JP6690747B2 - 改良型ニトリルヒドラターゼ - Google Patents

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Description

本発明は、改良型(変異型)ニトリルヒドラターゼ、及びその製造方法に関する。さらには、当該酵素をコードするDNA、当該DNAを含む組換えベクター、及び当該組換えベクターを有する形質転換体、並びにアミド化合物の製造方法に関する。
ニトリルヒドラターゼは、ニトリル基を水和しアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素である。当該酵素又は当該酵素を含有する微生物菌体等を用いてニトリル化合物より対応するアミド化合物を製造することが行われているが、この方法は、従来の化学合成法と比較し、ニトリル化合物から対応するアミド化合物への転化率及び選択率が高いことで知られている。
ニトリルヒドラターゼを生産する微生物としては、例えば、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレビシエラ(Klebsiella)属、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属等に属する微生物を挙げることができる。なかでもロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)J1株はアクリルアミドの工業的生産に使用されており、有用性が実証されている。また、その菌株が産生するニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子も明らかとなっている(特許文献1参照)。
一方、自然界に存在する微生物から単離したニトリルヒドラターゼやその遺伝子を利用するだけでなく、ニトリルヒドラターゼに対して、活性、基質特異性、Vmax、Km、熱安定性、基質に対する安定性、生成物に対する安定性等を変化させる目的でニトリルヒドラターゼに変異を導入することが試みられており、シュードノカルディア・サーモフィラJCM3095のニトリルヒドラターゼにおいては、立体構造情報から基質特異性や熱安定性に関与する領域を予測し、それらの中から基質特異性の変化した変異酵素を取得している(特許文献2〜4参照)。また、本発明者らは、耐熱性又はアミド化合物耐性を共に向上させたニトリルヒドラターゼ遺伝子も取得している(特許文献5〜9参照)。
しかし、さらなる耐熱性及びアミド化合物耐性の向上、又は高温での反応が可能なニトリルヒドラターゼを開発し、アミド化合物の製造に用いることは、触媒コスト等の生産コストの観点などから非常に有用であり、その様な性能を有する酵素の取得は、反応時の酵素量の削減及びコスト削減等の観点から望まれている。
特許第3162091号公報 国際公開第2004/056990号パンフレット 特開2004−194588号公報 特開2005−16403号公報 国際公開第2005/116206号パンフレット 特開2007−143409号公報 特開2007−43910号公報 特開2008−253182号公報 特開2010−172295号公報
本発明の目的は、高温下でのアミド化合物耐性が向上した新規な改良型ニトリルヒドラターゼを提供し、より製造効率の高いアミド化合物の製造方法を可能にすることにある。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列のうち、特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したタンパク質が、ニトリルヒドラターゼ活性を有するとともに、高温下でのアミド化合物耐性が向上したものであることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の[1]〜[13]を提供する。
[1] αサブユニットにおいて、下記配列番号46〜49に示される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、改良型ニトリルヒドラターゼ;
(a)配列番号46: XRXKAX
(但し、Rはアルギニン、Kはリジン、Aはアラニン、Eはグルタミン酸、Xはチロシン以外のアミノ酸であり、X〜Xはそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基を表す);
(b)配列番号47: X101112NX131415161718192021CX22LC
(但し、Nはアスパラギン、Vはバリン、Cはシステイン、Tはトレオニン、Lはロイシン、X9はセリン以外のアミノ酸であり、X10〜X22はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基を表す);
(c)配列番号48: X23WDSX2526EX27RX2829
(但し、Wはトリプトファン、Dはアスパラギン酸、Sはセリン、Eはグルタミン酸、Rはアルギニン、Vはバリン、X23はバリン以外のアミノ酸、X25〜X29はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基を表す);
(d)配列番号49: VX24DSX2526EX27RX2829
(但し、Vはバリン、Dはアスパラギン酸、Sはセリン、Eはグルタミン酸、Rはアルギニン、X24はトリプトファン以外のアミノ酸、X25〜X29はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基を表す)
[2] αサブユニットにおいて、下記配列番号46〜49に示される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、上記[1]に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ;
(a)配列番号46: XRXKAX
(但し、Rはアルギニン、Kはリジン、Aはアラニン、Eはグルタミン酸、Xはチロシン以外のアミノ酸であり、X〜Xはそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基を表す);
(b)配列番号47: X101112NX131415161718192021CX22LC
(但し、Nはアスパラギン、Vはバリン、Cはシステイン、Tはトレオニン、Lはロイシン、Xはセリン以外のアミノ酸であり、X10〜X20はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基、X21はバリン、X22はトレオニンを表す);
(c)配列番号48: X23WDSX2526EX27RX2829
(但し、Wはトリプトファン、Dはアスパラギン酸、Sはセリン、Eはグルタミン酸、Rはアルギニン、Vはバリン、X23はバリン以外のアミノ酸、X25〜X29はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基を表す);
(d)配列番号49: VX24DSX2526EX27RX2829
(但し、Vはバリン、Dはアスパラギン酸、Sはセリン、Eはグルタミン酸、Rはアルギニン、X24はトリプトファン以外のアミノ酸、X25〜X29はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基を表す)
[3] αサブユニットにおいて、下記配列番号46〜49に示される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、上記[1]に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ;
(a)配列番号46: XRXKAX
(但し、Rはアルギニン、Kはリジン、Aはアラニン、Eはグルタミン酸、Xはグリシン又はバリンであり、X〜Xはそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基を表す);
(b)配列番号47: X101112NX131415161718192021CX22LC
(但し、Nはアスパラギン、Vはバリン、Cはシステイン、Tはトレオニン、Lはロイシン、Xはバリン又はトレオニンであり、X10〜X20はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基、X21はバリン、X22はトレオニンを表す);
(c)配列番号48: X23WDSX2526EX27RX2829
(但し、Wはトリプトファン、Dはアスパラギン酸、Sはセリン、Eはグルタミン酸、Rはアルギニン、Vはバリン、X23はイソロイシン、ロイシン、メチオニン、及びトレオニンよりなる群から選択され、X25〜X29はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基を表す);
(d)配列番号49: VX24DSX2526EX27RX2829
(但し、Vはバリン、Dはアスパラギン酸、Sはセリン、Eはグルタミン酸、Rはアルギニン、X24はロイシン、X25〜X29はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基を表す)
[4] 前記配列番号46において、XがT(トレオニン)、XがE(グルタミン酸)、XがY(チロシン)、XがE(グルタミン酸)、XがA(アラニン)、XがT(トレオニン)、XがI(イソロイシン)であり、
前記配列番号47において、X10がA(アラニン)、X11がV(バリン)、X12がF(フェニルアラニン)、X13がD(アスパラギン酸)、X14がS(セリン)、X15がQ(グルタミン)、X16がT(トレオニン)、X17がH(ヒスチジン)、X18がH(ヒスチジン)、X19がV(バリン)、X20がV(バリン)であり、
前記配列番号48及び49において、X25がS(セリン)、X26がS(セリン)、X27がI(イソロイシン)、X28がY(チロシン)、X29がI(イソロイシン)である、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の改良型ニトリルヒドラターゼ;
なお、配列番号46に示されるアミノ酸配列は、ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列の8〜19位、配列番号47に示されるアミノ酸配列は同配列の88〜105位、配列番号48及び49に示されるアミノ酸配列は同配列の153〜164位に該当する。
[5] 配列番号50に示されるアミノ酸配列を有する、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
[6] αサブユニットにおいて、配列番号50に示されるアミノ酸配列を含む改良型ニトリルヒドラターゼであって、下記(i)〜(iv)から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸変異を有する、前記改良型ニトリルヒドラターゼ。
(i)XがG(グリシン)又はV(バリン)
(ii)XがV(バリン)又はT(トレオニン)
(iii)X23がI(イソロイシン)、L(ロイシン)、M(メチオニン)、及びT(トレオニン)よりなる群から選択されるアミノ酸
(iv)X24がL(ロイシン)
[7] XがT(トレオニン)、XがE(グルタミン酸)、XがY(チロシン)、XがE(グルタミン酸)、XがA(アラニン)、XがT(トレオニン)、XがI(イソロイシン)、X10がA(アラニン)、X11がV(バリン)、X12がF(フェニルアラニン)、X13がD(アスパラギン酸)、X14がS(セリン)、X15がQ(グルタミン)、X16がT(トレオニン)、X17がH(ヒスチジン)、X18がH(ヒスチジン)、X19がV(バリン)、X20がV(バリン)、X25がS(セリン)、X26がS(セリン)、X27がI(イソロイシン)、X28がY(チロシン)、X29がI(イソロイシン)である、上記[6]に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
[8] 前記ニトリルヒドラターゼがロドコッカス属細菌又はノカルジア属細菌由来である、上記[1]〜[7]のいずれかに記載の改良型ニトリルヒドラターゼ;
[9] 上記[1]〜[8]のいずれかに記載の改良型ニトリルヒドラターゼをコードするDNA又は前記DNAと相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、高温下でのアミド化合物耐性を有するニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
[10] 上記[9]に記載のDNAを含む組換えベクター;
[11] 上記[10]に記載の組換えベクターを含む形質転換体;
[12] 上記[11]に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からニトリルヒドラターゼを採取する、ニトリルヒドラターゼの製造方法;及び
[13] 上記[1]〜[8]のいずれかに記載の改良型ニトリルヒドラターゼ又は[11]に記載の形質転換体を培養して得られる培養物若しくは当該培養物の処理物をニトリル化合物に接触させることを特徴とする、アミド化合物の製造方法。
本発明によれば、高温下でのアミド化合物耐性が向上した新規な改良型(変異型)ニトリルヒドラターゼを提供することができる。本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、高温下でのアミド化合物耐性に優れ、アミド化合物の製造効率を向上させることができる。
プラスミドpSJ034の構築図である。 各種微生物由来のニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列(N末端側の一部)を示す図である。 図2−1と同様のアミノ酸配列を示す図であり、図2−1のアミノ酸配列に続く配列を示している。 配列番号50で示される、本発明のαサブユニットのアミノ酸配列である。
本出願は、日本特許出願2014−118041(2014年6月6日出願)に基づく優先権を主張しており、この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
1.ニトリルヒドラターゼ
1.1 既知のニトリルヒドラターゼ
「ニトリルヒドラターゼ」は、αサブユニット及びβサブユニットのドメインが集合してなる高次構造をとり、補欠分子として非ヘム鉄原子、又は非コリン核コバルト原子を有している。これらのニトリルヒドラターゼは、それぞれ鉄型ニトリルヒドラターゼ及びコバルト型ニトリルヒドラターゼという呼称で区別されている。
鉄型ニトリルヒドラターゼとしては、ロドコッカス属N−771株由来のものをその代表例として挙げることができる。この鉄型ニトリルヒドラターゼは、X線結晶構造解析がなされ、その立体構造が明らかになっている。その結果、当該酵素は、活性中心を形成するαサブユニットのシステインクラスター(Cys−Ser−Leu−Cys−Ser−Cys)中の4つのアミノ酸残基を介して非へム鉄と結合している。
コバルト型ニトリルヒドラターゼとしては、ロドコッカス・ロドクロウスJ1株(以下「J1菌」と称する場合がある)由来のもの、又はシュードノカルディア・サーモフィラ(Pseudonocardia thermophila)由来のものを代表例として挙げることができる。
J1菌由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼは、活性中心を形成するαサブユニットのシステインクラスター(Cys−Thr−Leu−Cys−Ser−Cys)で示される領域を介してコバルト原子と結合している。なお、シュードノカルディア・サーモフィラ由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼのシステインクラスターは、上記J1菌由来のシステインクラスターにおける上流側(N末端側)から第4番目のシステイン(Cys)がシステインスルフィン酸(Csi)であり、最も下流側(C末端側)の第6番目のシステイン(Cys)がシステインスルフェン酸(Cse)である。
上述の通り、補欠分子は、αサブユニット中のシステインクラスター「C(S/T)LCSC」で表される領域と結合している。このような補欠分子結合領域を含むニトリルヒドラターゼとしては、例えば、ロドコッカス・ロドクロウスJ1(FERM BP−1478)、ロドコッカス・ロドクロウスM8(旧ソ連特許1731814号(SU1731814))、ロドコッカス・ロドクロウスM33(VKM Ac−1515D)、ロドコッカス・ロドクロウスATCC39484(特開2001−292772)、バチルス・スミシ(Bacillus smithii)(特開平9−254188)、シュードノカルディア・サーモフィラ(特開平9−275978)又はジオバチルス・サーモグルコシダシアス(Geobacillus thermoglucosidasius)由来のアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼ及び遺伝子配列でコードされるニトリルヒドラターゼが挙げられる。一方、βサブユニットは構造の安定性に関与していると考えられている。
ロドコッカス・ロドクロウスJ1(FERM BP−1478)由来のニトリルヒドラターゼのGenBankアクセッション番号は「P21220」である。また、ロドコッカス・ロドクロウスM8(SU1731814)由来のαサブユニットのGenBankアクセッション番号は「ATT79340」であり、βサブユニットのGenBankアクセッション番号は「AAT79339」である。ロドコッカス・ピリジノボランスMW3由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子のGenBankアクセッション番号はAJ582605、ロドコッカス・ピリジノボランスS85−2由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子のGenBankアクセッション番号はAJ582605、ロドコッカス・ルーバーTH(CGMCC No.2380)のニトリルヒドラターゼ遺伝子は中国特許101463358号(CN1463358)に記載されている。さらに、ノカルジア・YS−2002由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子はGenBankアクセッション番号「X86737」であり、ノカルジア sp.JBRs由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子はGenBankアクセッション番号「AY141130」である。
配列表の配列番号1〜19に、既知のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列及び塩基配列を記載する。
配列番号1:ロドコッカス・ロドクロウスJ1由来のβサブユニットの塩基配列
配列番号2:ロドコッカス・ロドクロウスJ1由来のβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号3:ロドコッカス・ロドクロウスJ1由来のαサブユニットの塩基配列
配列番号4:ロドコッカス・ロドクロウスJ1由来のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号5:ロドコッカス・ロドクロウスM8のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号6:ロドコッカス・ルーバーTHのαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号7:ロドコッカス・ピリジノボランスMW33のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号8:ロドコッカス・ピリジノボランスS85−2のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号9:ロドコッカス・ピリジノボランスMS−38のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号10:ノカルジア sp.JBRsのαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号11:ノカルジア SP.YS−2002のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号12:アンカルチャード・バクテリウム SP1のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号13:アンカルチャード・バクテリウム BD2のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号14:ロドコッカス・ロドクロウス ATCC39484のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号15:シノリゾビウム・メディカエ WSM419のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号16:ゲオバチルス・サーモグルコシダシウス Q6のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号17:シュードノカルディア・サーモフィラJCM3095のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号18:ロドコッカス・ロドクロウス Cr4のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号19:コマモナス・テストステローニのαサブユニットのアミノ酸配列
また、各種微生物由来の既知のニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸(一文字表記)配列のアライメントを、図2−1及び2−2に示す。なお、図2−1、2−2のそれぞれにおいて、各アミノ酸配列は、上から順に、配列番号4、5〜19に対応する。
本発明に係るニトリルヒドラターゼは、上記配列を有するものに限定されるものではなく、配列番号1〜19のいずれかに記載のアミノ酸配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、、より好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90%以上、特に好ましくは約95%以上、最も好ましくは約98%以上の相同性あるいは同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質も本発明のニトリルヒドラターゼに含まれる。
また、本発明のニトリルヒドラターゼには、配列番号1〜19のいずれかに記載のアミノ酸配列において、1個または数個、具体的には、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜2個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質も本発明のニトリルヒドラターゼに含まれる。
1.2 改良型ニトリルヒドラターゼ
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、高温下でのアミド化合物耐性が向上した新規な改良型ニトリルヒドラターゼである。
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの由来は特に限定されず、例えば、米国生物工学情報センター(NCBI;National Center for Biotechnology Information)により提供されるGenBankデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=protein)において登録されているニトリルヒドラターゼや、公知文献に記載されているニトリルヒドラターゼを利用することができる。
具体的には、例えば、WO2005/116206号、特開2007−143409号、特開2007−43910号、特開2008−253182号、特開2010−172295号(参照により、本明細書に取り込まれる)に記載されたニトリルヒドラターゼを示すことができる。これらのニトリルヒドラターゼは耐熱性やアクリルアミド耐性を有するものだが、さらに本発明に係るアミノ酸置換を付加することにより、高温下でのアミド化合物耐性の向上という性質を付加することができる。
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの一例として、αサブユニットが図3に示すアミノ酸配列(配列番号50)を有するものを挙げることができる。図3に示すアミノ酸配列中、N末端から数えて8番目〜19番目に配列番号46に示されるアミノ酸配列、88番目〜105番目に配列番号47に示されるアミノ酸配列、153番目〜165番目に配列番号48又は配列番号49で示されるアミノ酸配列が存在する。
本発明における一つの実施態様として、配列番号50に示されるアミノ酸配列において、下記(a)〜(d)から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸変異を有するものが挙げられる(X〜X29は独立した任意のアミノ酸残基を表す)。
(a)Xがグリシン又はバリン
(b)Xがバリン又はトレオニン
(c)X23がイソロイシン、ロイシン、メチオニン、及びトレオニンよりなる群から選択されるアミノ酸
(d)X24がロイシン
他の実施態様として、配列番号50に示されるアミノ酸配列を有する改良型ニトリルヒドラターゼにおいて、XがT(トレオニン)、XがE(グルタミン酸)、XがY(チロシン)、XがE(グルタミン酸)、XがA(アラニン)、XがT(トレオニン)、XがI(イソロイシン)、X10がA(アラニン)、X11がV(バリン)、X12がF(フェニルアラニン)、X13がD(アスパラギン酸)、X14がS(セリン)、X15がQ(グルタミン)、X16がT(トレオニン)、X17がH(ヒスチジン)、X18がH(ヒスチジン)、X19がV(バリン)、X20がV(バリン)、X25がS(セリン)、X26がS(セリン)、X27がI(イソロイシン)、X28がY(チロシン)、X29がI(イソロイシン)であり、かつ、上記(a)〜(d)から選ばれる少なくとも一つの特徴を有するものが挙げられる。
なお、配列番号50に示されるアミノ酸配列と、上記置換部位以外において、約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、さらに好ましくは約95%以上、特に好ましくは約98%以上の相同性あるいは同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、同様の耐熱性及び/又はアミド化合物耐性を有するニトリルヒドラターゼも本発明の改良型ニトリルヒドラターゼに含まれる。
また、配列番号50に示されるアミノ酸配列において、上記置換部位以外において、1〜10個、好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜2個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、同様の耐熱性及び/又はアミド化合物耐性を有するニトリルヒドラターゼも本発明の改良型ニトリルヒドラターゼに含まれる。
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの他の一例としては、配列番号4で示される既知のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列において、下記(e)〜(h)から選ばれる少なくとも一つの特徴を有するものが挙げられる。
(e)αサブユニットの8番目のアミノ酸残基(チロシン)をグリシン又はバリンに置換したもの
(f)αサブユニットの88番目のアミノ酸残基(セリン)をバリン又はトレオニンに置換したもの
(g)αサブユニットの153番目のアミノ酸残基(バリン)をイソロイシン、ロイシン、メチオニン、及びトレオニンよりなる群から選択されるアミノ酸に置換したもの
(h)αサブユニットの154番目のアミノ酸残基(トリプトファン)をロイシンに置換したもの
なお、配列番号4に示されるアミノ酸配列と、上記置換部位以外において、約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、さらに好ましくは約95%以上、特に好ましくは約98%以上の相同性あるいは同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、同様の耐熱性及び/又はアミド化合物耐性を有するニトリルヒドラターゼも本発明の改良型ニトリルヒドラターゼに含まれる。
また、配列番号4に示されるアミノ酸配列において、上記置換部位以外において、1〜10個、好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜2個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、同様の耐熱性及び/又はアミド化合物耐性を有するニトリルヒドラターゼも本発明の改良型ニトリルヒドラターゼに含まれる。
上記(e)〜(h)のアミノ酸置換を、「Yα8G、Sα88V、Vα153I、Wα154L」等と表記する。標準的アミノ酸はアルファベット1文字で表され、アミノ酸置換の態様は、置換位置(置換箇所までのアミノ酸残基数)を表す数字の左側に置換前のアミノ酸の1文字表記を示し、右側に置換後のアミノ酸の1文字表記を示すことで、上記のように表記することができる。
具体的には、配列番号4に示すαサブユニットのアミノ酸配列に関して、「Yα8G」と表記した場合は、αサブユニットのアミノ酸配列(配列番号4)のうちN末端のアミノ酸残基から数えて(当該N末端のアミノ酸残基を含めて数えて)8番目のチロシン(Y)がグリシン(G)に置換された改良型ニトリルヒドラターゼにおけるアミノ酸置換の態様を意味する。
本発明のより好ましい改良型ニトリルヒドラターゼにおけるアミノ酸置換の態様は、それぞれ以下の1〜8の表記で表すことができる。
1.Yα8G
2.Yα8V
3.Sα88V
4.Sα88T
5.Vα153I
6.Vα153L
7.Vα153M
8.Vα153T
9.Wα154L
上記アミノ酸置換を生じさせるための塩基置換としては、以下の態様が好ましく挙げられる。
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの活性は、天然由来の特性を保持したままの野生型ニトリルヒドラターゼの活性に対して高温下でのアミド化合物耐性が向上している。
ここで、「ニトリルヒドラターゼ活性」とは、ニトリル化合物を、対応するアミド化合物に変換する水和反応(RCN+HO→RCONH)を触媒する酵素活性を意味する。活性測定は、基質であるニトリル化合物をニトリルヒドラターゼと接触させ、対応するアミド化合物に変換した後、当該アミド化合物を定量することにより算出することができる。基質としては、ニトリルヒドラターゼが反応すればいかなるニトリル化合物でも使用できるが、アクリロニトリルが好ましい。
反応条件は、基質濃度は2.5%、反応温度は10℃から30℃、反応時間は10分から30分の範囲である。酵素反応はリン酸を添加して停止させる。その後、HPLC(高速液体クロマトグラフィー)やガスクロマトグラフィーにより、生成したアクリルアミドを分析することでアミド化合物の定量を行うことができる。
「高温下でのアミド化合物耐性」とは、高温下、アミド化合物存在下でもニトリルヒドラターゼ活性を維持することができることを意味する。「高温」とは、具体的には40℃から60℃、より好ましくは45℃〜55℃を意味する。
「高温下でのアミド化合物耐性」は、改良型ニトリルヒドラターゼを有する形質転換体の培養物又は当該形質転換体から単離した改良型ニトリルヒドラターゼを、高温下、アクリルアミド等のアミド化合物(例えば、30〜50%の高濃度)の存在下で、基質であるアクリロニトリル等のニトリル化合物の消費量又は消費速度を分析することにより評価できる。例えば40℃から60℃の範囲で、改良型イントリルヒドラターゼをアミド化合物に接触させ、比較例(変異を施さないニトリルヒドラターゼ)に対し、消費量又は消費速度が1.1倍以上、好ましくは1.15倍以上、より好ましくは1.2倍以上のニトリルヒドラターゼを高温下でのアミド化合物耐性であると評価することができる。
「アミド化合物」としては、例えば、下記一般式(1):
R−CONH (1)
(ここで、Rは、置換されていてもよい炭素数1〜10の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基又はアルケニル基、置換されていてもよい炭素数3〜18のシクロアルキル基又はアリール基、あるいは、置換されていてもよい飽和又は不飽和複素環基である。)
で表されるアミド化合物が挙げられる。特に、式中、Rが「CH=CH−」であるアクリルアミドが好ましい。
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、既知のニトリルヒドラターゼをアミノ酸置換することで得られるものであり、例えば、ロドコッカス・ロドクロウスJ1株由来のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列(配列番号4)に上述の変異を導入し、高温下でのアミド化合物耐性が向上したニトリルヒドラターゼを選択することにより得られる。
J1菌以外のニトリルヒドラターゼにおいても対応する改変位置に同様の変異を導入することによって高温下でのアミド化合物耐性を向上させることができる。例えば、ニトリルヒドラターゼ産生菌としては、ロドコッカス・ロドクロウスM8(配列番号5)、ロドコッカス・ルーバーTH(配列番号6)、ロドコッカス・ロドクロウスM33(VKM Ac−1515D)、ロドコッカス・ピリジノボランスMW3(配列番号7)、ロドコッカス・ピリジノボランスS85−2(配列番号8)、ノカルジア sp.JBRs(配列番号10)、ノカルジア・YS−2002(配列番号11)等が挙げられる。なお、ロドコッカス・ロドクロウスM33(VKM Ac−1515D)は、上記M8菌から自然突然変異によって構成的にニトリルヒドラターゼを発現する株として選抜された菌株で、そのアミノ酸配列及び遺伝子配列に変異はない(米国特許第5,827,699号)。
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、例えば、既知のニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子に、周知の方法にしたがいランダムあるいは部位特異的に変異を導入し、所望の機能、すなわち高温下でのアミド化合物耐性を有する酵素を選択することで、取得することができる。
変異の導入方法としては、Error prone PCRのようなランダム変異導入法と、Kunkel法やGapped duplex法のようなSite−directed Mutagenesis(部位特異的変異導入法)を挙げることができる。
[Error prone PCR]
変異体を用いたタンパク質の機能、性質を研究する方法の一つに、ランダム変異導入法がある。ランダム変異導入法とは、特定のタンパク質をコードする遺伝子に対してランダムな変異を導入し、変異体を作製する方法である。PCRによるランダム変異導入法では、DNA増幅時に厳密度(ストリンジェンシー)の低い条件を設定して、塩基の変異を導入する(Error prone PCR)ことができる。
このError prone PCRでは、増幅されるDNAの全域に対して任意の部位に変異が導入される。そうすると、得られた任意の部位に変異が導入された変異体の機能を検討することによって、タンパク質固有の機能に重要なアミノ酸やドメインの情報を得ることができる。Error prone PCRの鋳型となるニトリルヒドラターゼは、野生株由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子、Error prone PCRによる増幅産物であるDNAを用いることができる。
Error prone PCRの反応条件としては、例えば、反応液中のdNTP(dGTP、dCTP、dATP又はdTTP)のいずれか1種、2種又は3種の配合割合を他のdNTPに比べて減らした組成とする条件が挙げられる。これにより、DNA合成の際、配合割合を減らしたdNTPが必要な箇所においては、誤って他のdNTPが用いられる可能性が高くなり、変異が導入される。また、他の反応条件としては、反応液中のMgCl及び/又はMnCl量を増やした組成とする条件も好ましく挙げられる。
[Site−directed Mutagenesis(部位特異的変異誘発)]
特定部位に変異を導入する方法で、一般的には、標的遺伝子を含むDNA鎖を一本鎖に解離し、目的の変異を含むオリゴヌクレオチド鎖をアニールさせて、DNAポリメラーゼで伸長させて二本鎖とし、これを大腸菌に組み込んで複製させ、目的とする変異を含むクローンを選択する(Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987−1997)等参照)。Kunkel法のほか、Gapped duplex法等様々な方法が知られており、市販の突変異導入用キット、例えばQuickChangeTM XL Site−Directed Mutagenesis Kit(ストラタジーン社製)、GeneTailorTM Site−Directed Mutagenesis System(インビトロジェン社製)、TaKaRa Site−Directed Mutagenesis System(Mutan−K、Mutan−Super Express Km等:タカラバイオ社製)等を用いて簡便に実施することができる。
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、上記のように既知のニトリルヒドラターゼ遺伝子に変異を導入する方法のほか、環境DNAからのメタゲノムスクリーニングによって取得することもできる。
1.3 改良型ニトリルヒドラターゼをコードするDNA
本発明は、本発明の改良型ニトリルヒドラターゼをコードするDNAも提供する。
本発明の「改良型ニトリルヒドラターゼをコードするDNA」には、上記改良型ニトリルヒドラターゼをコードするDNAと相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、高温下でのアミド化合物耐性を有するニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAも含まれる。
「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって塩濃度が300〜2000mM、温度が40〜75℃、好ましくは塩濃度が600〜900mM、温度が65℃の条件を意味する。例えば、2×SSCで50℃等の条件を挙げることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、本発明のニトリルヒドラターゼをコードするDNAを得るための条件を適宜設定することができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))等を参照することができる。ハイブリダイズするDNAとしては、本発明の遺伝子DNAに対して少なくとも40%以上、好ましくは60%、さらに好ましくは90%以上の配列同一性を有する塩基配列を含むDNA又はその部分断片が挙げられる。
1.4 組換えベクター、形質転換体
改良型ニトリルヒドラターゼをコードするDNAは、形質転換される宿主生物において発現可能なように、ベクターに組み込むことが必要である。使用するベクターとしては、プラスミドDNA、バクテリオファージDNA、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNAなどが挙げられる。
ベクターには、ニトリルヒドラターゼ遺伝子のほか、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列(SD配列)等を連結することができる。選択マーカーとしては、例えばカナマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
本発明の形質転換体に使用し得る宿主は、上記組換えベクターが導入された後、目的のニトリルヒドラターゼを発現することができる限り特に限定されないが、例えば、大腸菌及び枯草菌等の細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等を用いることができる。
大腸菌を宿主とする場合、発現効率の高い発現ベクター、例えばtrcプロモーターを有する発現ベクターpkk233−2(アマシャムバイオサイエンス社製)又はpTrc99A(アマシャムバイオサイエンス社製)などを用いることが好ましい。
細菌を宿主とする場合、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)が挙げられ、ロドコッカス菌としては、例えばロドコッカス・ロドクロウスATCC12674、ロドコッカス・ロドクロウスATCC17895、ロドコッカス・ロドクロウスATCC19140等が挙げられる。これらのATCC株はアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手できる。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)等が用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS−7、Vero、CHO細胞、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞等が用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞、Sf21細胞等が用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が用いられる。
植物細胞を宿主とする場合は、タバコBY−2細胞等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。植物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法、エレクトロポレーション法等が用いられる。
宿主に大腸菌を使用した場合、発現した大部分のニトリルヒドラターゼがインクルージョンボディーとなり不溶化するため、菌体活性の低い形質転換体が得られる。一方、ロドコッカス菌を宿主として使用した場合、ニトリルヒドラターゼは可溶性画分に存在するため、高活性な形質転換体が得られる。宿主は目的に応じて選択すれば良いが、厳しい条件で改良型酵素を選抜する場合は高活性なロドコッカス菌の形質転換体を用いるのが好ましい。
1.5 改良型ニトリルヒドラターゼの製造方法
改良型ニトリルヒドラターゼは、上記形質転換体を培養し、得られる培養物からニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質を採取することにより製造することができる。本発明はそのような改良型ニトリルヒドラターゼの製造方法も提供する。
本発明において、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも包含する。
形質転換体の培養は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行う。本発明の形質転換体を培養する培地は、宿主菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース及びデンプン等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、エタノール及びプロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸、若しくは有機酸のアンモニウム塩、又はその他の含窒素化合物が挙げられる。
その他、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じ、培養中の発泡を防ぐために消泡剤を添加してもよい。さらに、培地にはニトリルヒドラターゼの補欠分子であるコバルトイオンや鉄イオンを添加し、酵素の誘導剤となるニトリル類やアミド類を添加してもよい。
培養中、ベクター及び目的遺伝子の脱落を防ぐために選択圧を掛けた状態で培養してもよい。すなわち、選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合に相当する薬剤を培地に添加したり、選択マーカーが栄養要求性相補遺伝子である場合に相当する栄養因子を培地から除いたりしてもよい。
また、選択マーカーが資化性付与遺伝子である場合は、相当する資化因子を必要に応じて唯一因子として添加することができる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含むベクターで形質転換した大腸菌を培養する場合、培養中、必要に応じてアンピシリンを添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合には、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−D−チオガラクトシド(IPTG)で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、IPTG等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸(IAA)で誘導可能なtrpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、IAA等を培地に添加することができる。
形質転換体の培養条件は、目的の改良型ニトリルヒドラターゼの生産性及び宿主の生育が妨げられない条件であれば特に限定されるものではないが、通常、10℃〜40℃、好ましくは20℃〜37℃で5〜100時間行う。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行い、例えばロドコッカス菌であればpH6〜9に調整する。
培養方法としては、固体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養などが挙げられるが、特にロドコッカス菌の形質転換体を培養する場合には、振盪培養又は通気攪拌培養(ジャーファーメンター)により好気的条件下で培養することが好ましい。
上記培養条件で培養すると、高収率で本発明の改良型ニトリルヒドラターゼを上記培養物中、すなわち、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物の少なくともいずれかに蓄積することができる。
培養後、改良型ニトリルヒドラターゼが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより、目的の改良型ニトリルヒドラターゼを採取することができる。菌体又は細胞の破砕方法としては、フレンチプレス又はホモジナイザーによる高圧処理、超音波処理、ガラスビーズ等による磨砕処理、リゾチーム、セルラーゼ又はペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等を利用することができる。
破砕後、必要に応じて菌体又は細胞の破砕残渣(細胞抽出液不溶性画分を含む)を除くことができる。残渣を除去する方法としては、例えば、遠心分離やろ過などが挙げられ、必要に応じて、凝集剤やろ過助剤等を使用して残渣除去効率を上げることもできる。残渣を除去した後に得られた上清は、細胞抽出液可溶性画分であり、粗精製した改良型ニトリルヒドラターゼ溶液とすることができる。
また、改良型ニトリルヒドラターゼが菌体内又は細胞内に生産される場合、菌体や細胞そのものを遠心分離、膜分離等で回収して、未破砕のまま使用することも可能である。
改良型ニトリルヒドラターゼが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離やろ過等により菌体又は細胞を除去する。その後、必要に応じて硫安沈澱による抽出等により前記培養物中から改良型ニトリルヒドラターゼを採取し、さらに必要に応じて透析、各種クロマトグラフィー(ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等)を用いて単離精製することもできる。
形質転換体を培養して得られたニトリルヒドラターゼの生産収率は、例えば、培養液あたり、菌体湿重量又は乾燥重量あたり、粗酵素液タンパク質あたりなどの単位で、SDS−PAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)やニトリルヒドラターゼ活性測定などにより確認することができるが、特段限定されるものではない。SDS−PAGEは当業者であれば公知の方法を用いて行うことができる。また、ニトリルヒドラターゼ活性は、上述した活性の値を適用することができる。
上記した方法のほか、無細胞タンパク質合成系を採用して改良型ニトリルヒドラターゼを産生することも可能である。無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管等の人工容器内でタンパク質を合成する系である。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系には、DNAを鋳型としてRNAを合成する無細胞転写系も含まれる。
この場合、上記の宿主に対応する生物は、下記の細胞抽出液の由来する生物に相当する。ここで、上記細胞抽出液は、真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、例えば、小麦胚芽、大腸菌などの抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されていないものであってもよい。
細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール(PEG)沈殿等によって得ることができる。さらに本発明において、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットPROTEIOSTM(東洋紡)、TNTTM System(プロメガ)、合成装置のPG−MateTM(東洋紡)、RTS(ロシュ・ダイアグノスティクス)などが挙げられる。
上記のように無細胞タンパク質合成によって得られる改良型ニトリルヒドラターゼは、前述のように適宜クロマトグラフィーを選択して、精製することができる。
2.アミド化合物の製造方法
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、酵素触媒として物質生産に利用することができる。例えば、ニトリル化合物に、上記改良型ニトリルヒドラターゼを接触させ、生成されるアミド化合物を採取することにより、アミド化合物を製造することができる。
酵素触媒としては、分離精製されたニトリルヒドラターゼのほか、本発明の形質転換体を培養した後の培養物、又は当該培養物の処理物を利用することができる。処理物としては、例えば、培養後の細胞(形質転換体)をアクリルアミド等のゲルで包含したもの、グルタルアルデヒドで処理したもの、アルミナ、シリカ、ゼオライト及び珪藻土等の無機担体に担持したもの等が挙げられる。
ここで、「接触」とは、改良型ニトリルヒドラターゼとニトリル化合物を同一の反応系又は培養系に存在させることを意味し、例えば、分離精製した改良型ニトリルヒドラターゼとニトリル化合物を混合すること、改良型ニトリルヒドラターゼ遺伝子を発現する細胞(形質転換体)の培養容器にニトリル化合物を添加すること、当該細胞をニトリル化合物の存在下で培養すること、当該細胞の抽出液をニトリル化合物と混合することなどが含まれる。
基質として使用されるニトリル化合物は、酵素の基質特異性、酵素の基質に対する安定性等を考慮して選択される。ニトリル化合物としては、アクリロニトリルが好ましい。反応方法、及び反応終了後のアミド化合物の採取方法は、基質及び酵素触媒の特性により適宜選択される。
酵素触媒は、その活性が失活しない限り、リサイクル使用することが好ましい。失活の防止やリサイクルを容易にすることに鑑み、酵素触媒は処理物の形態で使用されることが好ましい。
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。ここで記載する「%」は、質量%を示す。
[実施例1]改良型ニトリルヒドラターゼ発現用プラスミドの作製
本発明のアミノ酸置換を導入するための鋳型となるプラスミドを以下の方法で作製した。
J1菌のニトリルヒドラターゼ遺伝子を有するプラスミドはpSJ034を使用した(図1)。pSJ034はロドコッカス菌においてニトリルヒドラターゼを発現するプラスミドである。pJD034は、pSJ023より特開平10−337185号公報に示す方法で作製した。すなわち、プラスミドpSJ023をXbaIの部分切断とSse8387Iリンカーライゲーションにより、1箇所のXbaIサイトをSse8387Iに置換したプラスミドpSJ033を作製した。次に、pSJ033をSse8387Iで部分切断し、クレノウフラグメントを用いて末端平滑化を行い、セルフライゲーションすることによりプラスミドpSJ034を作製した。
なお、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)J−1株は、FERM BP−1478として独立行攻法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6(現NITE特許生物寄託センター:千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 120号室))に寄託されている(原寄託日:1987年9月18日)。
また、pSJ023は形質転換体「R.rhodochrous ATCC12674/pSJ023」であり、受託番号FERM BP−6232として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(現NITE特許生物寄託センター:千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 120号室))に平成9(1997)年3月4日付けで国際寄託されている。
[実施例2]改良型ニトリルヒドラターゼの作製
実施例1で作製したプラスミドpSJ034を使用し、アミノ酸置換を行った。PCRは、下記反応液組成、反応条件、プライマーを用いて行った。
<PCR反応液組成>
滅菌水 20μl
pSJ034 (1ng/ml) 1μl
Forward Primer (10mM) 2μl
Reverse Primer (10mM) 2μl
PrimeSTAR MAX (2×) 25μl
合 計 50μl
<PCR反応条件>
(98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃で90秒)×30サイクル
PCR終了後、反応液5μlを0.7%アガロースゲル電気泳動に供し、11kbの増幅断片を確認し、1μlのDpnI(キットに付属)をPCR反応液に添加して37℃で1時間反応させ、鋳型プラスミドの除去を行った。反応終了液をWizard SV Gel and PCR Clean−Up Syste(プロメガ株式会社)で精製し、精製したPCR反応物を用いてJM109へ形質転換した。得られた培養物から、QIAprep Spin Miniprep Kit(キアゲン社)を用いてプラスミドDNAを抽出し、オートシークエンサーCEQ 8000(ベックマンコールター社)を用いて、ニトリルヒドラターゼの塩基配列を確認した。得られたプラスミドを表3のように命名した。
[実施例3]ロドコッカス形質転換体の作製
ロドコッカス・ロドクロウスATCC12674株の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて3回洗浄し、滅菌水に懸濁した。実施例2で調製したプラスミド1μlと菌体懸濁液10μlを混合し、氷冷した。キュベットにDNAと菌体の懸濁液を入れ、遺伝子導入装置Gene Pulser(BIORAD)により2.0kV、200OHMSで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下10分静置し、37℃で10分間ヒートショックを行い、MYK培地(0.5%ポリペプトン、0.3%バクトイーストエキス、0.3%バクトモルトエキス、0.2%KHPO、0.2%KHPO)500μlを加え、30℃、5時間静置した。その後、50μg/mlカナマイシン入りMYK寒天培地に塗布し、30℃で3日間培養した。30℃、3日間培養後のコロニーを形質転換体とした。
上記の工程で得られた各形質転換体をMYK培地(50μg/mlカナマイシン)にそれぞれ接種し、30℃にて2日間振盪培養し、GGPK培地(1.5%グルコース、1%グルタミン酸ナトリウム、0.1%酵母エキス、0.05%KHPO、0.05%KHPO、0.05%Mg・7HO、1% CoCl、0.1%尿素、50μg/mlカナマイシン、pH7.2)に1%植菌を行った。30℃で3日間振盪培養し、遠心分離により集菌した。その後、100mMリン酸緩衝液(pH7.0)で菌体を洗浄し、菌体懸濁液を調製した。
[実施例4]高温下でのアミド化合物耐性の評価
実施例3で得られた改良型ニトリルヒドラターゼのアミド化合物耐性を以下の方法で測定した。
菌体液0.2mlと50mMリン酸緩衝液(pH7.0)4.8mlとを混合し、さらに5.0%(w/v)のアクリロニトリルを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.0)5mlを混合液に加えて、10℃で10分間振盪しながら反応させた。次いで、菌体を濾別して、ガスクロマトグラフィーを用いて生成したアクリルアミドの量を定量した。
<分析条件>
分析機器: ガスクロマトグラフGC2014(島津製作所製)
検出器: FID(検出200℃)
カラム: ポラパックPS(ウォーターズ社製カラム充填剤)を充填した1mガラスカラム
カラム温度: 190℃
アクリルアミドの量からニトリルヒドラターゼ活性を換算した。ここで、ニトリルヒドラターゼ活性は、1分間に1μmolのアクリルアミドを生成する酵素量を1Uと定義する。
次に、下記反応液組成及び反応条件で実験を行った。なお、反応に用いる各菌体懸濁液は、事前に測定した酵素活性から同一の活性量になるように100mMリン酸緩衝液(pH7.0)で適宜希釈した。比較対照として、比較株であるATCC12674/pSJ034を使用した。
<反応液組成>
50%アクリルアミド溶液 94g
アクリロニトリル 3g
1M リン酸緩衝液 1g
菌液(同一の酵素活性単位(U)量) 2g
<反応条件>
反応温度 45℃
反応時間 3時間
反応開始前(0時間)、3時間後にそれぞれ反応液1mlをサンプリングし、0.45μmのフィルターを用いて濾過し、得られた濾液をガスクロマトグラフィーに供した。残存するアクリロニトリルの割合(%)の分析結果を表4に示した。
上記結果より全ての改良型ニトリルヒドラターゼは、比較例であるpSJ034よりもアクリロニトリルの消費率が110%以上であった。ニトリルヒドラターゼを使用したアミド化合物の合成反応において、高温・高濃度生成物への暴露による失活や、生成物であるアミド化合物による反応阻害が問題となる。本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、高温下、かつ高濃度のアクリルアミド存在下でもニトリルヒドラターゼ活性が維持されていることから、高温下でのアクリルアミド耐性が向上していると言える。
[実施例5]改良型ニトリルヒドラターゼの作製
WO2012/164933に記載のニトリルヒドラターゼ(pSJ306A)を使用し、実施例2と同様の方法でアミノ酸置換を行った。作製したプラスミドを表5に示す。
表5に記載のプラスミドを実施例3と同様の手法でロドコッカス・ロドロクロウスATCC12674形質転換体を得、MYK培地で培養した。得られた培養菌体を使用し、以下の条件で高温下のアミド化合物耐性の評価を実施した。
<反応液組成>
50%アクリルアミド溶液 94g
アクリロニトリル 3g
1Mリン酸緩衝液 1g
菌液(同一の酵素活性単位(U)量) 1g
<反応条件>
反応温度 45℃
反応時間 5時間
上記結果より全ての改良型ニトリルヒドラターゼは、比較例であるpSJ306Aよりもアクリロニトリルの消費率が110%以上であった。よって本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、高温下、かつ高濃度のアクリルアミド存在下でもニトリルヒドラターゼ活性が維持されていることから、高温下でのアクリルアミド耐性が向上していると言える。
[実施例6]改良型ニトリルヒドラターゼの作製(JBRs) ノカルジア sp.JBRs由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子(GenBankアクセッション番号 AY141130)の発現プラスミドを以下の手法で作製した。
ベクター断片は、pSJ034を鋳型としたPCRを行い、Wizard SV Gel and PCR Clean−Up Syste(プロメガ株式会社)で調製した。
<PCR反応液組成>
滅菌水 20μl
pSJ034 (1ng/ml) 1μl
Forward Primer (10mM) 2μl
Reverse Primer (10mM) 2μl
PrimeSTAR MAX (2×) 25μl
合 計 50μl
<PCR反応条件>
(98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃で90秒)×30サイクル
NH−F:GAAGTGATCG TATGAGTGAA GACACACTCA CTG(配列番号51)
NH−R:GTGGATACCA TCCATTTCCT CATTCCTTTC ATC(配列番号52)
上記で調製したベクター断片と、人工合成したノカルジア sp.JBRs由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子(配列番号44)をIn−Fusionクローニングキット(タカラバイオ)を用いてクローニングし、大腸菌HST08(タカラバイオ)に形質転換した。得られたコロニーからプラスミドを回収してDNA配列を確認し、ノカルジア sp.JBRs由来ニトリルヒドラターゼ発現プラスミド(pSJ−JBRs)を得た。
さらに、pSJ−JBRsを鋳型に使用し、実施例2と同様の方法でアミノ酸置換を実施した。作製したプラスミドを表7に示す。
表7に記載のプラスミドを実施例3と同様の手法でロドコッカス・ロドロクロウスATCC12674形質転換体を得、MYK培地で培養した。得られた培養菌体を使用し、実施例4の条件で高温下のアミド化合物耐性の評価を実施した。結果を表8に示す。
上記結果より全ての改良型ニトリルヒドラターゼは、比較例であるpSJ-JBRsよりもアクリロニトリルの消費率が108%以上であった。よって本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、高温下、かつ高濃度のアクリルアミド存在下でもニトリルヒドラターゼ活性が維持されていることから、高温下でのアクリルアミド耐性が向上していると言える。
[実施例7]改良型ニトリルヒドラターゼの作製(S85−2)
ロドコッカス・ピリジノボランスS85−2由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子(GenBankアクセッション番号 AJ582605)の発現プラスミドは、人工合成したニトリルヒドラターゼ遺伝子(配列番号45)を用いて実施例6と同様の手法で作製した。得られたプラスミドをpSJ−S85−2と命名した。
さらに、pSJ−S85−2を鋳型に使用し、実施例2と同様の方法でアミノ酸置換を実施した。作製したプラスミドを表9に示す。
表9に記載のプラスミドを実施例3と同様の手法でロドコッカス・ロドロクロウスATCC12674形質転換体を得、MYK培地で培養した。得られた培養菌体を使用し、実施例4の条件で高温下のアミド化合物耐性の評価を実施した。結果を表10に示す。
上記結果より全ての改良型ニトリルヒドラターゼは、比較例であるpSJ-S85−2よりもアクリロニトリルの消費率が130%以上であった。よって本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、高温下、かつ高濃度のアクリルアミド存在下でもニトリルヒドラターゼ活性が維持されていることから、高温下でのアクリルアミド耐性が向上していると言える。
[実施例8]改良型ニトリルヒドラターゼの作製(M8)
ロドコッカス・ロドクロウス M8由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子(GenBankアクセッション番号 ATT79340、AAT79339)の発現プラスミドは、特開2011-200132号公報に記載のプラスミドpSJ−NO1Aを使用し、実施例2と同様の方法でアミノ酸置換を実施した。作製したプラスミドを表11に示す。

表11に記載のプラスミドを実施例3と同様の手法でロドコッカス・ロドロクロウスATCC12674形質転換体を得、MYK培地で培養した。得られた培養菌体を使用し、実施例4の条件で高温下のアミド化合物耐性の評価を実施した。結果を表12に示す。
上記結果より全ての改良型ニトリルヒドラターゼは、比較例であるpSJ-NO1Aよりもアクリロニトリルの消費率が110%以上であった。よって本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、高温下、かつ高濃度のアクリルアミド存在下でもニトリルヒドラターゼ活性が維持されていることから、高温下でのアクリルアミド耐性が向上していると言える。
[実施例9]ロドコッカス・ロドクロウス(三井菌)
シュードノカルディア・サーモフィラJCM3095由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子(GenBankアクセッション番号 DD028560、DD028561)の発現プラスミドは、特開2011-200132号公報に記載のプラスミドpSJ−NO2Aを使用し、実施例2と同様の方法でアミノ酸置換を実施した。作製したプラスミドを表10に示す。
表13に記載のプラスミドを実施例3と同様の手法でロドコッカス・ロドロクロウスATCC12674形質転換体を得、MYK培地で培養した。得られた培養菌体を使用し、実施例4の条件で高温下のアミド化合物耐性の評価を実施した。結果を表14に示す。
上記結果より全ての改良型ニトリルヒドラターゼは、比較例であるpSJ-NO2Aよりもアクリロニトリルの消費率が240%であった。よって本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、高温下、かつ高濃度のアクリルアミド存在下でもニトリルヒドラターゼ活性が維持されていることから、高温下でのアクリルアミド耐性が向上していると言える。
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、高温下でのアクリルアミド耐性が向上しているため、ニトリル化合物から対応するアミド化合物を効率良く製造することができ、アミド化合物の工業的生産に有用である。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
ロドコッカス・ロドクロウスJ1株:FERM BP−1478
R.rhodochrous ATCC12674/pSJ023:FERM BP−6232
配列番号20:α8G−Fプライマー
配列番号21:α8G−Rプライマー
配列番号22:α8V−Fプライマー
配列番号23:α8V−Rプライマー
配列番号24:α88V−Fプライマー
配列番号25:α88V−Rプライマー
配列番号26:α153I−Fプライマー
配列番号27:α153I−Rプライマー
配列番号28:α153L−Fプライマー
配列番号29:α153L−Rプライマー
配列番号30:α153M−Fプライマー
配列番号31:α153M−Rプライマー
配列番号32:α153T−Fプライマー
配列番号33:α153T−Rプライマー
配列番号34:α154L−Fプライマー
配列番号35:α154L−Rプライマー
配列番号36:α153I・α154L−Fプライマー
配列番号37:α153I・α154L−Rプライマー
配列番号38:α153L・α154L−Fプライマー
配列番号39:α153L・α154L−Rプライマー
配列番号40:α153M・α154L−Fプライマー
配列番号41:α153M・α154L−Rプライマー
配列番号42:α153T・α154L−Fプライマー
配列番号43:α153T・α154L−Rプライマー
配列番号46:本発明に係る特定のアミノ酸
配列番号47:本発明に係る特定のアミノ酸
配列番号48:本発明に係る特定のアミノ酸
配列番号49:本発明に係る特定のアミノ酸
配列番号50:本発明に係るαサブユニットのアミノ酸
配列番号51:NH−Fプライマー
配列番号52:NH−Rプライマー
配列番号53:α88T−Fプライマー
配列番号54:α88T−Rプライマー

Claims (7)

  1. αサブユニットにおいて、下記配列番号47に示されるアミノ酸配列を含む、改良型ニトリルヒドラターゼであって、ロドコッカス属細菌又はノカルジア属細菌由来であり、高温下でのアミド化合物耐性が野生型より向上していることを特徴とする改良型ニトリルヒドラターゼ。
    (b)配列番号47: X101112NX131415161718192021CX22LC
    (但し、Nはアスパラギン、Vはバリン、Cはシステイン、Tはトレオニン、Lはロイシン、X9はV(バリン)又はT(トレオニン)であり、X10はA(アラニン)、X11はV(バリン)、X12はF(フェニルアラニン)、X13はD(アスパラギン酸)、X14はS(セリン)、X15はQ(グルタミン)、X16はT(トレオニン)、X17はH(ヒスチジン)、X18はH(ヒスチジン)、X19はV(バリン)、X20はV(バリン)、X21はV(バリン)、X22はT(トレオニン)である);
  2. 下記配列番号50に示されるアミノ酸配列
    MSEHVNKXRXKAXETLLYERGLITPAAVDRVVSYYENEIGPMGGAKVVAKSWVDPEYRKWLEEDATAAMASLGYAGEQAHQIX101112NX131415161718192021CX22LCSCYPWPVLGLPPAWYKSMEYRSRVVADPRGVLKRDFGFDIPDEVEVRX2324DSX2526EX27RX2829VIPERPAGTDGWSEEELTKLVSRDSMIGVSNALTPQEVIV (配列番号50)
    (但し、XがT(トレオニン)、XがE(グルタミン酸)、XがY(チロシン)、XがE(グルタミン酸)、XがA(アラニン)、XがT(トレオニン)、XがI(イソロイシン)、X25がS(セリン)、X26がS(セリン)、X27がI(イソロイシン)、X28がY(チロシン)、X29がI(イソロイシン)である)を有する、請求項1に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
  3. 請求項1又は2に記載の改良型ニトリルヒドラターゼをコードするDNA又は前記DNAと相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、高温下でのアミド化合物耐性を有するニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
  4. 請求項3に記載のDNAを含む組換えベクター。
  5. 請求項4に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
  6. 請求項5に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からニトリルヒドラターゼを採取する、ニトリルヒドラターゼの製造方法。
  7. 請求項1又は2に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ又は請求項5に記載の形質転換体を培養して得られる培養物若しくは当該培養物の処理物をニトリル化合物に接触させることを特徴とする、アミド化合物の製造方法。
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