JPH0556787A - エステル不斉加水分解酵素遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】エステラーゼをコードする遺伝子を提供する。
この遺伝子を用いて、微生物菌体でエステラーゼを発現
することにより工業的にピレスロイド系殺虫剤の中間体
である菊酸あるいは菊酸誘導体を不斉加水分解すること
が出来る。 【構成】 アリスロバクター−ＳＣ−６−９８−２８株
（ＦＥＲＭ Ｐ−１１８５１）からエステラーゼ遺伝子
を取得した。この遺伝子を用いて、発現ベクターを構築
し、微生物の菌体でエステラーゼを発現させた。そのエ
ステラーゼは、菊酸あるいは菊酸誘導体を不斉加水分解
した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、エステル不斉加水分解
酵素、即ち、エステラーゼをコードする遺伝子、該遺伝
子を含有する発現プラスミドおよびそれを保持する形質
転換体にに関する。本発明により得られた遺伝子を微生
物菌体内で発現させることにより、工業的に生産した該
酵素を、ピレスロイド系殺虫剤の中間体である菊酸ある
いは菊酸誘導体のエステルを不斉加水分解し、光学活性
な菊酸あるいはその誘導体を生産するバイオプロセスへ
応用することができる。

【０００２】

【従来の技術】近年、有機合成に微生物あるいは酵素を
利用した反応を応用する試みがさかんに行われている。
特に、医薬品、農薬品およびその合成中間体のように、
構造が複雑で、しかも光学活性な化合物を取得する事が
必要な場合には、酵素の有する高い立体選択性などを利
用することができるため、非常に有効な方法である。

【０００３】特に、光学活性体の製造に関して、ラセミ
体のエステル化合物から立体選択的加水分解反応により
１種の異性体を取得する場合や、プロキラルな化合物か
ら位置選択的加水分解反応によりキラルな化合物を製造
する反応、あるいは、それらの逆反応を利用した立体選
択的なエステルの生産に、エステラーゼやリパーゼが用
いられている。

【０００４】例えば、豚肝臓由来のエステラーゼを、こ
の様な反応に利用した例として、Laumenら（Tetrahedro
n Lett.26,407-410, (1985))，およびWangら（J.Am,Che
m.Soc.106,3695(1984)) の報告がある。 一方、微生物
由来のエステラーゼを有機合成反応に利用した例として
は、Bacillus subtilis NRRL-B-558をセファロスポリン
誘導体の合成に用いた（Appl Microbiol.30,413-419(19
75))もの等が挙げられる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、動物起源の酵
素は供給に限りがあり、しかも不安定で取り扱いが難し
く、経済的にも工業用として用いる事は困難である。微
生物由来のエステラーゼを利用する場合、多数の微生物
を自然界から分離し、目的とする反応に対して光学選択
性の高いものを選択して得た菌株について、菌株の培養
が難しく、また反応効率が十分高くなかったり、酵素の
生産性が高くない等の問題があった。

【０００６】このような理由で、分離した菌株を培養し
て工業的プロセスに利用するか、あるいは、菌株の培養
により高性能な不斉加水分解酵素を安価に、且つ大量に
生産し、工業的分野に応用する事は容易ではなかった。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、有機合成
反応特に、エステル不斉加水分解反応への応用範囲の広
いエステラーゼを取得すべく鋭意努力した結果、種々の
基質に対して高い立体選択性を示すアルスロバクター・
グロビフオルミス（Artbrobacter globiformis)(IFO-12
958)菌体内エステラーゼを見出した。（特開平１−１８
１７８８号） さらに、研究を進めた結果、エステラーゼ高産生株アル
スロバクターＳＣ−６−９８−２８（ＦＥＲＭ ＢＰ−
３６１８）を取得した。（特願平３−４７４号） さらに、該酵素をコードする遺伝子を取得することに成
功した。

【０００８】これにより、組み換えＤＮＡの手法を用い
て微生物に該酵素を大量に生産させる事が可能になり、
微生物の触媒能力を従来と比較して飛躍的に増大するこ
とができ、組み換え体微生物、或いはエステラーゼを、
遊離の状態で、あるいは担体に固定化し、エステル不斉
加水分解のバイオリアクターとして利用することが可能
になった。

【０００９】以下、さらに本発明を詳細に説明する。本
発明の第１の目的は、エステラーゼをコードする遺伝子
を提供することにある。本発明のエステラーゼ遺伝子
は、エステル不斉加水分解能を有する微生物例えばアリ
ストバクターＳＣ−６−９８−２８（ＦＥＲＭ ＢＰ−
３６１８）から取得することができる。エステラーゼを
コードする遺伝子は、適当な長さに切断した染色体ＤＮ
Ａ断片を、例えば、ファージベクターであるλgt11、あ
るいはプラスミドベクターである pUC19などに挿入する
事により染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、それをス
クリーニングする方法により取得することができる。Ｄ
ＮＡの選抜に関しては、エステラーゼに対する抗体を用
いた免疫学的手法の他に、蛋白質の部分アミノ酸配列に
対応した合成ＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼー
ションによる手法、エステラーゼ活性によるスクリーニ
ング法など、種々の方法を用いる事ができる。また、上
述の方法でエステラーゼＤＮＡの一部のみしか得られな
かった場合は、再度これをプローブとして完全なＤＮＡ
を得る事ができる。このようにして取得するエステラー
ゼ遺伝子の好ましい塩基配列は、下記アミノ酸配列に対
応する塩基配列を含む遺伝子である。

【化３】 配列番号１

【００１０】さらに好ましいものは下記の塩基配列で表
される遺伝子である。

【化４】 配列番号２

【００１１】本発明の第２の目的は、エステラーゼをコ
ードする塩基配列を含む発現プラスミドを提供すること
にある。発現ベクターとしては、宿主細胞中で複製可能
な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであって、
宿主からの単離精製が容易であり、検出可能なマーカー
をもつものが好適である。種々のベクターが市販されて
おり、ベクターの切断に用いる制限酵素等も市販されて
いる。これらの使用方法は公知である。例えば、大腸菌
での発現には、lac,tac,trp などのプロモーターを含む
発現ベクター（これらは、発現ベクターとして、あるい
はプロモーターカートリッジとしてファルマシアＰＬ社
より市販されている）を用いることができる。好ましい
発現プラスミドは、宿主細胞内で自己増殖可能な、すな
わち、自己増殖するに必要な塩基配列を含むＤＮＡであ
り、特に好ましいのは、前記塩基配列により表された遺
伝子がクローニングされた発現プラスミドpAGE-201,pAG
E-202,及びpAGE-203である。

【００１２】さらに、本発明の第３の目的はエステラー
ゼ菌体内で産生する微生物を提供することにある。発現
プラスミドにより、エステラーゼを産生する微生物とし
て、大腸菌、枯草菌、乳酸菌、カビ等が挙げられるが、
好ましくは、大腸菌を用いる。 特に好ましい微生物
は、エシェリキア・コリJM109(pAGE-201),JM109(pAGE-2
02),及びJM109(pAGE-203) 並びにエシェリキア・コリJM
105(pAGE-201),JM105(pAGE-202),及びJM105(pAGE-203)
である。発現プラスミドで微生物を形質転換する方法は
公知の方法を用いる。この微生物を培養することによ
り、エステラーゼを大量に製造することが可能になっ
た。

【００１３】こうして製造したエステラーゼを産生する
組み換え体細胞は、エステル不斉加水分解を行うバイオ
リアクターとして、例えば医薬品、農薬品の中間体であ
る光学活性体など、有用な化合物の生産に利用すること
が可能である。また、組み換え体細胞を培養することに
よって該エステラーゼを大量生産し、それをエンザイム
リアクターとして利用することができる。

【００１４】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をより詳細にす
るが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものでは
なく、本発明の技術分野における通常の変更を行うこと
ができる。 実施例エステラーゼＤＮＡクローンの単離 染色体ＤＮＡの調製 アルスロバクターＳＣ−６−９８−２８（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−３６１８）株を、５mlの前培養用培地（可溶性デン
プン３．０％、ポリペプトン０．７％、酵母エキス０．
５％、KH₂PO₄０．５％、pH５．０）で、３０℃，２４時
間振とう培養したのち、得られた培養液を５００mlの本
培養用培地（可溶性デンプン６．０％，ポリペプトン
１．０％，酵母エキス０．２％，KH₂PO₄０．５％，pH
５．０ )に接種し、３０℃で振とう培養した。その際、
ＯＤ₆₆₀ が０．２５に達した時点で、ペニシリンＧを最
終濃度が３００ユニット／ml培養液となるように添加
し、ＯＤ ₆₀₀ が１．０に達するまで培養を継続した。

【００１５】遠心により菌体を回収し、４５mlの１５０
ｍＭNaCl，１５ｍＭクエン酸ナトリウム１０ｍＭ，EDTA
２７％ショ糖に懸濁し、さらに、卵白リゾチームを最終
濃度が５mg／mlとなるように添加して、３７℃で３０分
間インキュベートした。次に、１０mlの１０％ＳＤＳを
添加し、さらにプロテアーゼＫを最終濃度２００μg/ml
となるように添加し、３７℃で４時間インキュベートし
た。その後、等容の０．１Ｍトリス飽和フェノールで２
回、エーテルで２回抽出を行ったのち、水層に２倍容の
エタノールを添加し、核酸を沈澱させ、それをガラス棒
に糸状に巻きつけてＤＮＡを回収した。

【００１６】得られた核酸を乾燥後、５mlのトリスEDTA
（１０ｍＭトリス塩酸pH8.0,1mM EDTA）に溶解し、最終
濃度１００μｇ／mlでRNaseA処理を３７℃で２時間行っ
た。その後、等容のフェノール・クロロホルム（１：１
(Ｖ／Ｖ) ）で２回抽出を行い、水層に２倍容の冷エタ
ノールを添加し、ＤＮＡを沈澱させた。得られたＤＮＡ
は８０％エタノールで洗浄後乾燥し、トリス・ＥＤＴＡ
緩衝液に溶解した。約５．８mgの染色体ＤＮＡを得た。

【００１７】 染色体ＤＮＡライブラリーの作製 １で得た染色体ＤＮＡをKpnIで消化した。一方、ベクタ
ーｐＵＣ１９（宝酒造株式会社）をKpnIで消化後、アル
カリフオスファターゼ処理し、先に得た染色体ＤＮＡ断
片と混合し、T₄ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。次
に、大腸菌Ｋ−１２株の１つであるＪＭ１０９のコンピ
テントセル（宝酒造株式会社）と、このリガーゼ反応液
を混合し、プラスミドＤＮＡを菌体内に導入した。

【００１８】ｐＵＣ１９を含むＪＭ１０９株を、アンピ
シリンとIPTG,X-Galを含むＬＢ寒天培地上に増殖させる
とＪＭ１０９菌体内で発現したβ−ガラクトシダーゼの
活性によりX-Gal が切断されるため、コロニーは青色を
呈する。しかし、ｐＵＣ１９のマルチクローニング部位
に外来ＤＮＡ断片が挿入された場合、β−ガラクトシダ
ーゼの活性は発現せず、コロニーは無色になる。以上の
方法で、ｐＵＣ１９に遺伝子が挿入されたコロニーを選
択し、ＤＮＡ配列を決定した。

【００１９】プレート上のコロニーから、まず白色コロ
ニーを選択し、次に精製したエステラーゼのＮ末端アミ
ノ酸配列に対応する混合ＤＮＡプローブを合成し、以下
の方法に従いコロニーハイブリダイゼーションを行っ
た。すなわち、プレート上に広げた白色コロニーをナイ
ロンメンブランに移し取るか或いは、竹串でナイロンメ
ンブラン上に植えて、このメンブランをＬＢアンピシリ
ンプレート上に置き数時間培養した。メンブラン上にコ
ロニーが生育したら、０．５Ｎ NaOHにメンブランを浸
す操作を２回行い、メンブラン上のコロニーを溶菌さ
せ、さらに１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）でメンプラン
を２回洗浄して中和した。こうしてコロニーから抽出し
たＤＮＡをメンブラン上に固定するため、真空下８０℃
で２時間メンブランを乾燥した。

【００２０】次に、このメンブランを６×ＳＳＣ，１
％ＳＤＳ，１０×デンハルト（０．２％フィコール，
０．２％ポリビニルピロリドン，０．２％ウシ血清アル
ブミン）５５℃１時間インキュベートした後、６×Ｓ
ＳＣ，１％ＳＤＳ，１０×デンハルト，１００μg/mlサ
ケ精巣ＤＮＡ，５５℃，４時間，の順で反応を行なっ
た。一方、混合ＤＮＡは〔γ³²Ｐ〕ＡＴＰを用いて５′
末端を標識し、カラムにより精製した。ハイブリダイゼ
ーションは、プラスティックバックにメンブランとの
溶液を加え、標識したＤＮＡをメンブラン１枚当たり約
５×１０⁵ ｃｐｍ添加して、５５℃で終夜行った。

【００２１】ハイブリダイゼーションを行ったフィルタ
ーは、６×ＳＳＣ，５５℃，１５分，６×ＳＳＣ，
５５℃，３０分，６×ＳＳＣ，１％ＳＤＳ，５５℃，
３０分の順に反応したのち、風乾し、Ｘ線フィルム（フ
ジＲＸ）と増感紙をあて、オートラジオグラムをとっ
た。この結果、ポジティブシグナルを与えるpK-12 株を
得た。

【００２２】pK-12株は、エステラーゼの全長をコード
するには十分な長さを有していなかった。そこで、ダイ
デオキシ法によりpK-12 の塩基配列を決定した後、その
配列の一部をＤＮＡプローブとして再度、コロニーハイ
ブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。そ
の際、染色体ＤＮＡはEcoRI で消化し、同様にEcoRIで
消化したベクターｐＵＣ１９に連結して作製したランブ
ラリーを使用した。その結果、ポジティブシグナルを与
えるクローン、ｐＥＨ−１６株を取得した。

【００２３】さらに、ｐＫ−１２株の挿入断片をEcoRI
で切り出し、それをｐＥＨ−１６株のEcoRI 部位に挿入
することにより、エステラーゼの全翻訳領域を含むプラ
スミドpAGE-1を構築した。その構築の方法を第５図に示
す。

【００２４】エステラーゼ遺伝子の制限酵素地図および
塩基配列の決定 前述の方法で取得したエステラーゼＤＮＡクローンにつ
いて、挿入断片の制限酵素地図を作製した。

【００２５】プラスミドｐＫ１２およびｐＥＨ１６を導
入した大腸菌ＪＭ１０９株を各々培養し、バーンボイム
−ドリ（Birnboim-Doly)の方法により、プラスミドＤＮ
Ａを調製した。プラスミドＤＮＡは、種々の制限酵素で
切断し、切断したＤＮＡ断片を１％アガロースゲル及び
５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。出現
した種々のＤＮＡ断片の鎖長を比較することにより制限
酵素地図を得た。

【００２６】エステラーゼＤＮＡ塩基配列およびアミノ
酸配列の決定 pAGE-1の挿入断片の全 2,175塩基対の塩基配列を、ｐＵ
Ｃプラスミドの正逆両方向のプライマーＤＮＡ（宝酒造
株式会社）、逐次合成したプライマーＤＮＡ、および７
−deaza シークエンシングキット（宝酒造株式会社）を
用いてダイデオキシ法により決定した。

【００２７】決定したpAGE-1の挿入ＤＮＡ断片の全 2,1
74塩基対の塩基配列を図１〜図４に示す。塩基配列中か
ら、オープンリーディングフレームを検索した結果、図
１〜図４に示すように、塩基番号２１１番目のＧＴＧか
ら、1335番目までが唯一のオープンリーディングフレー
ムである事が判明した。蛋白質の読み枠としては、塩基
を１つずつずらした他の２つの読み枠も考えられるが、
これらでは塩基配列の途中に終止コドンが何回も現れ、
SDS-PAGEにより推定した分子量43,000のエステラードを
コードできるとは考えられなかった。

【００２８】また、精製したエステラーゼのアミノ末端
のアミノ酸配列と、このオープンリーディングフレーム
の開始コドン以下のアミノ酸残基が一致した事から、こ
のオープンリーディングフレームがエステラーゼをコー
ドするものである事が明らかになった。その結果、エス
テラーゼは３７５アミノ酸残基から成る分子量39,836の
蛋白質であることが判明した。

【００２９】エステラーゼ高発現プラスミドの構築 発現ベクターpKK223-3(Boyerら、Prot.Natl.Acad.Sci.U
SA,80,21〜25(1983)ファルマシア社）をBamHI により部
分分解し、次にT₄DNA ポリメラーゼにより平滑化し、ラ
イゲーションを行う事によりBamHI 部位を１カ所欠失さ
せたpKK223-4を作製した

【００３０】一方、エステラーゼ遺伝子の開始コドンか
ら５′側のＤＮＡ配列を変換するため、下記の配列のＤ
ＮＡフラグメントをアプライド社ＤＮＡ合成機モデル３
８０Ａを用いて合成した。合成したpH-21,ES-01,ES-11,
ES-21,およびES-13 断片の５′末端をリン酸化し、それ
ぞれ未処理の断片とライゲーション，アニーリングを行
って、下記の３種類の２本鎖ＤＮＡ断片を作製した。

【００３１】PH-22

【化５】 配列番号３

【００３２】PH-21

【化６】 配列番号４

【００３３】ES-01

【化７】 配列番号５

【００３４】ES-02

【化８】 配列番号６

【００３５】ES-13

【化９】 配列番号７

【００３６】ES-11

【化１０】 配列番号８

【００３７】ES-12

【化１１】 配列番号９

【００３８】ES-21

【化１２】 配列番号１０

【００３９】ES-22

【化１３】 配列番号１１ 合成したpH-21,ES-01,ES-11,ES-21,およびES-13 断片の
５′末端をリン酸化し、それぞれ未処理の断片とライゲ
ーション，アニーリングを行って、下記の３種類の２本
鎖ＤＮＡ断片を作製した。

【化１４】 作製した２本鎖ＤＮＡ断片は、その両端をリン酸化し
た。一方、pAGE-1をNsp(7524) Ｖ，およびHindIII で消
化する事によりエステラーゼの翻訳領域を切り出し、合
成したＤＮＡ断片および、BamHI で消化し、アルカリホ
スフアターゼ処理を行ったベクターpKK223-4とライゲー
ションを行った。この様にして、ｔｏｃプロモーターの
下流に改変された５′側ＤＮＡ配列を有する３種類の大
腸菌用発現プラスミドpAGE-201,pAGE-202,およびpAGE-2
03を得た。

【００４０】組み換え体大腸菌による菊酸エステル不斉
加水分解酵素の生産 ３種類の発現プラスミドをそれぞれ大腸菌ＪＭ１０９に
導入し、Ｍ９培地（K₂HPO₄10.5ｇ,KH₂PO₄4.5g,(NH₄)₂SO
₄1.0g,クエン酸ナトリウム０．５ｇ，MgSO₄7H₂O 0.2g,
グルコース２．０ｇ，チアミン塩酸塩，２mg／Ｌ）を用
いて３７℃で培養し、対数増殖期にIPTG（イソプロピル
チオーβ−Ｄ−ガラクトシド）を終濃度１mMになる様添
加して、エステラーゼの発現を誘導した。

【００４１】培養終了後、遠心により菌体を回収し、そ
の一部をSDS-PAGEに供したところ、分子量40,000の位置
に、エステラーゼが主バンドとして認められ、大腸菌内
で該酵素がいずれも高発現している事が判明した。

【００４２】組み換え体大腸菌による菊酸エチルエステ
ルの不斉加水分解 これらの菌体を用いてラセミ体、菊酸（２，２−ジメチ
ル−３−イソブテニルシクロプロパン−１−カルボン
酸）のエチルエステル（シス体：トランス体＝１０：９
０，（＋）／（−）＝５０／５０）（以下、本明細書中
でＫＣＥと略す）の加水分解反応を行った。即ち、培養
液１００ml相当の菌体を、５０mlの２００mMグリシン・
水酸化ナトリウム緩衝液（pH10.0）中に懸濁し、１．０
ｇの上記菊酸エチルエステルを添加し、1,000 rpm で攪
拌下、３７℃で反応を行った。６時間後この反応液に、
３５％塩酸５．０mlを加えて反応を停止させた後、メチ
ルイソブチルケトン（以下MIBKと略す）で、生成した菊
酸（以下ＫＣＡと略す）と、未反応のＫＣＥを酸析、抽
出した。抽出液をガスクロマトグラフィー（カラム：Sh
inchrom Ｆ５５（５％）＋H₃PO₄ (1％），２．６ｍ，１
９０℃）で分析し、面積百分率より加水分解率を計算し
た。

【００４３】次に、上記抽出液に0.01N NaoH20mlを添加
してＫＣＡのみをナトリウム塩として水層に抽出した
後、再び３５％塩酸とMIBKにより、ＫＣＡを酸析抽出し
た。該抽出液を濃縮，脱水後，その一部をジシクロヘキ
シルカルボジイミドと３．５−ジクロロアニリンを加え
て室温で３時間放置後、高速液体クロマトグラフィー
（カラム：SUMIPAX OA−2100×２本，移動相：ｎ−ヘキ
サン：１，２−ジクロロメタン（１７：３V/V)，流速
１．５ml／min,検出:254mm）で異性体分析を行った。そ
の結果を表１に表す。

【００４４】

【表１】 １）加水分解率：原料中の（＋）−トランス体ＫＣＥモ
ル数に対する得られた（＋）−トランス体ＫＣＡのモル
分率を表わす。

【００４５】組換え体大腸菌による菊酸エチルエステル
の不斉加水分解 ３種類の発現プラスミドをそれぞれ大腸菌ＪＭ１０５に
導入し、Ｍ９培地を用いて３７℃で培養し、対数増殖期
にIPTGを終濃度１ｍＭになるように添加して、エステラ
−ゼの発現を誘導した。これらの菌体を用いてラセミ
体、菊酸（２，２−ジメチル−３−イソブテニルシクロ
プロパン−１−カルボン酸）のエチルエステル（シス
体：トランス体＝１０：９０，（＋）／（−）＝５０／
５０）の加水分解反応を行った。即ち、培養液１００ml
相当の菌体を、５０mlの２００mMグリシン・水酸化ナト
リウム緩衝液（pH10.0）中に懸濁し、１．０ｇの上記菊
酸エチルエステルを添加し、1,000 rpm で攪拌下、３７
℃で反応を行った。６時間後この反応液に、３５％塩酸
５．０mlを加えて反応を停止させた後、メチルイソブチ
ルケトン（以下MIBKと略す）で、生成した菊酸（以下Ｋ
ＣＡと略す）と、未反応のＫＣＥを酸析、抽出した。抽
出液をガスクロマトグラフィー（カラム：Shinchrom Ｆ
５５（５％）＋H₃PO₄ (1％），２．６ｍ，１９０℃）で
分析し、面積百分率より加水分解率を計算した。その結
果を表２に示す。

【表２】

【００４６】従来Arthrobacter globiformis(IFO-1295
8）を用いた場合、エステラーゼの該菌体内での発現量
が非常に低いため、精製酵素２０μｇ（２．５Ｌ培養液
相当）を用い、９０ＫＣＥ濃度２w/v ％，４０℃で２４
時間反応を行った時、加水分解率は６．４％であった
（特開平１−１８１７８８参照） 本発明により、大腸菌に該遺伝子をクローニングし、プ
ロモーター及び開始コドン付近を大腸菌に適した配列に
変換する事により、菌体内に於ける該酵素の発現量を飛
躍的に増大させ、その結果ラセミ体ＫＣＥから（＋）−
トランス体ＫＣＡを特異的かつ高収率で得る事が可能に
なった。

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：３７５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Asp Ala Gln Thr Ile Ala Pro Gly Phe Glu Ser Val Ala Glu Leu 5 10 15 Phe Gly Arg Phe Leu Ser Glu Asp Arg Glu Tyr Ser Ala Gln Leu Ala 20 25 30 Ala Tyr His Arg Gly Val Lys Val Leu Asp Ile Ser Gly Gly Pro His 35 40 45 Arg Arg Pro Asp Ser Val Thr Gly Val Phe Ser Cys Ser Lys Gly Val 50 55 60 Ser Gly Leu Val Ile Ala Leu Leu Val Gln Asp Gly Phe Leu Asp Leu 65 70 75 80 Asp Ala Glu Val Val Lys Tyr Trp Pro Glu Phe Gly Ala Glu Gly Lys 85 90 95 Ala Thr Ile Thr Val Ala Gln Leu Leu Ser His Gln Ala Gly Leu Leu 100 105 110 Gly Val Glu Gly Gly Leu Thr Leu Ala Glu Tyr Asn Asn Ser Glu Leu 115 120 125 Ala Ala Ala Lys Leu Ala Gln Met Arg Pro Leu Trp Lys Pro Gly Thr 130 135 140 Ala Phe Gly Tyr His Ala Leu Thr Ile Gly Val Phe Met Glu Glu Leu 145 150 155 160 Cys Arg Arg Ile Thr Gly Ser Thr Leu Gln Glu Ile Tyr Glu Gln Arg 165 170 175 Ile Arg Ser Val Thr Gly Ala His Phe Phe Leu Gly Leu Pro Glu Ser 180 185 190 Glu Glu Pro Arg Tyr Ala Thr Leu Arg Trp Ala Ala Asp Pro Ser Gln 195 200 205 Pro Trp Ile Asp Pro Ala Ser His Phe Gly Leu Ser Ala Asn Ser Ala 210 215 220 Val Gly Asp Ile Leu Asp Leu Pro Asn Leu Arg Glu Val Arg Ala Ala 225 230 235 240 Gly Leu Ser Ser Ala Ala Gly Val Ala Ser Ala Glu Gly Met Ala Arg 245 250 255 Val Tyr Ala Ala Ala Leu Thr Gly Leu Ala Ala Asn Gly Asp Arg Ala 260 265 270 Ala Val Ala Pro Leu Leu Ser Glu Glu Thr Ile Gln Thr Val Thr Ala 275 280 285 Glu Gln Val Phe Gly Ile Asp Arg Val Phe Gly Glu Thr Ser Cys Phe 290 295 300 Gly Thr Val Phe Met Lys Ser His Ala Arg Ser Pro Tyr Gly Ser Tyr 305 310 315 320 Arg Ala Phe Gly His Asp Gly Ala Ser Ala Ser Leu Gly Phe Ala Asp 325 330 335 Pro Val Tyr Glu Leu Ala Phe Gly Tyr Val Pro Gln Gln Ala Glu Pro 340 345 350 Gly Gly Ala Gly Cys Arg Asn Leu Glu Leu Ser Ala Ala Val Arg Lys 355 360 365 Ala Val Thr Glu Leu Ala Gln 370 375 配列番号：２ 配列の長さ：１１２５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：アリスロバクター・グロビフォルミス(Arthrob
acter globiformis) 株名: SC-6-98-28(FERM BP-3618) 配列の特徴 特徴を表す記号:CDS 存在位置:1..1125 特徴を決定した方法:E 配列 GTGGATGCAC AGACGATTGC CCCTGGATTC GAATCAGTCG CCGAACTCTT TGGCCGTTTC 60 CTGAGCGAAG ACCGGGAATA TTCAGCCCAG CTCGCGGCCT ACCACCGCGG AGTCAAGGTA 120 TTGGACATCA GCGGTGGGCC GCACCGCCGC CCGGATTCCG TGACCGGTGT TTTCTCCTGC 180 TCCAAGGGAG TATCCGGGCT GGTCATCGCA CTTTTGGTCC AGGACGGCTT CCTCGACCTC 240 GACGCCGAAG TGGTCAAGTA CTGGCCGGAA TTCGGCGCCG AAGGAAAGGC CACGATTACC 300 GTGGCCCAGC TGCTCTCCCA CCAGGCCGGG CTTCTGGGAG TCGAAGGCGG ACTCACCCTC 360 GCGGAATACA ACAACTCCGA ACTGGCCGCC GCCAAGCTCG CGCAGATGCG GCCGCTGTGG 420 AAGCCCGGGA CCGCCTTCGG GTACCACGCC CTGACCATCG GCGTCTTCAT GGAGGAGCTT 480 TGCCGCCGGA TCACCGGGTC CACGCTCCAG GAAATCTACG AACAGCGGAT CCGCTCGGTC 540 ACGGGCGCCC ACTTCTTCCT GGGACTGCCT GAGTCCGAGG AACCCCGCTA TGCCACCCTC 600 CGTTGGGCTG CAGACCCCTC CCAGCCGTGG ATTGATCCCG CCAGCCATTT CGGCCTTTCC 660 GCAAACTCGG CCGTGGGGGA CATCCTTGAC CTGCCCAACC TCCGCGAGGT CCGCGCAGCC 720 GGCCTGAGTT CAGCCGCCGG AGTCGCCAGC GCGGAAGGCA TGGCCCGCGT CTACGCTGCG 780 GCACTCACCG GACTTGCCGC CAACGGCGAC CGAGCCGCCG TCGCGCCCCT CCTCAGCGAA 840 GAGACCATCC AAACCGTCAC GGCCGAGCAG GTCTTCGGCA TCGACCGGGT GTTCGGCGAG 900 ACGAGCTGCT TTGGGACAGT GTTCATGAAA TCGCATGCAC GCTCGCCTTA TGGCAGCTAC 960 CGGGCGTTCG GGCACGACGG CGCCAGCGCA TCTTTGGGGT TCGCTGACCC TGTGTATGAA 1020 CTCGCCTTCG GGTACGTGCC GCAACAGGCC GAGCCGGGCG GAGCGGGATG CCGCAACCTT 1080 GAGCTGAGCG CCGCCGTGCG GAAGGCAGTC ACCGAACTGG CTCAG 1125 配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATCCTTTTT TAATAAAATC 20 配列番号：４ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTTACCTCC TGATTTTATT AAAAAAG 27 配列番号：５ 配列の長さ：４４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGGAGGTAAA AAACGATGGA CGCACAGACC ATCGCACCGG GCTT 34 配列番号：６配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGAAGCCCGG TGCGATGGTC TGTGCGTCCA TCGTT 35 配列番号：７ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTTTCCTCC TGATTTTATT AAAAAAG 27 配列番号：８ 配列の長さ：４４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGGAGGAAAA AATCGATGGA CGCACAGACC ATCGCACCGG GCTT 44 配列番号：９ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGAAGCCCGG TGCGATGGTC TGTGCGTCCA TCGAT 35 配列番号：１０ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGGAGGAAAA AATATGGACG CACAGACCAT CGCACCGGGC TT 42 配列番号：１１ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGAAGCCCGG TGCGATGGTC TGTGCGTCCA TAT 33

【図面の簡単な説明】

【図１】クローンpAGE-1の挿入ＤＮＡ断片の１番目から
５７０番目の塩基配列と、それから推定される該エステ
ラーゼのアミノ酸配列を示す。

【図２】クローンpAGE-1の挿入ＤＮＡ断片の５７１番目
から１００２番目の塩基配列と、それから推定される該
エステラーゼのアミノ酸配列を示す。スクリーニングに
用いたＮ末端ＤＮＡプローブは、塩基番号211 〜230 番
目に相当する。

【図３】クローンpAGE-1の挿入ＤＮＡ断片の１００３番
目から１６９５番目の塩基配列と、それから推定される
該エステラーゼのアミノ酸配列を示す。エステラーゼの
翻訳領域は、塩基番号210 〜1335番目に相当する。

【図４】クローンpAGE-1の挿入ＤＮＡ断片の１６９６番
目から２１７５番目の塩基配列を示す。

【図５】コロニーハイブリダイゼーションで得られたポ
ジティブクローンＰＫ−１２，pEH16,及び、これらを元
に構築したエステラーゼ翻訳領域の全長を含むクローン
pAGE-1の制限酵素地図を示す。図中イは、Ａ．globifor
mis 由来のＤＮＡを、ロはエステラーゼの翻訳領域を示
す。

【図６】エステラーゼ高発現プラスミドpAGE-201〜３の
構築ストラテジーを示す。図中ハは合成ＤＮＡを、太線
矢印はｔａｃプロモーターを表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｅ 8828−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/55 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】菊酸または菊酸誘導体のエステルの、不斉
   加水分解能を有し下記アミノ酸配列で表される酵素をコ
   ードすることを特徴とするエステル不斉加水分解酵素遺
   伝子 【化１】 配列番号１
2. 【請求項２】下記塩基配列で特定されることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載のエステル不斉加水分解酵
   素遺伝子 【化２】 配列番号２
3. 【請求項３】 特許請求の範囲第２項記載の遺伝子を含
   有することを特徴とするプラスミド
4. 【請求項４】 プラスミドｐＡＧＥ−２０１
5. 【請求項５】 プラスミドｐＡＧＥ−２０２
6. 【請求項６】 プラスミドｐＡＧＥ−２０３
7. 【請求項７】 請求項４、５または６記載のプラスミド
   を保持することを特徴とする微生物
8. 【請求項８】 エシエリキア・コリであることを特徴と
   する請求項７記載の微生物
9. 【請求項９】 エシエリキア・コリが、ＪＭ１０９株で
   あることを特徴とする特許請求の範囲第８項記載の微生
   物
10. 【請求項１０】 ＪＭ１０９／ｐＡＧＥ−２０１株
11. 【請求項１１】 ＪＭ１０９／ｐＡＧＥ−２０２株
12. 【請求項１２】 ＪＭ１０９／ｐＡＧＥ−２０３株
13. 【請求項１３】 エシエリキア・コリが、ＪＭ１０５株
    であることを特徴とする特許請求の範囲第８項記載の微
    生物
14. 【請求項１４】 ＪＭ１０５／ｐＡＧＥ−２０１株
15. 【請求項１５】 ＪＭ１０５／ｐＡＧＥ−２０２株
16. 【請求項１６】 ＪＭ１０５／ｐＡＧＥ−２０３株
17. 【請求項１７】 請求項７、８、９、１０、１１、１
    ２、１３、１４、１５あるいは１６項記載の微生物を培
    養することを特徴とするエステル不斉加水分解酵素の製
    造方法