CN116656657A - 改良型腈水合酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及提高了高温下的酰胺化合物耐性的新型改良型腈水合酶。具体而言，涉及在序列号50所示的氨基酸序列中具有选自下述(a)～(d)中的至少一个氨基酸变异的腈水合酶(X1～X27表示独立的任意的氨基酸残基)。(a)X1为缬氨酸或甘氨酸；(b)X9为缬氨酸或苏氨酸；(c)X23为选自由异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸组成的组中的氨基酸；(d)X24为亮氨酸。

Description

改良型腈水合酶
本申请是中国专利申请201580030220.1的分案申请201910099944.1的分案申请，原申请201580030220.1的申请日为2015年5月12日，其名称为“改良型腈水合酶”。
技术领域
本发明涉及改良型(变异型)腈水合酶及其制造方法。进而涉及编码该酶的DNA、包含该DNA的重组载体、和具有该重组载体的转化体以及酰胺化合物的制造方法。
背景技术
腈水合酶是具有使腈基水合而转化为酰胺基的腈水合活性的酶。使用该酶或含有该酶的微生物菌体等来进行与腈化合物对应的酰胺化合物的制造，已知该方法与现有的化学合成法相比，自腈化合物向对应的酰胺化合物的转化率和选择率高。
作为生产腈水合酶的微生物，例如可列举出属于棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、根瘤菌属(Rhizobium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)等的微生物。其中，玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J1株用于丙烯酰胺的工业生产中，其有用性已被证实。另外，编码该菌株所产生的腈水合酶的基因也已明确(参照专利文献1)。
另一方面，不仅利用由自然界中存在的微生物分离的腈水合酶、其基因，还出于改变腈水合酶的活性、底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、对底物的稳定性、对产物的稳定性等目的，尝试了向腈水合酶中导入变异；嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶中，由立体结构信息预测与底物特异性、热稳定性相关的区域，从中取得底物特异性变化了的变异酶(参照专利文献2～4)。另外，本发明人等得到耐热性或酰胺化合物耐性均提高了的腈水合酶基因(参照专利文献5～9)。
但是，从催化剂成本等生产成本的观点等出发，进一步提高耐热性和酰胺化合物耐性、或开发能在高温下反应的腈水合酶而用于酰胺化合物的制造是非常有用的，从反应时的酶量的削减和成本削减等观点出发，期望获得具有这种性能的酶。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第3162091号公报
专利文献2：国际公开第2004/056990号小册子
专利文献3：日本特开2004-194588号公报
专利文献4：日本特开2005-16403号公报
专利文献5：国际公开第2005/116206号小册子
专利文献6：日本特开2007-143409号公报
专利文献7：日本特开2007-43910号公报
专利文献8：日本特开2008-253182号公报
专利文献9：日本特开2010-172295号公报
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供提高了高温下的酰胺化合物耐性的新型改良型腈水合酶，使制造效率更高的酰胺化合物的制造方法成为可能。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述问题进行了深入的研究，发现在腈水合酶的氨基酸序列中将特定的氨基酸残基置换为其它氨基酸残基而成的蛋白质不仅具有腈水合酶活性，而且提高了高温下的酰胺化合物耐性，从而完成了本发明。
即，本发明提供以下的[1]～[13]。
[1]一种改良型腈水合酶，其在α亚基中包含下述序列号46～49所示的至少1个氨基酸序列，
(a)序列号46：X1X2X3X4X5X6RX7KAX8E
(其中，R为精氨酸，K为赖氨酸，A为丙氨酸，E为谷氨酸，X1为除酪氨酸之外的氨基酸，X2～X8彼此独立地表示任意的氨基酸残基)；
(b)序列号47：X9X10X11X12NX13X14X15X16X17X18X19X20X21CX22LC
(其中，N为天冬酰胺，V为缬氨酸，C为半胱氨酸，T为苏氨酸，L为亮氨酸，X9为除丝氨酸之外的氨基酸，X10～X22彼此独立地表示任意的氨基酸残基)；
(c)序列号48：X23WDSX25X26EX27RX28X29V
(其中，W表示色氨酸，D表示天冬氨酸，S表示丝氨酸，E表示谷氨酸、R表示精氨酸，V表示缬氨酸，X23表示除缬氨酸之外的氨基酸，X25～X29彼此独立地表示任意的氨基酸残基)；
(d)序列号49：VX24DSX25X26EX27RX28X29V
(其中，V表示缬氨酸，D表示天冬氨酸，S表示丝氨酸，E表示谷氨酸，R表示精氨酸，X24表示除色氨酸之外的氨基酸，X25～X29彼此独立地表示任意的氨基酸残基)
[2]根据上述[1]所述的改良型腈水合酶，其在α亚基中包含下述序列号46～49所示的至少1个氨基酸序列，
(a)序列号46：X1X2X3X4X5X6RX7KAX8E
(其中，R为精氨酸，K为赖氨酸，A为丙氨酸，E为谷氨酸，X1为除酪氨酸之外的氨基酸，X2～X8彼此独立地表示任意的氨基酸残基)；
(b)序列号47：X9X10X11X12NX13X14X15X16X17X18X19X20X21CX22LC
(其中，N为天冬酰胺，V为缬氨酸，C为半胱氨酸，T为苏氨酸，L为亮氨酸，X9为除丝氨酸之外的氨基酸，X10～X20彼此独立地表示任意的氨基酸残基，X21表示缬氨酸，X22表示苏氨酸)；
(c)序列号48：X23WDSX25X26EX27RX28X29V
(其中，W表示色氨酸，D表示天冬氨酸，S表示丝氨酸，E表示谷氨酸，R表示精氨酸，V表示缬氨酸，X23表示除缬氨酸之外的氨基酸，X25～X29彼此独立地表示任意的氨基酸残基)；
(d)序列号49：VX24DSX25X26EX27RX28X29V
(其中，V表示缬氨酸，D表示天冬氨酸，S表示丝氨酸，E表示谷氨酸，R表示精氨酸，X24表示除色氨酸之外的氨基酸，X25～X29彼此独立地表示任意的氨基酸残基)
[3]根据上述[1]所述的改良型腈水合酶，其在α亚基中包含下述序列号46～49所示的至少1个氨基酸序列，
(a)序列号46：X1X2X3X4X5X6RX7KAX8E
(其中，R为精氨酸，K为赖氨酸，A为丙氨酸，E为谷氨酸，X1为甘氨酸或缬氨酸，X2～X8彼此独立地表示任意的氨基酸残基)；
(b)序列号47：X9X10X11X12NX13X14X15X16X17X18X19X20X21CX22LC
(其中，N为天冬酰胺，V为缬氨酸，C为半胱氨酸，T为苏氨酸，L为亮氨酸，X9为缬氨酸或苏氨酸，X10～X20彼此独立地表示任意的氨基酸残基，X21表示缬氨酸，X22表示苏氨酸)；
(c)序列号48：X23WDSX25X26EX27RX28X29V
(其中，W表示色氨酸，D表示天冬氨酸，S表示丝氨酸，E表示谷氨酸，R表示精氨酸，V表示缬氨酸，X23选自由异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸和苏氨酸组成的组，X25～X29彼此独立地表示任意的氨基酸残基)；
(d)序列号49：VX24DSX25X26EX27RX28X29V
(其中，V表示缬氨酸，D表示天冬氨酸，S表示丝氨酸，E表示谷氨酸，R表示精氨酸，X24表示亮氨酸，X25～X29彼此独立地表示任意的氨基酸残基)
[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的改良型腈水合酶，其中，前述序列号46中，X2为T(苏氨酸)、X3为E(谷氨酸)、X4为Y(酪氨酸)、X5为E(谷氨酸)、X6为A(丙氨酸)、X7为T(苏氨酸)、X8为I(异亮氨酸)，
前述序列号47中，X10为A(丙氨酸)、X11为V(缬氨酸)、X12为F(苯丙氨酸)、X13为D(天冬氨酸)、X14为S(丝氨酸)、X15为Q(谷氨酰胺)、X16为T(苏氨酸)、X17为H(组氨酸)、X18为H(组氨酸)、X19为V(缬氨酸)、X20为V(缬氨酸)，
前述序列号48和49中，X25为S(丝氨酸)、X26为S(丝氨酸)、X27为I(异亮氨酸)、X28为Y(酪氨酸)、X29为I(异亮氨酸)。
需要说明的是，序列号46所示的氨基酸序列相当于腈水合酶的α亚基的氨基酸序列的8～19位、序列号47所示的氨基酸序列相当于该序列的88～105位、序列号48和49所示的氨基酸序列相当于该序列的153～164位。
[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的改良型腈水合酶，其具有序列号50所示的氨基酸序列。
[6]一种改良型腈水合酶，其在α亚基中包含序列号50所示的氨基酸序列，其具有选自下述(i)～(iv)中的至少一个氨基酸变异。
(i)X1为G(甘氨酸)或V(缬氨酸)
(ii)X9为V(缬氨酸)或T(苏氨酸)
(iii)X23为选自由I(异亮氨酸)、L(亮氨酸)、M(甲硫氨酸)和T(苏氨酸)组成的组中的氨基酸
(iv)X24为L(亮氨酸)
[7]根据上述[6]所述的改良型腈水合酶，其中，X2为T(苏氨酸)、X3为E(谷氨酸)、X4为Y(酪氨酸)、X5为E(谷氨酸)、X6为A(丙氨酸)、X7为T(苏氨酸)、X8为I(异亮氨酸)、X10为A(丙氨酸)、X11为V(缬氨酸)、X12为F(苯丙氨酸)、X13为D(天冬氨酸)、X14为S(丝氨酸)、X15为Q(谷氨酰胺)、X16为T(苏氨酸)、X17为H(组氨酸)、X18为H(组氨酸)、X19为V(缬氨酸)、X20为V(缬氨酸)、X25为S(丝氨酸)、X26为S(丝氨酸)、X27为I(异亮氨酸)、X28为Y(酪氨酸)、X29为I(异亮氨酸)。
[8]根据上述[1]～[7]中任一项所述的改良型腈水合酶，其中，前述腈水合酶来源于红球菌属细菌或诺卡氏菌属细菌。
[9]一种DNA，其为编码上述[1]～[8]中任一项所述的改良型腈水合酶的DNA；或者为，与具有跟前述DNA互补的碱基序列的DNA在严苛的条件下杂交，并且编码具有高温下的酰胺化合物耐性的、具有腈水合酶活性的蛋白质的DNA。
[10]一种重组载体，其包含上述[9]所述的DNA。
[11]一种转化体，其包含上述[10]所述的重组载体。
[12]一种腈水合酶的制造方法，所述制造方法培养上述[11]所述的转化体，从所得到的培养物中提取腈水合酶。以及，
[13]一种酰胺化合物的制造方法，其特征在于，使上述[1]～[8]中任一项所述的改良型腈水合酶或培养[11]所述的转化体而得到的培养物或该培养物的处理物与腈化合物接触。
发明的效果
根据本发明，能够提供提高了高温下的酰胺化合物耐性的新型改良型(变异型)腈水合酶。本发明的改良型腈水合酶在高温下的酰胺化合物耐性优异，能提高酰胺化合物的制造效率。
附图说明
图1为质粒pSJ034的结构图。
图2-1为示出来源于各种微生物的腈水合酶的α亚基的氨基酸序列(N末端侧的一部分)的图。
图2-2为示出与图2-1同样的氨基酸序列的图，其示出了紧接着图2-1的氨基酸序列的序列。
图3为序列号50所示的本发明的α亚基的氨基酸序列。
本申请要求基于日本专利申请2014-118041(2014年6月6日申请)的优先权，其内容在本说明书中作为参考并入。
具体实施方式
1.腈水合酶
1.1已知的腈水合酶
“腈水合酶”采取由α亚基和β亚基的结构域缔合而成的高级结构，具有非血红素铁原子或非咕啉核钴原子作为辅基。这些腈水合酶分别以铁型腈水合酶和钴型腈水合酶的称呼加以区分。
作为铁型腈水合酶，可列举出来源于红球菌属N-771株的腈水合酶作为其代表例。通过进行X射线结晶结构解析，该铁型腈水合酶的立体结构变得明确。结果，该酶介由形成活性中心的α亚基的半胱氨酸簇(Cys-Ser-Leu-Cys-Ser-Cys)中的4个氨基酸残基而与非血红素铁结合。
作为钴型腈水合酶，可列举出来源于玫瑰色红球菌J1株(以下有时称为“J1菌”)的钴型腈水合酶，或来源于嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardiathermophila)的钴型腈水合酶作为代表例。
来源于J1菌的钴型腈水合酶介由形成活性中心的α亚基的半胱氨酸簇(Cys-Thr-Leu-Cys-Ser-Cys)所示的区域而与钴原子结合。需要说明的是，来源于嗜热假诺卡氏菌的钴型腈水合酶的半胱氨酸簇中，上述来源于J1菌的半胱氨酸簇中的上游侧(N末端侧)起第4位的半胱氨酸(Cys)为半胱亚磺酸(Csi)，最下游侧(C末端侧)的第6位的半胱氨酸(Cys)为半胱次磺酸(Cse)。
如上所述，辅基与α亚基中的半胱氨酸簇“C(S/T)LCSC”所示的区域结合。作为包含这样的辅基结合区域的腈水合酶，例如可列举出具有来源于玫瑰色红球菌J1(FERM BP-1478)、玫瑰色红球菌M8(苏联专利1731814号(SU1731814))、玫瑰色红球菌M33(VKM Ac-1515D)、玫瑰色红球菌ATCC39484(日本特开2001-292772)、史密斯芽孢杆菌(Bacillussmithii)(日本特开平9-254188)、嗜热假诺卡氏菌(日本特开平9-275978)或热葡糖苷地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)的氨基酸序列的腈水合酶以及来源于上述菌的基因序列所编码的腈水合酶。另一方面，认为β亚基涉及结构的稳定性相关。
来源于玫瑰色红球菌J1(FERM BP-1478)的腈水合酶的GenBank登录号为“P21220”。另外，来源于玫瑰色红球菌M8(SU1731814)的α亚基的GenBank登录号为“ATT79340”，β亚基的GenBank登录号为“AAT79339”。来源于嗜吡啶红球菌MW3的腈水合酶基因的GenBank登录号为AJ582605，来源于嗜吡啶红球菌S85-2的腈水合酶基因的GenBank登录号为AJ582605，赤红球菌TH(CGMCC No.2380)的腈水合酶基因记载在中国专利101463358号(CN1463358)中。进而，来源于诺卡氏菌·YS-2002的腈水合酶基因的GenBank登录号为“X86737”，来源于诺卡氏菌sp.JBRs的腈水合酶基因的GenBank登录号为“AY141130”。
序列表的序列号1～19中记载已知的腈水合酶的氨基酸序列和碱基序列。
序列号1：来源于玫瑰色红球菌J1的β亚基的碱基序列
序列号2：来源于玫瑰色红球菌J1的β亚基的氨基酸序列
序列号3：来源于玫瑰色红球菌J1的α亚基的碱基序列
序列号4：来源于玫瑰色红球菌J1的α亚基的氨基酸序列
序列号5：玫瑰色红球菌M8的α亚基的氨基酸序列
序列号6：赤红球菌TH的α亚基的氨基酸序列
序列号7：嗜吡啶红球菌MW33的α亚基的氨基酸序列
序列号8：嗜吡啶红球菌S85-2的α亚基的氨基酸序列
序列号9：嗜吡啶红球菌MS-38的α亚基的氨基酸序列
序列号10：诺卡氏菌sp.JBRs的α亚基的氨基酸序列
序列号11：诺卡氏菌SP.YS-2002的α亚基的氨基酸序列
序列号12：未培养菌SP1的α亚基的氨基酸序列
序列号13：未培养菌BD2的α亚基的氨基酸序列
序列号14：玫瑰色红球菌ATCC39484的α亚基的氨基酸序列
序列号15：草木樨中华根瘤菌WSM419的α亚基的氨基酸序列
序列号16：热葡糖苷酶地芽孢杆菌Q6的α亚基的氨基酸序列
序列号17：嗜热假诺卡氏菌JCM3095的α亚基的氨基酸序列
序列号18：玫瑰色红球菌Cr4的α亚基的氨基酸序列
序列号19：睾丸酮丛毛单胞菌的α亚基的氨基酸序列
另外，将来源于各种微生物的已知的腈水合酶的α亚基的氨基酸(单字符号)序列的比对示于图2-1和2-2。需要说明的是，图2-1、2-2各自中，各氨基酸序列从上往下依次对应于序列号4、5～19。
本发明的腈水合酶不限定于具有上述序列的酶，包含与序列号1～19中任一项所述的氨基酸序列具有约60％以上、优选约70％以上、更优选约80％以上、进一步优选约90％以上、特别优选约95％以上、最优选约98％以上的同源性或同一性的氨基酸序列且具有腈水合酶活性的蛋白质也包括在本发明的腈水合酶中。
另外，本发明的腈水合酶中，包含序列号1～19中任一项所述的氨基酸序列中缺失、置换或附加有1个或多个、具体而言1～20个、优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～2个的氨基酸而成的氨基酸序列且具有腈水合酶活性的蛋白质也包括在本发明的腈水合酶中。
1.2改良型腈水合酶
本发明的改良型腈水合酶是提高了高温下的酰胺化合物耐性的新型改良型腈水合酶。
本发明的改良型腈水合酶的来源没有特别限定，例如可以利用由美国国家生物技术信息中心(NCBI；National Center for Biotechnology Informatio n)提供的GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？CM D＝search&DB＝protein)中登录的腈水合酶、公知文献中记载的腈水合酶。
具体而言，例如可以示出WO2005/116206号、日本特开2007-143409号、日本特开2007-43910号、日本特开2008-253182号、日本特开2010-172295号(通过参考引入至本说明书)中记载的腈水合酶。这些腈水合酶具有耐热性、丙烯酰胺耐性，通过进一步施加本发明的氨基酸置换，能够赋予提高高温下的酰胺化合物耐性的性质。
作为本发明的改良型腈水合酶的一例，可列举出α亚基具有图3所示的氨基酸序列(序列号50)的酶。图3所示的氨基酸序列中，在从N末端数第8位～第19位存在序列号46所示的氨基酸序列，在第88位～第105位存在序列号47所示的氨基酸序列，在第153位～第165位存在序列号48或序列号49所示的氨基酸序列。
作为本发明的一个实施方式，可列举出序列号50所示的氨基酸序列中具有选自下述(a)～(d)中的至少一个氨基酸变异的腈水合酶(X1～X29表示独立的任意的氨基酸残基)。
(a)X1为甘氨酸或缬氨酸
(b)X9为缬氨酸或苏氨酸
(c)X23为选自由异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸组成的组中的氨基酸
(d)X24为亮氨酸
作为其它实施方式，可列举出在具有序列号50所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中X2为T(苏氨酸)、X3为E(谷氨酸)、X4为Y(酪氨酸)、X5为E(谷氨酸)、X6为A(丙氨酸)、X7为T(苏氨酸)、X8为I(异亮氨酸)、X10为A(丙氨酸)、X11为V(缬氨酸)、X12为F(苯丙氨酸)、X13为D(天冬氨酸)、X14为S(丝氨酸)、X15为Q(谷氨酰胺)、X16为T(苏氨酸)、X17为H(组氨酸)、X18为H(组氨酸)、X19为V(缬氨酸)、X20为V(缬氨酸)、X25为S(丝氨酸)、X26为S(丝氨酸)、X27为I(异亮氨酸)、X28为Y(酪氨酸)、X29为I(异亮氨酸)且具有选自上述(a)～(d)中的至少一个特征的腈水合酶。
需要说明的是，具备与序列号50所示的氨基酸序列在上述置换部位以外具有约70％以上、优选约80％以上、更优选约90％以上、进一步优选约95％以上、特别优选约98％以上的同源性或同一性的氨基酸序列且具有同样的耐热性和/或酰胺化合物耐性的腈水合酶也包括在本发明的改良型腈水合酶中。
另外，具有在序列号50所示的氨基酸序列中在上述置换部位以外缺失、置换或附加有1～10个、优选1～5个、进一步优选1～2个的氨基酸而成的氨基酸序列且具有同样的耐热性和/或酰胺化合物耐性的腈水合酶也包括在本发明的改良型腈水合酶中。
作为本发明的改良型腈水合酶的另一例，可列举出在序列号4所示的已知的腈水合酶的氨基酸序列中具有选自下述(e)～(h)中的至少一个特征的腈水合酶。
(e)将α亚基的第8位的氨基酸残基(酪氨酸)置换为甘氨酸或缬氨酸
(f)将α亚基的第88位的氨基酸残基(丝氨酸)置换为缬氨酸或苏氨酸
(g)将α亚基的第153位的氨基酸残基(缬氨酸)置换为选自由异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸组成的组中的氨基酸
(h)将α亚基的第154位的氨基酸残基(色氨酸)置换为亮氨酸
需要说明的是，具备与序列号4所示的氨基酸序列在上述置换部位以外具有约70％以上、优选约80％以上、更优选约90％以上、进一步优选约95％以上、特别优选约98％以上的同源性或同一性的氨基酸序列且具有同样的耐热性和/或酰胺化合物耐性的腈水合酶也包括在本发明的改良型腈水合酶中。
另外，具备在序列号4所示的氨基酸序列中在上述置换部位以外缺失、置换或附加有1～10个、优选1～5个、进一步优选1～2个的氨基酸而成的氨基酸序列且具有同样的耐热性和/或酰胺化合物耐性的腈水合酶也包括在本发明的改良型腈水合酶中。
将上述(e)～(h)的氨基酸置换表示为“Yα8G、Sα88V、Vα153I、Wα154L”等。标准的氨基酸由字母单字表示，氨基酸置换的方式可以如下来表示：在表示置换位置(至置换位置为止的氨基酸残基数)的数字的左侧示出置换前的氨基酸的单字符号，在右侧示出置换后的氨基酸的单字符号，从而表示。
具体而言，关于序列号4所示的α亚基的氨基酸序列，表示为“Yα8G”时，意味着在α亚基的氨基酸序列(序列号4)中从N末端的氨基酸残基数(包括该N末端的氨基酸残基地计数)第8位的酪氨酸(Y)被置换为甘氨酸(G)而成的改良型腈水合酶中的氨基酸置换的方式。
本发明的更优选的改良型腈水合酶中的氨基酸置换的方式分别可以由以下的1～8的符号来表示。
1.Yα8G
2.Yα8V
3.Sα88V
4.Sα88T
5.Vα153I
6.Vα153L
7.Vα153M
8.Vα153T
9.Wα154L
作为用于产生上述氨基酸置换的碱基置换，可优选地列举出以下的方式。
[表1]
本发明的改良型腈水合酶的活性相对于保持源自天然的特性不变的野生型腈水合酶的活性提高了高温下的酰胺化合物耐性。
此处，“腈水合酶活性”是指，催化将腈化合物转化为对应的酰胺化合物的水合反应(RCN+H2O→RCONH2)的酶活性。关于活性测定，可以通过使作为底物的腈化合物与腈水合酶接触，转换为对应的酰胺化合物之后，将该酰胺化合物定量而算出。作为底物，只要腈水合酶发生反应，则不论怎样的腈化合物都可以使用，优选丙烯腈。
关于反应条件，底物浓度为2.5％、反应温度为10℃～30℃、反应时间为10分钟～30分钟的范围。酶反应通过添加磷酸而停止。之后，可以通过HPLC(高效液相色谱)、气相色谱分析生成的丙烯酰胺而进行酰胺化合物的定量。
“高温下的酰胺化合物耐性”是指，在高温下、酰胺化合物存在下能够维持腈水合酶活性。“高温”具体是指40℃～60℃、更优选为45℃～55℃。
“高温下的酰胺化合物耐性”可以通过对于具有改良型腈水合酶的转化体的培养物或从该转化体中分离的改良型腈水合酶在高温下、丙烯酰胺等酰胺化合物(例如，30～50％的高浓度)的存在下分析作为底物的丙烯腈等腈化合物的消耗量或消耗速度来进行评价。例如在40℃～60℃的范围内使改良型腈水合酶与酰胺化合物接触，可以将消耗量或消耗速度相对于比较例(未实施变异的腈水合酶)为1.1倍以上、优选为1.15倍以上、更优选为1.2倍以上的腈水合酶评价为具有高温下的酰胺化合物耐性。
作为“酰胺化合物”，例如可列举出下述通式(1)所示的酰胺化合物。
R-CONH2(1)
(此处，R为任选被取代的碳原子数1～10的直链状或者支链状的烷基或烯基、任选被取代的碳原子数3～18的环烷基或芳基、或者任选被取代的饱和或不饱和杂环基。)
特别优选式中R为“CH2＝CH-”的丙烯酰胺。
本发明的改良型腈水合酶通过对已知的腈水合酶进行氨基酸置换而得到，例如通过选择向来源于玫瑰色红球菌J1株的腈水合酶的氨基酸序列(序列号4)中导入上述变异并提高了高温下的酰胺化合物耐性的腈水合酶而得到。
对于J1菌以外的腈水合酶而言，也能够通过在对应的改变位置导入同样的变异而提高高温下的酰胺化合物耐性。例如，作为腈水合酶产生菌，可列举出玫瑰色红球菌M8(序列号5)、赤红球菌TH(序列号6)、玫瑰色红球菌M33(VKM Ac-1515D)、嗜吡啶红球菌MW3(序列号7)、嗜吡啶红球菌S85-2(序列号8)、诺卡氏菌sp.JBRs(序列号10)、诺卡氏菌·YS-2002(序列号11)等。需要说明的是，玫瑰色红球菌M33(VKM Ac-1515D)是作为由上述M8菌通过自然突变而在结构上表达腈水合酶的菌株来选拔的菌株，其氨基酸序列和基因序列中无变异(美国专利第5827699号)。
本发明的改良型腈水合酶例如可以如下取得：在编码已知的腈水合酶的基因中通过周知的方法随机或定点地导入变异，选择具有期望的功能、即高温下的酰胺化合物耐性的酶，从而取得。
作为变异的导入方法，可列举出Error prone PCR那样的随机变异导入法和Kunkel法、Gapped duplex法那样的Site-directed Mutagenesis(定点变异导入法)。
[Error prone PCR]
作为使用变异体研究蛋白质的功能、性质的方法之一，有随机变异导入法。随机变异导入法是指对于编码特定的蛋白质的基因，导入随机的变异，制作变异体的方法。利用PCR进行的随机变异导入法中，可以在DNA扩增时设定严格度(Stringency)低的条件而导入碱基的变异(Error prone PCR；易错聚合酶链反应)。
在易错聚合酶链反应中，对于被扩增的DNA的全部区域，在任意的部位导入变异。这样，通过对于得到的在任意的部位导入有变异的变异体的功能进行研究，能够得到对蛋白质固有的功能重要的氨基酸、结构域的信息。作为易错聚合酶链反应的模板的腈水合酶可以使用来源于野生株的腈水合酶基因、作为由易错聚合酶链反应得到的扩增产物的DNA。
作为易错聚合酶链反应的反应条件，例如可列举出将反应液中的dNTP(dGTP、dCTP、dATP或dTTP)的任1种、2种或3种的配混比例设为与其它dNTP相比减少了的组成的条件。由此，DNA合成时，在需要配混比例已经减少的dNTP的位置，错误地使用其它dNTP的可能性变高，从而导入变异。另外，作为其它反应条件，也优选列举出设为增加了反应液中的MgCl2和/或MnCl2量的组成的条件。
[Site-directed Mutagenesis(定点诱变)]
在特定部位导入变异的方法中，通常有：使包含靶基因的DNA链离解成单链，使包含目标变异的寡核苷酸链退火，用DNA聚合酶扩链，制成两条链，将其组入大肠杆菌并复制，选择包含目标变异的克隆体(参照Molecular Cloning，A Laboratory Manual 2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons(1987-1997)等)。除了Kunkel法之外，已知Gapped duplex法等各种方法，可以使用市售的突变导入用试剂盒、例如QuickChangeTM XL Site-DirectedMutagenesis Kit(Stratagene公司制造)、GeneTailorTM Site-Directed MutagenesisSystem(Invitrogen公司制造)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：TAKARA BIO INC.制造)等来简便地实施。
本发明的改良型腈水合酶除了如上所述向已知的腈水合酶基因中导入变异的方法之外还可以通过自环境DNA的宏基因组筛选来取得。
1.3编码改良型腈水合酶的DNA
本发明也提供编码本发明的改良型腈水合酶的DNA。
本发明的“编码改良型腈水合酶的DNA”中也包括与具有跟上述编码改良型腈水合酶的DNA互补的碱基序列的DNA在严苛的条件下杂交，并且编码具有高温下的酰胺化合物耐性的、具有腈水合酶活性的蛋白质的DNA。
“严苛的条件”意味着作为杂交后洗涤时的条件且为盐浓度300～2000mM、温度40～75℃；优选为盐浓度600～900mM、温度65℃的条件。例如可列举出2×SSC下50℃等的条件。本领域技术人员可以在这样的缓冲液的盐浓度、温度等条件的基础上，考虑其它的如探针浓度、探针的长度、反应时间等各种条件，来适宜地设定用于得到编码本发明的腈水合酶的DNA的条件。
对于杂交法的详细的步骤，可以参照Molecular Cloning，A Laboratory Manual2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))等。作为杂交的DNA，可列举出包含与本发明的基因DNA具有至少40％以上、优选60％、进一步优选90％以上的序列同一性的碱基序列的DNA或其部分片段。
1.4重组载体、转化体
编码改良型腈水合酶的DNA需要按照在被转化的宿主生物中能够表达的方式重组入载体中。作为使用的载体，可列举出质粒DNA、噬菌体DNA、反转录转座子DNA、人工染色体DNA等。
除了腈水合酶基因之外，载体中还可以连接有启动子、终止子、增强子、剪接信号(Splicing signal)、poly-A附加信号(poly-A additional signal)、选择标记、核糖体结合序列(SD序列)等。作为选择标记，例如可列举出卡那霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因、氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因等。
本发明的转化体能使用的宿主只要能够在导入上述重组载体后表达目标腈水合酶，就没有特别特别限定，例如可以使用大肠杆菌和枯草菌等细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等。
将大肠杆菌作为宿主时，优选使用表达效率高的表达载体、例如具有trc启动子的表达载体pkk233-2(Amersham Biosciences公司制造)或pTrc99A(Amersham Biosciences公司制造)等。
将细菌作为宿主时，例如可列举出大肠杆菌(Escherichia coli)，作为红球菌，例如可列举出玫瑰色红球菌ATCC12674、玫瑰色红球菌ATCC17895、玫瑰色红球菌ATCC19140等。这些ATCC株能够从美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection.)购得。作为向细菌导入重组载体的方法，只要是向细菌中导入DNA的方法，就没有特别的限定。例如可列举出使用钙离子的方法、电穿孔法等。
将酵母作为宿主的情况下，例如可以使用：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、毕赤酵母(Pichia pastoris)等。作为向酵母导入重组载体的方法，只要是向酵母中导入DNA的方法，就没有特别的限定，例如可列举出电穿孔法、原生质体法、醋酸锂法等。
将动物细胞作为宿主的情况下，可以使用猴细胞COS-7、Vero、CHO细胞、小鼠L细胞、大鼠GH3、人FL细胞等。作为向动物细胞中导入重组载体的方法，例如可列举出电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法等。
将昆虫细胞作为宿主的情况下，可以使用Sf9细胞、Sf21细胞等。作为向昆虫细胞导入重组载体的方法，可以使用例如磷酸钙法、脂质体法、电穿孔法等。
将植物细胞作为宿主的情况下，可列举出烟草BY-2细胞等，对其没有限定。作为向植物细胞导入重组载体的方法，例如可以使用土壤杆菌法、基因枪法、PEG法、电穿孔法等。
宿主使用大肠杆菌的情况下，表达的大部分腈水合酶成为包涵体而不溶化，因此得到的是菌体活性低的转化体。另一方面，将红球菌作为宿主使用的情况下，腈水合酶存在于可溶性级分中，因此能够得到高活性的转化体。宿主根据目的进行选择即可，在严苛的条件下选拔改良型酶时优选使用高活性的红球菌的转化体。
1.5改良型腈水合酶的制造方法
改良型腈水合酶可以通过培养上述转化体并从所得到的培养物提取具有腈水合酶活性的蛋白质而制造。本发明也提供这种改良型腈水合酶的制造方法。
本发明中，“培养物”中包括培养上清、培养细胞、培养菌体、或者细胞或菌体的破碎物中的任意者。
转化体的培养按照宿主培养中常用的方法来进行。培养本发明的转化体的培养基只要是含有宿主菌所能够同化(assimilation)的碳源、氮源、无机盐类等，能够有效地进行转化体的培养的培养基，就可以使用天然培养基、合成培养基的任意者。作为碳源，可列举出葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、棉子糖和淀粉等碳水化合物、醋酸和丙酸等有机酸、乙醇和丙醇等醇类。作为氮源，可列举出氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵和磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、或者其他的含氮化合物。
此外，也可以使用蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、玉米浆、各种氨基酸等。作为无机物，可列举出磷酸二氢钾、磷酸氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、碳酸钙等。另外，也可以根据需要，为了防止培养中的发泡而添加消泡剂。进而，也可以向培养基中添加作为腈水合酶的辅基的钴离子、铁离子，成为酶的诱导剂的腈类、酰胺类。
培养中，为了防止载体和目标基因的脱落，也可以在施加了选择压力的状态下进行培养。即，选择标记为药剂抗性基因的情况下，可以向培养基中添加相应的药剂；或者选择标记为营养缺陷型互补基因的情况下，也可以将相应的营养因子从培养基中去除。
另外，选择标记为赋予同化性的基因的情况下，可以根据需要添加相应的同化因子作为唯一因子。例如，培养用包含氨苄青霉素抗性基因的载体进行了转化的大肠杆菌的情况下，培养中也可以根据需要添加氨苄青霉素。
培养用将诱导型的启动子用作启动子的重组载体进行转化而制成的转化体的情况下，也可以根据需要向培养基中添加诱导物。例如，培养用具有能够用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子的表达载体进行转化而制成的转化体时，可以向培养基中添加IPTG等。另外，培养将使用了能够用吲哚乙酸(IAA)诱导的trp启动子的表达载体进行转化而制成的转化体时，可以向培养基中添加IAA等。
对于转化体的培养条件，只要在不妨碍目标改良型腈水合酶的生产率和宿主的生育的条件下，就没有特别的限定，通常在10℃～40℃、优选20℃～37℃下进行5～100小时。pH的调节使用无机或有机酸、碱溶液等进行，例如为红球菌时调节为6～9。
作为培养方法，可列举出固体培养、静置培养、振荡培养、通气搅拌培养等；特别是培养红球菌的转化体的情况下，优选通过振荡培养或通气搅拌培养(小型发酵罐)在需氧条件下进行培养。
如果在上述培养条件下进行培养，则能够以高收率将本发明的改良型腈水合酶累积于上述培养物中，即培养上清、培养细胞、培养菌体或者细胞或菌体的破碎物的至少一者中。
培养后，在菌体内或细胞内生产改良型腈水合酶的情况下，通过将菌体或细胞进行破碎，能够提取目标的改良型腈水合酶。作为菌体或细胞的破碎方法，可以利用通过弗氏压碎器或均化器的高压处理、超声波处理、通过玻璃珠等的磨碎处理、使用溶菌酶、纤维素酶或果胶酶等的酶处理、冻融处理、低渗液处理、通过噬菌体的溶菌诱导处理等。
破碎后，可以根据需要去除菌体或细胞的破碎残渣(包含细胞提取液不溶性级分)。作为将残渣去除的方法，例如可以列举出离心分离、过滤等，也可以根据需要使用絮凝剂、过滤助剂等提高残渣除去效率。去除残渣后得到的上清为细胞提取液可溶性级分，可以作为经粗纯化的改良型腈水合酶溶液。
另外，在菌体内或细胞内生产改良型腈水合酶的情况下，也可以将菌体、细胞自身用离心分离、膜分离等进行回收，以未破碎的状态使用。
在菌体外或细胞外生产改良型腈水合酶的情况下，将培养液直接使用、或者通过离心分离、过滤等将菌体或细胞去除。之后，也可以根据需要通过利用硫酸铵沉淀的提取等，从前述培养物中提取出改良型腈水合酶，进而，根据需要使用透析、各种色谱(凝胶过滤、离子交换色谱、亲和色谱等)进行分离纯化。
培养转化体而得到的腈水合酶的产率可以以例如单位培养液、单位菌体湿重量或干燥重量、单位粗酶液蛋白质等单位，通过SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)或腈水合酶活性测定等进行确认，没有特别的限定。SDS-PAGE可以使用本领域技术人员公知的方法进行。另外，腈水合酶活性可以适用上述的活性值。
除了上述方法之外，也可以采用无细胞蛋白质合成体系来产生改良型腈水合酶。无细胞蛋白质合成体系是指使用细胞提取液在试管等人工容器内合成蛋白质的体系。需要说明的是，本发明中使用的无细胞蛋白质合成体系中也包含将DNA作为模板合成RNA的无细胞转录体系。
此时，对应于上述的宿主的生物与下述的细胞提取液的来源生物相对应。此处，上述细胞提取液可以使用来源于真核细胞的提取液或来源于原核细胞的提取液，例如小麦胚芽、大肠杆菌等的提取液。需要说明的是，这些细胞提取液既可以被浓缩，也可以不被浓缩。
细胞提取液可以通过例如超滤、透析、聚乙二醇(PEG)沉淀等而得到。进而，本发明中，无细胞蛋白质合成也可以使用市售的试剂盒而进行。作为这样的试剂盒，可列举出例如:试剂盒PROTEIOSTM(TOYOBO CO.,LTD.)、TNTTM System(Promega KK.)、合成装置的PG-MateTM(TOYOBO CO.,LTD.)、RTS(Roche Diagnostics K.K.)等。
如上所述，通过无细胞蛋白质合成得到的改良型腈水合酶可以如前所述选择适宜色谱而进行纯化。
2.酰胺化合物的制造方法
本发明的改良型腈水合酶可以作为酶催化剂用于物质生产。例如，通过使腈化合物接触上述改良型腈水合酶，采集所生成的酰胺化合物，从而能够制造酰胺化合物。
作为酶催化剂，除了经分离纯化的腈水合酶之外，也可以利用培养本发明的转化体后的培养物或该培养物的处理物。作为处理物，例如可列举出：将培养后的细胞(转化体)用丙烯酰胺等凝胶包埋而成的处理物；用戊二醛进行处理而成的处理物；负载于氧化铝、二氧化硅、沸石和硅藻土等无机载体而成的处理物等。
此处，“接触”是指使改良型腈水合酶和腈化合物存在于相同的反应体系或培养体系中，例如包括：将经分离纯化的改良型腈水合酶与腈化合物进行混合；向表达改良型腈水合酶基因的细胞(转化体)的培养容器中添加腈化合物；在腈化合物的存在下培养该细胞；将该细胞的提取液与腈化合物混合等。
作为底物而使用的腈化合物，考虑酶的底物特异性、酶相对于底物的稳定性等而进行选择。作为腈化合物优选丙烯腈。反应方法、和反应结束后的酰胺化合物的提取方法根据底物和酶催化剂的特性而进行适宜选择。
酶催化剂只要其活性不失活，就优选循环使用。鉴于防止失活、容易地进行循环的观点，酶催化剂优选以处理物的形式而使用。
实施例
以下，列举实施例进一步具体说明本发明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。此处记载的“％”表示质量％。
[实施例1]改良型腈水合酶表达用质粒的制作
通过以下的方法制作成为用于导入本发明的氨基酸置换的模板的质粒。
具有J1菌的腈水合酶基因的质粒使用pSJ034(图1)。pSJ034为在红球菌中表达腈水合酶的质粒。pJD034由pSJ023使用日本特开平10-337185号公报所示的方法制作。即，将质粒pSJ023通过XbaI的部分切断和Sse8387I连接子连接(linker ligation)，制成1个XbaI位点被置换为Sse8387I的质粒pSJ033。接着，将pSJ033在Sse8387I进行部分切断，使用克列诺片段进行末端平滑化，通过自身连接而制作质粒pSJ034。
需要说明的是，玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J-1株以FERM BP-1478于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(现在的NITE专利生物保藏中心：千叶县木更津市上总镰足2-5-8 120号室))进行了保藏。(原保藏日：1987年9月18日)。
另外，pSJ023为转化体“R.rhodochrous ATCC12674/pSJ023”，以保藏号FERM BP-6232于平成9(1997)年3月4日于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(现在的NITE专利生物保藏中心：千叶县木更津市上总镰足2-5-8 120号室))进行了国际保藏。
[实施例2]改良型腈水合酶的制作
使用由实施例1制作的质粒pSJ034，进行氨基酸置换。PCR使用下述反应液组成、反应条件、引物来进行。
＜PCR反应液组成＞
＜PCR反应条件＞
(98℃10秒、55℃5秒、72℃下90秒)×30个循环
[表2]
<引物>
PCR结束后，将反应液5μl供于0.7％琼脂糖凝胶电泳，确认11kb的扩增片段，将1μl的Dpn I(试剂盒附带)添加至PCR反应液中并在37℃下反应1小时，进行模板质粒的去除。将反应结束液用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega KK.)进行纯化，使用经纯化的PCR反应物对JM109进行转化。由所得到的培养物，使用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN公司)提取质粒DNA，使用自动测序仪CEQ8000(Beckman Coulter,Inc.)，确认腈水合酶的碱基序列。将得到的质粒如表3那样进行命名。
[表3]
[实施例3]红球菌转化体的制作
将玫瑰色红球菌ATCC12674株的对数增殖期的细胞通过离心分离器进行集菌，在经冰冷的无菌水中洗涤3次，悬浮于无菌水中。将实施例2中制备的质粒1μl和菌体悬浮液10μl混合并进行冰冷。向比色皿中加入DNA和菌体的悬浮液，通过基因导入装置Gene Pulser(BIORAD)在2.0kV、200OHMS下进行电脉冲处理。将电脉冲处理液在冰冷下静置10分钟，37℃下进行10分钟热休克，加入MYK培养基(0.5％聚蛋白胨、0.3％Bacto酵母提取物、0.3％Bacto麦芽浸膏、0.2％K2HPO4、0.2％KH2PO4)500μl，在30℃静置5小时。之后，涂布至含50μg/ml卡那霉素的MYK琼脂培养基，30℃下培养3天。将30℃下培养3天后的菌落作为转化体。
将上述的工序中得到的各转化体分别接种于MYK培养基(50μg/ml卡那霉素)中，在30℃下进行2天振荡培养，在GGPK培养基(1.5％葡萄糖、1％谷氨酸钠、0.1％酵母提取物、0.05％K2HPO4、0.05％KH2PO4、0.05％Mg2O4·7H2O、1％CoCl2、0.1％尿素、50μg/ml卡那霉素、pH7.2)中进行1％接种。30℃下进行3天振荡培养，通过离心分离进行集菌。之后，用100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤菌体，制备菌体悬浮液。
[实施例4]高温下的酰胺化合物耐性的评价
通过以下的方法测定由实施例3得到的改良型腈水合酶的酰胺化合物耐性。
将菌体液0.2ml和50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)4.8ml进行混合，进一步，将包含5.0％(w/v)丙烯腈的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)5ml加入至混合液，10℃下边振荡边反应10分钟。接着，将菌体过滤，使用气相色谱对所生成的丙烯酰胺的量进行定量。
＜分析条件＞
分析仪器：气相色谱仪GC2014(岛津制作所制作)
检测器：FID(检测200℃)
柱：填充有Porapak PS(Nihon Waters K.K.制造的柱填充剂)的1m玻璃柱
柱温：190℃
由丙烯酰胺的量换算腈水合酶活性。此处，关于腈水合酶活性，将1分钟内生成1μmol的丙烯酰胺的酶量定义为1U。
接着，以下述反应液组成和反应条件进行实验。需要说明的是，反应中使用的各菌体悬浮液在事前根据所测定的酶活性以达到相同活性量的方式用100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)适当稀释。作为比较对照，使用作为比较株的ATCC12674/pSJ034。
<反应液组成>
<反应条件>
反应温度 45℃
反应时间 3小时
在反应开始前(0小时)、3小时后分别采集反应液1ml，使用0.45μm的过滤器进行过滤，将所得到的滤液供于气相色谱仪。将残留的丙烯腈的比例(％)的分析结果示于表4。
[表4]
质粒名称 丙烯腈的消耗量(％) 相对比率(％)
pSJ034(比较例) 0.8 100％
pSJH001 1.0 125％
pSJH002 1.4 163％
pSJH064 0.88 110％
pSJH004 1.8 225％
pSJH005 1.1 138％
pSJH022 2.3 288％
pSJH023 2.6 325％
pSJH024 1.3 163％
pSJH025 2.3 288％
pSJH026 1.7 213％
pSJH027 1.5 188％
pSJH028 1.6 200％
pSJH030 2.4 300％
pSJH032 2.6 325％
根据上述结果，与作为比较例的pSJ034相比，所有的改良型腈水合酶的丙烯腈的消耗率为110％以上。使用了腈水合酶的酰胺化合物的合成反应中，因暴露于高温/高浓度产物而导致的失活、由作为产物的酰胺化合物造成的反应抑制成为问题。本发明的改良型腈水合酶即使在高温下且高浓度的丙烯酰胺存在下也维持了腈水合酶活性，因此可以说提高了高温下的丙烯酰胺耐性。
[实施例5]改良型腈水合酶的制作
使用WO2012/164933所述的腈水合酶(pSJ306A)，通过与实施例2同样的方法进行氨基酸置换。将所制作的质粒示于表5。
[表5]
由表5所述的质粒通过与实施例3同样的方法获得玫瑰色红球菌ATCC12674转化体，在MYK培养基中培养。使用所得到的培养菌体，在以下的条件下实施高温下的酰胺化合物耐性的评价。
<反应液组成>
<反应条件>
反应温度 45℃
反应时间 5小时
[表6]
质粒名称 丙烯腈的消耗量(％) 丙烯腈的消耗率(％)
pSJ306A(比较例) 1.63 100％
pSJA006 2.16 133％
pSJA018 1.99 122％
pSJB018 1.79 110％
pSJC008 2.20 135％
pSJC010 2.41 148％
pSJC011 2.26 139％
pSJC017 2.42 148％
pSJD010 2.31 142％
pSJG001 2.26 139％
pSJG002 2.63 161％
pSJG003 2.68 164％
pSJG004 2.57 158％
pSJG005 2.38 146％
根据上述结果，与作为比较例的pSJ306A相比，所有的改良型腈水合酶的丙烯腈的消耗率为110％以上。因此，本发明的改良型腈水合酶即使在高温下且高浓度的丙烯酰胺存在下也维持了腈水合酶活性，因此可以说提高了高温下的丙烯酰胺耐性。
[实施例6]改良型腈水合酶的制作(JBRs)通过以下的方法制作来源于诺卡氏菌sp.JBRs的腈水合酶基因(GenBank登录号AY141130)的表达质粒。
关于载体片段，进行以pSJ034作为模板的PCR，通过Wizard SV Gel and PCRClean-Up Syste(Promega KK.)来制备。
＜PCR反应液组成＞
＜PCR反应条件＞
(98℃10秒、55℃5秒、72℃下90秒)×30个循环
NH-F：GAAGTGATCG TATGAGTGAA GACACACTCA CTG(序列号51)
NH-R：GTGGATACCA TCCATTTCCT CATTCCTTTC ATC(序列号52)
对于上述制备的载体片段和人工合成的来源于诺卡氏菌sp.JBRs的腈水合酶基因(序列号44)，使用In-Fusion克隆试剂盒(TAKARA Bio)进行克隆，转化为大肠杆菌HST08(TAKARA Bio)。从所得到的菌落回收质粒，确认DNA序列，得到来源于诺卡氏菌sp.JBRs的腈水合酶表达质粒(pSJ-JBRs)。
进而，将pSJ-JBRs用于模板，通过与实施例2同样的方法实施氨基酸置换。将制作的质粒示于表7。
[表7]
由表7所述的质粒通过与实施例3同样的方法得到玫瑰色红球菌ATCC12674转化体，在MYK培养基中培养。使用所得到的培养菌体，以实施例4的条件实施高温下的酰胺化合物耐性的评价。将结果示于表8。
[表8]
根据上述结果，与作为比较例的pSJ-JBRs相比，所有的改良型腈水合酶的丙烯腈的消耗率为108％以上。因此，本发明的改良型腈水合酶即使在高温下且高浓度的丙烯酰胺存在下也维持了腈水合酶活性，因此可以说提高了高温下的丙烯酰胺耐性。
[实施例7]改良型腈水合酶的制作(S85-2)
使用人工合成的腈水合酶基因(序列号45)通过与实施例6同样的方法制作来源于嗜吡啶红球菌S85-2的腈水合酶基因(GenBank登录号AJ582605)的表达质粒。将所得到的质粒命名为pSJ-S85-2。
进而，将pSJ-S85-2用于模板，通过与实施例2同样的方法实施氨基酸置换。将制作的质粒示于表9。
[表9]
由表9所述的质粒通过与实施例3同样的方法得到玫瑰色红球菌ATCC12674转化体，在MYK培养基中培养。使用所得到的培养菌体，以实施例4的条件实施高温下的酰胺化合物耐性的评价。将结果示于表10。
[表10]
根据上述结果，与作为比较例的pSJ-S85-2相比，所有的改良型腈水合酶的丙烯腈的消耗率为130％以上。因此，本发明的改良型腈水合酶即使在高温下且高浓度的丙烯酰胺存在下也维持了腈水合酶活性，因此可以说提高了高温下的丙烯酰胺耐性。
[实施例8]改良型腈水合酶的制作(M8)
来源于玫瑰色红球菌M8的腈水合酶基因(GenBank登录号ATT79340、AAT79339)的表达质粒使用日本特开2011-200132号公报中记载的质粒pSJ-NO1A，通过与实施例2同样的方法实施氨基酸置换。将制作的质粒示于表11。
[表11]
由表11所述的质粒通过与实施例3同样的方法得到玫瑰色红球菌ATCC12674转化体，在MYK培养基中培养。使用所得到的培养菌体，以实施例4的条件实施高温下的酰胺化合物耐性的评价。将结果示于表12。
[表12]
根据上述结果，与作为比较例的pSJ-NO1A相比，所有的改良型腈水合酶的丙烯腈的消耗率为110％以上。因此，本发明的改良型腈水合酶即使在高温下且高浓度的丙烯酰胺存在下也维持了腈水合酶活性，因此可以说提高了高温下的丙烯酰胺耐性。
[实施例9]玫瑰色红球菌(三井菌)
来源于嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶基因(GenBank登录号DD028560、DD028561)的表达质粒使用日本特开2011-200132号公报中记载的质粒pSJ-NO2A，通过与实施例2同样的方法实施氨基酸置换。将制作的质粒示于表10。
[表13]
质粒名称 自野生株的氨基酸置换
pSJ-NO2A(比较例)
pSJH021 Wα160L(相当于序列号49的X22)
由表13所述的质粒通过与实施例3同样的方法得到玫瑰色红球菌ATCC12674转化体，在MYK培养基中培养。使用所得到的培养菌体，以实施例4的条件实施高温下的酰胺化合物耐性的评价。将结果示于表14。
[表14]
质粒名称 丙烯腈的消耗量(％) 丙烯腈的消耗率(％)
pSJ-NO2A(比较例) 0.50 100％
pSJH021 1.20 240％
根据上述结果，与作为比较例的pSJ-NO2A相比，所有的改良型腈水合酶的丙烯腈的消耗率为240％。因此，本发明的改良型腈水合酶即使在高温下且高浓度的丙烯酰胺存在下也维持了腈水合酶活性，因此可以说提高了高温下的丙烯酰胺耐性。
产业上的可利用性
本发明的改良型腈水合酶提高了高温下的丙烯酰胺耐性，因此能够效率良好地制造与腈化合物对应的酰胺化合物，在酰胺化合物的工业生产中是有用的。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请直接作为参考并入到本说明书中。
保藏号
玫瑰色红球菌J1株：FERM BP-1478
玫瑰色红球菌ATCC12674/pSJ023：FERM BP-6232
序列号20：α8G-F引物
序列号21：α8G-R引物
序列号22：α8V-F引物
序列号23：α8V-R引物
序列号24：α88V-F引物
序列号25：α88V-R引物
序列号26：α153I-F引物
序列号27：α153I-R引物
序列号28：α153L-F引物
序列号29：α153L-R引物
序列号30：α153M-F引物
序列号31：α153M-R引物序列号32：α153T-F引物序列号33：α153T-R引物序列号34：α154L-F引物序列号35：α154L-R引物序列号36：α153I·α154L-F引物序列号37：α153I·α154L-R引物序列号38：α153L·α154L-F引物序列号39：α153L·α154L-R引物序列号40：α153M·α154L-F引物序列号41：α153M·α154L-R引物序列号42：α153T·α154L-F引物序列号43：α153T·α154L-R引物序列号46：本发明的特定的氨基酸序列号47：本发明的特定的氨基酸序列号48：本发明的特定的氨基酸序列号49：本发明的特定的氨基酸序列号50：本发明的α亚基的氨基酸序列号51：NH-F引物序列号52：NH-R引物序列号53：α88T-F引物序列号54：α88T-R引物。

Claims (11)

1.一种改良型腈水合酶，其特征在于，相比于野生型提高了高温下的酰胺化合物耐性，
α亚基的第154位的色氨酸置换成为亮氨酸，
所述腈水合酶来源于红球菌属细菌或诺卡氏菌属细菌，
野生型包含α亚基和β亚基，
所述α亚基包含序列号4所示的氨基酸序列、或者与序列号4所示的氨基酸序列具有98％以上同一性的氨基酸序列，
所述β亚基包含序列号2所示的氨基酸序列、或者与序列号2所示的氨基酸序列具有95％以上同一性的氨基酸序列，
所述α亚基具有下述共通序列：
(a)YTEYEARTKAIE(第8位～第19位)
(b)SAVFNDSQTHHVVVCTLC(第88位～第105位)
(c)VWDSSSEIRYIV(第153位～第164位)
β亚基中不具有置换。
2.根据权利要求1所述的改良型腈水合酶，其中，α亚基在上述置换的基础上具有选自下述(i)～(iii)的1个以上的置换：
(i)第8位的酪氨酸向甘氨酸或者缬氨酸的置换
(ii)第88位的丝氨酸向缬氨酸或苏氨酸的置换
(iii)第153位的缬氨酸向异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、或者苏氨酸的置换。
3.根据权利要求1所述的改良型腈水合酶，其中，腈水合酶来源于玫瑰色红球菌J1、玫瑰色红球菌M8、嗜吡啶红球菌S85-2、或诺卡氏菌sp.JBRs。
4.根据权利要求1所述的改良型腈水合酶，其中，野生型的α亚基如序列号4～11、和14中的任一项所示。
5.根据权利要求1所述的改良型腈水合酶，其中，野生型的α亚基如序列号4、序列号5、序列号8或序列号10所示。
6.根据权利要求1所述的改良型腈水合酶，其进一步具有Gα174L、Pβ17G、Sβ57M、Tβ107K、Kβ114Y、Nβ167S、Cβ218H和Vβ219A的置换，所述改良型腈水合酶来源于玫瑰色红球菌J1，相比于野生型提高了高温下的酰胺化合物耐性。
7.一种DNA，其为编码权利要求1～6中任一项所述的改良型腈水合酶的DNA；或者为，与具有跟所述DNA互补的碱基序列的DNA在严苛的条件下杂交，并且编码具有高温下的酰胺化合物耐性的、具有腈水合酶活性的蛋白质的DNA。
8.一种重组载体，其包含权利要求7所述的DNA。
9.一种转化体，其包含权利要求8所述的重组载体。
10.一种腈水合酶的制造方法，所述制造方法培养权利要求9所述的转化体，从所得到的培养物中提取腈水合酶。
11.一种酰胺化合物的制造方法，其特征在于，使权利要求1～6中任一项所述的改良型腈水合酶或者培养权利要求9所述的转化体而得到的培养物或该培养物的处理物与腈化合物接触。
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