RU2016152249A - Улучшенная нитрилгидратаза - Google Patents

Claims (43)

1. Улучшенная нитрилгидратаза, имеющая по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную следующими SEQ ID NO: 46 - 49 в α-субъединице;

(а) SEQ ID NO: 46: X₁X₂X₃YX₅X₆RX₇KAX₈E

(при условии, что R обозначает аргинин, K обозначает лизин, А обозначает аланин, Е обозначает глутаминовую кислоту, Х₁ обозначает аминокислоту, отличную от тирозина, и каждый из Х₂-Х₈ независимо обозначает любой аминокислотный остаток);

(b) SEQ ID NO: 47: X₉X₁₀X₁₁X₁₂NX₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇HX₁₉X₂₀X₂₁CX₂₂LC

(при условии, что N обозначает аспарагин, V обозначает валин, C обозначает цистеин, Т обозначает треонин, L обозначает лейцин, Х₉ обозначает аминокислоту, отличную от серина, и каждый из Х₁₀-Х₂₂ независимо обозначает любой аминокислотный остаток);

(с) SEQ ID NO: 48: X₂₃WDSX₂₅SEX₂₇RX₂₈X₂₉V

(при условии, что W обозначает триптофан, D обозначает аспарагиновую кислоту, S обозначает серин, Е обозначает глутаминовую кислоту, R обозначает аргинин, V обозначает валин, X₂₃ обозначает аминокислоту, отличную от валина, и каждый из Х₂₅-Х₂₉ независимо обозначает любой аминокислотный остаток);

(d) SEQ ID NO: 49: VX₂₄DSX₂₅SEX₂₇RX₂₈X₂₉V

(при условии, что V обозначает валин, D обозначает аспарагиновую кислоту, S обозначает серин, Е обозначает глутаминовую кислоту, R обозначает аргинин, Х₂₄ обозначает аминокислоту, отличную от триптофана, и каждый из Х₂₅-Х₂₉ независимо обозначает любой аминокислотный остаток).

2. Улучшенная нитрилгидратаза по п.1, имеющая по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную следующими SEQ ID NO: 46 - 49 в α-субъединице;

(а) SEQ ID NO: 46: X₁X₂X₃YX₅X₆RX₇KAX₈E

(при условии, что R обозначает аргинин, K обозначает лизин A обозначает аланин, Е обозначает глутаминовую кислоту, Х₁ обозначает аминокислоту, отличную от тирозина, и каждый из Х₂-Х₈ независимо обозначает любой аминокислотный остаток);

(b) SEQ ID NO: 47: X₉X₁₀X₁₁X₁₂NX₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇HX₁₉X₂₀X₂₁CX₂₂LC

(при условии, что N обозначает аспарагин, V обозначает валин, C обозначает цистеин, Т обозначает треонин, L обозначает лейцин, Х₉ обозначает аминокислоту, отличную от серина, каждый из X₁₀ до X₂₀ независимо обозначает любой аминокислотный остаток, Х₂₁ обозначает валин и X₂₂ обозначает треонин);

(с) SEQ ID NO: 48: X₂₃WDSX₂₅SEX₂₇RX₂₈X₂₉V

(при условии, что W обозначает триптофан, D обозначает аспарагиновую кислоту, S обозначает серин, Е обозначает глутаминовую кислоту, R обозначает аргинин, V обозначает валин, X₂₃ обозначает аминокислоту, отличную от валина, и каждый из Х₂₅-Х₂₉ независимо обозначает любой аминокислотный остаток);

(d) SEQ ID NO: 49: VX₂₄DSX₂₅SEX₂₇RX₂₈X₂₉V

(при условии, что V обозначает валин, D обозначает аспарагиновую кислоты, S обозначает серин, Е обозначает глутаминовую кислоту, R обозначает аргинин, Х₂₄ обозначает аминокислоту, отличную от триптофана, и каждый из Х₂₅-Х₂₉ независимо обозначает любой аминокислотный остаток).

3. Улучшенная нитрилгидратаза по п.1, имеющая по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, представленную следующими SEQ ID NO: 46-49 в α-субъединице;

(а) SEQ ID NO: 46: X₁X₂X₃YX₅X₆RX₇KAX₈E

(при условии, что R обозначает аргинин, K обозначает лизин, А обозначает аланин, Е обозначает глутаминовую кислоту, Х₁ обозначает глицин или валин и каждый из Х₂-Х₈ независимо обозначает любой аминокислотный остаток);

(b) SEQ ID NO: 47: X₉X₁₀X₁₁X₁₂NX₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇HX₁₉X₂₀X₂₁CX₂₂LC

(при условии, что N обозначает аспарагин, V обозначает валин, C обозначает цистеин, Т обозначает треонин, L обозначает лейцин, Х₉ обозначает валин или треонин, и каждый из Х₁₀-Х₂₀ независимо обозначает любой аминокислотный остаток, Х₂₁ обозначает валин и X₂₂ обозначает треонин);

(с) SEQ ID NO: 48: X₂₃WDSX₂₅SEX₂₇RX₂₈X₂₉V

(при условии, что W означает триптофан, D обозначает аспарагиновую кислоту, S обозначает серин, Е обозначает глутаминовую кислоту, R обозначает аргинин, V обозначает валин, X₂₃ выбран из группы, состоящей из изолейцина, лейцина, метионина и треонина, и каждый из Х₂₅-Х₂₉ независимо обозначает любой аминокислотный остаток);

(d) SEQ ID NO: 49: VX₂₄DSX₂₅SEX₂₇RX₂₈X₂₉V

(при условии, что V обозначает валин, D обозначает аспарагиновую кислоту, S обозначает серин, Е обозначает глутаминовую кислоту, R обозначает аргинин, Х₂₄ обозначает лейцин и каждый из Х₂₅-Х₂₉ независимо обозначает любой аминокислотный остаток).

4. Улучшенная нитрилгидратаза по любому из пп.1-3, где в вышеприведенной SEQ ID NO:46 Х₂ обозначает Т (треонин), Х3 обозначает Е (глутаминовая кислота), Х₄ обозначает Y (тирозин), Х₅ обозначает Е (глутаминовая кислота), Х₆ обозначает A (аланин), Х₇ обозначает Т (треонин) и Х₈ обозначает I (изолейцин),

в вышеприведенной SEQ ID NO:47 Х₁₀ обозначает А (аланин), Х₁₁ обозначает V (валин), Х₁₂ обозначает F (фенилаланин), Х₁₃ обозначает D (аспарагиновая кислота), Х₁₄ обозначает S (серин), Х₁₅ обозначает Q (глутамин), Х₁₆ обозначает Т (треонин), Х₁₇ обозначает Н (гистидин), Х18 обозначает Н (гистидин), Х19 обозначает V (валин) и Х20 обозначает V (валин), и

в вышеприведенных SEQ ID NO: 48 и 49 Х₂₅ обозначает S (серин), X26 обозначает S (серин), Х₂₇ обозначает I (изолейцин), Х₂₈ обозначает Y (тирозин) и Х₂₉ обозначает I (изолейцин).

5. Улучшенная нитрилгидратаза по любому из пп.1-4, где улучшенная нитрилгидратаза имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 50.

6. Улучшенная нитрилгидратаза, имеющая аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 50 в α-субъединице, в которой по меньшей мере одна аминокислотная мутация, выбранная из следующих с (I) по (IV), включает:

(I) Х₁ обозначает G (глицин) или V (валин),

(II) в Х₉ обозначает V (валин) или T (треонин),

(III) X₂₃ является аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из I (изолейцин), L (лейцин), М (метионин) и T (треонин), и

(IV) Х₂₄ обозначает L (лейцин).

7. Улучшенная нитрилгидратаза по п.6, где Х₂ обозначает Т (треонин), Х₃ обозначает Е (глутаминовая кислота), Х₄-обозначает Y (тирозин), Х₅ обозначает Е (глутаминовая кислота), Х₆ обозначает (аланин), Х₇ обозначает Т (треонин), Х₈ обозначает I (изолейцин), Х₁₀ обозначает (аланин), Х₁₁ обозначает V (валин), Х₁₂ обозначает F (фенилаланин), Х₁₃ обозначает D (аспарагиновая кислота), Х₁₄ обозначает S (серин), Х₁₅ обозначает Q (глутамин), X₁₆ обозначает Т (треонин), Х₁₇ обозначает H (гистидин), Х₁₈ обозначает H (гистидин), Х₁₉ обозначает V (валин), Х₂₀ обозначает V (валин), Х₂₅ обозначает S (серин), X₂₆ обозначает S (серин), Х₂₇ обозначает I (изолейцин), Х₂₈ обозначает Y (тирозин) и Х₂₉ обозначает I (изолейцин).

8. Улучшенная нитрилгидратаза по любому из пп.1-7, где нитрилгидратаза получена из бактерии Rhodococcus или бактерии Nocardia.

9. ДНК, кодирующая улучшенную нитрилгидратазу, описанную в любом из пп.1-8, или ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с ДНК, имеющей последовательность оснований, комплементарную вышеупомянутой ДНК, и кодирует белок, обладающий нитрилгидратазной активностью с повышенной устойчивостью к амидным соединениям при высоких температурах.

10. Рекомбинантный вектор, содержащий ДНК по п.9.

11. Трансформант, содержащий рекомбинантный вектор по п.10.

12. Способ получения нитрилгидратазы, включающий культивирование трансформанта по п.11 и сбор нитрилгидратазы из полученной культуры.

13. Способ получения амидного соединения, включающий приведение нитрильного соединения в контакт с улучшенной нитрилгидратазой по любому из пп.1-8, или с культурой, полученной при культивировании трансформанта по п.11, или переработанным продуктом культуры.