SI20642A - Nova karbonil-reduktaza, gen le-te in postopek za uporabo le-teh - Google Patents

Nova karbonil-reduktaza, gen le-te in postopek za uporabo le-teh Download PDF

Info

Publication number
SI20642A
SI20642A SI200020017A SI200020017A SI20642A SI 20642 A SI20642 A SI 20642A SI 200020017 A SI200020017 A SI 200020017A SI 200020017 A SI200020017 A SI 200020017A SI 20642 A SI20642 A SI 20642A
Authority
SI
Slovenia
Prior art keywords
butyl
tert
chloro
polypeptide
expression vector
Prior art date
Application number
SI200020017A
Other languages
English (en)
Inventor
Noriyuki Kizaki
Yukio Yamada
Yoshihiko Yasohara
Junzo Hasegawa
Original Assignee
Kaneka Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kaneka Corporation filed Critical Kaneka Corporation
Publication of SI20642A publication Critical patent/SI20642A/sl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/40—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Candida
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Prikazan je novi polipeptid za proizvodnjo terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoata, gen, ki kodira polipeptid, in postopek za uporabo polipeptida. Polipeptid ima encimsko aktivnost, da asimetrično reducira terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoat v terc. butil (3R, 5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoat. Polipeptid obsega aminokislinsko sekvenco prikazano s SEQ ID No. 1 na sekvenčni listi, ali aminokislinsko sekvenco, ki ima vsaj eno aminokislinsko substitucijo, insercijo, delecijo ali adicijo le-te.ŕ

Description

KANEKA CORPORATION
Nova karbonil-reduktaza, gen le-te in postopek za uporabo le-teh
Predloženi izum se nanaša na nov polipeptid, gen, ki kodira polipeptid, ekspresij ski vektor za ekspresijo polipeptida, transformant, dobljen s transformiranjem gostiteljske celice z uporabo ekspresij skega vektorja, in postopek za proizvodnjo spojine, uporabne kot material za sintezo zdravil in pesticidov z uporabo transformanta. Bolj podrobno se predloženi izum nanaša na polipeptid, izoliran iz mikroorganizma, ki ima encimsko aktivnost, da asimetrično reducira terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoat v terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoat, na polinukleotid, ki kodira peptid, ekspresijski vektor, ki vključuje polinukleotid, in transformant, transformiran z ekspresijskim vektorjem.
Predloženi izum se nanaša tudi na postopek za proizvodnjo terc. butil (3R,5S)-6-kloro3,5-dihidroksiheksanoata. Postopek vključuje stopnji: reakcijo transformanta ali njegovega procesiranega produkta s terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3oksoheksanoatom in zbiranje proizvedenega terc. butil (3R.,5S)-6-kloro-3,5dihidroksiheksanoata.
Terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoat je spojina, uporabna kot material za sintezo zdravil in pesticidov, zlasti HMG-CoA reduktaznih inhibitorjev.
Pri edinem opisanem postopku za proizvodnjo terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5dihidroksiheksanoata z asimetričnim reduciranjem terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi3-oksoheksanoata se uporablja dietilmetoksiboran in natrijev borohidrid (US-patent št. 52,783,131). Problem pri tej tehniki je, daje potrebna posoda za doseganje zelo nizke reakcijske temperature, kot je temperatura -78 °C, da je treba uporabiti drage materiale itd. Tako je obstajala potreba za praktičen reakcijski postopek.
Izumitelji predloženega izuma smo ugotovili polipeptid, izveden iz mikroorganizma, ki asimetrično reducira terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoat, da proizvede terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoat, in razvili postopek, s katerim se lahko učinkovito proizvede terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5dihidroksiheksanoat in končno dosegli predloženi izum.
Predmet predloženega izuma je, da zagotovimo polipeptid, ki je sposoben, da asimetrično reducira terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoat, da proizvede terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoat. Drugi predmet predloženega izuma je, da zagotovimo postopek za učinkovito proizvodnjo polipeptida z uporabo rekombinantne DNA-tehnologije. Še nadaljnji predmet predloženega izuma je, da zagotovimo transformant, ki lahko proizvede navedeni polipeptid, in polipeptid, ki ima aktivnost glukoza-dehidrogenaze, istočasno v večjem obsegu. Še nadaljnji predmet predloženega izuma je, da zagotovimo praktični postopek za proizvodnjo terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoata z uporabo transformanta.
Predloženi izum se nanaša na polipeptid, ki ima encimsko aktivnost, da asimetrično reducira terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoat v terc. butil (3R,5S)-6kloro-3,5-dihidroksiheksanoat. Polipeptid obsega aminokislinsko sekvenco, prikazano s SEQ ID No. 1 na sekvenčni listi, ali aminokislinsko sekvenco z vsaj eno aminokislinsko substitucijo, insercijo, delecijo ali adicijo le-te.
Prednostno je peptid lahko izveden iz mikroorganizma, ki pripada rodu Candida. Bolj prednostno je mikroorganizem lahko Candida magnoliae IFO 0705.
Z enega vidika se predloženi izum nanaša na polinukleotid, ki kodira zgoraj opisani polipeptid.
Z enega vidika se predloženi izum nanaša na polinukleotid, ki kodira polipeptid, ki ima encimsko aktivnost, da asimetrično reducira terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3oksoheksanoat v terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoat. Polinukleotid je hibridiziran z nukleotidno sekvenco, prikazano s SEQ ID No. 2 na sekvenčni listi, pri ostrih pogojih.
Z enega vidika se predloženi izum nanaša na ekspresijski vektor, ki vključuje zgoraj opisani polinukleotid. Prednostno je ekspresijski vektor lahko plazmid pNTCR.
V eni izvedbi lahko zgoraj opisani ekspresijski vektor nadalje vključuje polinukleotid, ki kodira polipeptid z aktivnostjo glukoza-dihidrogenaze.
Prednostno je polipeptid z aktivnostjo glukoza-dehidrogenaze lahko glukozadehidrogenaza, izvedena iz Bacillus megaterium.
Prednostno je ekspresijski vektor lahko plazmid pNTCRG.
Z enega vidika se predloženi izum nanaša na transformant, dobljen s transformiranjem gostitelj ske celice z uporabo zgoraj opisanega ekspresij skega vektorja.
Prednostno je gostiteljska celica lahko Escherichia coli. Bolj prednostno je transformant lahko E. coli HB101 (pNTCR) ali E. coli HB101 (pNTCRG).
Z enega vidika se predloženi izum nanaša na postopek za proizvodnjo terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoata. Postopek obsega stopnje: reakcijo zgoraj opisanega transformanta in/ali njegovega procesiranega produkta s terc. butil (S)-6kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoatom in zbiranje proizvedenega terc. butil (3R,5S)-6kloro-3,5-dihidroksiheksanoata.
Prednostno reakcijsko stopnjo izvedemo v navzočnosti koencimskega obnovitvenega sistema.
Kratek opis slik
Fig. 1 je diagram, ki prikazuje sekvenco polinukleotida v smislu predloženega izuma in njegovo napovedano aminokislinsko sekvenco.
Fig. 2 je diagram, ki prikazuje postopek za proizvodnjo rekombinantnega plazmida pNTCRG.
Najboljši način za izvedbo predloženega izuma
V nadaljevanju je predloženi izum podrobno opisan. Kot polipeptid v smislu izuma lahko uporabimo katerikoli polipeptid, samo da ima le-ta encimsko aktivnost, da asimetrično reducira terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoat, prikazan s spodnjo formulo (I), da proizvede terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoat, prikazan s spodnjo formulo (II).
terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoat.
Primeri za take polipeptide vključujejo polipeptid, ki obsega aminokislinsko sekvenco SEQ ID NO. 1 na sekvenčni listi, in polipeptid, ki obsega aminokislinsko sekvenco, ki ima eno aminokislinsko substitucijo, insercijo, delecijo ali adicijo ali del le-te in ima encimsko aktivnost, da asimetrično reducira terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3oksoheksanoat, da proizvede terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoat.
Polipeptid v smislu izuma lahko dobimo iz mikroorganizma, ki ima aktivnost, da asimetrično reducira terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoat, da proizvede terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoat. Zato je lahko mikroorganizem, uporabljen kot vir peptida, neomejujoče, kvasovka (rod Candida), najbolj prednostno Candida magnoliae IFO 0705. Ta sev je mikroorganizem, originalno deponiran pod depozitno številko CBS 166 pri Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS; Oosterstraat 1, Postbus 273, NL-3740 AG Baam, Nizozemska), izolacija in lastnosti seva pa so opisane v The Yeasts, Taxonomic Study, 3.izd. str. 731 (1984). Mikroorganizmi, ki proizvajajo polipeptide v smislu izuma, so lahko sev divjega tipa ali variantnega tipa. Alternativno lahko uporabimo mikroorganizme, ki so genetsko konstruirani (z uporabo celične fuzije, genske manipulacije itd.). Mikroorganizme, ki so genetsko konstruirani, da proizvedejo peptide v smislu izuma, lahko dobimo s postopkom, ki vključuje stopnje: izoliranje in/ali čiščenje teh encimov in določevanje njihove celotne ali delne aminokislinske sekvence; določevanje nukleotidnih sekvenc, ki kodirajo polipeptide na osnovi njihovih aminokislinskih sekvenc; pridobivanje nukleotidnih sekvenc, ki kodirajo polipeptide na osnovi njihovih aminokislinskih sekvenc; uvajanje nukleotidnih sekvenc v druge mikroorganizme, da dobimo rekombinatne mikroorganizme; in kultiviranje rekombinantnih mikroorganizmov, da dobimo encime v smislu izuma.
Kulturni medij za mikroorganizme, ki proizvajajo polipeptide v smislu izuma, je lahko katerikoli tekoči hranilni medij, ki vsebuje značilni vir ogljika, vir dušika, vir mineralne soli, organski hranilni vir ipd., dokler mikroorganizmi lahko rastejo.
Izraz kultura mikroorganizma, kot ga uporabljamo tukaj, se nanaša na sam mikroorganizem ali tekočo kulturo, ki vsebuje mikroorganizem in izraz njegov procesiran produkt pa se nanaša na produkt, dobljen z ekstrakcijo ali čiščenjem mikroorganizma samega ali tekoče kulture, ki vsebuje mikroorganizem.
Polipeptide v smislu izuma lahko očistimo iz mikroorganizmov, ki vsebujejo polipeptide, z uporabo konvencionalnega postopka. Mikroorganizem kultiviramo npr. v ustreznem mediju in kulturo centrifugiramo, da zberemo mikroorganizem. Mikroorganizem razbijemo z mlinom Dyno (izdelovalec Willy A. Bachofen Co., Ltd.) in cenrifugiramo, da odstranimo celične ostanke in tako dobimo ekstrakt brez celic. Ekstrakt brez celic nato izpostavimo tehnikam, kot so npr. izsoljevanje (npr. obarjanje z amonijevim sulfatom in obarjanje z natrijevim fosfatom), solventno obarjanje (proteinski frakcionacijski obarjalni postopek z uporabo acetona, etanola ipd.), dializa, gelska fitracija, ionska izmenjava, kolonska kromatografija (npr. kromatografija z reverzno fazo) in ultrafiltracija, bodisi eni sami tehniki ali kombinaciji, da očistimo polipeptide. Encimsko aktivnost lahko določimo z merjenjem zmanjšanja absorpcije pri valovni dolžini 340 nm pri 30 °C, kjer dodamo 5 mM terc. butil (S)-6-kloro-5hidroksi-3-oksoheksanoat kot substrat, 0,33 mM NADPH kot koencim in encim v 100 mM fosfatni pufer (pH 6,5).
Polipeptidi v smislu izuma lahko vključujejo aminokislinsko sekvenco SEQ ID No. 1, prikazano na sekvenčni listi. Polipeptidi z aminokislinsko sekvenco z vsaj eno aminokislinsko substitucijo, insercijo, dilecijo ali adicijo ali delom le-te in ki imajo encimsko aktivnost, da asimetrično reducirajo terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3oksoheksanoat, da proizvedejo terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoat, lahko pripravimo iz polipeptida z aminokislinsko sekvenco SEQ ID No. 1, prikazano na sekvenčni listi, z uporabo znanega postopka, opisanega v: Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons. Inc., 1989) ipd. V obseg predloženega izuma spada katerikoli polipeptid, samo da ima encimsko aktivnost, da asimetrično reducira terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoat v terc. butil (3R,5S)-6kloro-3,5-dihidroksiheksanoat.
Polinukleotid v smislu izuma je lahko katerikoli tisti, ki kodira kateregakoli od zgoraj opisanih polipeptidov. Primer za polinukleotid v smislu izuma je polinukleotid z nukleotidno sekvenco SEQ ID No. 2, prikazano na sekvenčni listi, in polinukleotid, sposoben, da se hibridizira s tem polinukleotidom pri ostrih pogojih.
Polinukleotid, sposoben da se hibridizira s polinukleotidom s polinukleotidno sekvenco SEQ ID No. 2, prikazano na sekvenčni listi, pri ostrih pogojih, pomeni polinukleotid, dobljen s postopkom za hibridizacijo kolonije, postopkom za hibridizacijo plakov, Southemovim hibridizacijskim postopkom ipd., kadar uporabimo nukleotidno sekvenco SEQ ID No. 2 kot DNA sondo. Podrobno lahko polinukleotid indentificiramo takole. Filter, na katerem so imobilizirani polinukleotidi, izvedeni iz kolonije ali plaka, izpostavimo hibridizaciji z nukleotidno sekvenco SEQ ID No. 2 v 0,7 do 1,0 M NaCI pri 65 °C, nato pa filter speremo z SSC-raztopino z 0,1- do 2kratno koncentracijo (enkratna koncentracija SSC-raztopine vsebuje 150 mM natrijev klorid in 15 mM natrijev citrat) pri 65 °C.
Hibridizacijo lahko izvedemo po postopku, opisanem v: Molecular Cloning, A laboratory maual, 2. izd. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) ipd. Podrobneje, primeri za polinukleotid, sposoben za zgoraj navedeno hibridizacijo, vključujejo polinukleotid z vsaj 60 % sekvenčno identiteto z nukleotidno sekvenco SEQ ID No. 2, prednostno vsaj 80 % sekvenčno identiteto, bolj prednostno vsaj 90 % sekvenčno identiteto, še bolj prednostno vsaj 95 % sekvenčno identiteto in najbolj prednostno vsaj 99 % sekvenčno identiteto.
Polinukleotidi v smislu izuma, ki kodirajo polipeptide, ki imajo encimsko aktivnost, da asimetrično reducirajo terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoat v terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoat, vključujejo polinukleotid z vsaj 60 % sekvenčno identiteto z nukleotidno sekvenco SEQ ID No. 2, prednostno vsaj 80 % sekvenčno identiteto, bolj prednostno vsaj 90 % sekvenčno identiteto, še bolj prednostno vsaj 95 % sekvenčno identiteto in najbolj prednostno vsaj 99 % sekvenčno identiteto, samo da imajo kodirani polipeptidi zgoraj opisano encimsko aktivnost. Izraz sekvenčna identiteta pomeni, da sta dve polinukleotidni sekvenci, ki jih je treba primerjati, identični ena z drugo, stopnjo (%) sekvenčne identitete med dvema polinukleotidoma, ki ju je treba primerjati, pa izračunano takole: najprej dve polinukleotidni sekvenci, ki ju je treba primerjati, poravnamo na optimalen način. Število mest, pri katerih so navzoče enake baze nukleinske kisline (npr. A, T, C, G, U ali I) pri obeh sekvencah (število mest, ki se ujemajo), preštejemo in število mest, ki se ujemajo, razdelimo s celotnim številom baz nukleinske kisline v polinukleotidu. Dobljeno vrednost pomnožimo s 100. Sekvenčno identiteto lahko izračunamo z uporabo orodja za analiziranje sekvence, kot npr.: Unix-based GCG Wisconsin Package (Program Manual for the Wisconsin Package, verzija 8, september 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wisconsin, USA53711; Rice P. (1996) Program Manual for EGCG Package, Peter Rice, The Sanger Centre, Hinxton Hall, Cambridge, CB10 1RQ, Anglija) in ExPASy World Wide Web server for molecular biology (Geneva University Hospital in University of Geneva, Geneva, Švica).
Polinukleotide v smislu izuma, lahko dobimo iz mikroorganizmov, ki imajo encimsko aktivnost, da asimetrično reducirajo terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoat v terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoat. Mikroorganizem, uporabljen kot vir polinukleotida, je lahko neomejujoče kvasovka (rod Candida), najbolj prednostno Candida magnoliae IFO 0705.
V nadaljevanju je opisan postopek za proizvodnjo polinukleotida v smislu izuma iz mikroorganizmov, ki imajo encimsko aktivnost, da asimetrično reducirajo terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoat v terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoat. Predloženi izum ni s tem omejen.
Na začetku sekvenciramo aminokislinske sekvence očiščenega polipeptida in peptidne fragmente, dobljene z razgradnjo polipeptida z ustrezno endopeptidazo, po Edmanovem postopku. Na osnovi informacije za to aminokislinsko sekvenco sintetiziramo nukleotidni primer. Nato pripravimo kromosomsko DNA iz mikroorganizma, iz katerega izvira polinukleotid, z uporabo značilnega postopka za izolacijo nukleotida (npr. Herefordov postopek, opisan v Celi, 18, 1261 (1979)). PCR izvedemo z uporabo zgoraj opisanega nukleotidnega primerja in te kromosomske DNA kot modela, da pomnožimo del polipeptidnega gena. Nadalje pomnoženi del polipeptidnega gena označimo s postopkom za naključno označevanje primerja, opisanim v Anal. Biochem., 132, 6 (1983), da pripravimo npr. nukleotidno sondo. Kromosomsko DNA mikroorganizma razgradimo z ustreznim rekstrikcijskim encimom. Dobljene fragmente vgradimo v vektor, ki ga v nadaljevanju uvedemo v ustrezno gostitelj sko celico, da tako konstruiramo DNA-knjižnico kromosomske DNA za mikroorganizem. To DNA-knjižnico selekcioniramo z uporabo zgoraj opisane nukleotidne sonde v skladu s postopkom za hibridizacijo kolonije, postopkom za hibridizacijo plaka ipd., pri čemer dobimo DNA, ki vključuje polipeptidni gen. Nukleotidno sekvenco tako dobljenega DNA-fragmenta, ki vključuje polipeptidni gen, lahko sekvenciramo z dideoksi sekvencimim postopkom, dideoksi verižnim terminacijskim postopkom ali podobnim. Sekvenciranje nukleotidne sekvence lahko npr. izvedemo z uporabo kompleta ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (izdelovalec Perkin Elmer Co., Ltd.) in sekvenatorja ABI 373A DNA Seqencer (izdelovalec Perkin Elmer Co., Ltd.).
Vektorji za uvedbo polinukleotidov v smislu izuma v gostiteljske mikroorganizme, v katerih se izrazijo polinukleotidi, so lahko katerikoli vektorji, samo da se encimski gen lahko izrazi v ustreznih gostiteljskih mikroorganizmih. Primeri takih vektorjev vključujejo plazmidni vektor, fagni vektor in kozmidni vektor. Uporabimo lahko prenosljivi vektor, ki lahko zamenja gen med gostitelj skimi sevi. Tak vektor značilno vključuje kontrolni element, kot npr. lacUV5-promotor, trp-promotor, trc-promotor, tac-promotor, lpp-promotor, tufB-promotor, recA-promotor ali pL-promotor, in ga prednostno uporabimo kot ekspresij ski vektor, ki vključuje ekspresij sko enoto, operativno vezano na polinukleotid v smislu izuma.
Izraz kontrolni element, kot ga uporabljamo tukaj, se nanaša na funkcionalni promotor in nukleotidno sekvenco, ki ima kakršenkoli združen transkripcij ski element (npr. ojačevalec, zaporedje CCAAT, zaporedje TATA, mesto SPI).
-1010
Fraza operativno vezan, kot jo uporabljamo tukaj, se nanaša na tisti polinukleotid, ki je vezan s kontrolnimi elementi, kot sta npr. promotor in ojačevalec, ki kontrolirajo ekspresijo polinukleotida na tak način, da lahko kontrolni elementi delujejo tako, da izrazijo gen. Strokovnjakom je dobro znano, da se tipi kontrolnih elementov lahko spreminjajo odvisno od gostitelj ske celice.
Primeri za gostiteljske celice, v katere je uveden vektor, ki ima polinukleotid v smislu izuma, vključujejo bakterije, kvasovke, plesni, rastlinske celice in živalske celice. Posebno prednostna je Escherichia coli. Polinukleotid v smislu izuma lahko uvedemo v gostiteljsko celico z uporabo konvencionalnega postopka. Kadar uporabimo E. coli kot gostiteljsko celico, lahko polinukleotid v smislu izuma uvedemo z uporabo npr. postopka s kalcijevim kloridom.
Pri proizvodnji terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoata z asimetričnim reduciranjem terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoata z uporabo polipeptida v smislu izuma je potreben koencim, kot npr. NADPH in NADH. Uporabimo pa lahko encim, ki je sposoben transformiranja oksidiranega koencima v reducirani koencim (v nadaljevanju imenovano kot sposobnost obnovitve koencima) skupaj z ustreznim substratom, tj. koencimski obnovitveni sistem uporabimo v kombinaciji s polipeptidom v smislu izuma pri reakciji, in tako zmanjšamo količino dragega uporabljenega koencima. Primeri za encime, ki imajo sposobnost obnovitve koencima, vključujejo hidrogenazo, formiat-dehidrogenazo, alkohol-dehidrogenazo, aldehid-dehidrogenazo, glukoza-6-fosfat-dehidrogenazo in glukoza-dehidrogenazo. Prednostno uporabimo glukoza-dehidrogenazo. Tako reakcijo lahko izvedemo z dodajanjem koencimskega obnovitvenega sistema v asimetrični reakcijski sistem. Kadar uporabimo kot katalizator transformant, transformiran tako s polinukleotidom, ki kodira polipeptid, ki ima encimsko aktivnost, da asimetrično reducira terc. butil (S)6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoat, da proizvede terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5dihidroksiheksanoat, kot tudi s polinukleotidom, ki kodira polipeptid, ki ima aktivnost glukoza-dehidrogenaze, lahko reakcije učinkovito izvedemo brez priprave encima, ki ima koencimsko obnovitveno sposobnost, in dodajanjem encima v reakcijski sistem.
-1111
Tak transformant lahko dobimo z vgradnjo polinukleotida, ki kodira polipeptid, ki ima encimsko aktivnost, da asimetrično reducira terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3oksoheksanoat, da proizvede terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoat, in polinukleotida, ki kodira polipeptid, ki ima aktivnost glukoza-dehidrogenaze, v isti vektor in uvedbo vektorja v gostiteljsko celico. Alternativno lahko transformant dobimo z vgradnjo teh dveh polinukleotidov v dva vektorja, izvedena iz nezdružljivih skupin, in uvajanjem teh polinukleotidov v isto gostiteljsko celico.
Glukoza-dehidrogenazno aktivnost transformanta lahko ugotovimo z merjenjem povečanja absorpcije pri valovni dolžini 340 nm pri 25 °C, pri čemer dodamo 0,1 M glukozo kot substrat, 2mM NADP kot koencim in encim v 1 M Tris HCI pufer (pH 8,0).
Proizvodnjo terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoata z uporabo transformanta v smislu izuma lahko izvedemo takole.
Najprej dodamo terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoat kot substrat, koencim, kot npr. NADP, in kulturo transformanta ali njegovega procesiranega produkta v ustrezno topilo, nato pa naravnamo pH. Dobljeno zmes mešamo, da reagira. Reakcijo izvajamo pri temperaturi od 10 °C do 70 °C, medtem ko vzdržujemo pH reakcije raztopine v območju od 4 do 10. Reakcijo izvajamo kot šaržni postopek ali kontinuimi postopek. V primeru šaržnega postopka dodamo substrat, ki mora reagirati, da pripravimo koncentracijo od 0,1 % do 70 % (mas./vol.). Procesirani produkt transformanta ipd., navedeno zgoraj, se nanaša na surovi ekstrakt, kultivirane mikroorganizme, liofilizirane organizme, organizme, posušene z acetonom, homogenate takih mikroorganizmov ipd. Take procesirane produkte ipd. lahko uporabimo v stanju, v katerem so imobilizirani, kot encime ali mikroorganizme, kakršni so, z znanimi sredstvi. Kadar reakcijo izvedemo z uporabo transformanta, ki proizvede polipeptid v smislu izuma, in glukoza-dehidrogenaze, dodatek glukoze v reakcijski sistem dopušča zmanjšanje količine koencimov v večjem obsegu.
-1212
Terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoat, proizveden z reakcijo, lahko očistimo s konvencionalnim postopkom. Terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5dihidroksiheksanoat izpostavimo npr. centrifugiranju, filtraciji in drugim postopkom, kot je treba za odstranitev suspendiranih snovi, kot so npr. mikroorganizmi. Dobljeni produkt izpostavimo ekstrakciji z organskim topilom, kot sta npr. etil acetat in toluen, in dehidraciji z dehidrantom, kot je npr. natrijev sulfat. Organsko topilo odstranimo z dekompresijo. Dobljeni produkt nato izpostavimo kristalizaciji, kromatografiji ipd., da ga očistimo.
Pri reakciji pripravimo terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoat kot substrat po postopku, opisanem v US-patentu št. 52,783,131, vključenim tukaj z referenco.
Kvantitativno določevanje terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoata in terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoata in meritev diastereomemega razmerja za terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoat lahko izvedemo s HPLC (visoko ločljivostna tekočinska kromatografija) (kolona: COSMOSIL 5CN-R (notr. pr. 4,6 x 250 mm), izdelovalec Nacalai Tesque Co., Ltd., eluant: 1 mM fosfatna raztopina/acetonitril = 5/1, hitrost pretoka: 0,7 ml/min, detekcija: 210 nm, temp. kolone: 30 °C).
Kot je opisano zgoraj, je v skladu s predloženim izumom možno učinkovito proizvesti polipeptid v smislu izuma. S takim polipeptidom lahko zagotovimo odličen postopek za proizvodnjo terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoata. V nadaljevanju je predloženi izum opisan z ilustrativnimi Primeri s sklicevanjem na priložene slike. Predloženi izum ni omejen s temi Primeri.
(Primeri)
Podrobnosti za postopke ravnanja, ki se nanašajo na rekombinantne DNA tehnike, uporabljene v spodnjih Primerih, so opisane v naslednjih tekstih:
-1313
Molecular Cloning 2. izdaja (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)
Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and WileyInterscience).
(Primer 1: Čiščenje polipeptida, ki ima asimetrično redukcijsko encimsko aktivnost)
Iz Candida magnoliae IFO 0705 očistimo samo polipeptid, ki ima encimsko aktivnost, da asimetrično reducira terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoat v terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoat, na naslednji način.
(Kultiviranje Candida magnoliae IFO 0705)
1 tekočega medija, ki ima spodaj navedeno sestavo, pripravimo v 30 1 fermentorski steklenici (izdelovalec Marubishi Bioeng Co., Ltd.) in steriliziramo s paro pri 120 °C 20 minut.
Sestava medija: vodovodna voda, glukoza 4,0 % , ekstrakt kvasovk 0,5 %, KH2PO4 0,1 %, (NH4)2HPO4 0,65 %, NaCI 0,1 %, MgSO4.7H2O 0,8 %, ZnSO4.7H2O 0,06 %, FeSO4.7H2O 0,09 %, CuSO4.5H2O 0,005 %, MnSO4.4-6H2O 0,01 % in Adecanol™ LG-109 (izdelovalec NOF Corporation) 0,02 % (pH 7,0).
Zgornji medij smo inokulirali s kulturo Candida magnoliae IFO 0705, ki smo jo predkultivirali v mediju, 180 ml/fermentor, in kultivirali pri 30 °C z mešanjem z 295 vrt./min s hitrostjo prezračevanja 5,0 Nl/min, medtem ko smo vzdrževali nižjo mejo pH pri 6,5 z dokapavanjem 30 % (mas./mas.) vodnega natrijevega hidroksida. 655 g 55 % (mas./mas.) vodne glukozne raztopine smo dodali 22 ur in 25 ur po začetku kultivacije. Kultivacijo smo izvajali 30 ur.
(Priprava ekstrakta brez celic)
-1414
Mikroorganizme smo zbrali iz 10 1 dobljene kulture s centrifugiranjem in nato sprali s fiziološko raztopino soli, pri čemer smo dobili 1350 g mokrih mikroorganizmov. Mokre mikroorganizme smo suspendirali v 2700 ml 100 mM fosfatnega pufra (pH 6,7) in dodali 2-merkaptoetanol in fenilmetilsulfonil fluorid do končnih koncentracij 5 mM oz. 0,1 mM. Mikroorganizme smo razbili z mlinom Dyno (izdelovalec Willy A. Bachofen Co., Ltd.) . Razbite mikroorganizme smo centrifugirali, da smo odstranili celične odpadke, pri čemer smo dobili 2880 ml ekstrakta brez celic.
(Frakcionacija z amonijevim sulfatom)
V ekstrakt brez celic smo dodali amonijev sulfat in ga raztopili v njem, tako da smo dobili 60 % nasičenje. Dobljene oborine smo odstranili s centrifugiranjem (v tem primeru smo pH ekstrakta brez celic vzdrževali pri 6,7 z amoniakalno vodo). V supernatant smo dodali še amonijev sulfat, da smo dobili 75 % nasičenje, medtem ko smo pH podobno vzdrževali 6,7. Dobljene oborine smo zbrali s centrifugiranjem. Oborine smo raztopili in dializirali preko noči v 10 mM fosfatnem pufru (pH 7,0), vsebujočem 2 mM 2-merkaptoetanol.
(Kromatografija na koloni DEAE-TOYOPEARL)
Surovo encimsko raztopino, ki smo jo dobili, kot je opisano zgoraj, smo dali v kolono DEAE-TOYOPEARL 650M (500 ml; izdelovalec Tosoh Corporation), ki je bila uravnotežena z 10 mM fosfatnim pufrom (pH 7,0), vsebujočim 2 mM 2merkpatoetanol, tako da so se polipeptidi z encimsko aktivnostjo adsorbirali v koloni. Kolono smo sprali z enakim pufrom. Aktivne frakcije smo eluirali z uporabo linearnega gradienta NaCI (od 0 M do 0,5 M). Aktivne frakcije smo zbrali in nato dializirali preko noči v 10 mM fosfatnem pufru (pH 7,0), vsebujočem 2 mM 2merkaptoetanol.
(Kromatografija na koloni Fenil Sepharose)
-1515
Amonijev sulfat smo raztopili v surovi encimski raztopini, dobljeni zgoraj, do končne koncentracije 1 M (medtem ko smo vzdrževali pH 7,0 z amoniakalno vodo) in nato dali v kolono Fenil Sepharoze CL-4B (140 ml, izdelovalec Pharmacia Biotech Co., Ltd.), ki je bila uravnotežena z 10 mM fosfatnim pufrom (pH 7,0), vsebujočim 2 mM 2-merkaptoetanol in 1 M amonijev sulfat, tako da so se polipeptidi z encimsko aktivnostjo adsorbirali v koloni. Kolono smo sprali z enakim pufrom. Aktivne frakcije smo eluirali z uporabo linearnega gradienta amonijevega sulfata (od 1 M do 0 M). Aktivne frakcije smo zbrali in nato dializirali preko noči v 10 mM fosfatnem pufru (pH 7,0) vsebujočem 2 mM 2-merkaptoetanol.
(Kromatografija na koloni Blue Sepharose)
Surovo encimsko raztopino, dobljeno kot je opisano zgoraj, smo dali v kolono Blue Sepharose CL-6B (40 ml, izdelovalec Pharmacia Biotech Co., Ltd.), ki je bila uravnotežena z 10 mM fosfatnim pufrom (pH 7,0), vsebujočim 2 mM 2merkaptoetanol, tako da so se polipeptidi z encimsko aktivnostjo adsorbirali v koloni. Kolono smo sprali z enakim pufrom. Aktivne frakcije smo eluirali z uporabo linearnega gradienta NaCI (od 0 M do 1 M). Aktivne frakcije smo sprali in nato dializirali preko noči v 10 mM fosfatnem pufru (pH 7,0), vsebujočim 2 mM 2merkaptoetanol.
( Kromatografija na koloni SuperQ-TOYOPEARL )
Surovo encimsko raztopino, dobljeno, kot je opisano zgoraj, smo dali v kolono SuperQ-TOYOPEARL 650S (12 ml, izdelovalec Tosoh Corporation), ki smo jo uravnotežili z 10 mM fosfatnim pufrom (pH 7,0), vsebujočim 2 mM 2merkaptoetanol, tako da so se polipeptidi z encimsko aktivnostjo adsorbirali v koloni. Kolono smo sprali z enakim pufrom. Aktivne frakcije smo eluirali z uporabo lienamega gradienta NaCI (od 0 M do 0,4 M). Aktivne frakcije smo zbrali in nato dializirali preko noči v 10 mM fosfatnem pufru (pH 7,0), vsebujočim 2 mM 2-1616 merkaptoetanol. Tako smo dobili čisti polipeptidni vzorec, ki je bil elektroforetsko ločen (zatem imenovan kot CR-encim).
(Primer 2: Kloniranje CR-encimskega gena) (Priprava sintetične oligonukleotidne sonde)
Očiščeni CR-encim, dobljen v Primeru 1, smo denaturirali v navzočnosti 8 M sečnine in nato razgradili z lizil-endopeptidazo, izvedeno iz Achromobacter (izdelovalec Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Aminokislinske sekvence dobljenih peptidnih fragmentov smo določili z uporabo ABI492 proteinskega sekvenatorja (izdelovalec Perkin Elmer Co., Ltd.). Na osnovi aminokislinskih sekvenc smo sintetizirali dva nukleotidna primerja (SEQ ID No. 3 in 4) s konvencionalnim postopkom.
(Pomnoževanje CR-encimskega gena s PCR)
Kromosomsko DNA smo ekstrahirali iz kultivirane Candida magnoliae IFO 0705 po Herefordovem postopku (Celi, 18, 1261 (1979)). Nato smo izvedli PCR z uporabo zgoraj pripravljenega nukleotidnega primerja in dobljene kromosomske DNA kot modela, da smo tako pomnožili nukleotidni fragment s pribl. 350 bp, za katerega smo domnevali, daje del CR-encimskega gena, (Priprava kromosomske DNA-knjižnice)
Kromosomsko DNA Candida magnoliae IFO 0705 smo popolnoma razgradili z restrikcij skim encimom Apal in razgrajene fragmente ločili z agarozno gelsko elektroforezo. Nato smo izvedli Southemov postopek (J. Mol. Biol., 98, 503 (1975)) z uporabo 350-bp DNA-fragmenta, ki smo ga dobili tako, kot je opisano zgoraj, za analizo dobljenih fragmentov kromosomov DNA (označevanje in detekcijo nukleotidne sonde smo izvedli z uporabo sistema Gene Images Labeling and Detection
-1717
System (izdelovalec Amersham Co., Ltd.)). Kot rezultat smo ugotovili, da je bil nukleotidni fragment s pribl. 5,5 kb hibridiziran z nukleotidno sondo.
Na osnovi tega dejstva smo, potem ko smo razgrajene fragmente ločili z agarozno gelsko elektroforezo, zbrali nukleotidne fragmente od 4,3 kb do 6,2 kb. Te nukleotidne fragmente smo uvedli na Apal mesto plazmidnega vektorja pBluescriptll KS(-) (izdelovalec STRATAGENE Co, Ltd.). Plazmid smo uvedli v E. coli JM109. Pripravili smo kromosomsko DNA-knjižnico tega seva.
(Selekcioniranje kromosomske DNA-knjižnice)
Tako dobljeni nukleotidni fragment smo uporabili kot sondo za selekcioniranje kromosomske DNA-knjižnice po postopku za hibridizacijo kolonije (označevanje in detekcijo nukleotidne sonde smo izvedli z uporabo sistema Gene Images Labeling and Detection System (izdelovalec Amersham Co, Ltd.) in eksperiment izvedli v skladu s postopki, opisanimi v navodilih za sistem). Kot rezultat smo dobili eno pozitivno kolonijo. Nato smo rekombinantne plazmide, dobljene iz pozitivne kolonije, v katero je bila vstavljena DNA s pribl. 5,5 kb, dvojno razgradili z EcoRI in SphL Razgrajene fragmente smo analizirali s Southemovim postopkom, kot je opisano zgoraj. Kot rezultat smo nukleotidne fragmente s približno 1,0 kb, proizvedene z razgradnjo z uporabo restrikcijskih encimov, hibridzirali s sondo. Na osnovi tega dejstva smo nukleotidni fragment s pribl. 1,0 kb vstavili v EcoRI-SphI-mesto plazmida pUC19 (izdelovalec Takara Shuzo Co, Ltd.) za konstruiranje rekombinantnega plazmida pUC-ES in izbrali kot kromosomski DNA-klon, ki vključuje CR-encimski gen.
(Določevanje bazne sekvence)
Zgornji rekombinantni plazmid pUC-ES smo razgradili z različnimi restrikcijskimi encimi in razgrajene fragmente, proizvedene med reakcijo, analizirali za pripravo restrikcijske mape. Nato smo različne DNA-fragmente, dobljene med analizo, vstavili v multiklonima mesta pUC19 za konstruiranje rekombinantnih plazmidov. Z uporabo
-1818 teh rekombinantnih plazmidov smo analizirali nukleotidne sekvence zadevnih vstavljenih fragmentov z uporabo kompleta ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (izdelovalec Perkin Elmer Co., Ltd.) in sekvenatorja ABI 373A DNA Sequencer (izdelovalec Perkin Elmer Co., Ltd.). Kot rezultat smo določili celotno bazno sekvenco DNA fragmenta s pribl. 1,0 kb, za katero smo pričakovali, da vključuje pričakovani encimski gen. Fig. 2 prikazuje tako določeno bazno sekvenco. Aminokislinska sekvenca, napovedana iz nukleotidne sekvence za strukturni genski del nukleotidne sekvence, je tudi prikazana, pri ustrezni nukleotidni sekvenci na Fig. 1. Aminokislinsko sekvenco smo primerjali z delno aminokislinsko sekvenco fragmenta, razgrajenega z lizil-endopeptidazo, očiščenega CR-encima. Kot rezultat smo ugotovili, da delna aminokislinska sekvenca očiščenega CR-encima popolnoma obstaja v aminokislinski sekvenci, napovedani iz nukleotidne sekvence, in se popolnoma ujema z njo (prikazano kot podčrtani del v aminokislinski sekvenci na Fig. 1). Zato smo za DNA-fragment domnevali, da vključuje CR-encimski gen.
(Primer 3: Priprava rekombinantnega plazmida, ki nosi CR-encimski gen)
Dvoverižno DNA, ki ima: Ndel mesto dodano začetnemu kodonskemu delu strukturnega gena CR encima; in nov terminacijski kodon (TAA) in EcoRI-mesto, dodano takoj za terminacijskim kodonom; in T substitucijo za G na šestem nukleotidu od 5' konca gena, zato da se uniči mesto Sall-gena brez aminokislinske kodirne modifikacije, smo dobili na naslednji način. N-terminalni nukleotidni primer z Ndelmestom, dodanim na začetnem kodonskem delu strukturnega gena CR-encima in T substitucijo za G na šestem nukleotidu od 5' konca gena, smo sintetizirali na osnovi nukleotidne sekvence, določene v Primeru 2. Nadalje smo C-terminalni nukleotidni primer, ki ima nov terminacijski kodon (TAA) in EcoRI-mesto, dodano takoj za terminacijskim kodonom strukturnega gena CR-encima, sintentizirali na osnovi nukleotidne sekvence, določene v Primeru 2. Nukleotidne sekvence teh dveh primerjev so prikazane s SEQ ID No. 5 in 6. Z uporabo obeh sintetičnih DNAprimerjev smo pomnožili dvoverižno DNA s PCR z uporabo plazmida pUC-ES, dobljenega v Primeru 2 kot modela. Dobljeni DNA-fragment smo razgradili z Ndel in
-1919
EcoRI in vstavili v mesti Ndel in EcoRI navzdol od lac-promotorja plazmida pUCNT (WO94/03613), da smo dobili rekombinantni plazmid pNTCR.
(Primer 4: Proizvodnja rekombinantnega plazmida, ki vključuje tako CR-encimski gen kot tudi gen glukoza-dehidrogenaze)
Dvoverižno DNA, ki ima: Shine-Dalgamo sekvenco (9 nukleotidov) E. coli, dodano 5 nukleotidov navzdol od iniciacijskega kodona gena glukoza-dehidrogenaze (zatem imenovano GDH), proizvedenega iz Bacillus megaterium IAM 1030; EcoRI-mesto dodano takoj pred tem; in Sall-mesto takoj za terminacijskim kodonom, smo dobili na naslednji način. Na osnovi informacije za nukleotidno sekvenco gena GDH, smo sintetizirali N-terminalni nukleotidni primer, ki ima Shine-Dalgamo sekvenco (9 nukleotidov) E. coli, dodano 5 nukleotidov navzdol od iniciacijskega kodona strukturnega gena GDH, in EcoRI-mesto, dodano takoj pred tem, in C-terminalni nukleotidni primer, ki ima Sall-mesto, dodano takoj za terminacijskim kodonom, po konvencionalnem postopku. Nukleotidne sekvence teh dveh primerjev so prikazane s SEQ ID No. 7 in 8. Z uporabo obeh sintetičnih DNA-primerjev smo sintetizirali dvoverižno DNA s PCR z uporabo plazmidov pGDK 1 (Eur. J. Biochem. 186, 389 (1989)) kot modela. Dobljeni DNA-fragment smo razgradili z EcoRI in Šali in vstavili v mesti EcoRI in Šali pNTCR, konstruiranega v Primeru 3 (obstoječega navzdol od CR-encimskega gena), da smo dobili rekombinantni plazmid pNTCRG. Postopek za proizvodnjo in struktura pNTCRG sta prikazana na Fig. 2.
(Primer 5: Priprava rekombinantne E. Coli)
E. coli HB101 (izdelovalec Takara Shuzo Co., Ltd.) smo transformirali z uporabo rekombinantnega plazmida pNTCR, dobljenega v Primeru 3, in rekombinantnega plazmida pNTCRG, dobljenega v Primeru 4, da smo dobili rekombinantno E. coli HB101 (pNTCR) oz. HB101 (pNTCRG). Tako dobljene transformante E. coli HB101 (pNTCR) in HB101 (pNTCRG) smo deponirali pri Ministry of International Trade and Industry, Agency of Industrial Science and Technology, National Institute of
-2020
Bioscience and Human Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japonska) pod posameznimi depozitnimi številkami FERM BP-6897 in FERM BP6898, 28. septembra 1999, v skladu s budimpeštansko pogodbo za mednarodno prepoznanje depozita mikroorganizmov za namene patentnih postopkov.
(Primer 6: Ekspresija CR-encima v rekombinatni E. coli)
Rekombinantno E. coli HB101 (pNTCR), dobljeno v Primeru 5, smo kultivirali v mediju 2xYT, vsebujočem 120 pg/ml ampicilina, zbrali, suspendirali v 100 mM fosfatnem pufru (pH 6,5) in izpostavili obdelavi z ultrazvokom, da smo dobili ekstrakt brez celic. CR-encimsko aktivnost ekstrakta brez celic smo izmerili na naslednji način. 5 mM terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoat kot substrat, 0,333 mM NADPH kot koencim in encim smo dodali v 100 mM fosfatni pufer (pH 6,5) in izmerili zmanjšanje absorpcije pri valovni dolžini 340 nm pri 30 °C. Pri teh reakcijskih razmerah smo definirali oksidacijo 1 pmol NADPH v NADP v eni minuti kot enoto encimske aktivnosti. Tako izmerjeno CR-encimsko aktivnost v ekstraktu brez celic smo predstavili kot specifično aktivnost in jo primerjali s tisto za transformant, ki nosi samo vektorski plazmid. Primerjali smo tudi CR-encimsko aktivnost v ekstraktu Candida magnoliae IFO 0705 brez celic, pripravljenem v bistvu na enak način, kot je opisano v Primeru 1. Rezultati so prikazani v tabeli 1 spodaj.
Tabela 1. Ekspresija CR-encima v rekombinantni E. coli
Mikroorganizem CR-encimska specifična aktivnost (E/mg)
HB101 (pUCNT) 0,12
HB101 (pNTCR) 3,76
Candida magnoliae IFO 0705 0,11
Iz tabele 1 je razvidno razločno povečanje CR-encimske aktivnosti za E. coli HB101 (pNTCR) v primerjavi z E. coli HB101 (pUCNT), ki je bila transformirana le z
-2121 uporabo vektorskega plazmida, in je razvidna aktivnost približno 34-krat večja od Candida magnoliae IFO 0705.
(Primer 7: Simultana ekspresija CR-encima in GDH v rekombinantni E. coli)
GDH-aktivnost ekstrakta brez celic, dobljenega s procesiranjem rekombinantne E. coli HB101 (pNTCRG), dobljene v Primeru 5 na način, kot je opisan v Primeru 6, smo izmerili takole. 0,1 m glukozo kot substrat, 2 mM NADP kot koencim in encim smo dodali v 1 M Tris HC1 pufer (pH 8,0) in izmerili povečanje absorpcije pri valovni dolžini 340 nm pri 25 °C. Pri teh reakcijskih pogojih je bila redukcija enega 1 pmol NADP v NADPH v eni minuti definirana kot enota encimske aktivnosti. Izmerili smo tudi CR-encimsko aktivnost kot v Primeru 5. Tako izmerjena CR-encimska aktivnost in GDH-encimska aktivnost v ekstraktu brez celic sta prikazani kot specifični aktivnosti in primerjani s tistima za E. coli HB101 (pNTCR) in transformant HB101 (pUCNT) samo z uporabo vektorja. Rezultati so prikazani v tabeli 2 spodaj.
Tabela 2. Simultana ekspresija CR-encima in GDH v rekombinantni E. Coli
Mikroorganizem CR-encimska specifična aktivnost (E/mg) GDH-specifična aktivnost (E/mg)
HB101 (pUCNT) 0,12 <0,01
HB101 (pNTCR) 3,76 <0,01
HB101 (pNTCRG) 2,16 87,8
Iz tabele 2 je razvidno razločno povečanje CR-encimske aktivnosti in GDH-aktivnosti za E. coli HB101 (pNTCRG) v primerjavi z E. coli HB101 (pUCNT), ki je bila transformirana samo z uporabo vektorskega plazmida.
(Primer 8: Sinteza terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoata iz terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoata z uporabo rekombinantni E. coli, v katero je uveden CR-encimski gen)
-2222
Rekombinantno E. coli HB101 (pNTCR), dobljeno v Primeru 5, smo inokulirali v 50 ml 2xYT medija (Bacto tripton 1,6 % (mas./vol.), ekstrakt kvasovk Bacto 1,0 % (mas./vol.), NaCI 0,5 % (mas./vol.), pH 7,0), sterilizirali v 500 ml bučki Sakaguchi in kultivirali s stresanjem pri 37 °C 16 ur. 680 enot GDH (izdelovalec Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), 5,0 g flukoze, 3,0 mg NADP in 4,5 g terc. butil (S)-6kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoata smo dodali v 25 ml nastale kulture. Kulturo smo mešali pri 30 °C 40 ur, medtem ko smo naravnali pH na 6,5 s 5 M vodno raztopino natrijevega hidroksida. Po reakciji smo reakcijsko raztopino izpostavili ekstrakciji z etil acetatom in ekstrakt po odstranitvi topila analizirali. Kot rezultat smo ugotovili, da je bil terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoat proizveden z dobitkom 96,9 %. Razmerje diastereomemega prebitka za terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5dihidroksiheksanoat je bilo 98,2 % de.
Kvantitativno določevanje tec.butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoata in terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoata in meritev diastereomemega razmerja za terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoata smo izvedli s HPLC (kolona:COSMOSIL 5CN-R (notr.pr. 4,6 x 250 mm) izdelovalec Nacalai Tesque Co., Ltd., eluant: 1 mM fosfatna raztopina/acetonitril = 5/1, hitrost pretoka: 0,7 ml/min, detekcija: 210 nm, temp.kolone: 30 °C ).
(Primer 9: Sinteza terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoata iz terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoata z uporabo rekombinantne E. coli s CRencimom in GDH, izraženima istočasno.)
Rekombinantno E. coli HB101 (pNTCRG), dobljeno v Primeru 4, smo inokulirali v 100 ml 2xYT medija (Bacto tripton 1,6 % (mas./vol.), ekstrakt kvasovk Bacto 1,0 % (mas./vol.), NaCI 0,5 % (mas./vol.), pH 7,0), sterilizirali v 500 ml bučki Sakaguchi in kultivirali s stresanjem pri 37 °C 16 ur. 5,0 g glukoze, 1,5 mg NADP in 5,0 g terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoata smo dodali v 25 ml nastale kulture. Kulturo smo mešali pri 30 °C 24 ur, medtem ko smo naravnali pH na 6,5 s 5 M vodno
-2323 raztopino natrijevega hidroksida. Po reakciji smo reakcijsko raztopino izpostavili ekstrakciji z etil acetatom in ekstrakt po odstranitvi topila analizirali. Kot rezultat smo ugotovili, da je bil terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoat proizveden z dobitkom 97,2 %. Razmerje diastereomemega prebitka za terc. butil (3R,5S)-6-kloro3,5-dihidroksiheksanoat je bilo 98,5 % de.
-2424
INDUSTRIJSKA UPORABLJIVOST
Možno je klonirati gene polipetidov, ki imajo encimsko aktivnost, da asimetrično reducirajo terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoat v terc. butil (3R,5S)-6kloro-3,5-dihidroksiheksanoat, in dobiti transformante, ki imajo visok nivo sposobnosti, da proizvedejo polipeptide, z analiziranjem nukleotidnih sekvenc genov. Nadalje je možno, da dobimo transformante, sposobne, da proizvedejo polipeptide in glukoza-dehidrogenazo istočasno v velikem obsegu. Nadalje je možno sintetizirati terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoat iz terc. butil (S)-6-kloro-5hidroksi-3-oksoheksanoata z uporabo transformantov.
-2525 sekvemCna lista <110> KANEKA Corporation <120> Novi karbonil-redukcijski encim, gen, ki kodira zato in uporaba le-teh <130> TKS-4025 <140> japonska patentna prijava <160> 8 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <2U> 241 <212> PRT <213> Candida magnoliae IFO 0705 <400> 1
Met Ser Thr Pro Leu Asn Ala Leu Val Thr Gly Ala Ser Arg Gly Ile
1 5 10 15
Gly Ala Ala Thr Ala Ile Lys Leu Ala Glu Asn Gly Tyr Ser Val Thr
20 25 30
Leu Ala Ala Arg Asn Val Ala Lys Leu Asn Glu Val Lys Glu Lys Leu
35 40 45
Pro Val Val tys Asp Gly Gin Lys His His Ile Trp Glu Leu Asp Leu
50 55 60
Ala Ser Val Glu Ala Ala Ser Ser Phe Lys GIy Ala Pro Leu Pro Ala
65 70 75 80
Ser Asp Tyr Asp Leu Phe Val Ser Asn Ala Gly Ile Ala Gin Phe Thr
85 90 95
Pro Thr Ala Asp Gin Thr Asp Lys Asp Phe Leu Asn Ile Leu Thr Val
-2626
100 105 110
As n Leu Ser Ser Pro Ile Ala Leu Thr Lys Ala Leu Leu Lys Gly Val
115 120 125
Ser Glu Arg Ser As n Glu Lys Pro Phe His Ile Ile Phe Leu Ser Ser
130 135 140
Ala Ala Ala Leu His Gly Val Pro Gin Thr Ala Val Tyr Ser Ala Ser
145 150 155 160
Lys Ala Gly Leu Asp Gly Phe Val Arg Ser Leu Ala. Arg Glu Val GIy
165 170 175
Pro Lys GIy Ile His Val Asu Val Ile His Pro Gly Trp Thr Lys Thr
180 185 190
Asp Met Thr Asp Gly Ile Asp Asp Pro As n Asp Thr Pro Ile Lys Gly
195 200 205
Trp Ile Gin Pro Glu Ala Ile Ala Asp Ala Val Val Phe Leu Ala Lys
210 215 220
Ser 'Lys As n Ile Thr Gly Thr As n Ile Val Yal Asp Asn Gly Leu Leu
225 230 235 240
Ala <210> 2 <211> 726 <212> DNA <213> Candida magnoliae 1F0 0705 <400> 2 atgtcgactc cgttgaatgc tctcgtaact ggcgctagcc gcggcattgg cgctgctact 60 gccattaagc tcgccgagaa tggatacagt gtgacgctgg ctgcgcgtaa tgtcgcgaag 120 ctgaacgaag tgaaggagaa gctgcctgtg gtcaaggacg gccagaagca ccacatctgg 180
-2727 gagctcgatc ttgcgagcgt tgaggctgca tcgtccttca agggcgcgcc tttaccggct 240 agcgactacg atctgttcgt ttcgaatgct ggcattgcgc agttcacgcc aacggcggac 300 caaaccgaca aggacttcct gaacattctc accgtgaacc tctcctcccc cattgcgctc 360 acgaaggccc tactgaaggg cgtctccgag aggtcgaacg agaagccgtt ccatattatc 420 ttcctctcgt ccgctgcagc cctgcacgga gtccctcaga ctgcagtcta cagtgcttcg 480 aaggcggggc ttgacggttt cgtgcgctct cttgctcgcg aggtgggtcc gaagggcatt 540 catgtgaacg ttattcatcc tggttggacg aagactgaca tgacggatgg tattgacgac 600 cccaatgata ctcctatcaa gggctggatc cagcctgagg cgattgctga tgcggttgtg 660 ttcctggcaa agtcgaagaa catcacaggc actaatatcg tggtggacaa tggcttgctc 720 gcttga 726 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> umetna sekvenca <223> opis umetne sekvence: primerska sekvenca <400> 3 atngcytcrg gytgdatcca 20 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> umetna sekvenca <223> opis umetne sekvence: primerska sekvenca <400> 4 gcgcatatgt ctactccgtt gaatgctctc gta . 33 <210> 5 <211> 33
-2828 <212> DNA <213> umetna sekvenca <223> opis umetne sekvence: primerska .sekvenca <400> 5 ggcgaattct tatcaagcga gcaagccatt gtc 3;
<210> 6 <21l> 20 <212> DNA <213> umetna sekvenca <223> opis umetne sekvence: primerska sekvenca <400> 6 acngcngayc aracygayaa 2fl <2I0> 7 <211> 43 <212> DNA <213> umetna sekvenca <223> opis umetne sekvence: primerska sekvenca <400> 7 gccgaattct aaggaggtta acaatgtata aagatttaga agg 43
-2929 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> .umetna sekvenca <223> opis umetne sekvence: primerska sekvenca <400> 8 gcggtcgact tatccgcgtc ctgcttgg 28
Za
KANEKA CORPORATION:
ΡΙΜΑ, D.O.O.

Claims (16)

  1. PATENTNI ZAHTEVKI
    1. Polipeptid, označen s tem, da ima encimsko aktivnost, da asimetrično reducira terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoat v terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5dihidroksiheksanoat, pri čemer obsega aminokislinsko sekvenco, prikazano s SEQ ID No. 1 na sekvenčni listi, ali aminokislinsko sekvenco, ki ima vsaj eno aminokislinsko substitucijo, insercijo, delecijo ali adicijo le-te.
  2. 2. Polipeptid po zahtevku 1, označen s tem, daje peptid izveden iz mikroorganizma, ki spada v rod Candida.
  3. 3. Polipeptid po zahtevku 2, označen s tem, daje mikroorganizem Candida magnoliae IFO 0705.
  4. 4. Polinukleotid, označen s tem, da kodira polipeptid po kateremkoli zahtevku od 1 do 3.
  5. 5. Polinukleotid, ki kodira polipeptid, ki ima encimsko aktivnost, da asimetrično reducira terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3-oksoheksanoat v terc. butil (3R,5S)-6kloro-3,5-dihidroksiheksanoat, označen s tem, da je hibridiziran z nukleotidno sekvenco, prikazano s SEQ ID No. 2 na sekvenčni listi, pri ostrih pogojih.
  6. 6. Ekspresijski vektor, označen s tem, da vključuje polinukleotid po zahtevku 4 ali 5.
  7. 7. Ekspresijski vektor po zahtevku 6, označen s tem, da ekspresijski vektor pomeni plazmid pNTCR.
  8. 8. Ekspresijski vektor po zahtevku 6, označen s tem, da nadalje vključuje polinukleotid, ki kodira polipeptid z aktivnostjo glukoza-dehidrogenaze.
    -3131
  9. 9. Ekspresijski vektor po zahtevku 8, označen s tem, da polipeptid, ki ima aktivnost glukoza-dehidrogenaze pomeni glukoza-dehidrogenazo, izvedeno iz Bacillus megaterium.
  10. 10. Ekspresijski vektor po zahtevku 9, označen s tem, da ekspresijski vektor pomeni plazmid pNTCRG.
  11. 11. Transformant, označen s tem, daje dobljen s transformiranjem gostiteljske celice z uporabo ekspresijskega vektorja po kateremkoli zahtevku od 6 do 10.
  12. 12. Transformant po zahtevku 11, označen s tem, daje gostiteljska celica Escherichia coli.
  13. 13. Transformant po zahtevku 12, označen s tem, da transformant pomeni E. coli HB101 (pNTCR).
  14. 14. Transformant po zahtevku 12, označen s tem, da transformant pomeni E. coli HB101 (pNTCRG).
  15. 15. Postopek za proizvodnjo terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5-dihidroksiheksanoata, označen s tem, da obsega stopnji: reakcijo transformanta po kateremkoli zahtevku od 11 do 14 ali njegovega procesiranega produkta s terc. butil (S)-6-kloro-5-hidroksi-3oksoheksanoatom in zbiranje proizvedenega terc. butil (3R,5S)-6-kloro-3,5dihidroksiheksanoata.
  16. 16. Postopek po zahtevku 15, označen s tem, da stopnjo reakcije izvedemo v navzočnosti koencimskega obnovitvenega sistema.
SI200020017A 1999-12-03 2000-11-24 Nova karbonil-reduktaza, gen le-te in postopek za uporabo le-teh SI20642A (sl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP34554199 1999-12-03
PCT/JP2000/008321 WO2001040450A1 (en) 1999-12-03 2000-11-24 Novel carbonyl reductase, gene thereof and method of using the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SI20642A true SI20642A (sl) 2002-02-28

Family

ID=18377296

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SI200020017A SI20642A (sl) 1999-12-03 2000-11-24 Nova karbonil-reduktaza, gen le-te in postopek za uporabo le-teh

Country Status (15)

Country Link
US (1) US6645746B1 (sl)
EP (1) EP1152054B1 (sl)
JP (1) JP4510351B2 (sl)
KR (1) KR100512080B1 (sl)
AT (1) ATE291616T1 (sl)
AU (1) AU1551701A (sl)
CA (1) CA2360376C (sl)
CZ (1) CZ20012792A3 (sl)
DE (1) DE60018909T2 (sl)
ES (1) ES2240205T3 (sl)
HU (1) HUP0105331A3 (sl)
MX (1) MXPA01007858A (sl)
NO (1) NO20013801L (sl)
SI (1) SI20642A (sl)
WO (1) WO2001040450A1 (sl)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2493941A1 (en) * 2002-08-09 2004-02-19 Codexis, Inc. Enzymatic processes for the production of 4-substituted 3-hydroxybutyric acid derivatives
EP1568679A4 (en) * 2002-12-06 2012-08-29 Kaneka Corp PROCESS FOR PRODUCING OPTICALLY ACTIVE ESTER 3-HYDROXYPROPIONIC DERIVATIVE
MXPA06001718A (es) 2003-08-11 2006-05-19 Codexis Inc Procedimiento enzimatico para la produccion de derivados de acido 3-hidroxibutirico 4-sustituido y esteres de acido carboxilico sustituido con ciano e hidroxi vecinales.
CA2535255A1 (en) * 2003-08-11 2005-02-24 Codexis, Inc. Improved halohydrin dehalogenases and related polynucleotides
CA2533838A1 (en) * 2003-08-11 2005-02-24 Codexis, Inc. Improved ketoreductase polypeptides and related polynucleotides
US7588928B2 (en) * 2003-08-11 2009-09-15 Codexis, Inc. Halohydrin dehalogenases and related polynucleotides
US7541171B2 (en) * 2003-08-11 2009-06-02 Codexis, Inc. Halohydrin dehalogenases and related polynucleotides
KR20060064620A (ko) * 2003-08-11 2006-06-13 코덱시스, 인코포레이티드 개선된 글루코스 데히드로게나제 폴리펩티드 및 관련폴리뉴클레오티드
DE10345772A1 (de) * 2003-10-01 2005-04-21 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von 3-Methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol
EP1811021A4 (en) * 2004-10-27 2008-05-28 Kaneka Corp NEW CARBONYL REDUCTASE, GENE FOR IT AND USE THEREOF
DE102005044736A1 (de) 2005-09-19 2007-03-22 Basf Ag Neue Dehydrogenasen, deren Derivate und ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Alkanolen
AT503017B1 (de) * 2005-12-19 2007-07-15 Iep Gmbh Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von hydroxyketoverbindungen
ATE529507T1 (de) 2006-03-31 2011-11-15 Kaneka Corp Verfahren zur produktion von erythro- oder threo- 2-amino-3-hydroxypropionsäureester, neuartige carbonylreduktase, gen für die reduktase, vektor, transformante und verfahren zur produktion von optisch aktivem alkohol unter verwendung dieser
WO2008042876A2 (en) 2006-10-02 2008-04-10 Codexis, Inc. Compositions and methods for producing stereoisomerically pure statins and synthetic intermediates therefor
AT504542B1 (de) * 2006-12-07 2008-09-15 Iep Gmbh Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von secodionderivaten
JP2010517574A (ja) 2007-02-08 2010-05-27 コデクシス， インコーポレイテッド ケトレダクターゼおよびその使用
EP2195443B1 (en) 2007-08-24 2015-01-07 Codexis, Inc. Improved ketoreductase polypeptides for the stereoselective production of (r)-3-hydroxythiolane
US8748143B2 (en) 2007-09-13 2014-06-10 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the reduction of acetophenones
TWI601825B (zh) * 2007-09-27 2017-10-11 Ｉｅｐ有限公司 對映異構選擇性酶催化還原中間產物之方法
ATE547513T1 (de) * 2007-09-28 2012-03-15 Codexis Inc Ketoreduktase-polypeptide und verwendungen davon
ES2547528T3 (es) 2007-10-01 2015-10-07 Codexis, Inc. Polipéptidos de cetorreductasa para la producción de acetidinona
ES2560459T3 (es) 2008-08-27 2016-02-19 Codexis, Inc. Polipéptidos cetorreductasa para la producción de una 3-aril-3-hidroxipropanamina a partir de una 3-aril-3-cetopropanamina
US8288131B2 (en) * 2008-08-27 2012-10-16 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides and uses thereof
WO2010025287A2 (en) 2008-08-27 2010-03-04 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the production of 3-aryl-3-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-ketopropanamine
EP2329014B1 (en) 2008-08-29 2014-10-22 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the stereoselective production of (4s)-3[(5s)-5(4-fluorophenyl)-5-hydroxypentanoyl]-4-phenyl-1,3-oxazolidin-2-one
US8187856B2 (en) * 2008-12-18 2012-05-29 Codexis, Inc. Recombinant halohydrin dehalogenase polypeptides
EP2226386A1 (de) 2009-03-05 2010-09-08 IEP GmbH Verfahren zur stereoselektiven enzymatischen Reduktion von Ketoverbindungen
US8501436B2 (en) * 2009-06-22 2013-08-06 Sk Biopharmaceuticals Co. Ltd. Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester
HUE055413T2 (hu) 2009-06-22 2021-11-29 Codexis Inc Ketoreduktáz-közvetített sztereoszelektív útvonal alfa-klóralkoholokhoz
SG178456A1 (en) 2009-08-19 2012-04-27 Codexis Inc Ketoreductase polypeptides for the preparation of phenylephrine
US8404461B2 (en) * 2009-10-15 2013-03-26 SK Biopharmaceutical Co. Ltd. Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester
WO2011100265A2 (en) 2010-02-10 2011-08-18 Codexis, Inc. Processes using amino acid dehydrogenases and ketoreductase-based cofactor regenerating system
WO2011140219A1 (en) 2010-05-04 2011-11-10 Codexis, Inc. Biocatalysts for ezetimibe synthesis
JP5941410B2 (ja) 2010-11-09 2016-06-29 株式会社カネカ ハロゲン化インデノン類及びそれを用いた光学活性インダノン類又は光学活性インダノール類の製造方法
CN102676596A (zh) * 2011-03-16 2012-09-19 苏州国镝医药科技有限公司 生物酶手性合成立普妥中间体ats-7
CN106479990B (zh) 2011-11-18 2020-09-18 科德克希思公司 用于制备羟基取代的氨基甲酸酯的生物催化剂
ES2746698T3 (es) 2012-02-07 2020-03-06 Annikki Gmbh Procedimiento para la preparación de derivados de furano a partir de glucosa
TW201343623A (zh) 2012-02-07 2013-11-01 Annikki Gmbh 使氧化還原輔因子經酶催化再生之方法
WO2013117251A1 (de) 2012-02-07 2013-08-15 Annikki Gmbh Verfahren zur enzymatischen regenerierung von redoxkofaktoren
DE102012017026A1 (de) 2012-08-28 2014-03-06 Forschungszentrum Jülich GmbH Sensor für NADP(H) und Entwicklung von Alkoholdehydrogenasen
KR101446551B1 (ko) 2013-02-26 2014-10-06 주식회사 아미노로직스 (2rs)-아미노-(3s)-히드록시-부티르산 또는 이의 유도체의 제조방법
WO2014154676A1 (de) 2013-03-27 2014-10-02 Annikki Gmbh Verfahren zur isomerisierung von glucose
US10093905B2 (en) 2014-04-22 2018-10-09 C-Lecta Gmbh Ketoreductases
CN104328148A (zh) * 2014-11-04 2015-02-04 尚科生物医药（上海）有限公司 酶法制备(3r,5s)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯
WO2016130412A1 (en) 2015-02-10 2016-08-18 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the synthesis of chiral compounds
CN104830921B (zh) * 2015-04-27 2019-07-02 上海工业生物技术研发中心 一种酶法制备他汀类化合物中间体的方法
CN105087685A (zh) * 2015-09-16 2015-11-25 连云港宏业化工有限公司 一种合成（3r，5s）-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法
CN105087684A (zh) * 2015-09-16 2015-11-25 连云港宏业化工有限公司 一种（3r，5s）-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的制备方法
CN106011092A (zh) * 2016-06-20 2016-10-12 苏州汉酶生物技术有限公司 一种工程化酮还原酶多肽及其用于制备孟鲁斯特中间体的方法
CN106011095B (zh) * 2016-07-27 2021-02-26 苏州汉酶生物技术有限公司 工程化酮还原酶多肽及使用其制备依替米贝中间体的方法
WO2018200214A2 (en) 2017-04-27 2018-11-01 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides and polynucleotides
WO2019012095A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 C-Lecta Gmbh TCO-reductase
CN108441523A (zh) * 2018-03-22 2018-08-24 南京工业大学 （3r,5s）-6-氯-3,5,-二羟基己酸叔丁酯的制备方法
CN110387359B (zh) * 2018-04-17 2021-04-20 湖州颐盛生物科技有限公司 羰基还原酶突变体及其应用
EP3587393B1 (en) 2018-06-21 2024-01-17 F.I.S.- Fabbrica Italiana Sintetici S.p.A. Enzymatic process for the preparation of droxidopa
IL307250A (en) 2021-04-02 2023-11-01 Hoffmann La Roche Processes for preparing bicyclic ketone compounds
CN114875081A (zh) * 2022-06-07 2022-08-09 湖北迅达药业股份有限公司 一种瑞舒伐他汀关键中间体的绿色工业化生产方法
EP4649143A1 (en) 2023-01-12 2025-11-19 Novartis AG Engineered ketoreductase polypeptides

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5278313A (en) 1992-03-27 1994-01-11 E. R. Squibb & Sons, Inc. Process for the preparation of 1,3-dioxane derivatives useful in the preparation of HMG-COA reductase inhibitors
GB9512837D0 (en) 1995-06-23 1995-08-23 Zeneca Ltd reduction of ketone groups
WO1999057109A1 (en) * 1998-04-30 1999-11-11 Kaneka Corporation Process for producing 6-cyanomethyl-1,3-dioxane-4-acetic acid derivatives
DK1619191T3 (da) * 1998-08-05 2011-01-31 Kaneka Corp Fremgangsmåde til fremstilling af optisk aktive 2-[6-hydroxymethyl)-1,3-dioxan-4-yl]-eddikesyre-derivater
DE19857302C2 (de) * 1998-12-14 2000-10-26 Forschungszentrum Juelich Gmbh Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von 3,5-Dioxocarbonsäuren, deren Salze und Ester
WO2001004336A1 (de) * 1999-07-09 2001-01-18 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur reduktion von keto-carbonsäuren und deren estern

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0105331A2 (hu) 2002-05-29
EP1152054B1 (en) 2005-03-23
KR100512080B1 (ko) 2005-09-02
WO2001040450A1 (en) 2001-06-07
CA2360376A1 (en) 2001-06-07
DE60018909T2 (de) 2006-03-30
NO20013801D0 (no) 2001-08-02
HUP0105331A3 (en) 2005-10-28
ATE291616T1 (de) 2005-04-15
ES2240205T3 (es) 2005-10-16
JP4510351B2 (ja) 2010-07-21
EP1152054A4 (en) 2002-11-20
US6645746B1 (en) 2003-11-11
NO20013801L (no) 2001-10-03
MXPA01007858A (es) 2003-07-14
KR20020008116A (ko) 2002-01-29
CZ20012792A3 (cs) 2002-03-13
EP1152054A1 (en) 2001-11-07
AU1551701A (en) 2001-06-12
DE60018909D1 (de) 2005-04-28
CA2360376C (en) 2005-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SI20642A (sl) Nova karbonil-reduktaza, gen le-te in postopek za uporabo le-teh
KR100506134B1 (ko) 신규한 카르보닐 환원효소 및 이것을 코딩하는 유전자 및 이러한 환원효소 및 유전자 이용방법
JPWO2001040450A1 (ja) 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法
JP5261172B2 (ja) エリスロ又はスレオ−２−アミノ−３−ヒドロキシプロピオン酸エステルの製造方法、新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、ベクター、形質転換体、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法
JP5516664B2 (ja) Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ遺伝子
JP5761641B2 (ja) （ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法
JP3941998B2 (ja) コエンザイムｑ１０の製造法
JP2003502021A (ja) アスペルギルス起源のエポキシドヒドロラーゼ
JP4880859B2 (ja) 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法
EP2128258B1 (en) Novel amidase, gene for the same, vector, transformant, and method for production of optically active carboxylic acid amide and optically active carboxylic acid by using any one of those items
JP5119783B2 (ja) Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−β−アミノ酸アシラーゼ遺伝子
JPWO2002010399A1 (ja) 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法
EP1408107B1 (en) Chlorohydrin and hydroxycarboxylic ester asymmetric hydrolase gene
JP6088973B2 (ja) 新規アミダーゼ
JP2006115729A (ja) 光学活性β−ヒドロキシアミノ酸の晶析方法
JP3012908B2 (ja) ジヒドロ葉酸還元酵素―抗アレルギー性ペンタペプチド多量体の融合タンパク質（▲ｉ▼）
JP2002320491A (ja) 新規なｄ−アミノアシラーゼをコードするｄｎａおよびそれを用いたｄ−アミノ酸の製造方法
JPWO2006043555A1 (ja) 生体高分子生成のための還元酵素変異体
MXPA99007259A (en) Novel carbonyl reductase, gene that encodes the same, and method of utilizing these

Legal Events

Date Code Title Description
IF Valid on the event date
KO00 Lapse of patent

Effective date: 20060731