間振盪培養した。これを２００μｌずつＬＢＡｍｐ寒天培地（１．５％寒天を含むＬＢＡｍｐ培地）にまき、３７℃で一晩培養し、形質転換体を得た。
（５）アミド加水分解酵素遺伝子を含む組換えＤＮＡの選別
工程（４）で得られた形質転換体コロニーを、乳酸アミド含有寒天培地に接種した。乳酸アミド含有寒天培地は、滅菌シャーレに２０ｍｌずつ固化させた寒天培地（０．２％グリセロール、０．０５％ ＮａＣｌ、０．００２％チアミン塩酸塩、０．６％ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％ ＫＨ２ＰＯ４、０．００１％ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００２５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００１％ ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ、０．０００１％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．５％寒天）に、フィルター除菌済みの２０％ ＤＬ−ラクトアミド溶液をプレート一枚あたり１００μｌ塗布して作製した。３７℃にて３日間培養した後、大きく出現したコロニー１２個を１ｍＭ ＩＰＴＧ含有ＬＢＡｍｐ培地１．５ｍｌに接種し、３７℃にて一晩培養した。培養後、遠心分離により集菌し、菌体を５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ４緩衝液（ｐＨ９．０）で洗浄し、０．７ｍｌの同緩衝液に懸濁した。この菌体懸濁液０．５ｍｌを７０℃で５〜１０分間前処理した後、２％ ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを含む５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ４緩衝液（ｐＨ９．０）０．５ｍｌと混合し、７０℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、遠心分離により菌体を除去した後、高速液体クロマトグラフィーにて分析を行った。分析条件を下記に記す。
（定量分析）
カラム； イナートシルＯＤＳ−３Ｖ（４．６φ×２５０ｍｍ）
移動層； ０．１％リン酸水溶液：アセトニトリル（８０：２０）
流速； １ｍｌ／ｍｉｎ
検出； ＵＶ（２５４ｎｍ）
（光学純度分析）
カラム； ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ−５０００（４．６φ×１５０ｍｍ）
移動層； ２ｍＭ硫酸銅：メタノール（７０：３０）
流速； １ｍｌ／ｍｉｎ
検出； ＵＶ（２５４ｎｍ）
その結果、５クローンについて０．４７〜０．６３％のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの生成が見られた。光学純度はいずれも１００％ｅｅであった。
（６）制限酵素地図の作成とサブクローニング
工程（５）で選別された５クローンのうちの一つ（Ｍ５と命名する）より、Ｆｌｅｘｉ Ｐｒｅｐ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてプラスミドを精製した。得られたプラスミド（ｐＭ５）を種々の制限酵素を用いて切断し、０．７％アガロースゲル電気泳動により解析を行った結果、図１に示される約８ｋｂの挿入断片の制限酵素地図が得られた。次いで、ｐＭ５の挿入断片中、約２ｋｂのＫｐｎＩ断片、および約３．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片を取り除いて自己連結させたサブクローンｐＭ５０１（図２）を作製した。さらに、挿入断片中のＮｃｏＩサイトおよびＰｓｔＩサイトを利用してサブクローニングを行った。すなわち、ｐＭ５０１をＮｃｏＩと挿入断片Ｃ末端側のＨｉｎｄＩＩＩで切断して、約０．７ｋｂのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を除去した後、両切断末端を平滑化して自己連結させ、ｐＭ５０１ＫＮとした（図３）。また、ＰｓｔＩと挿入断片Ｎ末端側マルチクローニングサイトのＥｃｏＲＩで切断して、約１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片を除去した後、両切断末端を平滑化して自己連結させたプラスミドｐＭ５０１ＰＨを作製した（図４）。
（７）サブクローンのアミド加水分解酵素活性確認
工程（６）にて作製されたプラスミド、ｐＭ５０１、ｐＭ５０１ＫＮ、ｐＭ５０１ＰＨ、およびポジティブコントロールとしてｐＭ５を用い、工程（４）の方法により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体（ＪＭ１０９／ｐＭ５０１、ＪＭ１０９／ｐＭ５０１ＫＮ、ＪＭ１０９／ｐＭ５０１ＰＨ、ＪＭ１０９／ｐＭ５）のコロニーを１ｍＭ ＩＰＴＧ含有ＬＢＡｍｐ培地１．５ｍｌに接種し、３７℃にて一晩培養した。培養後、遠心分離により集菌し、菌体を５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ４緩衝液（ｐＨ９．０）で洗浄し、０．７ｍｌの同緩衝液に懸濁した。この菌体懸濁液０．５ｍｌを７０℃で５〜１０分間前処理した後、２％ ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを含む５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ４緩衝液（ｐＨ９．０）０．５ｍｌと混合し、７０℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、遠心分離により菌体を除去した後、工程（５）に記載の高速液体クロマトグラフィー条件にて分析を行った。その結果、ＪＭ１０９／ｐＭ５０１、ＪＭ１０９／ｐＭ５０１ＫＮおよびＪＭ１０９／ｐＭ５では、ぞれぞれ０．１４％、０．１３％、０．１４％のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの生成が見られたが、ＪＭ１０９／ｐＭ５０１ＰＨではＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの生成はまったく見られなかった。従って、ｐＭ５０１ＫＮの約１．２ｋｂの挿入断片中に目的とするアミド加水分解酵素遺伝子が存在することが明らかになった。
（８）塩基配列の決定
工程（６）で得られたプラスミドｐＭ５０１ＫＮ挿入断片中のＫｐｎＩ−ＮｃｏＩ断片（約１．２ｋｂ）の塩基配列を、ジデオキシ法により蛍光シークエンサーＡＬＦＩＩ（ファルマシア社製）を用いて決定した。その結果、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム（配列番号２）が見出された。日本ＤＮＡデータバンクのＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ）により、配列番号１に示されるアミノ酸配列と相同性を持つ既知のアミノ酸配列を検索した結果、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｆａｔａｒｉｃｕｓの推定タンパク質（ｐｉｒＢ９０４５８）と４１％の相同性、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉの推定アセトアミド加水分解酵素（ｄａｄＡＰ０００９８１−１６５）と４２％の相同性、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘの推定アセトアミド加水分解酵素（ｄａｄＡＰ００００５９−２６８）と３６％の相同性をそれぞれ示したが、いずれもその相同性は低く、これら相同性を示したタンパク質はいずれもその機能が明らかになっていないこと、α−アミノ酸アミドを立体選択的に加水分解する作用を有していないことなどから、本アミド加水分解酵素は熱安定性に優れた新規なアミド加水分解酵素であると考えられた。
〔実施例６〕
（１）大腸菌ＪＭ１０９／ｐＭ５０１ＫＮを用いた光学活性Ｌ−α−アミノ酸の製造
ｐＭ５０１ＫＮを保持する大腸菌形質転換体を用いて光学活性Ｌ−α−アミノ酸の製造を行った。すなわち、ＪＭ１０９／ｐＭ５０１ＫＮをＬＢＡｍｐ培地１．５ｍｌに接種し、３７℃にて６時間培養した。得られた培養物を１ｍＭ ＩＰＴＧ含有ＬＢＡｍｐ培地４０ｍｌに接種し、３７℃にて１７時間振盪培養した。得られた培養物より５ｍｌを採取して遠心分離により集菌した後、菌体を５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ４緩衝液（ｐＨ９．０）で洗浄し、２ｍｌの同緩衝液に懸濁した。この菌体懸濁液を７０℃で３０分間熱処理した後０．５ｍｌを取り、２％ ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを含む５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ４緩衝液（ｐＨ９．０）０．５ｍｌと混合して、７０℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、遠心分離により菌体を除去した後、工程（５）に記載の高速液体クロマトグラフィー条件にて分析を行った。その結果、０．５５％のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの生成が見られ、光学純度は１００％ｅｅであった。なお、ｐＭ５０１ＫＮは、ブタペスト条約に基づき、平成１４年８月５日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１３８として寄託されている。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、そのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
産業上の利用可能性
本発明によれば、熱安定性に優れたアミド加水分解酵素を遺伝子組換えの手法によって宿主内に多数存在させることができるため、従来の方法に比較して飛躍的に熱安定性・活性を増大させた生体触媒の提供が可能となり、工業的に極めて効率的な光学活性Ｌ−α−アミノ酸の製造方法を提供することができる。
配列表フリーテキスト
配列番号１：ペプチド
配列番号２：ＤＮＡ
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、組換えプラスミドｐＭ５の制限酵素地図である。
図２は、組換えプラスミドｐＭ５０１の制限酵素地図である。
図３は、組換えプラスミドｐＭ５０１ＫＮの制限酵素地図である。
図４は、組換えプラスミドｐＭ５０１ＰＨの制限酵素地図である。
Claims (9)
- 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつアミド加水分解酵素活性を有するタンパク質 - 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするアミド加水分解酵素遺伝子。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつアミド加水分解酵素活性を有するタンパク質 - 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミド加水分解酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ - 請求の範囲第２項又は第３項記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求の範囲第４項記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 請求の範囲第５項記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からアミド加水分解酵素タンパク質を採取することを特徴とするアミド加水分解酵素の製造方法。
- 請求の範囲第５項記載の形質転換体を培養し、得られる培養物又はその処理物とα−アミノ酸アミドを接触させることを特徴とする光学活性Ｌ−α−アミノ酸の製造方法。
- サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．）０−３−１株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１３９）。
- 請求の範囲第８項に記載の微生物を培養し、得られる培養物又はその処理物とα−アミノ酸アミドを接触させることを特徴とする光学活性Ｌ−α−アミノ酸の製造方法。
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