JP4650421B2 - Ｌ体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Ｌ体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素及びそれをコードするｄｎａ Download PDF

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Description

本発明は、新規なＬ体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素及びそれをコードするＤＮＡ、並びにそれらの利用に関する。更に詳しくは、Ｌ体のアミノ酸アミド、特にＬ体の２−アルキルシステインアミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する活性を少なくとも有する新規な酵素、及び該酵素タンパク質をコードするＤＮＡ、並びに該ＤＮＡを導入した組換え微生物、及び該組換え微生物を使用することによって、酵素の培養生産性を大幅に向上させると共に、そのようにして得られた酵素を用いることによって、Ｌ体のアミノ酸アミドを効率的にＬ体のアミノ酸に変換する方法に関する。光学活性なアミノ酸やアミノ酸アミド、特に光学活性な２−アルキルシステインや２−アルキルシステインアミドは、各種工業薬品、医薬及び農薬の製造中間体として重要な物質である。
アミノ酸アミドから光学活性なアミノ酸を製造する方法としては、例えば、ラセミ体のアミノ酸アミドのアミド結合を立体選択的に不斉加水分解する酵素を含んだ微生物や微生物の菌体処理物を作用させる方法が、工業的に優れた方法として知られている（例えば、特許文献１，２参照）。しかしながら、このような生体由来の触媒である酵素は、穏和な反応条件で、しかも極めて高い反応特異性で目的産物を生成させると言う優れた特徴を有する反面、触媒可能な基質の種類が限られたり、菌体の酵素産生量そのものが少ないため、反応を行うに当たって多量の菌体を必要とし、結果的に、経済的に不利となり採用できなくなると言う技術的問題点を抱えていた。
そこで、このような働きをする酵素の産生量を高める目的から、アミノ酸アミドを立体選択的に加水分解する酵素の酵素タンパク質をコードするＤＮＡを、遺伝子組換え手法でクローン化して形質転換体となし、該形質転換体を用いてラセミ体のアミノ酸アミドから光学活性アミノ酸を製造するという試みがなされた（例えば、特許文献３〜８、非特許文献１参照）。
例えば、特許文献３には、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ由来のＤ−アミダーゼ、それをコードするＤＮＡ、そのような核酸を含有するプラスミド、ベクター及び微生物、ハイブリダイズする核酸、核酸を製造するためのプライマー等が、また特許文献４には改変型アミノ酸アミダーゼとそれを用いたＤ体アミノ酸の製造方法が開示されている。しかしながら、これらの方法はＤ体のアミノ酸アミドにのみ作用するものであって、Ｌ体のアミノ酸アミドを加水分解することはできない。
一方、Ｌ体のアミノ酸アミドに作用する例としては、例えば、特許文献５には、シュードモナス アゾトフォルマンス由来のＬ体のアミノ酸アミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する酵素とそれをコードするＤＮＡが開示されている。しかしながら、この酵素はＬ−プロリンアミドに対する活性は高いが、その他のＬ体のアミノ酸アミドに対する活性は低い。
その他、特許文献６は、コマモナス アシドボランス由来の酵素タンパクとこれをコードするＤＮＡ並びにこの酵素タンパクを用いた光学活性有機酸の製造方法が開示されており、その中にアミノ酸アミドの不斉加水分解も開示されているが、ロイシンアミド又はフェニルアラニンアミドを基質とした場合だけである。また、特許文献７には、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性を有するタンパク質とこれをコードするＤＮＡが開示されているが、好ましいアミノ酸アミドとして開示されているのはｔ−ロイシンアミドを基質とした場合だけである。また、特許文献８には、ペプチドアミダーゼを含有する微生物の獲得方法、それにより得られた微生物、その中に含有されるペプチドアミダーゼ及びその使用方法が開示されているが、この酵素は、ジペプチドアミドやＮ−アセチルアミノ酸アミド又は保護されたアミノ酸アミドに対して高い活性を有するが、未保護のアミノ酸アミドを加水分解する活性を有していない。さらに、例えば非特許文献１には、α位にアルキル基を有するアミノ酸アミドを立体選択的に加水分解する酵素が開示されているが、ここで開示されている例はメチルバリン、メチルロイシン及びメチルフェニルアラニン等の炭化水素型の側鎖を有するアミノ酸に限られており、側鎖にメルカプト基とアルキル基を有する２−アルキルシステインに関する記載は一切認められない。
通常の天然型アミノ酸以外の特殊アミノ酸であるアルキルシステインの誘導体である２−アルキルシステインは、α位の炭素原子にアルキル基を有する他、メルカプト基、アミノ基及びカルボキシル基と言った反応性に富む複数の置換基を分子内に有しており、特にその光学活性体は各種工業薬品、医薬、農薬等の製造原料、汎用キラルビルディングブロックとして広範な活用が期待される化合物であり、産業上非常に有用な化合物であるため、工業的に有利な、安価な製造方法の開発が望まれていた。
しかしながら、上述したように、Ｌ体の２−アルキルシステインアミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する活性を有する酵素は知られておらず、従って、このような方法で光学活性な２−アルキルシステイン、又は光学活性な２−アルキルシステインアミドを製造する方法も知られていなかった。また、その他のＬ体のアミノ酸アミドに対する基質スペクトルが広く、工業原料として有用な種々のアミノ酸アミド類に対応できる高活性かつ高立体選択的なＬ体のアミノ酸アミド加水分解酵素、及び該酵素の効率的な生産方法と利用方法が求められていた。
特開昭６１−２９３３９４号公報 特開昭６２−５５０９７号公報 特開２００３−２２５０９４号公報 特開２００２−２５３２５６号公報 特開２００３−２５０５５８号公報 特開平８−２５６７７１号公報 国際公開第００／６３３５４号パンフレット 特許第３１１２０９０号明細書 Ｈ．Ｆ．Ｍ．Ｈｅｒｍｅｓ他、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．６０、Ｎｏ１、ｐ．１５３−１５９、１９９４
本発明の目的は、各種工業薬品、医薬及び農薬の製造中間体として広範な活用が期待され、産業上、非常に有用な化合物である光学活性なアミノ酸、特に光学活性な２−アルキルシステインを製造するために好適に使用できる、Ｌ体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素及びそれをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを導入した組換え微生物、並びにこれらを用いた光学活性アミノ酸、特に光学活性な２−アルキルシステインの製造方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、Ｌ体のアミノ酸アミド、特にＬ体の２−アルキルシステインアミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する高い酵素活性を有する微生物を新規に見出し、この微生物から当該触媒活性を示す酵素を初めて単離・精製した。更に、この酵素をコードするＤＮＡを初めて分離取得し、該ＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ、及び該組換え体ＤＮＡを導入した組換え微生物を調製し、発現させることに成功した。また、更に、このようにして得られた組換え微生物を培養することによって、ＤＮＡ供与体として使用した野生株の場合と比較して、顕著に高い比活性を有する菌体又は酵素溶液を調製することが可能になり、Ｌ体のアミノ酸アミド、特にＬ体の２−アルキルシステインアミドを極めて効率よく対応のＬ体の２−アルキルシステインに変換することができるようになった。
また、本発明のＬ体のアミノ酸アミド不斉加水分解酵素は、Ｌ体の２−アルキルシステインアミドの不斉加水分解活性を有するだけではなく、基質スペクトルが非常に広く、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン等に代表される天然型の通常アミノ酸、更には、Ｌ−２−アミノ酪酸、Ｌ−ｔ−ロイシン、Ｌ−フェニルグリシン、Ｌ−ｐ−クロロフェニルグリシン、Ｌ−アリシンエチレンアセタール、Ｌ−ペニシルアミン、（４Ｒ）−５，５−ジメチル−１，３−チアゾリジン−４−カルボン酸等のいわゆる特殊アミノ酸に対応する各種のＬ体のアミノ酸アミドを不斉加水分解することができる。このように本発明の酵素は、Ｌ体のアミノ酸アミドのアミド結合を選択的に加水分解すると言う厳格な立体特異性と、幅広い種類のＬ体のアミノ酸アミドに反応するという性質を併せ持った、従来知られている酵素と異なる産業的利用性に優れた新規な酵素である。
すなわち、本発明は、以下の（１）に示すＬ体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素、（２）〜（３）に示すＬ体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素をコードするＤＮＡ、（４）〜（５）に示す組換え微生物、（６）に示す当該酵素を用いたＬ体アミノ酸アミドからＬ体アミノ酸を製造する方法、（７）〜（９）に示すＬ体の２−アルキルシステインアミドからＬ体の２―アルキルシステインを製造する方法に関するものである。
（１）配列番号８に示されるアミノ酸番号１〜３５５で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列から１個若しくは複数個のアミノ酸が欠損、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有する、Ｌ体のアミノ酸アミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する酵素。
（２）（１）記載の酵素の酵素タンパク質をコードするＤＮＡ。
（３）配列番号７に示される塩基配列の内の塩基番号８６８〜１９３２で表される塩基配列、又は該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する、（２）記載のＤＮＡ。
（４）（２）又は（３）記載のＤＮＡが導入された組換え微生物。
（５）組換え微生物がエシェリシア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、（４）記載の組換え微生物。
（６）（１）記載の酵素をＬ体のアミノ酸アミドに作用させＬ体のアミノ酸に変換する、Ｌ体のアミノ酸の製造方法。
（７）Ｌ体のアミノ酸アミドが式１に示す化合物である、（６）記載の製造方法。
Figure 0004650421
 式１中のＲ1は水素、低級アルキル基、置換低級アルキル基、フェニル基、置換フェニル基、複素環基、置換複素環基、又はＲ1が結合している炭素原子及び該炭素原子に結合しているアミノ基と一体となって含窒素複素環を形成し得る基である。ここで、低級アルキル基としては、炭素数１〜４のアルキル基などが挙げられ、置換低級アルキル基としては、そのうちの1又は複数の水素が、例えば、ヒドロキシ基、メトキシ基、メルカプト基、メチルメルカプト基、アミノ基、グアニル基、カルボキシル基、カルボキサミド基、ハロゲン基、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、イミダゾリル基などで置換された炭素数１〜４のアルキル基などが挙げられる。置換フェニル基としては、任意の水素がヒドロキシ基、メトキシ基、メルカプト基、メチルメルカプト基、アミノ基、グアニル基、カルボキシル基、カルボキサミド基、ハロゲン基などで置換されたフェニル基などが挙げられる。また、複素環基としては、インドリル基、イミダゾリル基などが挙げられ、置換複素環基としては、任意の水素がヒドロキシ基、メトキシ基、メルカプト基、メチルメルカプト基、アミノ基、グアニル基、カルボキシル基、カルボキサミド基、ハロゲン基などで置換された前記のインドリル基、イミダゾリル基などの複素環基が挙げられる。さらに、Ｒ1が結合している炭素原子及び該炭素原子に結合しているアミノ基と一体となって含窒素複素環を形成し得る基としては、ピロリジン環、ピロール環、チアゾリジン環、オキサゾリジン環などが挙げられる。
Ｒ2は水素、又は炭素数１〜４の低級アルキル基である。
なお、Ｒ1とＲ2が同時に水素である場合は化合物（１）からは除かれる。
（８）Ｌ体のアミノ酸アミドが式２に示す化合物である、（６）記載の製造方法。
Figure 0004650421
 （式２中のＲは炭素数１〜４の低級アルキル基を示す。）
（９）式２中のＲがメチル基である、（８）記載の製造方法。
なお、本発明の酵素は、その活性が失われない限り、配列番号８に示されるアミノ酸番号１〜３５５で表されるアミノ酸配列から、１個若しくは複数個のアミノ酸が、欠損、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。複数個のアミノ酸の数としては、好ましくは２〜２０個、好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。また、本発明の酵素は、配列番号８のアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつＬ体のアミノ酸アミドのアミド結合を立体選択に加水分解する酵素作用を有するものであってもよい。
また、本発明の酵素をコードするＤＮＡは、配列番号７の塩基配列の塩基番号８６８〜１９３２を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ体のアミノ酸アミドのアミド結合を立体選択に加水分解する酵素をコードするＤＮＡであってもよい。ストリンジェントな条件としては、例えば、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが互いにハイブリダイズする条件、具体的には、例えば、ハイブリダイズ反応を行い、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、特に好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄する条件が挙げられる。
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。本発明の酵素をコードするＤＮＡの供与体となりうる微生物は、Ｌ体のアミノ酸アミド、特にＬ体の２−アルキルシステインアミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する酵素活性を有する微生物であればよい。そのような微生物を見出す方法としては、タイプカルチャー等の保存菌株の中から選択する方法、或いは自然界から分離する方法がある。本発明者らは、まず保存菌株について検討を行い、そのような酵素活性を有する微生物として、例えば、プロタミノバクター属、ミコプラナ属、及びキサントバクター属に属する微生物、より具体的にはプロタミノバクター アルボフラバス（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｌｂｏｆｌａｖｕｓ）、ミコプラナ ラモサ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ ｒａｍｏｓｅ）、ミコプラナ ディモルファ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ ｄｉｍｏｒｐｈａ）、キサントバクター オートトロピカス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、キサントバクター フラバス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ ｆｌａｖｕｓ）等の微生物が該当することを見出した。
次に、より好適な菌株を求め自然界からの分離を鋭意行った結果、キサントバクター フラバス（Ｘ．ｆｌａｖｕｓ）と同定される新たな菌株を分離することに成功した。本菌株は、下記の菌学的性質（表１）に示すように、グラム染色陰性の非運動性桿菌であり、多形態、カタラーゼ反応陽性、オキシダーゼ反応陽性であることからキサントバクター属に属する微生物と判断され、さらに１６SｒＤＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子）の部分塩基配列約５００ｂｐを用いて帰属分類群を推定した結果、部分塩基配列が相同率１００％でキサントバクター フラバス（Ｘ．ｆｌａｖｕｓ）と一致し、分子系統樹上でもキサントバクター フラバス（Ｘ．ｆｌａｖｕｓ）と同じ場所に位置したことから、キサントバクター フラバス（Ｘ．ｆｌａｖｕｓ）と同定し、ＮＲ３０３株と命名した。
表１．菌学的性質
細胞形態 桿菌
大きさ （０．５−０．６×２．０μｍ）
多形態 あり
運動性 なし
胞子の有無 なし
グラム染色 −
コロニー形態 （栄養寒天、３０℃、２４時間）
円形
全縁滑らか
凸状
光沢あり
クリーム色
生育温度
３７℃ ＋
４０℃ −
カタラーゼ ＋
オキシダーゼ ＋
酸／ガス生産（グルコース） −／−
O／Fテスト（グルコース） −／−
硝酸塩還元 ＋
インドール生産 −
ブドウ糖 酸性化 −
アルギニンジヒドロラーゼ −
ウレアーゼ ＋
エスクリン加水分解 −
ゼラチン加水分解 −
β−ガラクトシダーゼ −
チトクロームオキシダーゼ ＋
資化性
ブドウ糖 −
Ｌ−アラビノース −
Ｄ−マンノース −
Ｄ−マンニトール −
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン −
マルトース −
グルコン酸カリウム ＋
ｎ−カプリン酸 −
アジピン酸 −
ｄｌ−リンゴ酸 ＋
クエン酸ナトリウム ＋
酢酸フェニル −
嫌気的生育性 ＋
一例として、本発明者らが新たに分離した上記キサントバクター フラバス（Ｘ．ｆｌａｖｕｓ）ＮＲ３０３株のアミノ酸アミド不斉加水分解酵素遺伝子の単離方法、及び該遺伝子のエシェリシア コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株への導入方法を、以下に示す。
ＤＮＡ供与体微生物の培養は、通常資化し得る炭素源、窒素源、各微生物に必須な無機塩、栄養素等を含有させた培地を用いて行われる。培養時のｐＨは４〜１０の範囲が好ましく、温度は２０〜３９℃が好ましい。培養は１日〜１週間程度好気的に行われる。
酵素の精製は、通常の酵素精製法を用いることができる。すなわち、培養終了後の培養液から遠心分離や膜分離等の通常の手法によって菌体を集め、超音波処理等の機械的方法等によって菌体を破砕する。その後、遠心分離等によって残渣を除き粗酵素液を得る。次にこの粗酵素液を塩析、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、結晶化等により精製することができる。
精製した酵素のＮ末端アミノ酸配列を、自動エドマン分解アミノ酸シークエンサーＨＰＧ１００５Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（ヒューレットパッカード社製）で決定し、決定したＮ末端配列をもとに、ＰＣＲで増幅するためのオリゴヌクレオチド（プライマー）を設計する。キサントバクター フラバス（Ｘ．ｆｌａｖｕｓ）より抽出した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲでＤＮＡを増幅し、ラベルしてプローブとする。
キサントバクター フラバス（Ｘ．ｆｌａｖｕｓ）より抽出したＤＮＡを適当な制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ等）で部分分解する。このＤＮＡ断片とラベル化したＤＮＡプローブを用いて、サザンハイブリダイゼーションを行う。ここで特定されたＤＮＡを抽出精製し、適当なプラスミドベクターに結合し、大腸菌を形質転換する。
ラベル化したＤＮＡプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行い、目的のＤＮＡ断片を含むクローンのプラスミドを取得する。このプラスミドを用いて、ベクターに組み込まれた、キサントバクター フラバス（Ｘ．ｆｌａｖｕｓ）由来のＤＮＡの塩基配列を決定する。決定されたＤＮＡ塩基配列中にＬ体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素遺伝子のアミノ酸配列の読み枠を見出し、上記工程で得られたＤＮＡ断片中に、Ｌ体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素遺伝子の全コード領域が存在することを確認する。
得られたＬ体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素遺伝子のＤＮＡ塩基配列を元に、プライマーを設計する。キサントバクター フラバス（Ｘ．ｆｌａｖｕｓ）より抽出した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲでＤＮＡを増幅し、プラスミドベクター（ｐＵＣ１９）と結合する。これをｐＭＣＡ１と命名する。ｐＭＣＡ１をＥ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１０９）に形質転換し、Ｌ体アミノ酸アミド不斉加水分解酵素遺伝子を保有する組換え菌をｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９と命名する。
なお、ここで得られた形質転換体ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９は、２００４年５月２１日に独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にＦＥＲＭ ＡＰ−２００５６として寄託され、その後、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３４の受託番号で寄託されている。したがって、この形質転換体に保持されるプラスミドｐＭＣＡ１から本発明の酵素をコードするＤＮＡを取得することもできる。例えば、プラスミドｐＭＣＡ１を、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトに存在する配列を認識する制限酵素で消化して該ＤＮＡを取得してもよいし、プラスミドｐＭＣＡ１を鋳型にし、配列番号７の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いたＰＣＲ法により該ＤＮＡを取得してもよい。
また、キサントバクター フラバスのその他の株、又はキサントバクター フラバス以外の微生物の染色体から、本発明のＤＮＡを取得することもできる。例えば、配列番号７の塩基配列に基づいて設計されたプローブを用い、ハイブリダイゼーション反応により、上記微生物由来の前記酵素をコードするＤＮＡをその微生物の染色体ＤＮＡから単離することもできる。
本発明のＤＮＡを宿主微生物に導入するためのベクターとしては、プラスミドベクター（例えばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８等）、ファージベクター（例えばλｇｔ１１等）の何れでもよい。さらにベクターを用いずに宿主微生物の染色体へ直接組込むことも可能である。また、形質転換に用いられる宿主微生物としては、エシェリヒア属細菌、例えば、エシェリシア コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０５株又はＪＭ１０９株等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
なお、ＤＮＡ、組換え体宿主としてのＥ．ｃｏｌｉの取扱いなどに必要な操作は、当業者間で通常行われているものであり、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ Ｅｄ．（ｅｄ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ．Ｗ．）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１（以下、モレキュラークローニング第３版と記す）に従えば容易に実施できる。使用する酵素、試薬類も全て市販の製品を用いることができ、特に断らない限り製品で指定されている使用条件に従えば完全にそれらの目的を達成することができる。該菌からの全ＤＮＡ抽出は、例えばＳａｉｔｏら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，７２，６１９−６２９，１９６３）の方法に準じて行うことができる。また、ＤＮＡのラベル化は従来から汎用されている放射性同位元素或いはジゴキシゲニン、ビオチン、フルオレセイン等の非放射性化合物の何れも使用可能であり、ＲｅｄｉｐｒｉｍｅTMＩＩ Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅ（アマシャムファルマシアバイオテク（株）社製）やＡｌｋＰｈｏｓＴＭ Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク（株）社製）等を用いれば容易に実施できる。ＤＮＡ塩基配列の決定もモレキュラークローニング第３版等に記された公知の方法を用いることができる。例えば、Ｌｉ−Ｃｏｒ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ ４０００Ｌ等の機器を付属のマニュアルインストラクションに従って使用すれば容易に実施できる。また、ハイブリダイゼーションはモレキュラークローニング第３版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
本発明の形質転換微生物の培養は、通常資化し得る炭素源、窒素源、微生物に必須な無機塩、栄養素等を含有させた培地を用いて行われる。培養時のｐＨは４〜１０の範囲が好ましく、温度は２０〜５０℃が好ましい。培養は１日〜１週間程度好気的に行われる。このようにして培養した形質転換微生物から通常の精製法により本発明の酵素を得ることができる。このようにして得られた酵素は立体選択的に式（Ｉ）に示される化合物などのＬ体のアミノ酸アミドからＬ体のアミノ酸を製造する反応に用いることができる。ラセミ体等のＤＬ体のアミノ酸アミドの混合物が基質である場合には、Ｌ体のアミノ酸とＤ体のアミノ酸アミドの混合物が得られる。この場合これらを分離することにより、Ｌ体のアミノ酸とＤ体のアミノ酸アミドがそれぞれ得られ、分離されたＤ体のアミノ酸アミドを別途加水分解することによってＤ体のアミノ酸が得られる。また、酵素反応の基質がＬ体のアミノ酸アミドのみからなる場合には対応したＬ体のアミノ酸が得られる。なお、形質転換体の菌体、又は該菌体の処理物を上記反応に用いることもできる。例えば、該菌体を含む培養液、分離菌体、菌体破砕物などを上記反応に使用することができ、常法に従って菌体又は酵素を固定化して使用することもできる。
反応条件は、反応液に含まれるＬ体アミノ酸アミドの種類及び量によっても異なるが、反応液中の原料アミノ酸アミドの濃度としては０．１〜４０ｗｔ％、酵素量は、該酵素を含む組換え微生物の乾燥菌体基準で、原料アミノ酸アミド重量の０．００００１〜３倍、通常は０．００００５〜０．００１倍が好ましい。反応温度は１０〜７０℃、好ましくは２０〜６０℃、ｐＨは４〜１３、好ましくは５〜１０、よりさらには６〜９が好ましい。また、２−アルキルシステインアミド及び２−アルキルシステインは酸化を受けやすく、酸素存在下で放置すると２量化したジスルフィドとなる。これを防止するため、生化学的不斉加水分解反応は窒素等の不活性ガス雰囲気下で行なうのが好ましいが、系内に２−メルカプトエタノール等の還元性物質を共存させる方法も可能である。また、反応に用いる全ての溶媒を反応実施前に脱気すると、副生成物を生成せず好適に反応が進行する。なお、本反応を行う際に、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｏ等の金属イオンを反応系に加えることによって反応速度をより高めることができる。添加する量は金属イオンの種類によって異なり一概には言えないが、好ましくは１〜５０ｐｐｍ、より好ましくは５〜２０ｐｐｍとなる濃度の金属イオンを添加することが望ましい。例えば、２価のＭｎイオンを５〜２０ｐｐｍ加えた場合、反応速度は、無添加の場合に比較して２〜５倍と大幅に向上する。また、不斉加水分解反応に使用した菌体又は菌体処理物は、遠心分離若しくは濾過操作などにより回収し、不斉加水分解反応用の酵素触媒として再利用することができる。なお、原料のアミノ酸アミドの反応液中における濃度が高い場合には、前記のアミノ酸アミドに対する酵素量は、使用量比が好ましい範囲の上限である3倍以下であって、反応が好適に実施できる比率を適宜選択すればよい。
ＤＬ体のアミノ酸アミドの不斉加水分解反応で生成したＬ体アミノ酸と未反応のＤ体アミノ酸アミドとの分離は、反応終了液から、例えば遠心分離や濾過膜などの通常の固液分離手段により微生物菌体を除いた後、減圧濃縮してから有機溶媒を加えてアミノ酸を析出させる方法、再結晶やカラムクロマトグラフィー等の公知の方法を利用でき、特に制限はないが、イオン交換電気透析法や、イオン交換樹脂による吸脱着を利用した分離方法も有効である。
本発明のＬ体のアミノ酸アミド不斉加水分解酵素はＬ体の２−アルキルシステインアミドのアミド結合を効率的に加水分解する特徴を有する他、基質スペクトルが非常に広く、本酵素を用いることにより多種類のＬ体のアミノ酸アミドから対応のＬ体のアミノ酸を製造することができる。具体的には、２−メチル−Ｌ−システインに加え、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン等に代表されるタンパク性アミノ酸、更にはＬ−２−アミノ酪酸、Ｌ−ｔ−ロイシン、Ｌ−フェニルグリシン、Ｌ−ｐ−クロロフェニルグリシン、Ｌ−アリシンエチレンアセタール、Ｌ−ペニシルアミン、（４Ｒ）−５，５−ジメチル−１，３−チアゾリジン−４−カルボン酸等のいわゆる非タンパク性アミノ酸を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
本発明を実施例及び比較例により更に具体的に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。
実施例１
アミノ酸アミド不斉加水分解酵素の単離
キサントバクター フラバス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ ｆｌａｖｕｓ）ＮＲ３０３株を、下表２の組成を有する培地３Ｌに接種し、３０℃で１７０時間培養し、遠心分離により菌体を取得した。菌体湿重量２４０ｇを超音波破砕し、遠心分離により無細胞抽出液を調製した。
表２．培地組成
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３ｇ
ＫＨ2ＰＯ4 １．４ｇ
Ｎａ2ＨＰＯ4 ３ｇ
ＮａＨＣＯ3 ０．３ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．２ｇ
２％ ＣａＣｌ2 １ｇ
Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．２ｇ
ビタミン混液 １ｇ
尿素 １ｇ
グリセリン １０ｇ
微量ミネラル ３．５ｇ
１Ｌ（ｐＨ７．０）
これに３０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、遠心分離して沈殿を除去した後、上清液に６０％飽和となるように硫酸アンモニウムを追加添加した。生成した沈殿を遠心分離で集め、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液に溶解し、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で透析した。これを１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ樹脂（東ソー（株）社製）に吸着させイオン交換クロマトグラフィーを行い、そのアミノ酸アミド不斉加水分解活性を有する画分を順次硫酸アンモニウムを用いたＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（東ソー（株）社製)、Ｇｉｇａｐｉｔｅカラム（生化学工業（株）社製）を用いてカラムクロマトグラフィーを行った。得られた精製酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したところ単一バンドであり、分子量は４００００であった。
実施例２
Ｎ末端アミノ酸配列の解析
実施例１により精製したポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列を、自動エドマン分解アミノ酸シークエンサー ＨＰ Ｇ１００５Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ （ヒューレットパッカード社製）を用いて分析した。このアミノ酸配列は配列番号１で示される。
実施例３
本発明ＤＮＡ断片の取得
キサントバクター フラバス（Ｘ．ｆｌａｖｕｓ）を上記表１の培地５．０ｍＬに接種し、３０℃で４８時間培養した。遠心分離により微生物菌体を取得し、フェノールクロロホルム法を用いて該微生物の染色体ＤＮＡを取得した。実施例２で判明したアミノ酸配列から、配列番号２（ＡＦ）、３（ＢＦ）、４（ＡＲ）、５（ＢＲ）のプライマーを設計し、耐熱型ＤＮＡポリメラーゼ存在下これら４種のプライマーのうち、任意の２種を添加してＰＣＲを行った。本ＰＣＲの産物をアガロースゲル電気泳動したところ配列番号３のプライマーＢＦと配列番号４のＡＲを用いた反応液に８７ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていたので、これをアガロース電気泳動ゲルから抽出精製した。そのＤＮＡの一部をｐＴ７ＢｌｕｅＴ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングしてＬｉ−ＣｏｒＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ ４０００Ｌを用いて（操作方法は付属のマニュアルインストラクションに従った）塩基配列を決定した（配列番号６）。上記ＤｅｇｅｎｅｒＰＣＲにより増幅した８７ｂｐの精製ＤＮＡの残りをＲｅｄｉｐｒｉｍｅTMＩＩ Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク（株）社製）により標識した。
実施例４
キサントバクター フラバス（Ｘ．ｆｌａｖｕｓ）染色体ＤＮＡライブラリーのサザンハイブリダイゼーション
実施例３記載の方法によりキサントバクター フラバス（Ｘ．ｆｌａｖｕｓ）の染色体ＤＮＡを取得した。本ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化した後。実施例３で作製した８７ｂｐの標識ＤＮＡをプローブとして用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。手法はモレキュラークローニング第３版に従った。その結果、約５ｋｂのＤＮＡバンドが検出され、本ＤＮＡをアガロースゲルから抽出精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、塩化カルシウムを用いた形質転換方法によりＥ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１０９）に導入した。
実施例５
コロニーハイブリダイゼーション及びサブクローニング
実施例４において得られたＥ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１０９）の形質転換株を５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１Ｌの水溶液中にＢａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎ １０．０ｇ、 Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ５．０ｇ、塩化ナトリウム １０．０ｇ、寒天１５．０ｇ を含む）に塗布し、３７℃で一晩培養した。生じたコロニーをニトロセルロース膜ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＮＩＴＲＡＴＥ（アドバンテック東洋（株）社製）にリフティングし、実施例３で取得したＤＮＡプローブを用い、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの結果、陽性のクローンからプラスミドを取得し、Ｌｉ−Ｃｏｒ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ ４０００Ｌを用いて、塩基配列を決定した（配列番号７）。
実施例６
発現用プラスミドの構築及びＥ．ｃｏｌｉの形質転換
キサントバクター フラバス（Ｘ．ｆｌａｖｕｓ）より抽出した染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマーＭＣＡ−ＦとＭＣＡ−Ｒ（配列番号９及び配列番号１０）を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ反応生成物を精製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化し、同様の酵素で消化したｐＵＣ１９（宝酒造（株）社製）に連結してｐＭＣＡ１を作製後、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１０９）に塩化カルシウム法で形質転換した。５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に形質転換株を塗布し、生育したクローンを取得して形質転換株ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９を得た。
実施例７
形質転換体を用いた２−メチルシステインアミドラセミ混合物の不斉加水分解〜塩化マンガン添加
下表３の組成の培地を調製し、この培地２００ｍＬを１Ｌの三角フラスコに入れ、滅菌後、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを添加してから形質転換株ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９を接種し、３７℃で１５時間振とう培養を行った。次いで、培養液から遠心分離により乾燥菌体０．１ｇに相当する生菌体を得た。
表３．培地組成
ｐＨ ７．０
トリプトン １％
酵母エキス ０．５％
塩化ナトリウム ０．５％
２−メチルシステインアミド塩酸塩のラセミ混合物１０．０ｇ（５８．６ｍｍｏｌ）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３００ｍＬに溶かした後、５００ｍＬフラスコに入れ、２価のＭｎイオンの濃度が１０ｐｐｍとなるように塩化マンガン水溶液を加え、さらに乾燥菌体０．０１ｇに相当する生菌体を加えて、窒素気流下、３０℃で２４時間攪拌して加水分解反応を行った。
反応後、反応液から遠心分離によって菌体を除去して上清を得た。この上清液に活性炭１ｇを加えて１時間攪拌した後、活性炭を濾別してからエバポレーターで減圧にて水を留去した。ここに２−プロパノール２０ｍＬを加えて過熱攪拌後、５℃に冷却して析出した結晶を濾取した。濾取した結晶をエタノールより再結晶して２−メチル−Ｌ−システイン３．０４ｇ（２２．５ｍｍｏｌ）を得た。反応に仕込んだラセミ混合物中の２−メチル−Ｌ−システインアミドからの単離収率は７６．８ｍｏｌ％、２−メチルシステインアミドのラセミ混合物からの単離収率は３８．４％であった。また、この固体を下表４のＨＰＬＣ条件Ａで分析した結果、光学純度は９８％ｅ．ｅ．以上であった。
表４．ＨＰＬＣ条件Ａ
カラム：Ｓｕｍｉｃｈｉｒａｌ ＯＡ−５０００（（株）住化分析センター社製）
カラム温度：６０℃
溶離液：３ｍＭ ＣｕＳＯ4水溶液
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＣＤ−２０９５ｐｌｕｓ（Ｊａｓｃｏ）
試料：０．１％水溶液をホルマリン処理後、５０μＬ注入
実施例８
形質転換体を用いた２−メチルシステインアミドラセミ混合物の不斉加水分解〜塩化マンガン非添加
実施例７において、塩化マンガン水溶液を加えずに生化学的不斉加水分解反応を行った。３０℃で２４時間反応を行い、実施例７と同様の後処理を施し、１．５０ｇ(１１.１ｍｍｏｌ)の２−メチル−Ｌ−システインが得られた。２−メチル−Ｌ−システインアミドからの単離収率は３７．９ｍｏｌ％、２−メチルシステインアミドからの単離収率は１８．９ｍｏｌ％、光学純度は９８％ｅ．ｅ．以上であった。
比較例1
野生型微生物（菌体０．０１ｇ）を用いた２−メチルシステインアミドラセミ混合物の不斉加水分解
下表５の組成を有する培地を調製し、この培地２００ｍＬを１Ｌの三角フラスコに入れ、滅菌後、キサントバクター フラバス（Ｘ．ｆｌａｖｕｓ）を接種し、３０℃で１７０時間振とう培養を行った。次いで、培養液から遠心分離により乾燥菌体０．１ｇに相当する生菌体を得た。
表５．培地組成
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ３ｇ
ＫＨ2ＰＯ4 １．４ｇ
Ｎａ2ＨＰＯ4 ３ｇ
ＮａＨＣＯ3 ０．３ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．２ｇ
２％ ＣａＣｌ2 １ｇ
Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．２ｇ
ビタミン混液 １ｇ
尿素 １ｇ
グリセリン １０ｇ
微量ミネラル ３．５ｇ
１Ｌ（ｐＨ７．０）
２−メチルシステインアミド塩酸塩のラセミ混合物１０．０ｇ（５８．６ｍｍｏｌ）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３００ｍＬに溶かした後、５００ｍＬフラスコに入れ、２価のＭｎイオンの濃度が１０ｐｐｍとなるように塩化マンガン水溶液を加え、さらに乾燥菌体０．０１ｇに相当する生菌体を加えて、窒素気流下、３０℃で２４時間攪拌して加水分解反応を行った。反応後、反応液から遠心分離によって菌体を除去し、上清液を下表６のＨＰＬＣ条件Ｂで分析したところ、生成物である２−メチルシステインは認められなかった。
表６．ＨＰＬＣ条件Ｂ
カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ １００ ＲＰ−１８（関東化学（株）社製）
カラム温度：４０℃
溶離液：５０ｍＭ ＨＣｌＯ4水溶液
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
試料：０．１％水溶液を５μＬ注入
比較例２
野生型微生物（菌体５ｇ）を用いた２−メチルシステインアミドラセミ混合物の不斉加水分解
比較例１の培地組成で培養した１０Ｌの培養液から遠心分離によりキサントバクター フラバス（Ｘ．ｆｌａｖｕｓ）の乾燥菌体５ｇに相当する生菌体を得た。２−メチルシステインアミド塩酸塩のラセミ混合物１０．０ｇ（５８．６ｍｍｏｌ）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３００ｍＬに溶かした後、５００ｍＬフラスコに入れ、２価のＭｎイオンの濃度が１０ｐｐｍとなるように塩化マンガン水溶液を加え、さらに乾燥菌体５ｇに相当する生菌体を加えて、窒素気流下、３０℃で２４時間攪拌して加水分解反応を行った。反応後、反応液から遠心分離によって菌体を除去し、上清液をＨＰＬＣ条件Ｂで分析したところ、２−メチルシステインが２８．２ｍｍｏｌ生成していることが確認された。さらにＨＰＬＣ条件Ａで分析したところＬ体アミノ酸の光学純度が９８％ｅ．ｅ．以上であった。
比較例３
野生型微生物を用いた２−メチルシステインアミドラセミ混合物の不斉加水分解〜塩化マンガン非添加
比較例２において、塩化マンガン水溶液を加えずに生化学的不斉加水分解反応を行った。３０℃で２４時間反応を行い、反応後、反応液から遠心分離によって菌体を除去し、上清液をＨＰＬＣ条件Ｂで分析したところ、２−メチルシステインが１３．９ｍｍｏｌ生成していることが確認された。さらにＨＰＬＣ条件Ａで分析したところＬ体アミノ酸の光学純度が９８％ｅ．ｅ．以上であった。
実施例９
形質転換体を用いた種々のアミノ酸アミドのラセミ化合物の不斉加水分解
実施例７と同様に培養した形質転換株ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９の培養液を用いて、種々のアミノ酸アミドのラセミ混合物を基質として酵素反応を行った。基質化合物を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、基質濃度を０．１％に調製し、菌体を添加して３０℃で酵素反応を行い、反応後、反応液から遠心分離によって菌体を除去し、立体選択性と反応率（反応率=反応後のアミノ酸ｍｏｌ量／（反応後のアミノ酸アミドｍｏｌ量＋反応後のアミノ酸ｍｏｌ量)×１００）をＨＰＬＣ条件Ａ及びＨＰＬＣ条件Ｂによって分析した。結果を表７に示す。何れの反応も、加水分解の選択性はＬ体選択的であり、生じたＬ体のアミノ酸の光学純度は、何れも９８％ｅ．ｅ．以上であった。
Figure 0004650421
産業上の利用の可能性
本発明により、各種工業薬品、医薬及び農薬の製造中間体として広範な活用が期待され、産業上、非常に有用な化合物である光学活性なアミノ酸、特に光学活性な２−アルキルシステインを製造する好適な方法を提供することができる。

Claims (9)

  1. 配列番号８に示されるアミノ酸番号１〜３５５で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列から１個若しくは複数個のアミノ酸が欠損、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有する、Ｌ体のアミノ酸アミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する酵素。
  2. 請求項１記載の酵素の酵素タンパク質をコードするＤＮＡ。
  3. 配列番号７に示される塩基配列の内の塩基番号８６８〜１９３２で表される塩基配列、又は該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する、請求項２記載のＤＮＡ。
  4. 請求項２又は３記載のＤＮＡが導入された組換え微生物。
  5. 組換え微生物がエシェリシア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項４記載の組換え微生物。
  6. 請求項１記載の酵素をＬ体のアミノ酸アミドに作用させＬ体のアミノ酸に変換する、Ｌ体のアミノ酸の製造方法。
  7. Ｌ体のアミノ酸アミドが式１に示す化合物である、請求項６記載の製造方法。
    Figure 0004650421
    （式１中のＲ1は水素、低級アルキル基、置換低級アルキル基、フェニル基、置換フェニル基、複素環基、置換複素環基、又はＲ1が結合している炭素原子及び該炭素原子に結合しているアミノ基と一体となって含窒素複素環を形成し得る基であり、Ｒ2は水素、又は炭素数１〜４の低級アルキル基を示す。ただし、Ｒ1とＲ2が同時に水素である場合は除く）
  8. Ｌ体のアミノ酸アミドが式２に示す化合物である、請求項６記載の製造方法。
    Figure 0004650421
     （式２中のＲは炭素数1〜４の低級アルキル基を示す。）
  9. 式２中のＲがメチル基である、請求項８記載の製造方法。
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