JP2002320491A - 新規なｄ−アミノアシラーゼをコードするｄｎａおよびそれを用いたｄ−アミノ酸の製造方法 - Google Patents
新規なｄ−アミノアシラーゼをコードするｄｎａおよびそれを用いたｄ−アミノ酸の製造方法Info
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- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 産業上実用的な基質濃度で充分な高活性を示
し、Ｎ−アシル−ＤＬ−アミノ酸よりＤ−アミノ酸を効
率よく生成する事が出来る新規なＤ−アミノアシラーゼ
及びそれをコードするＤＮＡ、並びに該ＤＮＡを含む形
質転換体を用いたＮ−アシルアミノ酸から対応するＤ−
アミノ酸を製造する方法を提供すること。 【解決手段】 Methylobacterium mesophilicum ＭＴ
１０８９４などから新規Ｄ−アミノアシラーゼをコード
するＤＮＡをクローニングし、該酵素活性を発現させ、
Ｎ−アシルアミノ酸を基質として対応するＤ−アミノ酸
の製造に供する。
し、Ｎ−アシル−ＤＬ−アミノ酸よりＤ−アミノ酸を効
率よく生成する事が出来る新規なＤ−アミノアシラーゼ
及びそれをコードするＤＮＡ、並びに該ＤＮＡを含む形
質転換体を用いたＮ−アシルアミノ酸から対応するＤ−
アミノ酸を製造する方法を提供すること。 【解決手段】 Methylobacterium mesophilicum ＭＴ
１０８９４などから新規Ｄ−アミノアシラーゼをコード
するＤＮＡをクローニングし、該酵素活性を発現させ、
Ｎ−アシルアミノ酸を基質として対応するＤ−アミノ酸
の製造に供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、産業上実用的な基
質濃度で高活性を示し、特にＮ−アセチル−ＤＬ−トリ
プトファンよりＤ−トリプトファンを立体選択的に効率
よく生成する事を可能とするな新規なＤ−アミノアシラ
ーゼ及びそれを用いたＮ−アシルアミノ酸からＤ−アミ
ノ酸を製造する方法に関する。さらに本発明は、このＤ
−アミノアシラーゼをコードする塩基配列、それを含有
するプラスミド及びこのプラスミドにより形質転換され
た形質転換体に関する。さらに本発明は、この形質転換
体を用いたＤ−アミノアシラーゼの生産方法に関する。
また、本発明は、この形質転換体、その培養液及びこれ
らの処理物の形でＤ−アミノアシラーゼをＮ−アシルア
ミノ酸に作用させてＮ−アシルアミノ酸から対応する光
学活性Ｄ−アミノ酸を製造する方法に関する。
質濃度で高活性を示し、特にＮ−アセチル−ＤＬ−トリ
プトファンよりＤ−トリプトファンを立体選択的に効率
よく生成する事を可能とするな新規なＤ−アミノアシラ
ーゼ及びそれを用いたＮ−アシルアミノ酸からＤ−アミ
ノ酸を製造する方法に関する。さらに本発明は、このＤ
−アミノアシラーゼをコードする塩基配列、それを含有
するプラスミド及びこのプラスミドにより形質転換され
た形質転換体に関する。さらに本発明は、この形質転換
体を用いたＤ−アミノアシラーゼの生産方法に関する。
また、本発明は、この形質転換体、その培養液及びこれ
らの処理物の形でＤ−アミノアシラーゼをＮ−アシルア
ミノ酸に作用させてＮ−アシルアミノ酸から対応する光
学活性Ｄ−アミノ酸を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｄ−アミノ酸は様々な農薬、抗生物質、
医薬品の中間体として重要な化合物であり、その合成法
が盛んに研究されている。現在、ＤＬ−アミノ酸の分割
は物理化学的、化学的、酵素的方法で行なう事が出来る
が、酵素的方法が最も簡便であり、有利な方法と考えら
れる。酵素的方法の一つとして例えば、Ｄ−アミノアシ
ラーゼを用いてＮ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸を加水分
解し、対応するＤ−アミノ酸を直接生産する方法が知ら
れている。
医薬品の中間体として重要な化合物であり、その合成法
が盛んに研究されている。現在、ＤＬ−アミノ酸の分割
は物理化学的、化学的、酵素的方法で行なう事が出来る
が、酵素的方法が最も簡便であり、有利な方法と考えら
れる。酵素的方法の一つとして例えば、Ｄ−アミノアシ
ラーゼを用いてＮ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸を加水分
解し、対応するＤ−アミノ酸を直接生産する方法が知ら
れている。
【０００３】Ｄ−アミノアシラーゼの起源としては、シ
ュウドモナス（Pseudomonas）属（特公昭６０−３１４
７７号公報）、ストレプトミセス（Streptomyses）属
（特公昭５３−３６０３５号公報）、アルカリゲネス
（Alcaligenes）属（特公平０７−８３７１１号公報）
ロドコッカス属(Rhodococcus)、ピメロバクター(Pimelo
bacter)属（特開平０６−２２７７８９号公報）アース
ロバクター(Arthrobacter)属、コリネバクテリウム(Cor
ynebacterium)属、エルビニア(Erwinia)属、エシュリヒ
ア(Eschheria)属、フラボバクテリウム(Flavobacteriu
m)属、ノカルディア(Nocardia)属、プロタミノバクター
（Protaminobacter）属、キサントモナス(Xanthomonas)
属（特開平１１−１１３５９２号公報）、アミコラトプ
シス(Amycolatopsis)属（特開平１１−９８９８２号公
報）、セベキア(Sebekia)属（特開平１１−３１８４４
２号公報）、ヒポミセス(Hypomyces)属、フザリウム(Fu
sarium)属、オーリクラリア(auricularia)属、フィシウ
ム(Pythium)属、メニスポロプシス(Menisporopsis)属
（特開平１２−４１６８４号公報）などの細菌、放線菌
またはかびに属する微生物が知られており、これらに由
来するＤ−アミノアシラーゼをＮ−アシルアミノ酸に作
用させてＤ−アミノ酸を製造することが報告されてい
る。
ュウドモナス（Pseudomonas）属（特公昭６０−３１４
７７号公報）、ストレプトミセス（Streptomyses）属
（特公昭５３−３６０３５号公報）、アルカリゲネス
（Alcaligenes）属（特公平０７−８３７１１号公報）
ロドコッカス属(Rhodococcus)、ピメロバクター(Pimelo
bacter)属（特開平０６−２２７７８９号公報）アース
ロバクター(Arthrobacter)属、コリネバクテリウム(Cor
ynebacterium)属、エルビニア(Erwinia)属、エシュリヒ
ア(Eschheria)属、フラボバクテリウム(Flavobacteriu
m)属、ノカルディア(Nocardia)属、プロタミノバクター
（Protaminobacter）属、キサントモナス(Xanthomonas)
属（特開平１１−１１３５９２号公報）、アミコラトプ
シス(Amycolatopsis)属（特開平１１−９８９８２号公
報）、セベキア(Sebekia)属（特開平１１−３１８４４
２号公報）、ヒポミセス(Hypomyces)属、フザリウム(Fu
sarium)属、オーリクラリア(auricularia)属、フィシウ
ム(Pythium)属、メニスポロプシス(Menisporopsis)属
（特開平１２−４１６８４号公報）などの細菌、放線菌
またはかびに属する微生物が知られており、これらに由
来するＤ−アミノアシラーゼをＮ−アシルアミノ酸に作
用させてＤ−アミノ酸を製造することが報告されてい
る。
【０００４】しかしながら、これらＤ−アミノアシラー
ゼは実用的な基質濃度での活性が充分ではなく、産業上
実用的なＤ−アミノアシラーゼが望まれていた。特にＮ
−アセチル−Ｄ−トリプトファンの加水分解について
は、実用的な基質濃度での酵素の活性は低く、産業上満
足のできる酵素とは呼べなかった。近年、Ｎ−アセチル
−Ｄ−トリプトファンに作用してＤ−トリプトファンを
生成することの出来るＤ−アミノアシラーゼとしてＴｏ
ｋｕｙａｍａらがヒポミセス(Hypomyces)属のＤ−アミ
ノアシラーゼ（特開平１３−２７５６８８号公報）をＣ
ｈｉｒｏｔｅｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅ
ｄ社のＴａｙｌｏｒらがアルカリゲネス（Alcaligene
s）属のＤ−アミノアシラーゼ（ＷＯ００／２３５９
８）を報告しているが、どちらのＤ−アミノアシラーゼ
も１０ｇ／ｌ程度までのＮ−アセチル−Ｄ−トリプトフ
ァンを加水分解するに過ぎず、実用的な基質濃度での反
応を触媒できる酵素とは言い難い。
ゼは実用的な基質濃度での活性が充分ではなく、産業上
実用的なＤ−アミノアシラーゼが望まれていた。特にＮ
−アセチル−Ｄ−トリプトファンの加水分解について
は、実用的な基質濃度での酵素の活性は低く、産業上満
足のできる酵素とは呼べなかった。近年、Ｎ−アセチル
−Ｄ−トリプトファンに作用してＤ−トリプトファンを
生成することの出来るＤ−アミノアシラーゼとしてＴｏ
ｋｕｙａｍａらがヒポミセス(Hypomyces)属のＤ−アミ
ノアシラーゼ（特開平１３−２７５６８８号公報）をＣ
ｈｉｒｏｔｅｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅ
ｄ社のＴａｙｌｏｒらがアルカリゲネス（Alcaligene
s）属のＤ−アミノアシラーゼ（ＷＯ００／２３５９
８）を報告しているが、どちらのＤ−アミノアシラーゼ
も１０ｇ／ｌ程度までのＮ−アセチル−Ｄ−トリプトフ
ァンを加水分解するに過ぎず、実用的な基質濃度での反
応を触媒できる酵素とは言い難い。
【０００５】Ｄ−アミノ酸は医薬品原料などとして重要
な化合物であり、安価な製法開発が望まれている。しか
しながら、Ｄ−アミノ酸を効率よく触媒する事が出来る
Ｄ−アミノアシラーゼはこれまで一切知られていなかっ
た。
な化合物であり、安価な製法開発が望まれている。しか
しながら、Ｄ−アミノ酸を効率よく触媒する事が出来る
Ｄ−アミノアシラーゼはこれまで一切知られていなかっ
た。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、産業
上実用的な基質濃度で充分な高活性を示し、Ｎ−アシル
−ＤＬ−アミノ酸よりＤ−アミノ酸を効率よく生成する
事が出来る新規なＤ−アミノアシラーゼ及びそれを用い
たＮ−アシルアミノ酸からの対応するＤ−アミノ酸の製
造方法を提供することにある。本発明の他の目的は、こ
のＤ−アミノアシラーゼの生産及びＤ−アミノアシラー
ゼを用いたＤ−アミノ酸の製造に有用な材料としてのＤ
−アミノアシラーゼをコードする塩基配列、この塩基配
列を組み込んだプラスミド及びこのプラスミドで形質で
宿主を形質転換して得られた形質転換体を提供すること
にある。
上実用的な基質濃度で充分な高活性を示し、Ｎ−アシル
−ＤＬ−アミノ酸よりＤ−アミノ酸を効率よく生成する
事が出来る新規なＤ−アミノアシラーゼ及びそれを用い
たＮ−アシルアミノ酸からの対応するＤ−アミノ酸の製
造方法を提供することにある。本発明の他の目的は、こ
のＤ−アミノアシラーゼの生産及びＤ−アミノアシラー
ゼを用いたＤ−アミノ酸の製造に有用な材料としてのＤ
−アミノアシラーゼをコードする塩基配列、この塩基配
列を組み込んだプラスミド及びこのプラスミドで形質で
宿主を形質転換して得られた形質転換体を提供すること
にある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく、種々の微生物由来のＤ−アミノアシラーゼ
について、それらの性質を評価した。基質濃度と反応速
度の相関性を調べたところ、驚くべき事に公知のＤ−ア
ミノアシラーゼにおいては、基質濃度が高いほど反応速
度は著しく低下するといった現象、すなわち基質による
酵素活性の阻害現象を見出す事が出来た。この現象は特
に基質がＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの場合が著
しく、それゆえに従来のＤ−アミノアシラーゼにおいて
は実用的な基質濃度でＮ−アセチル−ＤＬ−トリプトフ
ァンよりＤ−トリプトファンを効率的に生成する事が困
難となっているのではないかと考察するに至った。
解決すべく、種々の微生物由来のＤ−アミノアシラーゼ
について、それらの性質を評価した。基質濃度と反応速
度の相関性を調べたところ、驚くべき事に公知のＤ−ア
ミノアシラーゼにおいては、基質濃度が高いほど反応速
度は著しく低下するといった現象、すなわち基質による
酵素活性の阻害現象を見出す事が出来た。この現象は特
に基質がＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの場合が著
しく、それゆえに従来のＤ−アミノアシラーゼにおいて
は実用的な基質濃度でＮ−アセチル−ＤＬ−トリプトフ
ァンよりＤ−トリプトファンを効率的に生成する事が困
難となっているのではないかと考察するに至った。
【０００８】そこで、本発明者らは様々な微生物につい
て、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンに対して阻害の
かかりにくく、基質濃度が高い場合も高活性を示す新規
なＤ−アミノアシラーゼの探索した結果、メチロバクテ
リウム（Methylobacterium）属に属する微生物及びノカ
ルディオイデス（Nocardioides）属に属する微生物にお
いて、目的に適う新規なＤ−アミノアシラーゼ活性を有
する微生物を発見した。そして、メチロバクテリウム
（Methylobacterium）属に属する微生物由来のＤ−アミ
ノアシラーゼを種々の精製方法を組合せて、配列番号：
３に示されるＮ末端アミノ酸残基の配列の決定に成功し
た。さらに本発明者等は配列表の配列番号：１に示され
る塩基配列を有するＤＮＡを獲得することにより、この
塩基配列を有するＤＮＡ断片を含んだプラスミドによる
形質転換体を取得し、上記のＤ−アミノアシラーゼを活
性型として産生させること、さらには実用的な基質濃度
においてＮ−アシルアミノ酸から対応するＤ−アミノ酸
を高効率的で製造することに成功し、本発明を完成する
に至った。
て、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンに対して阻害の
かかりにくく、基質濃度が高い場合も高活性を示す新規
なＤ−アミノアシラーゼの探索した結果、メチロバクテ
リウム（Methylobacterium）属に属する微生物及びノカ
ルディオイデス（Nocardioides）属に属する微生物にお
いて、目的に適う新規なＤ−アミノアシラーゼ活性を有
する微生物を発見した。そして、メチロバクテリウム
（Methylobacterium）属に属する微生物由来のＤ−アミ
ノアシラーゼを種々の精製方法を組合せて、配列番号：
３に示されるＮ末端アミノ酸残基の配列の決定に成功し
た。さらに本発明者等は配列表の配列番号：１に示され
る塩基配列を有するＤＮＡを獲得することにより、この
塩基配列を有するＤＮＡ断片を含んだプラスミドによる
形質転換体を取得し、上記のＤ−アミノアシラーゼを活
性型として産生させること、さらには実用的な基質濃度
においてＮ−アシルアミノ酸から対応するＤ−アミノ酸
を高効率的で製造することに成功し、本発明を完成する
に至った。
【０００９】上記の本発明者らによる新たな知見に基づ
いて成された本発明は以下の各態様を含むものである。 （１） Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸に作用して対応する
Ｄ−アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有するＤ
−アミノアシラーゼであって、水性媒体中でＮ−アセチ
ル−Ｄ−トリプトファンからＤ−トリプトファンを生成
する反応を触媒する際におけるＮ−アセチル−Ｄ−トリ
プトファンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ
−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場
合の反応速度に対して少なくとも４０％である事を特徴
とするＤ−アミノアシラーゼ。 （２） Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が１
００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−ト
リプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対し
て少なくとも２０％である上記項目（１）に記載のＤ−
アミノアシラーゼ。 （３） メチロバクテリウム（Methylobacterium）属又
はノカルディオイデス（Nocardioides）属に属する微生
物由来である上記項目（１）に記載のＤ−アミノアシラ
ーゼ。 （４） メチロバクテリウム（Methylobacterium）属に
属する微生物がメチロバクテリウム・メソフィリカム
（Methylobacterium mesophilicum）種、ノカルディオ
イデス（Nocardioides）属に属する微生物がノカルディ
オイデス・サーモリラシナス（Nocardioides thermolil
acinus）種である上記項目（３）に記載のＤ−アミノア
シラーゼ。 （５） ノカルディオイデス・サーモリラシナス（Noca
rdioides thermolilacinus）種に属する微生物がノカル
ディオイデス・サーモリラシナス（Nocardioidesthermo
lilacinus）ＡＴＣＣ３５８６３株である上記項目
（４）に記載のＤ−アミノアシラーゼ。 （６）Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸に作用して対応するＤ
−アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有するＤ−
アミノアシラーゼであって、 （Ａ）配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列または （Ｂ）該アミノ酸配列に対して前記触媒活性を維持し得
る範囲内で１以上のアミノ酸残基の挿入、欠失または置
換を行って得られる変異アミノ酸配列 を有することを特徴とするＤ−アミノアシラーゼ。 （７） 水性媒体中でＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファ
ンからＤ−トリプトファンを生成する反応を触媒する際
におけるＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５
０ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリ
プトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して
少なくとも４０％である上記項目（６）に記載のＤ−ア
ミノアシラーゼ。 （８） Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が１
００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−ト
リプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対し
て少なくとも２０％である上記項目（７）に記載のＤ−
アミノアシラーゼ。 （９） Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸に作用して対応する
Ｄ−アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有するＤ
−アミノアシラーゼをコードする塩基配列であって、 （ａ）配列表の配列番号：１記載の塩基配列または （ｂ）配列番号：１の塩基配列に対して該塩基配列がコ
ードするＤ−アミノアシラーゼの作用が維持される範囲
内で１以上の塩基の挿入、欠失または置換を行って得ら
れる変異塩基配列 からなることを特徴とするＤ−アミノアシラーゼをコー
ドする塩基配列。 （１０） 前記変異塩基配列が、前記配列番号：１の塩
基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るものである上記項目（９）に記載の塩基配列。 （１１） Ｄ−アミノアシラーゼの水性媒体中でＮ−ア
セチル−Ｄ−トリプトファンからＤ−トリプトファンを
生成する反応を触媒する際のＮ−アセチル−Ｄ−トリプ
トファンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−
アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合
の反応速度に対して少なくとも４０％である上記項目
（９）に記載の塩基配列。 （１２） Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が
１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−
トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対
して少なくとも２０％である上記項目（１１）に記載の
塩基配列。 （１３） 上記項目（９）に記載の塩基配列を含むプラ
スミド。 （１４） 上記項目（１３）に記載のプラスミドによっ
て形質転換された形質転換体。 （１５） 上記項目（１４）に記載の形質転換体を培養
して、該形質転換体に組み込まれたプラスミドの有する
塩基配列によりコードされたＤ−アミノアシラーゼを生
産させることを特徴とするＤ−アミノアシラーゼの産生
方法。 （１６） 水性媒体中でＮ−アシルアミノ酸にＤ−アミ
ノアシラーゼを作用させて対応するＤ−アミノ酸を生産
する光学活性アミノ酸の生産方法であって、該Ｄ−アミ
ノアシラーゼが水性媒体中でＮ−アセチル−Ｄ−トリプ
トファンからＤ−トリプトファンを生成する反応を触媒
する際におけるＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃
度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ
−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に
対して少なくとも４０％であることを特徴とする光学活
性アミノ酸の生産方法。 （１７） Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が
１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−
トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対
して少なくとも２０％である上記項目1６記載の生産方
法。 （１８） メチロバクテリウム（Methylobacterium）属
又はノカルディオイデス（Nocardioides）属に属する微
生物由来である上記項目１６に記載の生産方法。 （１９） メチロバクテリウム（Methylobacterium）属
に属する微生物がメチロバクテリウム・メソフィリカム
（Methylobacterium mesophilicum）種、ノカルディオ
イデス（Nocardioides）属に属する微生物がノカルディ
オイデス・サーモリラシナス（Nocardioides thermolil
acinus）種である上記項目１８記載の生産方法。 （２０） ノカルディオイデス・サーモリラシナス（No
cardioides thermolilacinus）種に属する微生物がノカ
ルディオイデス・サーモリラシナス（Nocardioides the
rmolilacinus）ＡＴＣＣ３５８６３株である上記項目１
９記載の生産方法。 （２１） Ｎ−アシルアミノ酸濃度が５０ｇ／ｌ以上で
ある上記項目１６に記載の製造方法。 （２２） Ｎ−アシルアミノ酸濃度が１００ｇ／ｌ以上
である上記項目２１記載の製造方法。 （２３） 水性媒体中でＮ−アシルアミノ酸にＤ−アミ
ノアシラーゼを作用させて対応するＤ−アミノ酸を生産
する光学活性アミノ酸の生産方法であって、該Ｄ−アミ
ノアシラーゼが請求項６に記載のＤ−アミノアシラーゼ
であることを特徴とする光学活性アミノ酸の生産方法。 （２４） 前記Ｄ−アミノアシラーゼが水性媒体中でＮ
−アセチル−Ｄ−トリプトファンからＤ−トリプトファ
ンを生成する反応を触媒する際のＮ−アセチル−Ｄ−ト
リプトファンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度が、
Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの
場合の反応速度に対して少なくとも４０％である上記項
目２３に記載の生産方法。 （２５） Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が
１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−
トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対
して少なくとも２０％である上記項目２４に記載の生産
方法。 （２６） Ｄ−アミノアシラーゼを、請求項１４に記載
の形質転換体を培養して得られる培養液、該培養液から
分離された形質転換体又はそれらの処理物の形でＮ−ア
シルアミノ酸に作用させる上記項目２３に記載の生産方
法。 （２７） Ｎ−アシルアミノ酸濃度が５０ｇ／ｌ以上で
ある上記項目２３に記載の製造方法。 （２８） Ｎ−アシルアミノ酸濃度が１００ｇ／ｌ以上
である上記項目２７記載の製造方法。
いて成された本発明は以下の各態様を含むものである。 （１） Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸に作用して対応する
Ｄ−アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有するＤ
−アミノアシラーゼであって、水性媒体中でＮ−アセチ
ル−Ｄ−トリプトファンからＤ−トリプトファンを生成
する反応を触媒する際におけるＮ−アセチル−Ｄ−トリ
プトファンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ
−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場
合の反応速度に対して少なくとも４０％である事を特徴
とするＤ−アミノアシラーゼ。 （２） Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が１
００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−ト
リプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対し
て少なくとも２０％である上記項目（１）に記載のＤ−
アミノアシラーゼ。 （３） メチロバクテリウム（Methylobacterium）属又
はノカルディオイデス（Nocardioides）属に属する微生
物由来である上記項目（１）に記載のＤ−アミノアシラ
ーゼ。 （４） メチロバクテリウム（Methylobacterium）属に
属する微生物がメチロバクテリウム・メソフィリカム
（Methylobacterium mesophilicum）種、ノカルディオ
イデス（Nocardioides）属に属する微生物がノカルディ
オイデス・サーモリラシナス（Nocardioides thermolil
acinus）種である上記項目（３）に記載のＤ−アミノア
シラーゼ。 （５） ノカルディオイデス・サーモリラシナス（Noca
rdioides thermolilacinus）種に属する微生物がノカル
ディオイデス・サーモリラシナス（Nocardioidesthermo
lilacinus）ＡＴＣＣ３５８６３株である上記項目
（４）に記載のＤ−アミノアシラーゼ。 （６）Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸に作用して対応するＤ
−アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有するＤ−
アミノアシラーゼであって、 （Ａ）配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列または （Ｂ）該アミノ酸配列に対して前記触媒活性を維持し得
る範囲内で１以上のアミノ酸残基の挿入、欠失または置
換を行って得られる変異アミノ酸配列 を有することを特徴とするＤ−アミノアシラーゼ。 （７） 水性媒体中でＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファ
ンからＤ−トリプトファンを生成する反応を触媒する際
におけるＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５
０ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリ
プトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して
少なくとも４０％である上記項目（６）に記載のＤ−ア
ミノアシラーゼ。 （８） Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が１
００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−ト
リプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対し
て少なくとも２０％である上記項目（７）に記載のＤ−
アミノアシラーゼ。 （９） Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸に作用して対応する
Ｄ−アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有するＤ
−アミノアシラーゼをコードする塩基配列であって、 （ａ）配列表の配列番号：１記載の塩基配列または （ｂ）配列番号：１の塩基配列に対して該塩基配列がコ
ードするＤ−アミノアシラーゼの作用が維持される範囲
内で１以上の塩基の挿入、欠失または置換を行って得ら
れる変異塩基配列 からなることを特徴とするＤ−アミノアシラーゼをコー
ドする塩基配列。 （１０） 前記変異塩基配列が、前記配列番号：１の塩
基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るものである上記項目（９）に記載の塩基配列。 （１１） Ｄ−アミノアシラーゼの水性媒体中でＮ−ア
セチル−Ｄ−トリプトファンからＤ−トリプトファンを
生成する反応を触媒する際のＮ−アセチル−Ｄ−トリプ
トファンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−
アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合
の反応速度に対して少なくとも４０％である上記項目
（９）に記載の塩基配列。 （１２） Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が
１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−
トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対
して少なくとも２０％である上記項目（１１）に記載の
塩基配列。 （１３） 上記項目（９）に記載の塩基配列を含むプラ
スミド。 （１４） 上記項目（１３）に記載のプラスミドによっ
て形質転換された形質転換体。 （１５） 上記項目（１４）に記載の形質転換体を培養
して、該形質転換体に組み込まれたプラスミドの有する
塩基配列によりコードされたＤ−アミノアシラーゼを生
産させることを特徴とするＤ−アミノアシラーゼの産生
方法。 （１６） 水性媒体中でＮ−アシルアミノ酸にＤ−アミ
ノアシラーゼを作用させて対応するＤ−アミノ酸を生産
する光学活性アミノ酸の生産方法であって、該Ｄ−アミ
ノアシラーゼが水性媒体中でＮ−アセチル−Ｄ−トリプ
トファンからＤ−トリプトファンを生成する反応を触媒
する際におけるＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃
度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ
−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に
対して少なくとも４０％であることを特徴とする光学活
性アミノ酸の生産方法。 （１７） Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が
１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−
トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対
して少なくとも２０％である上記項目1６記載の生産方
法。 （１８） メチロバクテリウム（Methylobacterium）属
又はノカルディオイデス（Nocardioides）属に属する微
生物由来である上記項目１６に記載の生産方法。 （１９） メチロバクテリウム（Methylobacterium）属
に属する微生物がメチロバクテリウム・メソフィリカム
（Methylobacterium mesophilicum）種、ノカルディオ
イデス（Nocardioides）属に属する微生物がノカルディ
オイデス・サーモリラシナス（Nocardioides thermolil
acinus）種である上記項目１８記載の生産方法。 （２０） ノカルディオイデス・サーモリラシナス（No
cardioides thermolilacinus）種に属する微生物がノカ
ルディオイデス・サーモリラシナス（Nocardioides the
rmolilacinus）ＡＴＣＣ３５８６３株である上記項目１
９記載の生産方法。 （２１） Ｎ−アシルアミノ酸濃度が５０ｇ／ｌ以上で
ある上記項目１６に記載の製造方法。 （２２） Ｎ−アシルアミノ酸濃度が１００ｇ／ｌ以上
である上記項目２１記載の製造方法。 （２３） 水性媒体中でＮ−アシルアミノ酸にＤ−アミ
ノアシラーゼを作用させて対応するＤ−アミノ酸を生産
する光学活性アミノ酸の生産方法であって、該Ｄ−アミ
ノアシラーゼが請求項６に記載のＤ−アミノアシラーゼ
であることを特徴とする光学活性アミノ酸の生産方法。 （２４） 前記Ｄ−アミノアシラーゼが水性媒体中でＮ
−アセチル−Ｄ−トリプトファンからＤ−トリプトファ
ンを生成する反応を触媒する際のＮ−アセチル−Ｄ−ト
リプトファンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度が、
Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの
場合の反応速度に対して少なくとも４０％である上記項
目２３に記載の生産方法。 （２５） Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が
１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−
トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対
して少なくとも２０％である上記項目２４に記載の生産
方法。 （２６） Ｄ−アミノアシラーゼを、請求項１４に記載
の形質転換体を培養して得られる培養液、該培養液から
分離された形質転換体又はそれらの処理物の形でＮ−ア
シルアミノ酸に作用させる上記項目２３に記載の生産方
法。 （２７） Ｎ−アシルアミノ酸濃度が５０ｇ／ｌ以上で
ある上記項目２３に記載の製造方法。 （２８） Ｎ−アシルアミノ酸濃度が１００ｇ／ｌ以上
である上記項目２７記載の製造方法。
【００１０】本発明にかかるＤ−アシルアミラーゼを用
いることで産業上実用的な基質濃度を用いて改善された
反応速度でのＮ−アシルアミノ酸からの対応するＤ−ア
ミノ酸の製造が可能となる。更に、本発明によれば、こ
の有用なＤ−アシルアミラーゼの遺伝子組み換え技術を
用いた生産に有用な塩基配列、それを組み込んだプラス
ミド及びこのプラスミドで宿主を形質転換した形質転換
体を提供することができる。
いることで産業上実用的な基質濃度を用いて改善された
反応速度でのＮ−アシルアミノ酸からの対応するＤ−ア
ミノ酸の製造が可能となる。更に、本発明によれば、こ
の有用なＤ−アシルアミラーゼの遺伝子組み換え技術を
用いた生産に有用な塩基配列、それを組み込んだプラス
ミド及びこのプラスミドで宿主を形質転換した形質転換
体を提供することができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明にかかるＤ−アミノアシラ
ーゼは、Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸に作用して対応する
Ｄ−アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有する酵
素であり、特にＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンに対
して阻害がかかりにくく、基質濃度が高い場合も高活性
を示すことに特徴を有するものである。このＮ−アセチ
ル−Ｄ−トリプトファンによる阻害作用は、以下に記載
する基質濃度と反応速度との関係により規定することが
できる。 Ｉ．水性媒体中においてＮ−アセチル−Ｄ−トリプトフ
ァンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセ
チル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反
応速度に対して少なくとも４０％である。 II．Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が１００
ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプ
トファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少
なくとも２０％である。
ーゼは、Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸に作用して対応する
Ｄ−アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有する酵
素であり、特にＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンに対
して阻害がかかりにくく、基質濃度が高い場合も高活性
を示すことに特徴を有するものである。このＮ−アセチ
ル−Ｄ−トリプトファンによる阻害作用は、以下に記載
する基質濃度と反応速度との関係により規定することが
できる。 Ｉ．水性媒体中においてＮ−アセチル−Ｄ−トリプトフ
ァンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセ
チル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反
応速度に対して少なくとも４０％である。 II．Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が１００
ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプ
トファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少
なくとも２０％である。
【００１２】本発明にかかるＤ−アミノアシラーゼは上
記の阻害に関する特性Ｉを有するものであり、上記阻害
に関する特性Ｉ及びIIの両方を有するものが好ましい。
従って、少なくとも上記阻害に関する特性ＩのＤ−アミ
ノアシラーゼ活性を有する酵素であれば、いかなる微生
物由来であっても、もしくは公知のＤ−アミノアシラー
ゼを遺伝子組換により改変したものであっても、本発明
に包含されるものとする。
記の阻害に関する特性Ｉを有するものであり、上記阻害
に関する特性Ｉ及びIIの両方を有するものが好ましい。
従って、少なくとも上記阻害に関する特性ＩのＤ−アミ
ノアシラーゼ活性を有する酵素であれば、いかなる微生
物由来であっても、もしくは公知のＤ−アミノアシラー
ゼを遺伝子組換により改変したものであっても、本発明
に包含されるものとする。
【００１３】更に、上記特性Ｉに関しては、Ｎ−アセチ
ル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反
応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が
５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも５０％、
特に少なくとも６０％である事が更に好ましい。また、
上記特性IIに関しては、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトフ
ァンの濃度が１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−ア
セチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の
反応速度に対して少なくとも２５％、特に少なくとも３
０％である事が更に好ましい。
ル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反
応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が
５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも５０％、
特に少なくとも６０％である事が更に好ましい。また、
上記特性IIに関しては、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトフ
ァンの濃度が１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−ア
セチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の
反応速度に対して少なくとも２５％、特に少なくとも３
０％である事が更に好ましい。
【００１４】また本発明における基質濃度と反応速度の
関係は次の様にして確認する事ができる。例えば、１０
ｇ／ｌ、５０ｇ／ｌ、１００ｇ／ｌ、２００ｇ／ｌの基
質（Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファン）をそれぞれ含
む１００ｍＭのリン酸緩衝液２００μｌに反応に十分な
活性量の酵素液を２００μｌ添加し３０℃において適当
な時間反応させる。この反応によって生成するＤ−トリ
プトファンの量をＨＰＬＣ法などで測定する事により、
各基質濃度における酵素活性（反応速度）を比較する事
ができる。本発明において反応速度を測定する際の水性
媒体は、酵素反応を進行させることができるものであれ
ば特に限定されず、水はもちろんの事、リン酸、トリ
ス、クエン酸、酢酸、ホウ酸、グリシン、ＨＥＰＥＳ、
ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＰＩＰＥＳな
どから適宜一種または二種以上選択して成る成分を水に
含有させた緩衝液を用いることができる。反応温度はＤ
−アミノアシラーゼが活性を発現できる、至適温度を含
む温度範囲から選択することができ、例えば３０℃〜６
０℃に維持する事が特に望ましい。また反応ｐＨも、Ｄ
−アミノアシラーゼが活性を維持できる範囲であればよ
く、特に至適ｐＨを含むｐＨ６〜１１に維持する事が望
ましい。また酵素は菌体の培養液そのものや該培養液よ
り遠心分離などによって分離、回収して得られる菌体、
また該菌体の抽出物、磨砕物、分離精製物を使用でき
る。また本発明において反応速度を測定する際の酵素の
使用量や反応時間は有意に反応速度が測定できる条件、
例えば反応速度の測定時間内で反応が飽和状態に達しな
い条件であればよく、基質となるＮ−アセチル−Ｄ−ト
リプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合にＤ−トリプトフ
ァンの生成蓄積濃度が０．２ｇ／ｌ〜１ｇ／ｌ程度の条
件である事が望ましい。
関係は次の様にして確認する事ができる。例えば、１０
ｇ／ｌ、５０ｇ／ｌ、１００ｇ／ｌ、２００ｇ／ｌの基
質（Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファン）をそれぞれ含
む１００ｍＭのリン酸緩衝液２００μｌに反応に十分な
活性量の酵素液を２００μｌ添加し３０℃において適当
な時間反応させる。この反応によって生成するＤ−トリ
プトファンの量をＨＰＬＣ法などで測定する事により、
各基質濃度における酵素活性（反応速度）を比較する事
ができる。本発明において反応速度を測定する際の水性
媒体は、酵素反応を進行させることができるものであれ
ば特に限定されず、水はもちろんの事、リン酸、トリ
ス、クエン酸、酢酸、ホウ酸、グリシン、ＨＥＰＥＳ、
ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＰＩＰＥＳな
どから適宜一種または二種以上選択して成る成分を水に
含有させた緩衝液を用いることができる。反応温度はＤ
−アミノアシラーゼが活性を発現できる、至適温度を含
む温度範囲から選択することができ、例えば３０℃〜６
０℃に維持する事が特に望ましい。また反応ｐＨも、Ｄ
−アミノアシラーゼが活性を維持できる範囲であればよ
く、特に至適ｐＨを含むｐＨ６〜１１に維持する事が望
ましい。また酵素は菌体の培養液そのものや該培養液よ
り遠心分離などによって分離、回収して得られる菌体、
また該菌体の抽出物、磨砕物、分離精製物を使用でき
る。また本発明において反応速度を測定する際の酵素の
使用量や反応時間は有意に反応速度が測定できる条件、
例えば反応速度の測定時間内で反応が飽和状態に達しな
い条件であればよく、基質となるＮ−アセチル−Ｄ−ト
リプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合にＤ−トリプトフ
ァンの生成蓄積濃度が０．２ｇ／ｌ〜１ｇ／ｌ程度の条
件である事が望ましい。
【００１５】本発明にかかるＤ−アミノアシラーゼの物
性は以下のとおりである。 至適ｐＨ：ｐＨ８〜１０（最適はｐＨ９） 至適温度：６０℃ 熱安定性：４０℃／２０時間の熱処理で８０％の残存活
性を示す。
性は以下のとおりである。 至適ｐＨ：ｐＨ８〜１０（最適はｐＨ９） 至適温度：６０℃ 熱安定性：４０℃／２０時間の熱処理で８０％の残存活
性を示す。
【００１６】本発明におけるＤ−アミノアシラーゼの一
態様は、配列表の配列番号：２に記載のアミノ酸配列、
あるいは配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしく
は２以上、好ましくは数個のアミノ酸がＤ−アミノアシ
ラーゼ活性が維持し得る範囲内で置換、欠失、修飾また
は挿入または付加されたアミノ酸配列を有する。
態様は、配列表の配列番号：２に記載のアミノ酸配列、
あるいは配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしく
は２以上、好ましくは数個のアミノ酸がＤ−アミノアシ
ラーゼ活性が維持し得る範囲内で置換、欠失、修飾また
は挿入または付加されたアミノ酸配列を有する。
【００１７】本発明におけるＤ−アミノアシラーゼをコ
ードするポリヌクレオチドは配列表の配列番号：１に記
載の塩基配列を含む。配列番号：１に示す塩基配列は、
配列番号：２に示すタンパク質をコードする。ただし、
配列番号：２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列
には、配列番号：１に示す塩基配列のみならず、異なる
コドンに基づくあらゆる塩基配列が含まれる。更に適宜
置換、欠失、修飾または挿入または付加を導入する事に
よりポリヌクレオチドのホモログを得る事も可能であ
る。本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは配列
番号：１に示す塩基配列に対して、これによりコードさ
れるＤ−アシルアミラーゼが所定の酵素活性を維持し得
る範囲内で塩基の置換、欠失または付加を行って得られ
るものである。このホモログには、例えば、配列番号：
１の塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとス
トリンジェントな条件でハイブリダイズできる塩基配列
を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
ードするポリヌクレオチドは配列表の配列番号：１に記
載の塩基配列を含む。配列番号：１に示す塩基配列は、
配列番号：２に示すタンパク質をコードする。ただし、
配列番号：２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列
には、配列番号：１に示す塩基配列のみならず、異なる
コドンに基づくあらゆる塩基配列が含まれる。更に適宜
置換、欠失、修飾または挿入または付加を導入する事に
よりポリヌクレオチドのホモログを得る事も可能であ
る。本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは配列
番号：１に示す塩基配列に対して、これによりコードさ
れるＤ−アシルアミラーゼが所定の酵素活性を維持し得
る範囲内で塩基の置換、欠失または付加を行って得られ
るものである。このホモログには、例えば、配列番号：
１の塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとス
トリンジェントな条件でハイブリダイズできる塩基配列
を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００１８】このストリンジェントな条件でのハイブリ
ダイゼ−ションは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ；Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅに記載の方
法によって行なう事ができ、市販のシステムとしては、
ＧｅｎｅＩｍａｇｅシステム（アマシャム）を挙げる事
ができる。具体的には以下の操作によってハイブリダイ
ゼ−ションを行なう事ができる。試験すべきＤＮＡまた
はＲＮＡ分子を転写した膜を製品プロトコールに従っ
て、標識したプローブとプロトコール指定のハイブリダ
イゼ−ションバッファー中でハイブリダイズさせる。ハ
イブリダイゼ−ションバッファーの組成は、０．１重量
％ＳＤＳ、５重量％デキストラン硫酸、１／２０溶のキ
ット添付のブロッキング試薬及び２〜７×ＳＳＣからな
る。ブロッキング試薬としては例えば、１００×Ｄｅｎ
ｈａｒｄｔ‘ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２％（重量／容
量）Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、２％
（重量／容量）ＦｉｃｌｌTM４００、２％（重量／容
量）ポリビニルピロリドンを５倍濃度で調整したものを
１／２０に希釈して使用する事ができる。２０×ＳＳＣ
は、３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液であ
り、ＳＳＣは、より好ましくは３〜６×ＳＳＣ、更に好
ましくは４〜５×ＳＳＣの濃度で使用する。ハイブリダ
イゼ−ションの温度は４０〜８０℃、より好ましくは５
０〜７０℃、更に好ましくは５５〜６５℃の範囲であ
り、数時間から一晩のインキュベーションを行なった
後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好まし
くは室温、より好ましくはハイブリダイゼーション時の
温度である。洗浄バッファーの組成は６×ＳＳＣ＋０．
１重量％ＳＤＳ溶液、より好ましくは４×ＳＳＣ＋０．
１重量％ＳＤＳ溶液、更に好ましくは１×ＳＳＣ＋０．
１重量％ＳＤＳ溶液、最も好ましくは０．１×ＳＳＣ＋
０．１重量％ＳＤＳ溶液である。このような洗浄バッフ
ァーで膜を洗浄し、プローブがハイブリダイズしたＤＮ
Ａ分子またはＲＮＡ分子をプローブに用いた標識を利用
して識別する事ができる。
ダイゼ−ションは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ；Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅに記載の方
法によって行なう事ができ、市販のシステムとしては、
ＧｅｎｅＩｍａｇｅシステム（アマシャム）を挙げる事
ができる。具体的には以下の操作によってハイブリダイ
ゼ−ションを行なう事ができる。試験すべきＤＮＡまた
はＲＮＡ分子を転写した膜を製品プロトコールに従っ
て、標識したプローブとプロトコール指定のハイブリダ
イゼ−ションバッファー中でハイブリダイズさせる。ハ
イブリダイゼ−ションバッファーの組成は、０．１重量
％ＳＤＳ、５重量％デキストラン硫酸、１／２０溶のキ
ット添付のブロッキング試薬及び２〜７×ＳＳＣからな
る。ブロッキング試薬としては例えば、１００×Ｄｅｎ
ｈａｒｄｔ‘ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２％（重量／容
量）Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、２％
（重量／容量）ＦｉｃｌｌTM４００、２％（重量／容
量）ポリビニルピロリドンを５倍濃度で調整したものを
１／２０に希釈して使用する事ができる。２０×ＳＳＣ
は、３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液であ
り、ＳＳＣは、より好ましくは３〜６×ＳＳＣ、更に好
ましくは４〜５×ＳＳＣの濃度で使用する。ハイブリダ
イゼ−ションの温度は４０〜８０℃、より好ましくは５
０〜７０℃、更に好ましくは５５〜６５℃の範囲であ
り、数時間から一晩のインキュベーションを行なった
後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好まし
くは室温、より好ましくはハイブリダイゼーション時の
温度である。洗浄バッファーの組成は６×ＳＳＣ＋０．
１重量％ＳＤＳ溶液、より好ましくは４×ＳＳＣ＋０．
１重量％ＳＤＳ溶液、更に好ましくは１×ＳＳＣ＋０．
１重量％ＳＤＳ溶液、最も好ましくは０．１×ＳＳＣ＋
０．１重量％ＳＤＳ溶液である。このような洗浄バッフ
ァーで膜を洗浄し、プローブがハイブリダイズしたＤＮ
Ａ分子またはＲＮＡ分子をプローブに用いた標識を利用
して識別する事ができる。
【００１９】本発明による新規なＤ−アミノアシラーゼ
には、Methylobacterium mesophilicum ＭＴ１０８９４
株由来のもの及びNocardioides thermolilacinus ＡＴ
ＣＣ３５８６３株由来のものが含まれる。Methylobacte
rium mesophilicum ＭＴ１０８９４株は千葉県茂原市の
土壌から分離した。その菌学的性質を示すと表１の通り
である。
には、Methylobacterium mesophilicum ＭＴ１０８９４
株由来のもの及びNocardioides thermolilacinus ＡＴ
ＣＣ３５８６３株由来のものが含まれる。Methylobacte
rium mesophilicum ＭＴ１０８９４株は千葉県茂原市の
土壌から分離した。その菌学的性質を示すと表１の通り
である。
【００２０】
【表１】
【００２１】以上の菌学的緒性質を「バージェイーズ・
マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー
第１巻（１９８４）ウイリアムス＆ウイルキンス[Berge
y'sManual of Systematic Bacteriology Vol.1(1984) W
illiams&Wilkins]」、「バージェイーズ・マニュアル・
オブ・デターミティブ・バクテリオロジー第９版（１９
９４）ウイリアムス＆ウイルキンス[Bergey's Manual o
f Determinative Bacteriology Ninth Edition(1994) W
illiams&Wilkins]」、「ジー アイ バロー&アール
ケイ エイ フェルタム版：コーエン アンド スチー
ルス マニュアル フォー ザ アイデンティフィケー
ション オブ メディカル バクテリア 第3版 ケン
ブリッジ ユニバーシティ プレス （１９９３） [G.
I Barrow and R.K.A.Feltham ed.,Cowan&Steel's Mannu
al for the Identification of Medical Bacteria 3
rd .ed,Cambridge univ.press,(1993)]」の分類に当て
はめて本株の同定を行った結果、本菌株はMethylobacte
rium mesophilicumに属すると考えられた。この菌株Ｍ
Ｔ１０８９４は受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７７７１とし
て茨城県つくば市東１丁目１番１号経済産業省産業技術
総合研究所生命工学工業研究所に２０００年３月８日付
けで寄託され、平成１４年１月２１日付けのブタペスト
条約に基づく国際寄託への移管により寄託番号はＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−７８５６に変更された。
マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー
第１巻（１９８４）ウイリアムス＆ウイルキンス[Berge
y'sManual of Systematic Bacteriology Vol.1(1984) W
illiams&Wilkins]」、「バージェイーズ・マニュアル・
オブ・デターミティブ・バクテリオロジー第９版（１９
９４）ウイリアムス＆ウイルキンス[Bergey's Manual o
f Determinative Bacteriology Ninth Edition(1994) W
illiams&Wilkins]」、「ジー アイ バロー&アール
ケイ エイ フェルタム版：コーエン アンド スチー
ルス マニュアル フォー ザ アイデンティフィケー
ション オブ メディカル バクテリア 第3版 ケン
ブリッジ ユニバーシティ プレス （１９９３） [G.
I Barrow and R.K.A.Feltham ed.,Cowan&Steel's Mannu
al for the Identification of Medical Bacteria 3
rd .ed,Cambridge univ.press,(1993)]」の分類に当て
はめて本株の同定を行った結果、本菌株はMethylobacte
rium mesophilicumに属すると考えられた。この菌株Ｍ
Ｔ１０８９４は受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７７７１とし
て茨城県つくば市東１丁目１番１号経済産業省産業技術
総合研究所生命工学工業研究所に２０００年３月８日付
けで寄託され、平成１４年１月２１日付けのブタペスト
条約に基づく国際寄託への移管により寄託番号はＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−７８５６に変更された。
【００２２】本発明の新規なＤ−アミノアシラーゼをコ
ードするＤＮＡは、例えば、以下の様な方法によって単
離することができる。微生物からゲノムＤＮＡを精製
し、制限酵素によって消化した後に得られたＤＮＡを超
遠心分離もしくは電気泳動等によって、その長さによっ
て分画する。その分画試料のＤＮＡを回収してプラスミ
ドに組み込むことによってプラスミドライブラリーを作
成し、その中からＤ−アミノアシラーゼ活性を持つクロ
ーンを選抜してＤ−アミノアシラーゼ遺伝子をコードす
るＤＮＡを含むプラスミドを取得する。そのプラスミド
の塩基配列を解析することによって、目的のＤ−アミノ
アシラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列が判明
し、ＤＮＡの塩基配列からコードされているＤ−アミノ
アシラーゼのアミノ酸配列を推定することが出来る。
ードするＤＮＡは、例えば、以下の様な方法によって単
離することができる。微生物からゲノムＤＮＡを精製
し、制限酵素によって消化した後に得られたＤＮＡを超
遠心分離もしくは電気泳動等によって、その長さによっ
て分画する。その分画試料のＤＮＡを回収してプラスミ
ドに組み込むことによってプラスミドライブラリーを作
成し、その中からＤ−アミノアシラーゼ活性を持つクロ
ーンを選抜してＤ−アミノアシラーゼ遺伝子をコードす
るＤＮＡを含むプラスミドを取得する。そのプラスミド
の塩基配列を解析することによって、目的のＤ−アミノ
アシラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列が判明
し、ＤＮＡの塩基配列からコードされているＤ−アミノ
アシラーゼのアミノ酸配列を推定することが出来る。
【００２３】上記のようにして単離された本発明のＤ−
アミノアシラーゼをコードするＤＮＡを、例えば宿主が
大腸菌の場合、ｐＵＣ１８やｐＫＫ２２３−３、ｐＢＲ
３２２、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ（＋）、ｐＳＣ
１０１などに代表される発現用のプラスミドに組み込む
ことにより、Ｄ−アミノアシラーゼ発現プラスミドが提
供される。尚、形質転換に使用する宿主生物としては、
組換えベクターが安定、かつ自律的に増殖可能で、さら
に外来性ＤＮＡの形質が発現できるものであればよく、
例として大腸菌が挙げられるが、特に大腸菌に限定され
るものではない。
アミノアシラーゼをコードするＤＮＡを、例えば宿主が
大腸菌の場合、ｐＵＣ１８やｐＫＫ２２３−３、ｐＢＲ
３２２、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ（＋）、ｐＳＣ
１０１などに代表される発現用のプラスミドに組み込む
ことにより、Ｄ−アミノアシラーゼ発現プラスミドが提
供される。尚、形質転換に使用する宿主生物としては、
組換えベクターが安定、かつ自律的に増殖可能で、さら
に外来性ＤＮＡの形質が発現できるものであればよく、
例として大腸菌が挙げられるが、特に大腸菌に限定され
るものではない。
【００２４】そして、本発明においては該プラスミドで
形質転換して得られた形質転換体を公知の情報に基づい
て、培養することができ、本発明のＤ−アミノアシラー
ゼを産生させることができる。培地としては炭素源、窒
素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地な
らば合成培地または天然培地のいずれでも使用可能であ
る。培養は前記培養成分を含有する液体培地中で振とう
培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の
培養方法を用いて行なう事が出来る。培養条件は、培養
の種類、培養方法により適宜選択すればよく、菌株が生
育しＤ−アミノアシラーゼを産生できる条件であれば特
に制限はない。
形質転換して得られた形質転換体を公知の情報に基づい
て、培養することができ、本発明のＤ−アミノアシラー
ゼを産生させることができる。培地としては炭素源、窒
素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地な
らば合成培地または天然培地のいずれでも使用可能であ
る。培養は前記培養成分を含有する液体培地中で振とう
培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の
培養方法を用いて行なう事が出来る。培養条件は、培養
の種類、培養方法により適宜選択すればよく、菌株が生
育しＤ−アミノアシラーゼを産生できる条件であれば特
に制限はない。
【００２５】また、本発明におけるＤ−アミノ酸の製造
方法においては、Ｄ−アミノアシラーゼを、上記のＤ−
アミノアシラーゼ生産菌の培養液そのものや、該培養液
より遠心分離によって分離・回収して得られる形質転換
菌体、該形質転換菌体の菌体処理物の形で利用すること
もできる。ここでいう菌体処理物とは、該形質転換菌体
の抽出物や磨砕物、該抽出物や磨砕物のＤ−アミノアシ
ラーゼ活性画分を分離・精製して得られる分離物、該形
質転換菌体や該形質転換菌体の抽出物、磨砕物、分離物
を適当な担体を用いて固定化した固定化物の事を示して
いる。また宿主微生物由来の活性成分が該培養液そのも
のや、該培養液より遠心分離によって分離・回収して得
られる形質転換菌体、該形質転換菌体の菌体処理物の本
来の目的とする反応の反応性や選択性に悪影響を及ぼす
場合が考えられる。この場合、該培養液そのものや、該
培養液より遠心分離によって分離・回収して得られる形
質転換菌体、該形質転換菌体の菌体処理物を反応に先立
ってか、もしくは反応と同時に、有機溶媒処理または熱
処理を施す事によって反応性や選択性を改善する事が可
能である。有機溶媒としてはメタノール、エタノールな
どのアルコール類やアセトン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＤＭ
Ｉ、ＤＭＳＯなどの水溶性の有機溶媒やトルエンやベン
ゼンなどの芳香族系有機溶媒、酢酸エチルや酢酸ブチル
などのエステル類、ヘキサンやヘプタンなどの炭化水素
類、ジクロロメタンやクロロホルムなどのハロゲン化炭
化水素類、ジエチルエーテルなどのエーテル類などか
ら、適宜一種または二種以上選択して使用する事ができ
る。有機溶媒の使用量はＤ−アミノアシラーゼ活性の安
定な範囲で使用すれば良い。また熱処理を行なう場合、
４０℃〜７０℃程度で行なう事ができる。Ｄ−アミノア
シラーゼの安定性を考慮すれば４５℃〜５５℃で行なう
事が望ましい。熱処理時間はＤ−アミノアシラーゼ活性
の安定な範囲であればよく、３０分〜１００分も行なえ
ば充分である。
方法においては、Ｄ−アミノアシラーゼを、上記のＤ−
アミノアシラーゼ生産菌の培養液そのものや、該培養液
より遠心分離によって分離・回収して得られる形質転換
菌体、該形質転換菌体の菌体処理物の形で利用すること
もできる。ここでいう菌体処理物とは、該形質転換菌体
の抽出物や磨砕物、該抽出物や磨砕物のＤ−アミノアシ
ラーゼ活性画分を分離・精製して得られる分離物、該形
質転換菌体や該形質転換菌体の抽出物、磨砕物、分離物
を適当な担体を用いて固定化した固定化物の事を示して
いる。また宿主微生物由来の活性成分が該培養液そのも
のや、該培養液より遠心分離によって分離・回収して得
られる形質転換菌体、該形質転換菌体の菌体処理物の本
来の目的とする反応の反応性や選択性に悪影響を及ぼす
場合が考えられる。この場合、該培養液そのものや、該
培養液より遠心分離によって分離・回収して得られる形
質転換菌体、該形質転換菌体の菌体処理物を反応に先立
ってか、もしくは反応と同時に、有機溶媒処理または熱
処理を施す事によって反応性や選択性を改善する事が可
能である。有機溶媒としてはメタノール、エタノールな
どのアルコール類やアセトン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＤＭ
Ｉ、ＤＭＳＯなどの水溶性の有機溶媒やトルエンやベン
ゼンなどの芳香族系有機溶媒、酢酸エチルや酢酸ブチル
などのエステル類、ヘキサンやヘプタンなどの炭化水素
類、ジクロロメタンやクロロホルムなどのハロゲン化炭
化水素類、ジエチルエーテルなどのエーテル類などか
ら、適宜一種または二種以上選択して使用する事ができ
る。有機溶媒の使用量はＤ−アミノアシラーゼ活性の安
定な範囲で使用すれば良い。また熱処理を行なう場合、
４０℃〜７０℃程度で行なう事ができる。Ｄ−アミノア
シラーゼの安定性を考慮すれば４５℃〜５５℃で行なう
事が望ましい。熱処理時間はＤ−アミノアシラーゼ活性
の安定な範囲であればよく、３０分〜１００分も行なえ
ば充分である。
【００２６】本発明のＤ−アミノアシラーゼをＮ−アシ
ル−Ｄ−アミノ酸に作用させる際には、Ｄ−アミノアシ
ラーゼの活性や安定性など反応性にとって好ましい条件
を選択することが望ましい。
ル−Ｄ−アミノ酸に作用させる際には、Ｄ−アミノアシ
ラーゼの活性や安定性など反応性にとって好ましい条件
を選択することが望ましい。
【００２７】反応に用いる媒体としては、水あるいは各
種緩衝液からなる水性媒体を用いることができる。緩衝
液としては、リン酸、トリス、クエン酸、酢酸、ホウ
酸、グリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＣＡＰ
Ｓ、ＣＨＥＳ、ＰＩＰＥＳなどから適宜一種または二種
以上選択して成る成分を水に含有させた緩衝液を挙げる
ことができる。
種緩衝液からなる水性媒体を用いることができる。緩衝
液としては、リン酸、トリス、クエン酸、酢酸、ホウ
酸、グリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＣＡＰ
Ｓ、ＣＨＥＳ、ＰＩＰＥＳなどから適宜一種または二種
以上選択して成る成分を水に含有させた緩衝液を挙げる
ことができる。
【００２８】また、反応効率や生産物の収率を更に向上
させるために各種の添加剤を必要に応じて用いることが
できる。Ｄ−アミノアシラーゼには金属イオン、例えば
Ｚｎ 2+やＣｏ2+などで活性化されるものもあるため、こ
れら２価金属を反応液に添加する事もできる。また逆に
金属イオンにより阻害を受ける場合にはＥＤＴＡなどの
キレート剤を添加する事もできる。
させるために各種の添加剤を必要に応じて用いることが
できる。Ｄ−アミノアシラーゼには金属イオン、例えば
Ｚｎ 2+やＣｏ2+などで活性化されるものもあるため、こ
れら２価金属を反応液に添加する事もできる。また逆に
金属イオンにより阻害を受ける場合にはＥＤＴＡなどの
キレート剤を添加する事もできる。
【００２９】本発明におけるＤ−アミノ酸の製造に用い
る原料（Ｎ−アシルアミノ酸）としては、Ｎ−アシル−
Ｄ−アミノ酸を含むものであって、ＤＬ体、Ｄ体の割合
の多い光学活性体、Ｄ体のみからなるものなどを用いる
ことができる。
る原料（Ｎ−アシルアミノ酸）としては、Ｎ−アシル−
Ｄ−アミノ酸を含むものであって、ＤＬ体、Ｄ体の割合
の多い光学活性体、Ｄ体のみからなるものなどを用いる
ことができる。
【００３０】出発原料の濃度は特に制限はないが通常１
ｇ／ｌ〜３００ｇ／ｌ程度の濃度で用いられる。とりわ
け反応性や経済性を鑑みれば、好ましくは５０ｇ／ｌ以
上、より好ましくは１００ｇ／ｌ以上で、好ましくは２
００ｇ／ｌ以下の濃度が好適である。反応温度はＤ−ア
ミノアシラーゼがその活性を発現できる温度に維持する
事が好ましく、特に３０〜６０℃に維持する事が望まし
い。また反応ｐＨも、Ｄ−アミノアシラーゼがその活性
を発現できるｐＨに維持する事が好ましく、特にｐＨ６
〜１１に維持する事が望ましい。
ｇ／ｌ〜３００ｇ／ｌ程度の濃度で用いられる。とりわ
け反応性や経済性を鑑みれば、好ましくは５０ｇ／ｌ以
上、より好ましくは１００ｇ／ｌ以上で、好ましくは２
００ｇ／ｌ以下の濃度が好適である。反応温度はＤ−ア
ミノアシラーゼがその活性を発現できる温度に維持する
事が好ましく、特に３０〜６０℃に維持する事が望まし
い。また反応ｐＨも、Ｄ−アミノアシラーゼがその活性
を発現できるｐＨに維持する事が好ましく、特にｐＨ６
〜１１に維持する事が望ましい。
【００３１】本発明の新規なＤ−アミノアシラーゼは種
々のＮ−アシルアミノ酸のＤ体から対応するＤ−アミノ
酸を生じる性質を有しており、本発明のＤ−アミノアシ
ラーゼを用いてＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸より光学活
性アミノ酸を工業的に有利に製造する事が可能である。
適応可能なＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸としては特に制
限されず、広い範囲の化合物から選択できる。代表的な
好ましいＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸としては、Ｎ−ア
シル−ＤＬ−メチオニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−ロイシ
ン、Ｎ−アシル−ＤＬ−トリプトファン、Ｎ−アシル−
ＤＬ−５−ヒドロキシトリプトファン、Ｎ−アシル−Ｄ
Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−フェニルグ
リシン、Ｎ−アシル−ＤＬ−ホモフェニルアラニン、Ｎ
−アシル−ＤＬ−ビスホモフェニルアラニン、Ｎ−アシ
ル−ＤＬ−ｐ−ニトロフェニルアラニン、Ｎ−アシル−
ＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｎ−アシル−Ｄ
Ｌ−ｐ−クロロフェニルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−
ｐ−ブロモフェニルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−ｐ−
メトキシフェニルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−チロシ
ン、、Ｎ−アシル−ＤＬ−ｐ−シアノフェニルアラニ
ン、Ｎ−アシル−ＤＬ−２−ピリジルアラニン、Ｎ−ア
シル−ＤＬ−３−ピリジルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ
−４−ピリジルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−o―ベン
ジルセリン、Ｎ−アシル−ＤＬ−Ｓ−フェニルシステイ
ン、Ｎ−アシル−ＤＬ−１−ナフチルアラニン、Ｎ−ア
シル−ＤＬ−２−ナフチルアラニンなどを挙げることが
出来る。更に好ましいＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸とし
てはＮ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸が挙げられ、とりわ
けＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル
−Ｄ−トリプトファンに対して高い基質特異性を示す。
々のＮ−アシルアミノ酸のＤ体から対応するＤ−アミノ
酸を生じる性質を有しており、本発明のＤ−アミノアシ
ラーゼを用いてＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸より光学活
性アミノ酸を工業的に有利に製造する事が可能である。
適応可能なＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸としては特に制
限されず、広い範囲の化合物から選択できる。代表的な
好ましいＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸としては、Ｎ−ア
シル−ＤＬ−メチオニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−ロイシ
ン、Ｎ−アシル−ＤＬ−トリプトファン、Ｎ−アシル−
ＤＬ−５−ヒドロキシトリプトファン、Ｎ−アシル−Ｄ
Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−フェニルグ
リシン、Ｎ−アシル−ＤＬ−ホモフェニルアラニン、Ｎ
−アシル−ＤＬ−ビスホモフェニルアラニン、Ｎ−アシ
ル−ＤＬ−ｐ−ニトロフェニルアラニン、Ｎ−アシル−
ＤＬ−ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｎ−アシル−Ｄ
Ｌ−ｐ−クロロフェニルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−
ｐ−ブロモフェニルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−ｐ−
メトキシフェニルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−チロシ
ン、、Ｎ−アシル−ＤＬ−ｐ−シアノフェニルアラニ
ン、Ｎ−アシル−ＤＬ−２−ピリジルアラニン、Ｎ−ア
シル−ＤＬ−３−ピリジルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ
−４−ピリジルアラニン、Ｎ−アシル−ＤＬ−o―ベン
ジルセリン、Ｎ−アシル−ＤＬ−Ｓ−フェニルシステイ
ン、Ｎ−アシル−ＤＬ−１−ナフチルアラニン、Ｎ−ア
シル−ＤＬ−２−ナフチルアラニンなどを挙げることが
出来る。更に好ましいＮ−アシル−ＤＬ−アミノ酸とし
てはＮ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸が挙げられ、とりわ
けＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル
−Ｄ−トリプトファンに対して高い基質特異性を示す。
【００３２】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。
【００３３】尚、反応性及び光学純度は、反応で生成す
るＤ−アミノ酸及び残存するＮ−アシルアミノ酸を高速
液体クロマトグラフィ法（カラム：ＣＲＯＷＮＰＡＫ
ＣＲ（−）（ダイセル化学工業製）、カラム温度４０
℃、移動相：ＨＣｌＯ4水溶液ｐＨ１．５、０〜１５％
メタノール（ｖ／ｖ）、流速０．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出
２１０ｎｍ）で測定し、評価した。
るＤ−アミノ酸及び残存するＮ−アシルアミノ酸を高速
液体クロマトグラフィ法（カラム：ＣＲＯＷＮＰＡＫ
ＣＲ（−）（ダイセル化学工業製）、カラム温度４０
℃、移動相：ＨＣｌＯ4水溶液ｐＨ１．５、０〜１５％
メタノール（ｖ／ｖ）、流速０．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出
２１０ｎｍ）で測定し、評価した。
【００３４】実施例１：メチロバクテリウム メソフィ
リカム（Methylobacterium mesophilicum）ＭＴ１０８
９４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５６）の培養 下記の組成の液体培地にあらかじめブイヨン寒天プレー
トに生育させた菌体を接種し３０℃、４０時間振とう培
養してＤ−アミノアシラーゼの活性を有する菌体を得
た。 （培地組成） Ｎ−アセチル―ＤＬ−ロイシン：５ｇ／Ｌ グルコース： １０ｇ／Ｌ ペプトン：１０ｇ／Ｌ リン酸２水素カリウム：１ｇ／Ｌ リン酸１水素カリウム：１ｇ／Ｌ 硫酸マグネシウム７水和物：０．１ｇ／Ｌ イーストエキス：０．５ｇ／Ｌ ｐＨ７．０（ＫＯＨで調整）。
リカム（Methylobacterium mesophilicum）ＭＴ１０８
９４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５６）の培養 下記の組成の液体培地にあらかじめブイヨン寒天プレー
トに生育させた菌体を接種し３０℃、４０時間振とう培
養してＤ−アミノアシラーゼの活性を有する菌体を得
た。 （培地組成） Ｎ−アセチル―ＤＬ−ロイシン：５ｇ／Ｌ グルコース： １０ｇ／Ｌ ペプトン：１０ｇ／Ｌ リン酸２水素カリウム：１ｇ／Ｌ リン酸１水素カリウム：１ｇ／Ｌ 硫酸マグネシウム７水和物：０．１ｇ／Ｌ イーストエキス：０．５ｇ／Ｌ ｐＨ７．０（ＫＯＨで調整）。
【００３５】実施例２：ノカルディオイデス・サーモリ
ラシナス（Nocardioides thermolilacinus）（ＡＴＣＣ
３５８６３）の培養 下記の組成の液体培地にあらかじめブイヨン寒天プレー
トに生育させた菌体を接種し３０℃、１００時間振とう
培養してＤ−アミノアシラーゼの活性を有する菌体を得
た。 （培地組成） Ｎ−アセチル―ＤＬ−ロイシン：５ｇ／Ｌ Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ Ｌｉｑｕｉｄ ｍｅｄｉｕｍ
ｍｏｄｉｆｉｅｄ（Ｏｘｏｉｄ）：５ｇ／Ｌ イーストエキス：２ｇ／Ｌ ビタミンアッセイカザミノ酸：１０ｇ／Ｌ ｐＨ ７．２（ＫＯＨで調整）。
ラシナス（Nocardioides thermolilacinus）（ＡＴＣＣ
３５８６３）の培養 下記の組成の液体培地にあらかじめブイヨン寒天プレー
トに生育させた菌体を接種し３０℃、１００時間振とう
培養してＤ−アミノアシラーゼの活性を有する菌体を得
た。 （培地組成） Ｎ−アセチル―ＤＬ−ロイシン：５ｇ／Ｌ Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ Ｌｉｑｕｉｄ ｍｅｄｉｕｍ
ｍｏｄｉｆｉｅｄ（Ｏｘｏｉｄ）：５ｇ／Ｌ イーストエキス：２ｇ／Ｌ ビタミンアッセイカザミノ酸：１０ｇ／Ｌ ｐＨ ７．２（ＫＯＨで調整）。
【００３６】実施例３：メチロバクテリウム メソフィ
リカム（Methylobacterium mesophilicum）ＭＴ１０８
９４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５６）及びノカルディオイ
デス・サーモリラシナス（Nocardioides thermolilacin
us）（ＡＴＣＣ３５８６３）由来Ｄ−アミノアシラーゼ
の基質濃度と反応速度の相関性 （粗酵素溶液）実施例１及び２で示した方法により得ら
れたメチロバクテリウム メソフィリカム（Methylobac
terium mesophilicum）ＭＴ１０８９４（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−７８５６）及びノカルディオイデス・サーモリラシ
ナス（Nocardioides thermolilacinus）（ＡＴＣＣ３５
８６３）を用いて菌体溶液（０.１ｇ／０.１Ｍリン酸バ
ッファー（ｐＨ７.８）１ｍｌ）を調製し、超音波菌体
破砕機により破砕、冷却遠心機にて破砕菌体を沈殿させ
た上清を粗酵素溶液とする。 （基質溶液）Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度
が２００ｇ／ｌとなるように０.１Ｍリン酸バッファー
（ｐＨ７.８）に溶解したものを基質溶液とした。 （測定）基質溶液を０.１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.
８）で容量希釈して５、２５、５０、１００ｇ／ｌの基
質溶液を２００μｌ調製した。粗酵素溶液を２００μｌ
添加、３０℃で１時間反応後、１Ｍリン酸０.４ｍｌを
添加して反応を停止した。１Ｎ水酸化ナトリウム０.４
ｍｌを添加して析出した未反応アセチル体を溶解し、遠
心分離にて菌体破砕物除去後、反応液中の生成Ｄ−トリ
プトファンをＨＰＬＣにて測定した。基質濃度５ｇ／ｌ
としたときの反応速度を１００とし、２５、５０、１０
０ｇ／ｌとしたときの各菌株由来のＤ−アミノアシラー
ゼによるＤ−トリプトファン生成速度の相対値を表２に
示す。
リカム（Methylobacterium mesophilicum）ＭＴ１０８
９４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５６）及びノカルディオイ
デス・サーモリラシナス（Nocardioides thermolilacin
us）（ＡＴＣＣ３５８６３）由来Ｄ−アミノアシラーゼ
の基質濃度と反応速度の相関性 （粗酵素溶液）実施例１及び２で示した方法により得ら
れたメチロバクテリウム メソフィリカム（Methylobac
terium mesophilicum）ＭＴ１０８９４（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−７８５６）及びノカルディオイデス・サーモリラシ
ナス（Nocardioides thermolilacinus）（ＡＴＣＣ３５
８６３）を用いて菌体溶液（０.１ｇ／０.１Ｍリン酸バ
ッファー（ｐＨ７.８）１ｍｌ）を調製し、超音波菌体
破砕機により破砕、冷却遠心機にて破砕菌体を沈殿させ
た上清を粗酵素溶液とする。 （基質溶液）Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度
が２００ｇ／ｌとなるように０.１Ｍリン酸バッファー
（ｐＨ７.８）に溶解したものを基質溶液とした。 （測定）基質溶液を０.１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.
８）で容量希釈して５、２５、５０、１００ｇ／ｌの基
質溶液を２００μｌ調製した。粗酵素溶液を２００μｌ
添加、３０℃で１時間反応後、１Ｍリン酸０.４ｍｌを
添加して反応を停止した。１Ｎ水酸化ナトリウム０.４
ｍｌを添加して析出した未反応アセチル体を溶解し、遠
心分離にて菌体破砕物除去後、反応液中の生成Ｄ−トリ
プトファンをＨＰＬＣにて測定した。基質濃度５ｇ／ｌ
としたときの反応速度を１００とし、２５、５０、１０
０ｇ／ｌとしたときの各菌株由来のＤ−アミノアシラー
ゼによるＤ−トリプトファン生成速度の相対値を表２に
示す。
【００３７】
【表２】
【００３８】比較例１：公知の菌株由来Ｄ−アミノアシ
ラーゼの基質濃度と反応速度の相関性 公知のＤ−アミノアシラーゼ保有菌株であるアルカリゲ
ネス デニトリフィカンス サブスウピーシーズ キシ
ロースオキシダンス ＭＩ４（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｏ
ｓｏｄａｎｓＭＩ４）（ＦＥＲＭ Ｐ−９４１３）、ス
トレプトマイセス ツイルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ｔｕｉｒｕｓ）（ＩＦＯ１３４１８）由来のＤ−ア
ミノアシラーゼの基質濃度と反応速度の関係について調
べた。それぞれの菌株の調製方法について以下に記す。
アルカリゲネス デニトリフィカンス サブスウピーシ
ーズ キシロースオキシダンス ＭＩ４（Ａｌｃａｌｉ
ｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ｓｕｂｓ
ｐ．ｘｙｌｏｓｏｄａｎｓ ＭＩ４）（ＦＥＲＭＰ−９
４１３）は実施例１記載の方法と同様に行なった。スト
レプトマイセスツイルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｔｕｉｒｕｓ）（ＩＦＯ１３４１８）は下記の組成の液
体培地にて３０℃で４８時間培養を行なった。 （培地組成） Ｄ−バリン：４ｇ／Ｌ グルコース：１０ｇ／Ｌ ペプトン：１０ｇ／Ｌ リン酸２水素カリウム：１ｇ／Ｌ リン酸１水素カリウム：１ｇ／Ｌ 硫酸マグネシウム７水和物：０．５ｇ／Ｌ イーストエキス：１０ｇ／Ｌ 塩化コバルト：１ｍｇ／ｍｌ ｐＨ７．０（ＫＯＨで調整） 粗酵素液の調製方法、基質液の調製方法、酵素活性の測
定方法は実施例３に記載の通りに行なった。基質濃度５
ｇ／ｌとしたときの反応速度を１００とし、２５、５
０、１００ｇ／ｌとしたときの各菌株由来のＤ−アミノ
アシラーゼによるＤ−トリプトファン生成速度の相対値
を表３に示す
ラーゼの基質濃度と反応速度の相関性 公知のＤ−アミノアシラーゼ保有菌株であるアルカリゲ
ネス デニトリフィカンス サブスウピーシーズ キシ
ロースオキシダンス ＭＩ４（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｏ
ｓｏｄａｎｓＭＩ４）（ＦＥＲＭ Ｐ−９４１３）、ス
トレプトマイセス ツイルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ｔｕｉｒｕｓ）（ＩＦＯ１３４１８）由来のＤ−ア
ミノアシラーゼの基質濃度と反応速度の関係について調
べた。それぞれの菌株の調製方法について以下に記す。
アルカリゲネス デニトリフィカンス サブスウピーシ
ーズ キシロースオキシダンス ＭＩ４（Ａｌｃａｌｉ
ｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ｓｕｂｓ
ｐ．ｘｙｌｏｓｏｄａｎｓ ＭＩ４）（ＦＥＲＭＰ−９
４１３）は実施例１記載の方法と同様に行なった。スト
レプトマイセスツイルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｔｕｉｒｕｓ）（ＩＦＯ１３４１８）は下記の組成の液
体培地にて３０℃で４８時間培養を行なった。 （培地組成） Ｄ−バリン：４ｇ／Ｌ グルコース：１０ｇ／Ｌ ペプトン：１０ｇ／Ｌ リン酸２水素カリウム：１ｇ／Ｌ リン酸１水素カリウム：１ｇ／Ｌ 硫酸マグネシウム７水和物：０．５ｇ／Ｌ イーストエキス：１０ｇ／Ｌ 塩化コバルト：１ｍｇ／ｍｌ ｐＨ７．０（ＫＯＨで調整） 粗酵素液の調製方法、基質液の調製方法、酵素活性の測
定方法は実施例３に記載の通りに行なった。基質濃度５
ｇ／ｌとしたときの反応速度を１００とし、２５、５
０、１００ｇ／ｌとしたときの各菌株由来のＤ−アミノ
アシラーゼによるＤ−トリプトファン生成速度の相対値
を表３に示す
【００３９】
【表３】
【００４０】実施例４：メチロバクテリウム メソフィ
リカム（Methylobacterium mesophilicum）ＭＴ１０８
９４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５６）由来Ｄ−アミノアシ
ラーゼのＮ末端アミノ酸配列決定 実施例１に示される方法でメチロバクテリウム メソフ
ィリカムを培養して菌体を回収し、１ｍＭ ＤＴＴ（Di
thiothreitol）を添加した０.１Ｍリン酸バッファー
（ｐＨ７.８）に懸濁した。懸濁液の状態で超音波破砕
機によって菌体を破砕し、冷却遠心分離にて菌体破砕物
を除去し、粗酵素溶液を得た。この粗酵素溶液に対して
硫安を添加し、３０〜６０％の沈殿画分を脱塩後、ＤＥ
ＡＥトヨパールカラムに通してパス画分を回収した。こ
の画分をさらにフェニルトヨパール、Ｑ−セファロース
によるクロマトグラフィーに供し、Ｄ−アミノアシラー
ゼ活性を持つ画分を得た。この画分についてドデシル硫
酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
い、分子量約５６ｋＤａの位置にバンドを確認した。こ
の５６ｋＤａタンパク質についてＮ末端アミノ酸配列の
分析を行ったところ、配列番号：３に示す様にThr-Asp-
Ser-Thr-Arg-と決定された。
リカム（Methylobacterium mesophilicum）ＭＴ１０８
９４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５６）由来Ｄ−アミノアシ
ラーゼのＮ末端アミノ酸配列決定 実施例１に示される方法でメチロバクテリウム メソフ
ィリカムを培養して菌体を回収し、１ｍＭ ＤＴＴ（Di
thiothreitol）を添加した０.１Ｍリン酸バッファー
（ｐＨ７.８）に懸濁した。懸濁液の状態で超音波破砕
機によって菌体を破砕し、冷却遠心分離にて菌体破砕物
を除去し、粗酵素溶液を得た。この粗酵素溶液に対して
硫安を添加し、３０〜６０％の沈殿画分を脱塩後、ＤＥ
ＡＥトヨパールカラムに通してパス画分を回収した。こ
の画分をさらにフェニルトヨパール、Ｑ−セファロース
によるクロマトグラフィーに供し、Ｄ−アミノアシラー
ゼ活性を持つ画分を得た。この画分についてドデシル硫
酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
い、分子量約５６ｋＤａの位置にバンドを確認した。こ
の５６ｋＤａタンパク質についてＮ末端アミノ酸配列の
分析を行ったところ、配列番号：３に示す様にThr-Asp-
Ser-Thr-Arg-と決定された。
【００４１】実施例５：メチロバクテリウム メソフィ
リカム（Methylobactrium mesophilicum）ＭＴ１０８９
４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５６）のゲノミックＤＮＡラ
イブラリー作成 実施例１に示した培養方法でメチロバクテリウム メソ
フィリカム（Methylobactrium mesophilicum）を２日間
培養し、遠心分離で菌体を回収し、リン酸バッファー
（ｐＨ７.８）で洗浄した。この菌体より「基礎生化学
実験法２ 抽出・分離・精製 阿南功一他著 丸善株式
会社出版」記載によるバクテリアゲノムＤＮＡの分離方
法に従い、ゲノムＤＮＡを調製した。調製したゲノムＤ
ＮＡを制限酵素Sac Iで完全消化して超遠心分離法にて
ＤＮＡの長さによって分画し、３ｋｂ以上のＤＮＡを回
収した。それらのＤＮＡと、制限酵素SacIで消化して
５'末端を脱リン酸化したベクターｐＵＣ１８とをＤＮ
Ａ連結反応に供し、プラスミドライブラリーを作成し
た。このプラスミドライブラリーによって大腸菌ＤＨ５
αを形質転換したものを５０μｇ/ｍｌのアンピシリン
を添加したＬＢ（Luria-Bertani）アガロース培地に塗
布して静置培養し、コロニーを出現させた。
リカム（Methylobactrium mesophilicum）ＭＴ１０８９
４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５６）のゲノミックＤＮＡラ
イブラリー作成 実施例１に示した培養方法でメチロバクテリウム メソ
フィリカム（Methylobactrium mesophilicum）を２日間
培養し、遠心分離で菌体を回収し、リン酸バッファー
（ｐＨ７.８）で洗浄した。この菌体より「基礎生化学
実験法２ 抽出・分離・精製 阿南功一他著 丸善株式
会社出版」記載によるバクテリアゲノムＤＮＡの分離方
法に従い、ゲノムＤＮＡを調製した。調製したゲノムＤ
ＮＡを制限酵素Sac Iで完全消化して超遠心分離法にて
ＤＮＡの長さによって分画し、３ｋｂ以上のＤＮＡを回
収した。それらのＤＮＡと、制限酵素SacIで消化して
５'末端を脱リン酸化したベクターｐＵＣ１８とをＤＮ
Ａ連結反応に供し、プラスミドライブラリーを作成し
た。このプラスミドライブラリーによって大腸菌ＤＨ５
αを形質転換したものを５０μｇ/ｍｌのアンピシリン
を添加したＬＢ（Luria-Bertani）アガロース培地に塗
布して静置培養し、コロニーを出現させた。
【００４２】実施例６：プラスミドライブラリーからの
Ｄ−アミノアシラーゼ活性スクリーニング 実施例５で出現した個々のコロニーをＬＢ培地（１％バ
クトトリプトン、０.５％バクトイーストエキストラク
ト、１％塩化ナトリウム、ｐＨ７.０）で３７℃一晩液
体振盪培養し、遠心分離によって形質転換体を沈殿さ
せ、０.１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.８）にて一回洗
浄後、再び遠心分離にて菌体を回収した。回収した菌体
を破砕したものを粗酵素溶液とし、基質であるＮ−アセ
チル−Ｄ−トリプトファンと反応させてＤ−トリプトフ
ァンを生成するＤ−アミノアシラーゼ活性を有する形質
転換体を選抜した。以下にその測定法を示す。 （粗酵素溶液）上記回収菌体を０.１ｍｇ/ｍｌの濃度に
なるように０.１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７.８）に
懸濁し、超音波菌体破砕機にて菌体を破砕した後、冷却
遠心機にて破砕菌体を沈殿させた上清を粗酵素溶液とし
た。 （基質溶液）Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度
が１０ｇ／ｌとなるように０.１Ｍリン酸バッファー
（ｐＨ７.８）に溶解したものを基質溶液とした。 （測定）基質溶液２００μｌに対し粗酵素溶液２００μ
ｌ添加、３０℃、１時間反応後、１Ｍリン酸０.４ｍｌ
を添加して反応を停止した。遠心分離にて菌体破砕物除
去後、反応液中の生成Ｄ−トリプトファンをＨＰＬＣに
て測定した。
Ｄ−アミノアシラーゼ活性スクリーニング 実施例５で出現した個々のコロニーをＬＢ培地（１％バ
クトトリプトン、０.５％バクトイーストエキストラク
ト、１％塩化ナトリウム、ｐＨ７.０）で３７℃一晩液
体振盪培養し、遠心分離によって形質転換体を沈殿さ
せ、０.１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.８）にて一回洗
浄後、再び遠心分離にて菌体を回収した。回収した菌体
を破砕したものを粗酵素溶液とし、基質であるＮ−アセ
チル−Ｄ−トリプトファンと反応させてＤ−トリプトフ
ァンを生成するＤ−アミノアシラーゼ活性を有する形質
転換体を選抜した。以下にその測定法を示す。 （粗酵素溶液）上記回収菌体を０.１ｍｇ/ｍｌの濃度に
なるように０.１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７.８）に
懸濁し、超音波菌体破砕機にて菌体を破砕した後、冷却
遠心機にて破砕菌体を沈殿させた上清を粗酵素溶液とし
た。 （基質溶液）Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度
が１０ｇ／ｌとなるように０.１Ｍリン酸バッファー
（ｐＨ７.８）に溶解したものを基質溶液とした。 （測定）基質溶液２００μｌに対し粗酵素溶液２００μ
ｌ添加、３０℃、１時間反応後、１Ｍリン酸０.４ｍｌ
を添加して反応を停止した。遠心分離にて菌体破砕物除
去後、反応液中の生成Ｄ−トリプトファンをＨＰＬＣに
て測定した。
【００４３】実施例７：Ｄ−アミノアシラーゼ遺伝子を
コードするＤＮＡの塩基配列決定 実施例６より得られたＤ−アミノアシラーゼ活性を有す
る形質転換体よりプラスミドを抽出し、その物理的地図
を調べたところ、図１の様であることが判明した。さら
にその塩基配列の解析を行った。塩基配列の決定はPE A
pplied Biosystems社、BigDye Teminator Cycle Sequen
cing kitを用い、同社製Genetic Analyzer 310にて行っ
た。その結果配列番号１に示すＤ−アミノアシラーゼ遺
伝子をコードするＤＮＡの塩基配列が得られた。該Ｄ−
アミノアシラーゼ遺伝子の塩基配列をアミノ酸翻訳した
ものを配列番号２に示す。そのＮ末端のアミノ酸配列は
実施例２に示したＮ−末端アミノ酸配列分析の結果と一
致した。また、該アミノ酸配列からＤ−アミノアシラー
ゼの分子量は約５３ｋＤａと推定された。
コードするＤＮＡの塩基配列決定 実施例６より得られたＤ−アミノアシラーゼ活性を有す
る形質転換体よりプラスミドを抽出し、その物理的地図
を調べたところ、図１の様であることが判明した。さら
にその塩基配列の解析を行った。塩基配列の決定はPE A
pplied Biosystems社、BigDye Teminator Cycle Sequen
cing kitを用い、同社製Genetic Analyzer 310にて行っ
た。その結果配列番号１に示すＤ−アミノアシラーゼ遺
伝子をコードするＤＮＡの塩基配列が得られた。該Ｄ−
アミノアシラーゼ遺伝子の塩基配列をアミノ酸翻訳した
ものを配列番号２に示す。そのＮ末端のアミノ酸配列は
実施例２に示したＮ−末端アミノ酸配列分析の結果と一
致した。また、該アミノ酸配列からＤ−アミノアシラー
ゼの分子量は約５３ｋＤａと推定された。
【００４４】実施例８：メチロバクテリウム メソフィ
リカム（Methylobacterium mesophilicum）ＭＴ１０８
９４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５６）由来Ｄ−アミノアシ
ラーゼ遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換した大腸菌
を用いたＮ−アセチル−ＤＬ−トリプトファンを基質と
したときの反応評価 （菌体懸濁液の調製）実施例７の図１で示されるプラス
ミドで形質転換した大腸菌をアンピシリン（５０μｇ／
ｍｌ）を含むＬＢ培地で終夜３７℃振とう培養を行なっ
た。培養後、遠心分離により集菌、０.１Ｍのリン酸バ
ッファー（ｐＨ７.８）で洗浄後に菌体を０.１Ｍのリン
酸バッファー（ｐＨ７.８）に懸濁した。 （Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン溶液の調製）Ｎ
−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が２００ｇ／ｌ
となるように０.１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.８）に
溶解したものを基質溶液とした。 （測定）上記菌体懸濁液２.５ｍｌと基質溶液２.５ｍｌ
をあらかじめ４０℃に保温し、この２つの溶液を混合し
た後４０℃で反応を行った（反応基質濃度：１００ｇ／
ｌ）。反応開始２０時間後に反応液１００μｌを採取
し、同量の１ＮＮａＯＨを添加して反応を停止した。そ
の後、ＨＰＬＣ移動相で１／２００に希釈して、遠心分
離によって菌体を沈殿させ、上清をＨＰＬＣによって分
析し、生成したＤ−およびＬ−トリプトファン、そして
基質であるＮ−アセチル−ＤＬ−トリプトファンの濃度
を測定した。その結果を表４に示す。
リカム（Methylobacterium mesophilicum）ＭＴ１０８
９４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５６）由来Ｄ−アミノアシ
ラーゼ遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換した大腸菌
を用いたＮ−アセチル−ＤＬ−トリプトファンを基質と
したときの反応評価 （菌体懸濁液の調製）実施例７の図１で示されるプラス
ミドで形質転換した大腸菌をアンピシリン（５０μｇ／
ｍｌ）を含むＬＢ培地で終夜３７℃振とう培養を行なっ
た。培養後、遠心分離により集菌、０.１Ｍのリン酸バ
ッファー（ｐＨ７.８）で洗浄後に菌体を０.１Ｍのリン
酸バッファー（ｐＨ７.８）に懸濁した。 （Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファン溶液の調製）Ｎ
−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が２００ｇ／ｌ
となるように０.１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.８）に
溶解したものを基質溶液とした。 （測定）上記菌体懸濁液２.５ｍｌと基質溶液２.５ｍｌ
をあらかじめ４０℃に保温し、この２つの溶液を混合し
た後４０℃で反応を行った（反応基質濃度：１００ｇ／
ｌ）。反応開始２０時間後に反応液１００μｌを採取
し、同量の１ＮＮａＯＨを添加して反応を停止した。そ
の後、ＨＰＬＣ移動相で１／２００に希釈して、遠心分
離によって菌体を沈殿させ、上清をＨＰＬＣによって分
析し、生成したＤ−およびＬ−トリプトファン、そして
基質であるＮ−アセチル−ＤＬ−トリプトファンの濃度
を測定した。その結果を表４に示す。
【００４５】
【表４】
【００４６】＊（生成Ｄ−トリプトファン［ｍＭ］）÷
（生成Ｄ−トリプトファン［ｍＭ］+生成Ｌ−トリプト
ファン［ｍＭ］+残存Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトフ
ァン［ｍＭ］）。
（生成Ｄ−トリプトファン［ｍＭ］+生成Ｌ−トリプト
ファン［ｍＭ］+残存Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトフ
ァン［ｍＭ］）。
【００４７】実施例９：メチロバクテリウム メソフィ
リカム（Methylobacterium mesophilicum）ＭＴ１０８
９４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５６）由来Ｄ−アミノアシ
ラーゼ遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換した大腸菌
のＮ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸に対する基質特異性 実施例７の図１で示されるプラスミドで形質転換した大
腸菌のＮ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸に対する基質特異
性を比較した。本実施例においては、基質であるＮ−ア
セチル−ＤＬ−アミノ酸濃度を５ｇ／ｌに設定して４０
℃で１６時間反応を行った。Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリ
プトファンを基質とした時のＤ−アミノアシラーゼ活性
を１００として、各種Ｎ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸に
対する相対活性を、またその時の光学純度及び反応収率
を求めた。その結果を表５に示す。
リカム（Methylobacterium mesophilicum）ＭＴ１０８
９４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５６）由来Ｄ−アミノアシ
ラーゼ遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換した大腸菌
のＮ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸に対する基質特異性 実施例７の図１で示されるプラスミドで形質転換した大
腸菌のＮ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸に対する基質特異
性を比較した。本実施例においては、基質であるＮ−ア
セチル−ＤＬ−アミノ酸濃度を５ｇ／ｌに設定して４０
℃で１６時間反応を行った。Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリ
プトファンを基質とした時のＤ−アミノアシラーゼ活性
を１００として、各種Ｎ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸に
対する相対活性を、またその時の光学純度及び反応収率
を求めた。その結果を表５に示す。
【００４８】
【表５】
【００４９】＊：（生成Ｄ−アミノ酸［ｍＭ］）÷（生
成Ｄ−アミノ酸［ｍＭ］+生成Ｌ−アミノ酸［ｍＭ］+残
存Ｎ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸［ｍＭ］）
成Ｄ−アミノ酸［ｍＭ］+生成Ｌ−アミノ酸［ｍＭ］+残
存Ｎ−アセチル−ＤＬ−アミノ酸［ｍＭ］）
【００５０】
【発明の効果】本発明により、メチロバクテリウム メ
ソフィリカム（Methylobacterium mesophilicum）ＭＴ
１０８９４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５６）などに由来す
る新規なＤ−アミノアシラーゼ及びそれをコードするＤ
ＮＡが提供される。本発明のＤ−アミノアシラーゼは産
業上の有用性に優れた酵素であり、Ｎ−アシルアミノ酸
から対応するＤ−アミノ酸を高効率で製造することがで
きる。
ソフィリカム（Methylobacterium mesophilicum）ＭＴ
１０８９４（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５６）などに由来す
る新規なＤ−アミノアシラーゼ及びそれをコードするＤ
ＮＡが提供される。本発明のＤ−アミノアシラーゼは産
業上の有用性に優れた酵素であり、Ｎ−アシルアミノ酸
から対応するＤ−アミノ酸を高効率で製造することがで
きる。
【００５１】
【配列表】 <110> Mitsui Chemicals Inc. <120> DNA encoding a new D-aminoacylase and method of producing thereof using the same <130> P0000716 <160> 3 <210> 1 <211> 1464 <212> DNA <213> Methylobacterium mesophilicum <400> 1 atgaccgaca gcacccgtaa gcacgacctg atcatccgcg gcggcaccgt catcgacggc 60 cgccggacgc cccgcttccg cgccgatgtg gcggtgcgcg acggccgact gagcgccatc 120 ggcgatctgg cggaccatcg ggccgcccag gagatcgatg ccacgggacg catcgtggcg 180 ccgggcttca tcgactcgca cacgcacgat gaccaggcgg tgctgtcgca gccgcagatc 240 ccgttcaagg tgtcgcaggg cgtcacgacg gtgatcgccg gcaattgcgg catcagcgcg 300 gcgccgctgc ggcgggacat ggacctgccc atgcccctca acctgatcga cgtgcccgcc 360 gaggagcgct tcacccgctt cgccgactac ctggatgcgc tgcgtgcccg cccctcgtcg 420 gtcaacgtgg ccgcgatggt cggccactcc accctgcgcg ccgtcaccat gccggcgctg 480 gaccgcgagg ccaacagcga ggaaatcgca cgcatgcgcg cgctggtgca ggaggcgatg 540 gacgcgggcg ccatcggcgt ctccaccggc accttctatc cacccgcggt gaaggccacc 600 acggaggaga tcatcgaagt ctgccggccc ctcactgccg cggggggcct gtacgtcacc 660 cacatgcggg acgagtccga ccaggtgatg acctcgctgg aagagacctt ccgcatcggc 720 cgcgcgctgg acgtgccggt ggtcgtctcc caccacaaag tgcagaacac gcccaacttc 780 ggcaagtcgc aggtcacgct gcccttcatc cgcgaagcca tgcaacgcca gcgcagtgtg 840 cctcgactgc tatccctaca cggcgggctc gaccatgatc cgcgcggacc ggggcatgct 900 cgaaggccgc gtgctgatcg ccgagagcct gccgcatccg gaatgcgcag gccgcgacct 960 ggacgacatc gcccgcgact ggggcgtgac cgggtggagg ccgcccgccg gctgcagccc 1020 ggcagcgcca tctacttcct gatggacgag ggcgatgtgc agcgcatcct ggccttcgac 1080 gacacgatga tcggctcgga cggcatcccg gtcggcagca agccgcatcc gcggctctgg 1140 ggcaccttcc cgcgcgtgct gggccattac agccgcgacg tcggcctgtt ccccctggag 1200 accgccgtct ggaagatgac cggactcacg gcccgcaact tcggcctgca cggccggggc 1260 acgctggagg ccggccaggc cgccgacatc gtggtcttcg atgccggcac cgtgcgcgac 1320 gcggccgact atgccgagcc cacgcgtccc gcggaaggca tcgatgcggt gatcgtcaat 1380 ggcgccatca cctggcaagg cggccagcac acgggcgcac gccagggtca ggtcatccgc 1440 cgccaggcgg ccccatccca ctga 1464 <210> 2 <211> 487 <212> PRT <213> Methylobacterium mesophilicum <400> 2 Met Thr Asp Ser Thr Arg Lys His Asp Leu Ile Ile Arg Gly Gly Thr 1 5 10 15 Val Ile Asp Gly Arg Arg Thr Pro Arg Phe Arg Ala Asp Val Ala Val 20 25 30 Arg Asp Gly Arg Leu Ser Ala Ile Gly Asp Leu Ala Asp His Arg Ala 35 40 45 Ala Gln Glu Ile Asp Ala Thr Gly Arg Ile Val Ala Pro Gly Phe Ile 50 55 60 Asp Ser His Thr His Asp Asp Gln Ala Val Leu Ser Gln Pro Gln Ile 65 70 75 80 Pro Phe Lys Val Ser Gln Gly Val Thr Thr Val Ile Ala Gly Asn Cys 85 90 95 Gly Ile Ser Ala Ala Pro Leu Arg Arg Asp Met Asp Leu Pro Met Pro 100 105 110 Leu Asn Leu Ile Asp Val Pro Ala Glu Glu Arg Phe Thr Arg Phe Ala 115 120 125 Asp Tyr Leu Asp Ala Leu Arg Ala Arg Pro Ser Ser Val Asn Val Ala 130 135 140 Ala Met Val Gly His Ser Thr Leu Arg Ala Val Thr Met Pro Ala Leu 145 150 155 160 Asp Arg Glu Ala Asn Ser Glu Glu Ile Ala Arg Met Arg Ala Leu Val 165 170 175 Gln Glu Ala Met Asp Ala Gly Ala Ile Gly Val Ser Thr Gly Thr Phe 180 185 190 Tyr Pro Pro Ala Val Lys Ala Thr Thr Glu Glu Ile Ile Glu Val Cys 195 200 205 Arg Pro Leu Thr Ala Ala Gly Gly Leu Tyr Val Thr His Met Arg Asp 210 215 220 Glu Ser Asp Gln Val Met Thr Ser Leu Glu Glu Thr Phe Arg Ile Gly 225 230 235 240 Arg Ala Leu Asp Val Pro Val Val Val Ser His His Lys Val Gln Asn 245 250 255 Thr Pro Asn Phe Gly Lys Ser Gln Val Thr Leu Pro Phe Ile Arg Glu 260 265 270 Ala Met Gln Arg Gln Arg Ser Val Pro Arg Leu Leu Ser Leu His Gly 275 280 285 Gly Leu Asp His Asp Pro Arg Gly Pro Gly His Ala Arg Arg Pro Arg 290 295 300 Ala Asp Arg Arg Glu Pro Ala Ala Ser Gly Met Arg Arg Pro Arg Pro 305 310 315 320 Gly Arg His Arg Pro Arg Leu Gly Arg Asp Arg Val Glu Ala Ala Arg 325 330 335 Arg Leu Gln Pro Gly Ser Ala Ile Tyr Phe Leu Met Asp Glu Gly Asp 340 345 350 Val Gln Arg Ile Leu Ala Phe Asp Asp Thr Met Ile Gly Ser Asp Gly 355 360 365 Ile Pro Val Gly Ser Lys Pro His Pro Arg Leu Trp Gly Thr Phe Pro 370 375 380 Arg Val Leu Gly His Tyr Ser Arg Asp Val Gly Leu Phe Pro Leu Glu 385 390 395 400 Thr Ala Val Trp Lys Met Thr Gly Leu Thr Ala Arg Asn Phe Gly Leu 405 410 415 His Gly Arg Gly Thr Leu Glu Ala Gly Gln Ala Ala Asp Ile Val Val 420 425 430 Phe Asp Ala Gly Thr Val Arg Asp Ala Ala Asp Tyr Ala Glu Pro Thr 435 440 445 Arg Pro Ala Glu Gly Ile Asp Ala Val Ile Val Asn Gly Ala Ile Thr 450 455 460 Trp Gln Gly Gly Gln His Thr Gly Ala Arg Gln Gly Gln Val Ile Arg 465 470 475 480 Arg Gln Ala Ala Pro Ser His 485 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Methylobacterium mesophilicum <400> 3 Thr Asp Ser Thr Arg 1 5
【図１】組替えプラスミドｐＵＳＤＡ３の物理的地図を
示す図である。図中、oriはプラスミドの複製開始点
を、Amprはアンピシリン耐性マーカーを、SacI，HincI
I，PstI，XhoIは各々制限酵素認識部位をそれぞれ示
す。また、太矢印はＤ−アミノアシラーゼのＯＲＦの位
置と向きを示す。
示す図である。図中、oriはプラスミドの複製開始点
を、Amprはアンピシリン耐性マーカーを、SacI，HincI
I，PstI，XhoIは各々制限酵素認識部位をそれぞれ示
す。また、太矢印はＤ−アミノアシラーゼのＯＲＦの位
置と向きを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｐ 13/22 Ａ Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 13/22 5/00 Ａ (72)発明者 八巻 俊文 千葉県茂原市東郷1144 三井化学株式会社 内 (72)発明者 有井 輝夫 千葉県茂原市東郷1144 三井化学株式会社 内 (72)発明者 及川 利洋 千葉県茂原市東郷1144 三井化学株式会社 内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA71 BA75 CA03 EA04 GA11 HA03 4B050 CC03 DD02 LL05 4B064 AE03 AE34 CA19 CC24 CD13 DA01 DA02 DA11 4B065 AB01 BA01 CA28 CA44 CA47
Claims (28)
- 【請求項１】 Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸に作用して対
応するＤ−アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有
するＤ−アミノアシラーゼであって、 水性媒体中でＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンからＤ
−トリプトファンを生成する反応を触媒する際における
Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５０ｇ／ｌ
の場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファ
ンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に対して少なくと
も４０％である事を特徴とするＤ−アミノアシラーゼ。 - 【請求項２】 Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃
度が１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−
Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度
に対して少なくとも２０％である請求項1記載のＤ−ア
ミノアシラーゼ。 - 【請求項３】 メチロバクテリウム（Methylobacteriu
m）属又はノカルディオイデス（Nocardioides）属に属
する微生物由来である請求項１に記載のＤ−アミノアシ
ラーゼ。 - 【請求項４】 メチロバクテリウム（Methylobacteriu
m）属に属する微生物がメチロバクテリウム・メソフィ
リカム（Methylobacterium mesophilicum）種、ノカル
ディオイデス（Nocardioides）属に属する微生物がノカ
ルディオイデス・サーモリラシナス（Nocardioides the
rmolilacinus）種である請求項３記載のＤ−アミノアシ
ラーゼ。 - 【請求項５】 ノカルディオイデス・サーモリラシナス
（Nocardioides thermolilacinus）種に属する微生物が
ノカルディオイデス・サーモリラシナス（Nocardioides
thermolilacinus）ＡＴＣＣ３５８６３株である請求項
４記載のＤ−アミノアシラーゼ。 - 【請求項６】 Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸に作用して対
応するＤ−アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有
するＤ−アミノアシラーゼであって、 （Ａ）配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列または （Ｂ）該アミノ酸配列に対して前記触媒活性を維持し得
る範囲内で１以上のアミノ酸残基の挿入、欠失または置
換を行って得られる変異アミノ酸配列 を有することを特徴とするＤ−アミノアシラーゼ。 - 【請求項７】 水性媒体中でＮ−アセチル−Ｄ−トリプ
トファンからＤ−トリプトファンを生成する反応を触媒
する際におけるＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃
度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−Ｄ
−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度に
対して少なくとも４０％である請求項６に記載のＤ−ア
ミノアシラーゼ。 - 【請求項８】 Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃
度が１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル−
Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速度
に対して少なくとも２０％である請求項７に記載のＤ−
アミノアシラーゼ。 - 【請求項９】 Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸に作用して対
応するＤ−アミノ酸を生成する反応を触媒する作用を有
するＤ−アミノアシラーゼをコードする塩基配列であっ
て、 （ａ）配列表の配列番号：１記載の塩基配列または （ｂ）配列番号：１の塩基配列に対して該塩基配列がコ
ードするＤ−アミノアシラーゼの作用が維持される範囲
内で１以上の塩基の挿入、欠失または置換を行って得ら
れる変異塩基配列 からなることを特徴とするＤ−アミノアシラーゼをコー
ドする塩基配列。 - 【請求項１０】 前記変異塩基配列が、前記配列番号：
１の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズするものである請求項９に記載の塩基配列。 - 【請求項１１】 Ｄ−アミノアシラーゼが水性媒体中で
Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンからＤ−トリプトフ
ァンを生成する反応を触媒する際のＮ−アセチル−Ｄ−
トリプトファンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度
が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／
ｌの場合の反応速度に対して少なくとも４０％である請
求項９に記載の塩基配列。 - 【請求項１２】 Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの
濃度が１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル
−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速
度に対して少なくとも２０％である請求項１１に記載の
塩基配列。 - 【請求項１３】 請求項９に記載の塩基配列を含むプラ
スミド。 - 【請求項１４】 請求項１３に記載のプラスミドによっ
て形質転換された形質転換体。 - 【請求項１５】 請求項１４に記載の形質転換体を培養
して、該形質転換体に組み込まれたプラスミドの有する
塩基配列によりコードされたＤ−アミノアシラーゼを生
産させることを特徴とするＤ−アミノアシラーゼの産生
方法。 - 【請求項１６】 水性媒体中でＮ−アシルアミノ酸にＤ
−アミノアシラーゼを作用させて対応するＤ−アミノ酸
を生産する光学活性アミノ酸の生産方法であって、該Ｄ
−アミノアシラーゼが水性媒体中でＮ−アセチル−Ｄ−
トリプトファンからＤ−トリプトファンを生成する反応
を触媒する際におけるＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファ
ンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチ
ル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応
速度に対して少なくとも４０％であることを特徴とする
光学活性アミノ酸の生産方法。 - 【請求項１７】 Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの
濃度が１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル
−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速
度に対して少なくとも２０％である請求項1６記載の生
産方法。 - 【請求項１８】 メチロバクテリウム（Methylobacteri
um）属又はノカルディオイデス（Nocardioides）属に属
する微生物由来である請求項１６に記載の生産方法。 - 【請求項１９】 メチロバクテリウム（Methylobacteri
um）属に属する微生物がメチロバクテリウム・メソフィ
リカム（Methylobacterium mesophilicum）種、ノカル
ディオイデス（Nocardioides）属に属する微生物がノカ
ルディオイデス・サーモリラシナス（Nocardioides the
rmolilacinus）種である請求項１８記載の生産方法。 - 【請求項２０】 ノカルディオイデス・サーモリラシナ
ス（Nocardioides thermolilacinus）種に属する微生物
がノカルディオイデス・サーモリラシナス（Nocardioid
es thermolilacinus）ＡＴＣＣ３５８６３株である請求
項１９記載の生産方法。 - 【請求項２１】 Ｎ−アシルアミノ酸濃度が５０ｇ／ｌ
以上である請求項１６に記載の製造方法。 - 【請求項２２】 Ｎ−アシルアミノ酸濃度が１００ｇ／
ｌ以上である請求項２１記載の製造方法。 - 【請求項２３】 水性媒体中でＮ−アシルアミノ酸にＤ
−アミノアシラーゼを作用させて対応するＤ−アミノ酸
を生産する光学活性アミノ酸の生産方法であって、該Ｄ
−アミノアシラーゼが請求項６に記載のＤ−アミノアシ
ラーゼであることを特徴とする光学活性アミノ酸の生産
方法。 - 【請求項２４】 前記Ｄ−アミノアシラーゼが水性媒体
中でＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンからＤ−トリプ
トファンを生成する反応を触媒する際のＮ−アセチル−
Ｄ−トリプトファンの濃度が５０ｇ／ｌの場合の反応速
度が、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ
／ｌの場合の反応速度に対して少なくとも４０％である
請求項２３に記載の生産方法。 - 【請求項２５】 Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの
濃度が１００ｇ／ｌの場合の反応速度が、Ｎ−アセチル
−Ｄ−トリプトファンの濃度が５ｇ／ｌの場合の反応速
度に対して少なくとも２０％である請求項２４に記載の
生産方法。 - 【請求項２６】 Ｄ−アミノアシラーゼを、請求項１４
に記載の形質転換体を培養して得られる培養液、該培養
液から分離された形質転換体又はそれらの処理物の形で
Ｎ−アシルアミノ酸に作用させる請求項２３に記載の生
産方法。 - 【請求項２７】 Ｎ−アシルアミノ酸濃度が５０ｇ／ｌ
以上である請求項２３に記載の製造方法。 - 【請求項２８】 Ｎ−アシルアミノ酸濃度が１００ｇ／
ｌ以上である請求項２７記載の製造方法。
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|---|---|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008061642A (ja) * | 2006-08-10 | 2008-03-21 | Toyobo Co Ltd | Ｄ−アミノ酸の製造方法 |
| JP2008182986A (ja) * | 2007-01-31 | 2008-08-14 | Sumitomo Chemical Co Ltd | アミノアシラーゼ遺伝子 |
-
2002
- 2002-02-01 JP JP2002026052A patent/JP3765758B2/ja not_active Expired - Fee Related
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