KR101995103B1 - 개량형 니트릴 히드라타제 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 고온 하에서의 아미드 화합물 내성이 향상된 신규의 개량형 니트릴 히드라타제에 관한 것이다. 구체적으로는, 서열 번호 50으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 하기 (a) 내지 (d)로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 변이를 갖는 니트릴 히드라타제(X₁ 내지 X₂₇은 독립된 임의의 아미노산 잔기를 나타냄)에 관한 것이다. (a) X₁이 발린 또는 글리신 (b) X₉가 발린 또는 트레오닌 (c) X₂₃이 이소류신, 류신, 메티오닌 및 트레오닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 (d) X₂₄가 류신

Description

개량형 니트릴 히드라타제 {IMPROVED NITRILE HYDRATASE}

본 발명은 개량형(변이형) 니트릴 히드라타제 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 나아가, 당해 효소를 코딩하는 DNA, 당해 DNA를 포함하는 재조합 벡터, 및 당해 재조합 벡터를 갖는 형질 전환체, 그리고 아미드 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.

니트릴 히드라타제는 니트릴기를 수화하여 아미드기로 변환하는 니트릴 수화 활성을 갖는 효소이다. 당해 효소 또는 당해 효소를 함유하는 미생물 균체 등을 사용하여 니트릴 화합물로부터 대응하는 아미드 화합물을 제조하는 것이 행해지고 있는데, 이 방법은 종래의 화학 합성법과 비교하여, 니트릴 화합물로부터 대응하는 아미드 화합물로의 전화율 및 선택률이 높은 것으로 알려져 있다.

니트릴 히드라타제를 생산하는 미생물로서는, 예를 들어 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 로도코커스(Rhodococcus)속, 리조비움(Rhizobium)속, 클렙시엘라(Klebsiella)속, 슈도노카르디아(Pseudonocardia)속 등에 속하는 미생물을 들 수 있다. 그 중에서도 로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous) J1주는 아크릴아미드의 공업적 생산에 사용되고 있으며, 유용성이 실증되어 있다. 또한 그 균주가 산생하는 니트릴 히드라타제를 코딩하는 유전자도 밝혀져 있다(특허문헌 1 참조).

한편, 자연계에 존재하는 미생물로부터 단리한 니트릴 히드라타제나 그의 유전자를 이용하는 것뿐만 아니라, 니트릴 히드라타제에 대하여 활성, 기질 특이성, Vmax, Km, 열 안정성, 기질에 대한 안정성, 생성물에 대한 안정성 등을 변화시킬 목적으로 니트릴 히드라타제에 변이를 도입하는 것이 시도되고 있으며, 슈도노카르디아 서모필라 JCM3095의 니트릴 히드라타제에 있어서는, 입체 구조 정보로부터 기질 특이성이나 열 안정성에 관여하는 영역을 예측하여, 그들 중에서 기질 특이성이 변화된 변이 효소를 취득하고 있다(특허문헌 2 내지 4 참조). 또한 본 발명자들은 내열성 또는 아미드 화합물 내성을 모두 향상시킨 니트릴 히드라타제 유전자도 취득하고 있다(특허문헌 5 내지 9 참조).

그러나 추가적인 내열성 및 아미드 화합물 내성의 향상, 또는 고온에서의 반응이 가능한 니트릴 히드라타제를 개발하여 아미드 화합물의 제조에 사용하는 것은 촉매 비용 등의 생산 비용의 관점 등에서 매우 유용하며, 그와 같은 성능을 갖는 효소의 취득은 반응 시의 효소량의 삭감 및 비용 삭감 등의 관점에서 요망되고 있다.

일본 특허 제3162091호 공보 국제 공개 제2004/056990호 공보 일본 특허 공개 제2004-194588호 공보 일본 특허 공개 제2005-16403호 공보 국제 공개 제2005/116206호 공보 일본 특허 공개 제2007-143409호 공보 일본 특허 공개 제2007-43910호 공보 일본 특허 공개 제2008-253182호 공보 일본 특허 공개 제2010-172295호 공보

본 발명의 목적은, 고온 하에서의 아미드 화합물 내성이 향상된 신규의 개량형 니트릴 히드라타제를 제공하여, 보다 제조 효율이 높은 아미드 화합물의 제조 방법을 가능하게 하는 데 있다.

본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 연구를 행하여, 니트릴 히드라타제의 아미노산 서열 중, 특정한 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환한 단백질이 니트릴 히드라타제 활성을 가짐과 함께, 고온 하에서의 아미드 화합물 내성이 향상된 것임을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하의 [1] 내지 [13]을 제공한다.

[1] α 서브유닛에 있어서, 하기 서열 번호 46 내지 49로 표시되는 적어도 1개의 아미노산 서열을 포함하는, 개량형 니트릴 히드라타제;

(a) 서열 번호 46: X₁X₂X₃X₄X₅X₆RX₇KAX₈E

(단, R은 아르기닌, K는 리신, A는 알라닌, E는 글루탐산, X₁은 티로신 이외의 아미노산이고, X₂ 내지 X₈은 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기를 나타냄);

(b) 서열 번호 47: X₉X₁₀X₁₁X₁₂NX₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁CX₂₂LC

(단, N은 아스파라긴, V는 발린, C는 시스테인, T는 트레오닌, L은 류신, X₉는 세린 이외의 아미노산이고, X₁₀ 내지 X₂₂는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기를 나타냄);

(c) 서열 번호 48: X₂₃WDSX₂₅X₂₆EX₂₇RX₂₈X₂₉V

(단, W는 트립토판, D는 아스파라긴산, S는 세린, E는 글루탐산, R은 아르기닌, V는 발린, X₂₃은 발린 이외의 아미노산, X₂₅ 내지 X₂₉는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기를 나타냄);

(d) 서열 번호 49: VX₂₄DSX₂₅X₂₆EX₂₇RX₂₈X₂₉V

(단, V는 발린, D는 아스파라긴산, S는 세린, E는 글루탐산, R은 아르기닌, X₂₄는 트립토판 이외의 아미노산, X₂₅ 내지 X₂₉는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기를 나타냄)

[2] α 서브유닛에 있어서, 하기 서열 번호 46 내지 49로 표시되는 적어도 1개의 아미노산 서열을 포함하는, 상기 [1]에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제;

(a) 서열 번호 46: X₁X₂X₃X₄X₅X₆RX₇KAX₈E

(단, R은 아르기닌, K는 리신, A는 알라닌, E는 글루탐산, X₁은 티로신 이외의 아미노산이고, X₂ 내지 X₈은 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기를 나타냄);

(b) 서열 번호 47: X₉X₁₀X₁₁X₁₂NX₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁CX₂₂LC

(단, N은 아스파라긴, V는 발린, C는 시스테인, T는 트레오닌, L은 류신, X₉는 세린 이외의 아미노산이고, X₁₀ 내지 X₂₀은 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기, X₂₁은 발린, X₂₂는 트레오닌을 나타냄);

(c) 서열 번호 48: X₂₃WDSX₂₅X₂₆EX₂₇RX₂₈X₂₉V

(단, W는 트립토판, D는 아스파라긴산, S는 세린, E는 글루탐산, R은 아르기닌, V는 발린, X₂₃은 발린 이외의 아미노산, X₂₅ 내지 X₂₉는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기를 나타냄);

(d) 서열 번호 49: VX₂₄DSX₂₅X₂₆EX₂₇RX₂₈X₂₉V

(단, V는 발린, D는 아스파라긴산, S는 세린, E는 글루탐산, R은 아르기닌, X₂₄는 트립토판 이외의 아미노산, X₂₅ 내지 X₂₉는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기를 나타냄)

[3] α 서브유닛에 있어서, 하기 서열 번호 46 내지 49로 표시되는 적어도 1개의 아미노산 서열을 포함하는, 상기 [1]에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제;

(a) 서열 번호 46: X₁X₂X₃X₄X₅X₆RX₇KAX₈E

(단, R은 아르기닌, K는 리신, A는 알라닌, E는 글루탐산, X₁은 글리신 또는 발린이고, X₂ 내지 X₈은 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기를 나타냄);

(b) 서열 번호 47: X₉X₁₀X₁₁X₁₂NX₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁CX₂₂LC

(단, N은 아스파라긴, V는 발린, C는 시스테인, T는 트레오닌, L은 류신, X₉는 발린 또는 트레오닌이고, X₁₀ 내지 X₂₀은 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기, X₂₁은 발린, X₂₂는 트레오닌을 나타냄);

(c) 서열 번호 48: X₂₃WDSX₂₅X₂₆EX₂₇RX₂₈X₂₉V

(단, W는 트립토판, D는 아스파라긴산, S는 세린, E는 글루탐산, R은 아르기닌, V는 발린, X₂₃은 이소류신, 류신, 메티오닌 및 트레오닌으로 이루어지는 군에서 선택되고, X₂₅ 내지 X₂₉는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기를 나타냄);

(d) 서열 번호 49: VX₂₄DSX₂₅X₂₆EX₂₇RX₂₈X₂₉V

(단, V는 발린, D는 아스파라긴산, S는 세린, E는 글루탐산, R은 아르기닌, X₂₄는 류신, X₂₅ 내지 X₂₉는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기를 나타냄)

[4] 상기 서열 번호 46에 있어서, X₂가 T(트레오닌), X₃이 E(글루탐산), X₄가 Y(티로신), X₅가 E(글루탐산), X₆이 A(알라닌), X₇이 T(트레오닌), X₈이 I(이소류신)이고,

상기 서열 번호 47에 있어서, X₁₀이 A(알라닌), X₁₁이 V(발린), X₁₂가 F(페닐알라닌), X₁₃이 D(아스파라긴산), X₁₄가 S(세린), X₁₅가 Q(글루타민), X₁₆이 T(트레오닌), X₁₇이 H(히스티딘), X₁₈이 H(히스티딘), X₁₉가 V(발린), X₂₀이 V(발린)이고,

상기 서열 번호 48 및 49에 있어서, X₂₅가 S(세린), X₂₆이 S(세린), X₂₇이 I(이소류신), X₂₈이 Y(티로신), X₂₉가 I(이소류신)인, 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제;

또한 서열 번호 46으로 표시되는 아미노산 서열은 니트릴 히드라타제의 α 서브유닛의 아미노산 서열 8 내지 19위치, 서열 번호 47로 표시되는 아미노산 서열은 동 서열의 88 내지 105위치, 서열 번호 48 및 49로 표시되는 아미노산 서열은 동 서열의 153 내지 164위치에 해당한다.

[5] 서열 번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는, 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제.

[6] α 서브유닛에 있어서, 서열 번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 개량형 니트릴 히드라타제이며, 하기 (ⅰ) 내지 (ⅳ)로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 변이를 갖는, 상기 개량형 니트릴 히드라타제.

(ⅰ) X₁이 G(글리신) 또는 V(발린)

(ⅱ) X₉가 V(발린) 또는 T(트레오닌)

(ⅲ) X₂₃이 I(이소류신), L(류신), M(메티오닌) 및 T(트레오닌)로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산

(ⅳ) X₂₄가 L(류신)

[7] X₂가 T(트레오닌), X₃이 E(글루탐산), X₄가 Y(티로신), X₅가 E(글루탐산), X₆이 A(알라닌), X₇이 T(트레오닌), X₈이 I(이소류신), X₁₀이 A(알라닌), X₁₁이 V(발린), X₁₂가 F(페닐알라닌), X₁₃이 D(아스파라긴산), X₁₄가 S(세린), X₁₅가 Q(글루타민), X₁₆이 T(트레오닌), X₁₇이 H(히스티딘), X₁₈이 H(히스티딘), X₁₉가 V(발린), X₂₀이 V(발린), X₂₅가 S(세린), X₂₆이 S(세린), X₂₇이 I(이소류신), X₂₈이 Y(티로신), X₂₉가 I(이소류신)인, 상기 [6]에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제.

[8] 상기 니트릴 히드라타제가 로도코커스속 세균 또는 노카르디아속 세균 유래인, 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제;

[9] 상기 [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제를 코딩하는 DNA 또는 상기 DNA와 상보적인 염기 서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 또한 고온 하에서의 아미드 화합물 내성을 갖는 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA.

[10] 상기 [9]에 기재된 DNA를 포함하는 재조합 벡터;

[11] 상기 [10]에 기재된 재조합 벡터를 포함하는 형질 전환체;

[12] 상기 [11]에 기재된 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터 니트릴 히드라타제를 채취하는, 니트릴 히드라타제의 제조 방법; 및

[13] 상기 [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제 또는 [11]에 기재된 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물 혹은 당해 배양물의 처리물을 니트릴 화합물에 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 아미드 화합물의 제조 방법.

본 발명에 따르면, 고온 하에서의 아미드 화합물 내성이 향상된 신규의 개량형(변이형) 니트릴 히드라타제를 제공할 수 있다. 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제는 고온 하에서의 아미드 화합물 내성이 우수하여, 아미드 화합물의 제조 효율을 향상시킬 수 있다.

도 1은 플라스미드 pSJ034의 구축도이다.
도 2a는 각종 미생물 유래의 니트릴 히드라타제의 α 서브유닛의 아미노산 서열(N 말단측의 일부)을 나타내는 도면이다.
도 2b는 도 2a와 마찬가지의 아미노산 서열을 나타내는 도면이며, 도 2a의 아미노산 서열에서 이어지는 서열을 나타내고 있다.
도 3은 서열 번호 50으로 표시되는, 본 발명의 α 서브유닛의 아미노산 서열이다.
본 출원은 일본 특허 출원 제2014-118041호(2014년 6월 6일 출원)에 기초한 우선권을 주장하고 있으며, 이 내용은 본 명세서에 참조로서 도입된다.

1. 니트릴 히드라타제

1. 1 기지의 니트릴 히드라타제

「니트릴 히드라타제」는 α 서브유닛 및 β 서브유닛의 도메인이 집합하여 이루어지는 고차 구조를 취하며, 보결 분자로서 비(非)헴 철 원자, 또는 비(非)콜린 핵 코발트 원자를 갖고 있다. 이들 니트릴 히드라타제는 각각 철형 니트릴 히드라타제 및 코발트형 니트릴 히드라타제라는 호칭으로 구별되어 있다.

철형 니트릴 히드라타제로서는 로도코커스속 N-771주 유래의 것을 그의 대표예로서 들 수 있다. 이 철형 니트릴 히드라타제는, X선 결정 구조 해석이 이루어져 그의 입체 구조가 밝혀져 있다. 그 결과, 당해 효소는, 활성 중심을 형성하는 α 서브유닛의 시스테인 클러스터(Cys-Ser-Leu-Cys-Ser-Cys) 중의 4개의 아미노산 잔기를 통해 비헴 철과 결합해 있다.

코발트형 니트릴 히드라타제로서는, 로도코커스 로도크로스 J1주(이하 「J1균」이라 칭하는 경우가 있음) 유래의 것, 또는 슈도노카르디아 서모필라(Pseudonocardia thermophila) 유래의 것을 대표예로서 들 수 있다.

J1균 유래의 코발트형 니트릴 히드라타제는, 활성 중심을 형성하는 α 서브유닛의 시스테인 클러스터(Cys-Thr-Leu-Cys-Ser-Cys)로 표시되는 영역을 통해 코발트 원자와 결합해 있다. 또한 슈도노카르디아 서모필라 유래의 코발트형 니트릴 히드라타제의 시스테인 클러스터는, 상기 J1균 유래의 시스테인 클러스터에 있어서의 상류측(N 말단측)으로부터 제4번째의 시스테인(Cys)이 시스테인술핀산(Csi)이고, 가장 하류측(C 말단측)의 제6번째의 시스테인(Cys)이 시스테인술펜산(Cse)이다.

상술한 바와 같이, 보결 분자는, α 서브유닛 중의 시스테인 클러스터 「C(S/T)LCSC」로 표시되는 영역과 결합해 있다. 이러한 보결 분자 결합 영역을 포함하는 니트릴 히드라타제로서는, 예를 들어 로도코커스 로도크로스 J1(FERM BP-1478), 로도코커스 로도크로스 M8(구소련 특허 제1731814호(SU1731814)), 로도코커스 로도크로스 M33(VKM Ac-1515D), 로도코커스 로도크로스 ATCC39484(일본 특허 공개 제2001-292772호), 바실러스 스미티이(Bacillus smithii)(일본 특허 공개 평9-254188), 슈도노카르디아 서모필라(일본 특허 공개 평9-275978호) 또는 게오바실러스 서모글루코시다시어스(Geobacillus thermoglucosidasius) 유래의 아미노산 서열을 갖는 니트릴 히드라타제 및 유전자 서열로 코딩되는 니트릴 히드라타제를 들 수 있다. 한편, β 서브유닛은 구조의 안정성에 관여하고 있다고 생각되고 있다.

로도코커스 로도크로스 J1(FERM BP-1478) 유래의 니트릴 히드라타제의 GenBank 액세션 번호는 「P21220」이다. 또한 로도코커스 로도크로스 M8(SU1731814) 유래의 α 서브유닛의 GenBank 액세션 번호는 「ATT79340」이고, β 서브유닛의 GenBank 액세션 번호는 「AAT79339」이다. 로도코커스 피리디노보란스 MW3 유래의 니트릴 히드라타제 유전자의 GenBank 액세션 번호는 AJ582605, 로도코커스 피리디노보란스 S85-2 유래의 니트릴 히드라타제 유전자의 GenBank 액세션 번호는 AJ582605, 로도코커스 루버 TH(CGMCC No. 2380)의 니트릴 히드라타제 유전자는 중국 특허 제101463358호(CN1463358)에 기재되어 있다. 또한 노카르디아 YS-2002 유래의 니트릴 히드라타제 유전자는 GenBank 액세션 번호 「X86737」이고, 노카르디아 sp. JBRs 유래 니트릴 히드라타제 유전자는 GenBank 액세션 번호 「AY141130」이다.

서열표의 서열 번호 1 내지 19에 기지의 니트릴 히드라타제의 아미노산 서열 및 염기 서열을 기재한다.

서열 번호 1: 로도코커스 로도크로스 J1 유래의 β 서브유닛의 염기 서열

서열 번호 2: 로도코커스 로도크로스 J1 유래의 β 서브유닛의 아미노산 서열

서열 번호 3: 로도코커스 로도크로스 J1 유래의 α 서브유닛의 염기 서열

서열 번호 4: 로도코커스 로도크로스 J1 유래의 α 서브유닛의 아미노산 서열

서열 번호 5: 로도코커스 로도크로스 M8의 α 서브유닛의 아미노산 서열

서열 번호 6: 로도코커스 루버 TH의 α 서브유닛의 아미노산 서열

서열 번호 7: 로도코커스 피리디노보란스 MW33의 α 서브유닛의 아미노산 서열

서열 번호 8: 로도코커스 피리디노보란스 S85-2의 α 서브유닛의 아미노산 서열

서열 번호 9: 로도코커스 피리디노보란스 MS-38의 α 서브유닛의 아미노산 서열

서열 번호 10: 노카르디아 sp. JBRs의 α 서브유닛의 아미노산 서열

서열 번호 11: 노카르디아 SP.YS-2002의 α 서브유닛의 아미노산 서열

서열 번호 12: 비배양 세균 SP1의 α 서브유닛의 아미노산 서열

서열 번호 13: 비배양 세균 BD2의 α 서브유닛의 아미노산 서열

서열 번호 14: 로도코커스 로도크로스 ATCC39484의 α 서브유닛의 아미노산 서열

서열 번호 15: 시노리조비움 메디카에 WSM419의 α 서브유닛의 아미노산 서열

서열 번호 16: 게오바실러스 서모글루코시다시어스 Q6의 α 서브유닛의 아미노산 서열

서열 번호 17: 슈도노카르디아 서모필라 JCM3095의 α 서브유닛의 아미노산 서열

서열 번호 18: 로도코커스 로도크로스 Cr4의 α 서브유닛의 아미노산 서열

서열 번호 19: 코마모나스 테스토스테로니의 α 서브유닛의 아미노산 서열

또한 각종 미생물 유래의 기지의 니트릴 히드라타제의 α 서브유닛의 아미노산(한 글자 표기) 서열의 얼라인먼트를 도 2a 및 2b에 나타낸다. 또한 도 2a, 2b 각각에 있어서, 각 아미노산 서열은 위에서부터 순차적으로 서열 번호 4, 5 내지 19에 대응한다.

본 발명에 따른 니트릴 히드라타제는 상기 서열을 갖는 것에 한정되는 것은 아니며, 서열 번호 1 내지 19 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 약 60% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 80% 이상, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상, 특히 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 98% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 단백질도 본 발명의 니트릴 히드라타제에 포함된다.

또한 본 발명의 니트릴 히드라타제에는, 서열 번호 1 내지 19 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 몇 개, 구체적으로는 1 내지 20개, 바람직하게는 1 내지 10개, 보다 바람직하게는 1 내지 5개, 더욱 바람직하게는 1 내지 2개의 아미노산이 결실(缺失), 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며, 또한 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 단백질도 본 발명의 니트릴 히드라타제에 포함된다.

1.2 개량형 니트릴 히드라타제

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제는, 고온 하에서의 아미드 화합물 내성이 향상된 신규의 개량형 니트릴 히드라타제이다.

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제의 유래는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 미국 생물공학정보센터(NCBI; National Center for Biotechnology Information)에 의하여 제공되는 GenBank 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=protein)에 있어서 등록되어 있는 니트릴 히드라타제나, 공지 문헌에 기재되어 있는 니트릴 히드라타제를 이용할 수 있다.

구체적으로는, 예를 들어 WO2005/116206호, 일본 특허 공개 제2007-143409호, 일본 특허 공개 제2007-43910호, 일본 특허 공개 제2008-253182호, 일본 특허 공개 제2010-172295호(참조에 의하여 본 명세서에 도입됨)에 기재된 니트릴 히드라타제를 나타낼 수 있다. 이들 니트릴 히드라타제는 내열성이나 아크릴아미드 내성을 갖는 것인데, 추가로 본 발명에 따른 아미노산 치환을 부가함으로써, 고온 하에서의 아미드 화합물 내성의 향상이라는 성질을 부가할 수 있다.

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제의 일례로서, α 서브유닛이 도 3에 나타내는 아미노산 서열(서열 번호 50)을 갖는 것을 들 수 있다. 도 3에 나타내는 아미노산 서열 중, N 말단으로부터 헤아려 8번째 내지 19번째에 서열 번호 46으로 표시되는 아미노산 서열, 88번째 내지 105번째에 서열 번호 47로 표시되는 아미노산 서열, 153번째 내지 165번째에 서열 번호 48 또는 서열 번호 49로 표시되는 아미노산 서열이 존재한다.

본 발명에 있어서의 일 실시 형태로서, 서열 번호 50으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 하기 (a) 내지 (d)로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 변이를 갖는 것을 들 수 있다(X₁ 내지 X₂₉는 독립된 임의의 아미노산 잔기를 나타냄).

(a) X₁이 글리신 또는 발린

(b) X₉가 발린 또는 트레오닌

(c) X₂₃이 이소류신, 류신, 메티오닌 및 트레오닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산

(d) X₂₄가 류신

다른 실시 형태로서, 서열 번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 개량형 니트릴 히드라타제에 있어서, X₂가 T(트레오닌), X₃이 E(글루탐산), X₄가 Y(티로신), X₅가 E(글루탐산), X₆이 A(알라닌), X₇이 T(트레오닌), X₈이 I(이소류신), X₁₀이 A(알라닌), X₁₁이 V(발린), X₁₂가 F(페닐알라닌), X₁₃이 D(아스파라긴산), X₁₄가 S(세린), X₁₅가 Q(글루타민), X₁₆이 T(트레오닌), X₁₇이 H(히스티딘), X₁₈이 H(히스티딘), X₁₉가 V(발린), X₂₀이 V(발린), X₂₅가 S(세린), X₂₆이 S(세린), X₂₇이 I(이소류신), X₂₈이 Y(티로신), X₂₉가 I(이소류신)이고, 또한 상기 (a) 내지 (d)로부터 선택되는 적어도 하나의 특징을 갖는 것을 들 수 있다.

또한 서열 번호 50으로 표시되는 아미노산 서열과, 상기 치환 부위 이외에 있어서, 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상, 특히 바람직하게는 약 98% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고, 또한 마찬가지의 내열성 및/또는 아미드 화합물 내성을 갖는 니트릴 히드라타제도, 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제에 포함된다.

또한 서열 번호 50으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 상기 치환 부위 이외에 있어서, 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 5개, 더욱 바람직하게는 1 내지 2개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖고, 또한 마찬가지의 내열성 및/또는 아미드 화합물 내성을 갖는 니트릴 히드라타제도, 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제에 포함된다.

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제의 다른 일례로서는, 서열 번호 4로 표시되는 기지의 니트릴 히드라타제의 아미노산 서열에 있어서, 하기 (e) 내지 (h)로부터 선택되는 적어도 하나의 특징을 갖는 것을 들 수 있다.

(e) α 서브유닛의 8번째의 아미노산 잔기(티로신)를 글리신 또는 발린으로 치환한 것

(f) α 서브유닛의 88번째의 아미노산 잔기(세린)를 발린 또는 트레오닌으로 치환한 것

(g) α 서브유닛의 153번째의 아미노산 잔기(발린)를 이소류신, 류신, 메티오닌 및 트레오닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 치환한 것

(h) α 서브유닛의 154번째의 아미노산 잔기(트립토판)를 류신으로 치환한 것

또한 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열과, 상기 치환 부위 이외에 있어서, 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상, 특히 바람직하게는 약 98% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고, 또한 마찬가지의 내열성 및/또는 아미드 화합물 내성을 갖는 니트릴 히드라타제도, 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제에 포함된다.

또한 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 상기 치환 부위 이외에 있어서, 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 5개, 더욱 바람직하게는 1 내지 2개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖고, 또한 마찬가지의 내열성 및/또는 아미드 화합물 내성을 갖는 니트릴 히드라타제도, 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제에 포함된다.

상기 (e) 내지 (h)의 아미노산 치환을 「Yα8G, Sα88V, Vα153I, Wα154L」 등으로 표기한다. 표준적 아미노산은 알파벳 1문자로 표기되며, 아미노산 치환된 형태는 치환 위치(치환 개소까지의 아미노산 잔기 수)를 나타내는 숫자의 좌측에 치환 전의 아미노산의 1문자 표기를 나타내고, 우측에 치환 후의 아미노산의 1문자 표기를 나타냄으로써, 상기와 같이 표기할 수 있다.

구체적으로는, 서열 번호 4로 표시되는 α 서브유닛의 아미노산 서열에 대하여 「Yα8G」라고 표기했을 경우에는, α 서브유닛의 아미노산 서열(서열 번호 4) 중 N 말단의 아미노산 잔기로부터 헤아려(당해 N 말단의 아미노산 잔기를 포함하고 헤아려) 8번째의 티로신(Y)이 글리신(G)으로 치환된 개량형 니트릴 히드라타제에 있어서의 아미노산 치환된 형태를 의미한다.

본 발명의 보다 바람직한 개량형 니트릴 히드라타제에 있어서의 아미노산 치환된 형태는, 각각 이하의 1 내지 8의 표기로 나타낼 수 있다.

1. Yα8G

2. Yα8V

3. Sα88V

4. Sα88T

5. Vα153I

6. Vα153L

7. Vα153M

8. Vα153T

9. Wα154L

상기 아미노산 치환을 발생시키기 위한 염기 치환으로서는, 이하의 형태가 바람직하게 예시된다.

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제의 활성은, 천연 유래의 특성을 유지한 채의 야생형 니트릴 히드라타제의 활성에 대하여 고온 하에서의 아미드 화합물 내성이 향상되어 있다.

여기서 「니트릴 히드라타제 활성」이란, 니트릴 화합물을, 대응하는 아미드 화합물로 변환하는 수화 반응(RCN + H₂O → RCONH₂)을 촉매하는 효소 활성을 의미한다. 활성 측정은, 기질인 니트릴 화합물을 니트릴 히드라타제와 접촉시켜, 대응하는 아미드 화합물로 변환한 후, 당해 아미드 화합물을 정량함으로써 산출할 수 있다. 기질로서는, 니트릴 히드라타제가 반응하면 어떠한 니트릴 화합물이어도 사용할 수 있지만, 아크릴로니트릴이 바람직하다.

반응 조건은, 기질 농도는 2.5%, 반응 온도는 10℃ 내지 30℃, 반응 시간은 10분 내지 30분의 범위이다. 효소 반응은 인산을 첨가하여 정지시킨다. 그 후, HPLC(고속 액체 크로마토그래피)나 가스 크로마토그래피에 의하여, 생성된 아크릴아미드를 분석함으로써 아미드 화합물의 정량을 행할 수 있다.

「고온 하에서의 아미드 화합물 내성」이란, 고온 하, 아미드 화합물 존재 하에서도 니트릴 히드라타제 활성을 유지할 수 있는 것을 의미한다. 「고온」이란, 구체적으로는 40℃ 내지 60℃, 보다 바람직하게는 45℃ 내지 55℃를 의미한다.

「고온 하에서의 아미드 화합물 내성」은, 개량형 니트릴 히드라타제를 갖는 형질 전환체의 배양물 또는 당해 형질 전환체로부터 단리한 개량형 니트릴 히드라타제를, 고온 하, 아크릴아미드 등의 아미드 화합물(예를 들어 30 내지 50%의 고농도)의 존재 하에서, 기질인 아크릴로니트릴 등의 니트릴 화합물의 소비량 또는 소비 속도를 분석함으로써 평가할 수 있다. 예를 들어 40℃ 내지 60℃의 범위에서, 개량형 니트릴 히드라타제를 아미드 화합물에 접촉시켜, 비교예(변이를 실시하지 않은 니트릴 히드라타제)에 대하여, 소비량 또는 소비 속도가 1.1배 이상, 바람직하게는 1.15배 이상, 보다 바람직하게는 1.2배 이상의 니트릴 히드라타제를 고온 하에서의 아미드 화합물 내성으로 평가할 수 있다.

「아미드 화합물」로서는, 예를 들어 하기 일반식 1:

R-CONH₂ (1)

(여기서, R은 치환되어 있을 수 있는 탄소수 1 내지 10의 직쇄상 혹은 분지상의 알킬기 또는 알케닐기, 치환되어 있을 수 있는 탄소수 3 내지 18의 시클로알킬기 또는 아릴기, 혹은 치환되어 있을 수 있는 포화 또는 불포화 복소환기임)

로 표시되는 아미드 화합물을 들 수 있다. 특히 식 중, R이 「CH₂=CH-」인 아크릴아미드가 바람직하다.

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제는 기지의 니트릴 히드라타제를 아미노산 치환함으로써 얻어지는 것이며, 예를 들어 로도코커스 로도크로스 J1주 유래의 니트릴 히드라타제의 아미노산 서열(서열 번호 4)에 상술한 변이를 도입하여 고온 하에서의 아미드 화합물 내성이 향상된 니트릴 히드라타제를 선택함으로써 얻어진다.

J1균 이외의 니트릴 히드라타제에 있어서도 대응하는 개변 위치에 마찬가지의 변이를 도입함으로써 고온 하에서의 아미드 화합물 내성을 향상시킬 수 있다. 예를 들어 니트릴 히드라타제 산생균으로서는 로도코커스 로도크로스 M8(서열 번호 5), 로도코커스 루버 TH(서열 번호 6), 로도코커스 로도크로스 M33(VKM Ac-1515D), 로도코커스 피리디노보란스 MW3(서열 번호 7), 로도코커스 피리디노보란스 S85-2(서열 번호 8), 노카르디아 sp. JBRs(서열 번호 10), 노카르디아 YS-2002(서열 번호 11) 등을 들 수 있다. 또한 로도코커스 로도크로스 M33(VKM Ac-1515D)은 상기 M8균으로부터 자연 돌연변이에 의하여 구성적으로 니트릴 히드라타제를 발현시키는 주로서 선발된 균주이며, 그의 아미노산 서열 및 유전자 서열에 변이는 없다(미국 특허 제5,827,699호).

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제는, 예를 들어 기지의 니트릴 히드라타제를 코딩하는 유전자에 주지의 방법에 따라 랜덤 또는 부위 특이적으로 변이를 도입하여, 원하는 기능, 즉, 고온 하에서의 아미드 화합물 내성을 갖는 효소를 선택함으로써 취득할 수 있다.

변이의 도입 방법으로서는 오류 유발 PCR(Error prone PCR)과 같은 랜덤 변이 도입법과, 쿤켈(Kunkel)법이나 갭드 듀플렉스(Gapped duplex)법과 같은 Site-directed Mutagenesis(부위 특이적 변이 도입법)를 들 수 있다.

[오류 유발 PCR(Error prone PCR)]

변이체를 사용한 단백질의 기능, 성질을 연구하는 방법의 하나로, 랜덤 변이 도입법이 있다. 랜덤 변이 도입법이란, 특정한 단백질을 코딩하는 유전자에 대하여 랜덤한 변이를 도입하여 변이체를 제작하는 방법이다. PCR에 의한 랜덤 변이 도입법에서는, DNA 증폭 시에 엄밀도(엄격함)가 낮은 조건을 설정하여 염기의 변이를 도입할(오류 유발 PCR(Error prone PCR)) 수 있다.

이 오류 유발 PCR(Error prone PCR)에서는, 증폭되는 DNA의 전체 영역에 대하여 임의의 부위에 변이가 도입된다. 그렇게 하면, 얻어진 임의의 부위에 변이가 도입된 변이체의 기능을 검토함으로써, 단백질 고유의 기능에 중요한 아미노산이나 도메인의 정보를 얻을 수 있다. 오류 유발 PCR(Error prone PCR)의 주형이 되는 니트릴 히드라타제는, 야생주 유래의 니트릴 히드라타제 유전자, 오류 유발 PCR(Error prone PCR)에 의한 증폭 산물인 DNA를 사용할 수 있다.

오류 유발 PCR(Error prone PCR)의 반응 조건으로서는, 예를 들어 반응액 중의 dNTP(dGTP, dCTP, dATP 또는 dTTP) 중 어느 1종, 2종 또는 3종의 배합 비율을 다른 dNTP에 비교하여 감소시킨 조성으로 하는 조건을 들 수 있다. 이것에 의하여, DNA 합성 시, 배합 비율을 감소시킨 dNTP가 필요한 개소에 있어서는, 잘못해서 다른 dNTP가 사용될 가능성이 높아져, 변이가 도입된다. 또한 다른 반응 조건으로서는, 반응액 중의 MgCl₂ 및/또는 MnCl₂양을 증가시킨 조성으로 하는 조건도 바람직하게 들 수 있다.

[Site-directed Mutagenesis(부위 특이적 변이 유발)]

특정 부위에 변이를 도입하는 방법이며, 일반적으로는 표적 유전자를 포함하는 DNA쇄를 단일쇄로 해리하여, 목적으로 하는 변이를 포함하는 올리고뉴클레오티드쇄를 어닐시키고, DNA 폴리메라제로 신장시켜 2중쇄로 하고, 이를 대장균에 삽입하여 복제시켜, 목적으로 하는 변이를 포함하는 클론을 선택한다(Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) 등 참조). 쿤켈(Kunkel)법 외에, 갭드 듀플렉스(Gapped duplex)법 등 다양한 방법이 알려져 있으며, 시판 중인 돌연변이 도입용 키트, 예를 들어 퀵체인지TM XL 부위 특이적 변이 유발 키트(QuickChangeTM XL Site-Directed Mutagenesis Kit)(스트라타진사 제조), 진테일러TM 부위 특이적 변이 유발 시스템(GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System)(인비트로젠사 제조), 다카라 부위 특이적 변이 유발 시스템(TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System)(뮤탄-K(Mutan-K), 뮤탄-슈퍼 익스프레스 Km(Mutan-Super Express Km) 등: 다카라 바이오사 제조) 등을 이용하여 간편히 실시할 수 있다.

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제는, 상기와 같이 기지의 니트릴 히드라타제 유전자에 변이를 도입하는 방법 외에, 환경 DNA로부터의 메타게놈 스크리닝에 의하여 취득할 수도 있다.

1.3 개량형 니트릴 히드라타제를 코딩하는 DNA

본 발명은, 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제를 코딩하는 DNA도 제공한다.

본 발명의 「개량형 니트릴 히드라타제를 코딩하는 DNA」에는, 상기 개량형 니트릴 히드라타제를 코딩하는 DNA와 상보적인 염기 서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 또한 고온 하에서의 아미드 화합물 내성을 갖는 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA도 포함된다.

「엄격한 조건」이란, 하이브리다이제이션 후의 세정 시의 조건이며, 염 농도가 300 내지 2000mM, 온도가 40 내지 75℃, 바람직하게는 염 농도가 600 내지 900mM, 온도가 65℃인 조건을 의미한다. 예를 들어 2×SSC에서 50℃ 등의 조건을 들 수 있다. 당업자이면 이러한 버퍼의 염 농도, 온도 등의 조건 외에, 기타 프로브 농도, 프로브의 길이, 반응 시간 등의 여러 조건을 가미하여, 본 발명의 니트릴 히드라타제를 코딩하는 DNA를 얻기 위한 조건을 적절히 설정할 수 있다.

하이브리다이제이션법의 상세한 수순에 대해서는, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)) 등을 참조할 수 있다. 하이브리다이즈하는 DNA로서는, 본 발명의 유전자 DNA에 대하여 적어도 40% 이상, 바람직하게는 60%, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 DNA 또는 그의 부분 단편을 들 수 있다.

1.4 재조합 벡터, 형질 전환체

개량형 니트릴 히드라타제를 코딩하는 DNA는, 형질 전환되는 숙주 생물에 있어서 발현 가능하도록 벡터에 삽입할 필요가 있다. 사용하는 벡터로서는 플라스미드 DNA, 박테리오파지 DNA, 레트로트랜스포손 DNA, 인공 염색체 DNA 등을 들 수 있다.

벡터에는, 니트릴 히드라타제 유전자 외에, 프로모터, 터미네이터, 인핸서, 스플라이싱 시그널, 폴리 A 부가 시그널, 선택 마커, 리보솜 결합 배열(SD 배열) 등을 연결할 수 있다. 선택 마커로서는, 예를 들어 카나마이신 내성 유전자, 디히드로엽산 환원 효소 유전자, 암피실린 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자 등을 들 수 있다.

본 발명의 형질 전환체에 사용할 수 있는 숙주는, 상기 재조합 벡터가 도입된 후, 목적으로 하는 니트릴 히드라타제를 발현시키는 것이 가능한 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 대장균 및 고초균 등의 세균, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등을 사용할 수 있다.

대장균을 숙주로 하는 경우, 발현 효율이 높은 발현 벡터, 예를 들어 trc 프로모터를 갖는 발현 벡터 pkk233-2(아머샴 바이오 사이언스사 제조) 또는 pTrc99A(아머샴 바이오 사이언스사 제조) 등을 사용하는 것이 바람직하다.

세균을 숙주로 하는 경우, 예를 들어 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)를 들 수 있으며, 로도코커스균으로서는, 예를 들어 로도코커스 로도크로스 ATCC12674, 로도코커스 로도크로스 ATCC17895, 로도코커스 로도크로스 ATCC19140 등을 들 수 있다. 이들 ATCC주는 아메리칸 타입 컬처 컬렉션으로부터 입수할 수 있다. 세균에의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 세균에 DNA를 도입하는 방법이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 칼슘 이온을 사용하는 방법, 일렉트로포레이션법 등을 들 수 있다.

효모를 숙주로 하는 경우에는, 예를 들어 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 등이 사용된다. 효모에의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 효모에 DNA를 도입하는 방법이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 일렉트로포레이션법, 스페로플라스트법, 아세트산리튬법 등을 들 수 있다.

동물 세포를 숙주로 하는 경우에는 원숭이 세포 COS-7, 버로(Vero), CHO 세포, 마우스 L 세포, 래트 GH3, 인간 FL 세포 등이 사용된다. 동물 세포에의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 예를 들어 일렉트로포레이션법, 인산칼슘법, 리포펙션법 등을 들 수 있다.

곤충 세포를 숙주로 하는 경우에는 Sf9 세포, Sf21 세포 등이 사용된다. 곤충 세포에의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 예를 들어 인산칼슘법, 리포펙션법, 일렉트로포레이션법 등이 이용된다.

식물 세포를 숙주로 하는 경우에는 담배 BY-2 세포 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 식물 세포에의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 예를 들어 아그로박테리움법, 파티클건법, PEG법, 일렉트로포레이션법 등이 이용된다.

숙주에 대장균을 사용했을 경우, 발현된 대부분의 니트릴 히드라타제가 인클루전 보디가 되어 불용화되기 때문에, 균체 활성이 낮은 형질 전환체가 얻어진다. 한편, 로도코커스균을 숙주로서 사용했을 경우, 니트릴 히드라타제는 가용성 획분에 존재하기 때문에 고활성의 형질 전환체가 얻어진다. 숙주는 목적에 따라 선택하면 되는데, 엄격한 조건에서 개량형 효소를 선발하는 경우에는 고활성의 로도코커스균의 형질 전환체를 사용하는 것이 바람직하다.

1.5 개량형 니트릴 히드라타제의 제조 방법

개량형 니트릴 히드라타제는, 상기 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 단백질을 채취함으로써 제조할 수 있다. 본 발명은 그러한 개량형 니트릴 히드라타제의 제조 방법도 제공한다.

본 발명에 있어서, 「배양물」에는, 배양 상청, 배양 세포, 배양 균체, 또는 세포 혹은 균체의 파쇄물 중 어느 것도 포함한다.

형질 전환체의 배양은 숙주의 배양에 통상 사용되는 방법에 따라 행한다. 본 발명의 형질 전환체를 배양하는 배지는, 숙주균이 자화(資化)될 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하며, 형질 전환체의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지이면, 천연 배지, 합성 배지 중 어느 것을 사용해도 된다. 탄소원으로서는 글루코오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 라피노오스 및 전분 등의 탄수화물, 아세트산 및 프로피온산 등의 유기산, 에탄올 및 프로판올 등의 알코올류를 들 수 있다. 질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄 및 인산암모늄 등의 무기산, 혹은 유기산의 암모늄염, 또는 기타 질소 함유 화합물을 들 수 있다.

그 외에, 펩톤, 효모 엑기스, 고기 엑기스, 옥수수 침지액, 각종 아미노산 등을 사용해도 된다. 무기물로서는 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 황산아연, 황산구리, 탄산칼슘 등을 들 수 있다. 또한 필요에 따라, 배양 중의 발포를 방지하기 위하여 소포제를 첨가해도 된다. 또한 배지에는 니트릴 히드라타제의 보결 분자인 코발트 이온이나 철 이온을 첨가하고, 효소의 유도제가 되는 니트릴류나 아미드류를 첨가해도 된다.

배양 중, 벡터 및 목적 유전자의 탈락을 방지하기 위하여 선택압을 가한 상태에서 배양해도 된다. 즉, 선택 마커가 약제 내성 유전자인 경우에 상당하는 약제를 배지에 첨가하거나, 선택 마커가 영양 요구성 상보 유전자인 경우에 상당하는 영양 인자를 배지로부터 제외하거나 해도 된다.

또한 선택 마커가 자화성 부여 유전자인 경우에는, 상당하는 자화 인자를 필요에 따라 유일 인자로서 첨가할 수 있다. 예를 들어 암피실린 내성 유전자를 포함하는 벡터로 형질 전환한 대장균을 배양하는 경우, 배양 중, 필요에 따라 암피실린을 첨가해도 된다.

프로모터로서 유도성의 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질 전환한 형질 전환체를 배양하는 경우에는, 필요에 따라 인듀서를 배지에 첨가해도 된다. 예를 들어 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)로 유도 가능한 프로모터를 갖는 발현 벡터로 형질 전환한 형질 전환체를 배양할 때는 IPTG 등을 배지에 첨가할 수 있다. 또한 인돌아세트산(IAA)으로 유도 가능한 trp 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질 전환한 형질 전환체를 배양할 때는 IAA 등을 배지에 첨가할 수 있다.

형질 전환체의 배양 조건은, 목적으로 하는 개량형 니트릴 히드라타제의 생산성 및 숙주의 생육이 방해받지 않는 조건이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 통상 10℃ 내지 40℃, 바람직하게는 20℃ 내지 37℃에서 5 내지 100시간 행한다. pH의 조정은 무기 또는 유기산, 알칼리 용액 등을 사용하여 행하며, 예를 들어 로도코커스균이면 pH 6 내지 9로 조정한다.

배양 방법으로서는 고체 배양, 정치 배양, 진탕 배양, 통기 교반 배양 등을 들 수 있는데, 특히 로도코커스균의 형질 전환체를 배양하는 경우에는 진탕 배양 또는 통기 교반 배양(자 퍼멘터)에 의하여 호기적 조건 하에서 배양하는 것이 바람직하다.

상기 배양 조건에서 배양하면, 고수율로 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제를 상기 배양물 중, 즉, 배양 상청, 배양 세포, 배양 균체, 또는 세포 혹은 균체의 파쇄물 중 적어도 어느 하나에 축적할 수 있다.

배양 후, 개량형 니트릴 히드라타제가 균체 내 또는 세포 내에 생산되는 경우에는 균체 또는 세포를 파쇄함으로써, 목적으로 하는 개량형 니트릴 히드라타제를 채취할 수 있다. 균체 또는 세포의 파쇄 방법으로서는, 프렌치 프레스 또는 호모게나이저에 의한 고압 처리, 초음파 처리, 유리 비즈 등에 의한 마쇄 처리, 리소자임, 셀룰라제 또는 펙티나제 등을 사용하는 효소 처리, 동결 융해 처리, 저장액(低張液) 처리, 파지에 의한 용균 유도 처리 등을 이용할 수 있다.

파쇄 후, 필요에 따라 균체 또는 세포의 파쇄 잔사(세포 추출액 불용성 획분을 포함함)를 제거할 수 있다. 잔사를 제거하는 방법으로서는, 예를 들어 원심 분리나 여과 등을 들 수 있으며, 필요에 따라 응집제나 여과 보조제 등을 사용하여 잔사 제거 효율을 높일 수도 있다. 잔사를 제거한 후에 얻어진 상청은, 세포 추출액 가용성 획분이며, 조(粗)정제한 개량형 니트릴 히드라타제 용액으로 할 수 있다.

또한 개량형 니트릴 히드라타제가 균체 내 또는 세포 내에 생산되는 경우, 균체나 세포 그 자체를 원심 분리, 막 분리 등으로 회수하여 미파쇄인 채로 사용하는 것도 가능하다.

개량형 니트릴 히드라타제가 균체 외 또는 세포 외에서 생산되는 경우에는 배양액을 그대로 사용하거나, 원심 분리나 여과 등에 의하여 균체 또는 세포를 제거한다. 그 후, 필요에 따라 유안 침전에 의한 추출 등에 의하여 상기 배양물 중에서 개량형 니트릴 히드라타제를 채취하고, 추가로 필요에 따라 투석, 각종 크로마토그래피(겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등)을 이용하여 단리 정제할 수도 있다.

형질 전환체를 배양하여 얻어진 니트릴 히드라타제의 생산 수율은, 예를 들어 배양액당, 균체 습중량 또는 건조 중량당, 조(粗)효소액 단백질당 등의 단위로 SDS-PAGE(폴리아크릴아미드 겔 전기 영동)나 니트릴 히드라타제 활성 측정 등에 의하여 확인할 수 있지만, 특별히 한정되는 것은 아니다. SDS-PAGE는 당업자이면 공지된 방법을 이용하여 행할 수 있다. 또한 니트릴 히드라타제 활성은 상술한 활성의 값을 적용할 수 있다.

상기한 방법 외에, 무세포 단백질 합성계를 채용하여 개량형 니트릴 히드라타제를 산생하는 것도 가능하다. 무세포 단백질 합성계란, 세포 추출액을 사용하여 시험관 등의 인공 용기 내에서 단백질을 합성하는 계이다. 또한 본 발명에 있어서 사용되는 무세포 단백질 합성계에는, DNA를 주형으로 하여 RNA를 합성하는 무세포 전사계도 포함된다.

이 경우, 상기 숙주에 대응하는 생물은, 하기 세포 추출액이 유래하는 생물에 상당한다. 여기서, 상기 세포 추출액은, 진핵 세포 유래 또는 원핵 세포 유래의 추출액, 예를 들어 소맥 배아, 대장균 등의 추출액을 사용할 수 있다. 또한 이들 세포 추출액은 농축된 것이어도, 농축되어 있지 않은 것이어도 된다.

세포 추출액은, 예를 들어 한외 여과, 투석, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 침전 등에 의하여 얻을 수 있다. 또한 본 발명에 있어서, 무세포 단백질 합성은, 시판 중인 키트를 사용하여 행할 수도 있다. 그러한 키트로서는, 예를 들어 시약 키트PROTEIOSTM(도요보), TNTTM System(프로메가), 합성 장치인 PG-MateTM(도요보), RTS(로슈 다이아그노스틱) 등을 들 수 있다.

상기와 같이 무세포 단백질 합성에 의하여 얻어지는 개량형 니트릴 히드라타제는, 상술한 바와 같이 적절히 크로마토그래피를 선택하여 정제할 수 있다.

2. 아미드 화합물의 제조 방법

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제는, 효소 촉매로서 물질 생산에 이용할 수 있다. 예를 들어 니트릴 화합물에 상기 개량형 니트릴 히드라타제를 접촉시켜 생성되는 아미드 화합물을 채취함으로써, 아미드 화합물을 제조할 수 있다.

효소 촉매로서는, 분리 정제된 니트릴 히드라타제 외에, 본 발명의 형질 전환체를 배양한 후의 배양물, 또는 당해 배양물의 처리물을 이용할 수 있다. 처리물로서는, 예를 들어 배양 후의 세포(형질 전환체)를 아크릴아미드 등의 겔로 포함한 것, 글루타르알데히드로 처리한 것, 알루미나, 실리카, 제올라이트 및 규조토 등의 무기 담체에 담지시킨 것 등을 들 수 있다.

여기서 「접촉」이란, 개량형 니트릴 히드라타제와 니트릴 화합물을 동일한 반응계 또는 배양계에 존재시키는 것을 의미하며, 예를 들어 분리 정제한 개량형 니트릴 히드라타제와 니트릴 화합물을 혼합하는 것, 개량형 니트릴 히드라타제 유전자를 발현시키는 세포(형질 전환체)의 배양 용기에 니트릴 화합물을 첨가하는 것, 당해 세포를 니트릴 화합물의 존재 하에서 배양하는 것, 당해 세포의 추출액을 니트릴 화합물과 혼합하는 것 등이 포함된다.

기질로서 사용되는 니트릴 화합물은, 효소의 기질 특이성, 효소의 기질에 대한 안정성 등을 고려하여 선택된다. 니트릴 화합물로서는 아크릴로니트릴이 바람직하다. 반응 방법 및 반응 종료 후의 아미드 화합물의 채취 방법은 기질 및 효소 촉매의 특성에 따라 적절히 선택된다.

효소 촉매는, 그의 활성이 실활되지 않는 한, 리사이클 사용하는 것이 바람직하다. 실활의 방지나 리사이클을 용이하게 하는 것을 감안하여, 효소 촉매는 처리물의 형태로 사용되는 것이 바람직하다.

실시예

이하에, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다. 여기서 기재하는 「%」는 질량%를 나타낸다.

[실시예 1] 개량형 니트릴 히드라타제 발현용 플라스미드의 제작

본 발명의 아미노산 치환을 도입하기 위한 주형이 되는 플라스미드를 이하의 방법으로 제작하였다.

J1균의 니트릴 히드라타제 유전자를 갖는 플라스미드는 pSJ034를 사용하였다(도 1). pSJ034는 로도코커스균에 있어서 니트릴 히드라타제를 발현시키는 플라스미드이다. pJD034는 pSJ023로부터 일본 특허 공개 평10-337185호 공보에 제시하는 방법으로 제작하였다. 즉, 플라스미드 pSJ023을 XbaⅠ의 부분 절단과 Sse8387Ⅰ 링커 라이게이션에 의하여, 1개소의 XbaⅠ 사이트를 Sse8387Ⅰ로 치환한 플라스미드 pSJ033을 제작하였다. 다음으로, pSJ033을 Sse8387Ⅰ로 부분 절단하고, 클레노브 절편을 이용하여 말단 평활화를 행하고 셀프 라이게이션함으로써 플라스미드 pSJ034를 제작하였다.

또한 로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous) J-1주는, FERM BP-1478로서 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물 기탁 센터(일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반치 1추오 다이6(현 NITE 특허생물 기탁 센터: 일본 지바켄 기사라즈시 가즈사카마타리 2-5-8 120고시쓰))에 기탁되어 있다(원 기탁일: 1987년 9월 18일).

또한 pSJ023은 형질 전환체 「R. 로도크로스 ATCC12674/pSJ023」이며, 수탁 번호 FERM BP-6232로서 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물 기탁 센터(일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반치 1추오 다이6(현 NITE 특허생물 기탁 센터: 일본 지바켄 기사라즈시 가즈사카마타리 2-5-8 120고시쓰))에 1997년 3월 4일자로 국제 기탁되어 있다.

[실시예 2] 개량형 니트릴 히드라타제의 제작

실시예 1에서 제작한 플라스미드 pSJ034를 사용하여 아미노산 치환을 행하였다. PCR은 하기 반응액 조성, 반응 조건, 프라이머를 이용하여 행하였다.

<PCR 반응 조건>

(98℃ 10초, 55℃ 5초, 72℃에서 90초)×30사이클

PCR 종료 후, 반응액 5μl를 0.7% 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하여 11kb의 증폭 단편을 확인하고, 1μl의 DpnⅠ(키트에 부속)을 PCR 반응액에 첨가하고 37℃에서 1시간 반응시켜 주형 플라스미드의 제거를 행하였다. 반응 종료액을 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(프로메가 가부시키가이샤)로 정제하고, 정제한 PCR 반응물을 사용하여 JM109로 형질 전환하였다. 얻어진 배양물로부터 QIAprep Spin Miniprep Kit(퀴아젠 사)를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하고, 오토시퀀서 CEQ 8000(베크만 콜터사)를 사용하여 니트릴 히드라타제의 염기 서열을 확인하였다. 얻어진 플라스미드를 표 3과 같이 명명하였다.

[실시예 3] 로도코커스 형질 전환체의 제작

로도코커스 로도크로스 ATCC12674주의 대수 증식기의 세포를 원심 분리기에 의하여 집균하고, 빙냉한 멸균수로 3회 세정하고 멸균수에 현탁하였다. 실시예 2에서 조제한 플라스미드 1μl와 균체 현탁액 10μl를 혼합하고 빙냉하였다. 큐벳에 DNA와 균체의 현탁액을 넣고, 유전자 도입 장치 진 펄서(Gene Pulser)(바이오라드(BIORAD))에 의하여 2.0㎸, 200 OHMS로 전기 펄스 처리를 행하였다. 전기 펄스 처리액을 빙냉 하 10분 정치하고, 37℃에서 10분 간 히트 쇼크를 행하고, MYK 배지(0.5% 폴리펩톤, 0.3% 박트 이스트 엑기스, 0.3% 박트 몰트 엑기스, 0.2% K₂HPO₄, 0.2% KH₂PO₄) 500μl를 첨가하고 30℃, 5시간 정치하였다. 그 후, 50μg/ml 카나마이신이 든 MYK 한천 배지에 도포하고, 30℃에서 3일 간 배양하였다. 30℃, 3일 간 배양 후의 콜로니를 형질 전환체로 하였다.

상기 공정에서 얻어진 각 형질 전환체를 MYK 배지(50μg/ml 카나마이신)에 각각 접종하고, 30℃에서 2일 간 진탕 배양하고, GGPK 배지(1.5% 글루코오스, 1% 글루탐산나트륨, 0.1% 효모 엑기스, 0.05% K₂HPO₄, 0.05% KH₂PO₄, 0.05% Mg₂O₄·7H₂O, 1% CoCl₂, 0.1% 요소, 50μg/ml 카나마이신, pH 7.2)에 1% 식균을 행하였다. 30℃에서 3일 간 진탕 배양하고, 원심 분리에 의하여 집균하였다. 그 후, 100mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 균체를 세정하여 균체 현탁액을 조제하였다.

[실시예 4] 고온 하에서의 아미드 화합물 내성의 평가

실시예 3에서 얻어진 개량형 니트릴 히드라타제의 아미드 화합물 내성을 이하의 방법으로 측정하였다.

균체액 0.2ml와 50mM 인산 완충액(pH 7.0) 4.8ml를 혼합하고, 추가로 5.0%(w/v)의 아크릴로니트릴을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH 7.0) 5ml를 혼합액에 첨가하고, 10℃에서 10분 간 진탕하면서 반응시켰다. 이어서, 균체를 여과 분별하고 가스 크로마토그래피를 이용하여, 생성된 아크릴아미드의 양을 정량하였다.

<분석 조건>

분석 기기: 가스 크로마토그래프 GC2014(시마즈 세이사쿠쇼 제조)

검출기: FID(검출 200℃)

칼럼: 폴라팩 PS(워터스사 제조의 칼럼 충전제)를 충전한 1m 유리 칼럼

칼럼 온도: 190℃

아크릴아미드의 양으로부터 니트릴 히드라타제 활성을 환산하였다. 여기서, 니트릴 히드라타제 활성은, 1분 간에 1μ㏖의 아크릴아미드를 생성하는 효소량을 1U로 정의한다.

다음으로, 하기 반응액 조성 및 반응 조건에서 실험을 행하였다. 또한 반응에 사용하는 각 균체 현탁액은, 사전에 측정한 효소 활성으로부터 동일한 활성량이 되도록 100mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 적절히 희석하였다. 비교 대조로서 비교주인 ATCC12674/pSJ034를 사용하였다.

<반응액 조성>

50% 아크릴아미드 용액 94g

아크릴로니트릴 3g

1M 인산 완충액 1g

균액(동일한 효소 활성 단위(U)량) 2g

<반응 조건>

반응 온도 45℃

반응 시간 3시간

반응 개시 전(0시간), 3시간 후에 각각 반응액 1ml를 샘플링하여, 0.45㎛의 필터를 사용하여 여과하고, 얻어진 여과액을 가스 크로마토그래피에 제공하였다. 잔존하는 아크릴로니트릴의 비율(%)의 분석 결과를 표 4에 나타내었다.

상기 결과로부터 모든 개량형 니트릴 히드라타제는, 비교예인 pSJ034보다도 아크릴로니트릴의 소비율이 110% 이상이었다. 니트릴 히드라타제를 사용한 아미드 화합물의 합성 반응에 있어서, 고온·고농도 생성물에의 폭로에 의한 실활이나, 생성물인 아미드 화합물에 의한 반응 저해가 문제가 된다. 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제는 고온 하, 및 고농도의 아크릴아미드 존재 하에서도 니트릴 히드라타제 활성이 유지되어 있는 점에서, 고온 하에서의 아크릴아미드 내성이 향상되어 있다고 할 수 있다.

[실시예 5] 개량형 니트릴 히드라타제의 제작

WO2012/164933에 기재된 니트릴 히드라타제(pSJ306A)를 사용하여, 실시예 2와 마찬가지의 방법으로 아미노산 치환을 행하였다. 제작한 플라스미드를 표 5에 나타낸다.

표 5에 기재된 플라스미드를 실시예 3과 마찬가지의 방법으로 로도코커스 로도크로스 ATCC12674 형질 전환체를 얻고, MYK 배지에서 배양하였다. 얻어진 배양 균체를 사용하여, 이하의 조건에서 고온 하의 아미드 화합물 내성의 평가를 실시하였다.

<반응액 조성>

50% 아크릴아미드 용액 94g

아크릴로니트릴 3g

1M 인산 완충액 1g

균액(동일한 효소 활성 단위(U)량) 1g

<반응 조건>

반응 온도 45℃

반응 시간 5시간

상기 결과로부터 모든 개량형 니트릴 히드라타제는, 비교예인 pSJ306A보다도 아크릴로니트릴의 소비율이 110% 이상이었다. 따라서 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제는 고온 하, 및 고농도의 아크릴아미드 존재 하에서도 니트릴 히드라타제 활성이 유지되어 있는 점에서, 고온 하에서의 아크릴아미드 내성이 향상되어 있다고 할 수 있다.

[실시예 6] 개량형 니트릴 히드라타제의 제작(JBRs)

노카르디아 sp. JBRs 유래 니트릴 히드라타제 유전자(GenBank 액세션 번호 AY141130)의 발현 플라스미드를 이하의 방법으로 제작하였다.

벡터 단편은, pSJ034를 주형으로 한 PCR을 행하고, Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(프로메가 가부시키가이샤)으로 조제하였다.

<PCR 반응 조건>

(98℃ 10초, 55℃ 5초, 72℃에서 90초)×30사이클

NH-F: GAAGTGATCG TATGAGTGAA GACACACTCA CTG(서열 번호 51)

NH-R: GTGGATACCA TCCATTTCCT CATTCCTTTC ATC(서열 번호 52)

상기에서 조제한 벡터 단편과, 인공 합성한 노카르디아 sp. JBRs 유래 니트릴 히드라타제 유전자(서열 번호 44)를, 인-퓨전(In-Fusion) 클로닝 키트(다카라 바이오)를 사용하여 클로닝하여 대장균 HST08(다카라 바이오)로 형질 전환하였다. 얻어진 콜로니로부터 플라스미드를 회수하여 DNA 서열을 확인하고, 노카르디아 sp. JBRs 유래 니트릴 히드라타제 발현 플라스미드(pSJ-JBRs)를 얻었다.

또한 pSJ-JBRs를 주형에 사용하여, 실시예 2와 마찬가지의 방법으로 아미노산 치환을 실시하였다. 제작한 플라스미드를 표 7에 나타낸다.

표 7에 기재된 플라스미드를 실시예 3과 마찬가지의 방법으로 로도코커스 로도크로스 ATCC12674 형질 전환체를 얻고, MYK 배지에서 배양하였다. 얻어진 배양 균체를 사용하여, 실시예 4의 조건에서 고온 하의 아미드 화합물 내성의 평가를 실시하였다. 결과를 표 8에 나타낸다.

상기 결과로부터 모든 개량형 니트릴 히드라타제는, 비교예인 pSJ-JBRs보다도 아크릴로니트릴의 소비율이 108% 이상이었다. 따라서 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제는 고온 하, 및 고농도의 아크릴아미드 존재 하에서도 니트릴 히드라타제 활성이 유지되어 있는 점에서, 고온 하에서의 아크릴아미드 내성이 향상되어 있다고 할 수 있다.

[실시예 7] 개량형 니트릴 히드라타제의 제작(S85-2)

로도코커스 피리디노보란스 S85-2 유래 니트릴 히드라타제 유전자(GenBank 액세션 번호 AJ582605)의 발현 플라스미드는, 인공 합성한 니트릴 히드라타제 유전자(서열 번호 45)를 사용하여 실시예 6과 마찬가지의 방법으로 제작하였다. 얻어진 플라스미드를 pSJ-S85-2라 명명하였다.

또한 pSJ-S85-2를 주형에 사용하여, 실시예 2와 마찬가지의 방법으로 아미노산 치환을 실시하였다. 제작한 플라스미드를 표 9에 나타낸다.

표 9에 기재된 플라스미드를 실시예 3과 마찬가지의 방법으로 로도코커스 로도크로스 ATCC12674 형질 전환체를 얻고, MYK 배지에서 배양하였다. 얻어진 배양 균체를 사용하여, 실시예 4의 조건에서 고온 하의 아미드 화합물 내성의 평가를 실시하였다. 결과를 표 10에 나타낸다.

상기 결과로부터 모든 개량형 니트릴 히드라타제는, 비교예인 pSJ-S85-2보다도 아크릴로니트릴의 소비율이 130% 이상이었다. 따라서 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제는 고온 하, 및 고농도의 아크릴아미드 존재 하에서도 니트릴 히드라타제 활성이 유지되어 있는 점에서, 고온 하에서의 아크릴아미드 내성이 향상되어 있다고 할 수 있다.

[실시예 8] 개량형 니트릴 히드라타제의 제작(M8)

로도코커스 로도크로스 M8 유래 니트릴 히드라타제 유전자(GenBank 액세션 번호 ATT79340, AAT79339)의 발현 플라스미드는, 일본 특허 공개 제2011-200132호 공보에 기재된 플라스미드 pSJ-NO1A를 사용하여, 실시예 2와 마찬가지의 방법으로 아미노산 치환을 실시하였다. 제작한 플라스미드를 표 11에 나타낸다.

표 11에 기재된 플라스미드를 실시예 3과 마찬가지의 방법으로 로도코커스 로도크로스 ATCC12674 형질 전환체를 얻고, MYK 배지에서 배양하였다. 얻어진 배양 균체를 사용하여, 실시예 4의 조건에서 고온 하의 아미드 화합물 내성의 평가를 실시하였다. 결과를 표 12에 나타낸다.

상기 결과로부터 모든 개량형 니트릴 히드라타제는, 비교예인 pSJ-NO1A보다도 아크릴로니트릴의 소비율이 110% 이상이었다. 따라서 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제는 고온 하, 및 고농도의 아크릴아미드 존재 하에서도 니트릴 히드라타제 활성이 유지되어 있는 점에서, 고온 하에서의 아크릴아미드 내성이 향상되어 있다고 할 수 있다.

[실시예 9] 로도코커스 로도크로스(미쓰이균)

슈도노카르디아 서모필라 JCM3095 유래 니트릴 히드라타제 유전자(GenBank 액세션 번호 DD028560, DD028561)의 발현 플라스미드는, 일본 특허 공개 제2011-200132호 공보에 기재된 플라스미드 pSJ-NO2A를 사용하여, 실시예 2와 마찬가지의 방법으로 아미노산 치환을 실시하였다. 제작한 플라스미드를 표 13에 나타낸다.

표 13에 기재된 플라스미드를 실시예 3과 마찬가지의 방법으로 로도코커스 로도크로스 ATCC12674 형질 전환체를 얻고, MYK 배지에서 배양하였다. 얻어진 배양 균체를 사용하여, 실시예 4의 조건에서 고온 하의 아미드 화합물 내성의 평가를 실시하였다. 결과를 표 14에 나타낸다.

상기 결과로부터 모든 개량형 니트릴 히드라타제는, 비교예인 pSJ-NO2A보다도 아크릴로니트릴의 소비율이 240%였다. 따라서 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제는 고온 하, 및 고농도의 아크릴아미드 존재 하에서도 니트릴 히드라타제 활성이 유지되어 있는 점에서, 고온 하에서의 아크릴아미드 내성이 향상되어 있다고 할 수 있다.

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제는, 고온 하에서의 아크릴아미드 내성이 향상되어 있기 때문에, 니트릴 화합물로부터 대응하는 아미드 화합물을 효율적으로 제조할 수 있어, 아미드 화합물의 공업적 생산에 유용하다.

본 명세서 중에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서 중에 도입하는 것으로 한다.

수탁 번호

로도코커스 로도크로스 J1주: FERM BP-1478

R. 로도크로스 ATCC12674/pSJ023: FERM BP-6232

서열표 프리텍스트

서열 번호 20: α8G-F 프라이머

서열 번호 21: α8G-R 프라이머

서열 번호 22: α8V-F 프라이머

서열 번호 23: α8V-R 프라이머

서열 번호 24: α88V-F 프라이머

서열 번호 25: α88V-R 프라이머

서열 번호 26: α153I-F 프라이머

서열 번호 27: α153I-R 프라이머

서열 번호 28: α153L-F 프라이머

서열 번호 29: α153L-R 프라이머

서열 번호 30: α153M-F 프라이머

서열 번호 31: α153M-R 프라이머

서열 번호 32: α153T-F 프라이머

서열 번호 33: α153T-R 프라이머

서열 번호 34: α154L-F 프라이머

서열 번호 35: α154L-R 프라이머

서열 번호 36: α153I·α154L-F 프라이머

서열 번호 37: α153I·α154L-R 프라이머

서열 번호 38: α153L·α154L-F 프라이머

서열 번호 39: α153L·α154L-R 프라이머

서열 번호 40: α153M·α154L-F 프라이머

서열 번호 41: α153M·α154L-R 프라이머

서열 번호 42: α153T·α154L-F 프라이머

서열 번호 43: α153T·α154L-R 프라이머

서열 번호 46: 본 발명에 따른 특정한 아미노산

서열 번호 47: 본 발명에 따른 특정한 아미노산

서열 번호 48: 본 발명에 따른 특정한 아미노산

서열 번호 49: 본 발명에 따른 특정한 아미노산

서열 번호 50: 본 발명에 따른 α 서브유닛의 아미노산

서열 번호 51: NH-F 프라이머

서열 번호 52: NH-R 프라이머

서열 번호 53: α88T-F 프라이머

서열 번호 54: α88T-R 프라이머

SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Rayon Co., Ltd. <120> Improved Nitrilehydratase <130> PMR-9014WO <150> JP2014-118041 <151> 2014-06-06 <160> 55 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 690 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous J-1 <400> 1 atggatggta tccacgacac aggcggcatg accggatacg gaccggtccc ctatcagaag 60 gacgagccct tcttccacta cgagtgggag ggtcggaccc tgtcaattct gacttggatg 120 catctcaagg gcatatcgtg gtgggacaag tcgcggttct tccgggagtc gatggggaac 180 gaaaactacg tcaacgagat tcgcaactcg tactacaccc actggctgag tgcggcagaa 240 cgtatcctcg tcgccgacaa gatcatcacc gaagaagagc gaaagcaccg tgtgcaagag 300 atccttgagg gtcggtacac ggacaggaag ccgtcgcgga agttcgatcc ggcccagatc 360 gagaaggcga tcgaacggct tcacgagccc cactccctag cgcttccagg agcggagccg 420 agtttctctc tcggtgacaa gatcaaagtg aagagtatga acccgctggg acacacacgg 480 tgcccgaaat atgtgcggaa caagatcggg gaaatcgtcg cctaccacgg ctgccagatc 540 tatcccgaga gcagctccgc cggcctcggc gacgatcctc gcccgctcta cacggtcgcg 600 ttttccgccc aggaactgtg gggcgacgac ggaaacggga aagacgtagt gtgcgtcgat 660 ctctgggaac cgtacctgat ctctgcgtga 690 <210> 2 <211> 229 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous <400> 2 Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Ile Ser Trp Trp 35 40 45 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Lys Pro Ser 100 105 110 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Gln Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 Gly Asp Lys Ile Lys Val Lys Ser Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg 145 150 155 160 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Ala Tyr His 165 170 175 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly 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<212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous <400> 4 Met Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr 85 90 95 His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val 100 105 110 Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp 130 135 140 Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile 145 150 155 160 Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser 165 170 175 Glu Glu Glu Leu Thr Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val 180 185 190 Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val 195 200 <210> 5 <211> 203 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous M8 <400> 5 Met Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr 85 90 95 His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val 100 105 110 Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp 130 135 140 Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile 145 150 155 160 Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser 165 170 175 Glu Asp Glu Leu Ala Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val 180 185 190 Ser Asn Ala Leu Thr Pro 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Asp Pro Arg Gly Val Met 130 135 140 Ala Glu Phe Gly Tyr Thr Pro Ala Ser Asp Val Glu Ile Arg Val Trp 145 150 155 160 Asp Ser Ser Ala Glu Leu Arg Tyr Trp Val Leu Pro Gln Arg Pro Ala 165 170 175 Gly Thr Glu Asn Phe Thr Glu Glu Gln Leu Ala Ala Leu Val Thr Arg 180 185 190 Asp Ser Leu Ile Gly Val Ser Val Pro Thr Ala Pro Asn Lys Ala 195 200 205 <210> 19 <211> 210 <212> PRT <213> Comamonas testosteroni <400> 19 Met Gly Gln Ser His Thr His Asp His His His Asp Gly Tyr Gln Ala 1 5 10 15 Pro Pro Glu Asp Ile Ala Leu Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser Leu Leu 20 25 30 Ile Glu Lys Gly Leu Val Asp Pro Ala Ala Met Asp Leu Val Val Gln 35 40 45 Thr Tyr Glu His Lys Val Gly Pro Arg Asn Gly Ala Lys Val Val Ala 50 55 60 Lys Ala Trp Val Asp Pro Ala Tyr Lys Ala Arg Leu Leu Ala Asp Gly 65 70 75 80 Thr Ala Gly Ile Ala Glu Leu Gly Phe Ser Gly Val Gln Gly Glu Asp 85 90 95 Met Val Ile Leu Glu Asn Thr Pro Ala Val His Asn Val Val Val Cys 100 105 110 Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Thr Leu Gly Leu Pro Pro Ala 115 120 125 Trp Tyr Lys Ala Pro Pro Tyr Arg Ser Arg Met Val Ser Asp Pro Arg 130 135 140 Gly Val Leu Ala Glu Phe Gly Leu Val Ile Pro Ala Lys Glu Ile Arg 145 150 155 160 Val Trp Asp Thr Thr Ala Glu Leu Arg Tyr Met Val Leu Pro Glu Arg 165 170 175 Pro Ala Gly Thr Glu Ala Tyr Ser Glu Glu Gln Leu Ala Glu Leu Val 180 185 190 Thr Arg Asp Ser Met Ile Gly Thr Gly Leu Pro Ile Gln Pro Thr Pro 195 200 205 Ser His 210 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alfa8G-F primer <400> 20 aataagggca cggagtacga ggcacgt 27 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alfa8G-R primer <400> 21 ctccgtgccc ttattgacgt gctcgct 27 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alfa8V-F primer <400> 22 aataaggtca cggagtacga ggcacgt 27 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alfa8V-R primer <400> 23 ctccgtgacc ttattgacgt gctcgct 27 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alfa88V-F primer <400> 24 ccaaattgtc gcggtcttca acgactc 27 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alfa88V-R primer <400> 25 gaccgcgaca atttggtgtg cctgctc 27 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alfa153I-F primer <400> 26 gtcaggatct gggacagcag ctccgaa 27 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alfa153I-R primer <400> 27 gtcccagatc ctgacctcca cctcatc 27 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alfa153L-F primer <400> 28 gtcaggctct gggacagcag ctccgaa 27 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alfa153L-R primer <400> 29 gtcagggagt gggacagcag ctccgaa 27 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alfa153M-F primer <400> 30 gtcaggatgt gggacagcag ctccgaa 27 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alfa153M-R primer <400> 31 gtcaggcatt gggacagcag ctccgaa 27 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alfa153T-F primer <400> 32 gtcaggacct gggacagcag ctccgaa 27 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alfa153T-R primer <400> 33 gtcaggggtt gggacagcag ctccgaa 27 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alfa154L-F primer <400> 34 agggttctcg acagcagctc cgaaatc 27 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alfa154L-R primer <400> 35 gctgtcgaga accctgacct ccacctc 27 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a153I?/Ea154L-F primer <400> 36 gtcaggatcc tcgacagcag ctccgaa 27 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a153I/a154L-R primer <400> 37 gctgtcgagg atcctgacct ccacctc 27 <210> 38 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a153L/a154L-F primer <400> 38 gtcaggctcc tcgacagcag ctccgaa 27 <210> 39 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a153L/a154L-R primer <400> 39 gctgtcgagg agcctgacct ccacctc 27 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a153M/a154L-F primer <400> 40 gtcaggatgc tcgacagcag ctccgaa 27 <210> 41 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a153M/a154L-R <400> 41 gctgtcgagc atcctgacct ccacctc 27 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a153T/a154L-F primer <400> 42 gtcaggaccc tcgacagcag ctccgaa 27 <210> 43 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a153T/a154L-R primer <400> 43 gctgtcgagg agcctgacct ccacctc 27 <210> 44 <211> 1315 <212> DNA <213> Nocardia sp. JBRs <400> 44 atggatggta tccacgacac aggcggcatg accggatacg gaccggtccc ctatcagaag 60 gacgagccct tcttccacta cgagtgggag ggtcggaccc tgtcgattct gacctggatg 120 catctcaagg gcatgtcgtg gtgggacaag tcgcggttct tccgggagtc gatggggaac 180 gaaaactacg tcaacgagat tcgcaactcg tactacaccc actggctgag tgcggcagaa 240 cgtatcctcg tcgccgacaa gatcatcacc gaagaagagc gaaagcaccg tgtgcaggag 300 atcctcgagg gtcggtacac ggacaggaac ccgtcgcgga agttcgatcc ggccgagatc 360 gagaaggcga tcgaacggct tcacgagccc cactccctag cacttccagg agcggagccg 420 agtttctccc tcggtgacaa ggtcaaagtg aagaatatga acccgctggg acacacacgg 480 tgcccgaaat atgtgcggaa caagatcggg gaaatcgtca cctcccacgg ctgccagatc 540 tatcccgaga gcagctccgc cggcctcggc gacgatcccc gcccgctcta cacggtcgcg 600 ttttccgccc aggaactgtg gggcgacgac ggaaacggga aagacgtagt gtgcgtcgat 660 ctctgggaac cgtacctgat ctctgcgtga aaggaatacg atagtgagcg agcacgtcaa 720 taagtacacg gagtacgagg cacgtaccaa ggcaatcgaa actttgctgt acgagcgagg 780 gctcatcacg cccgccgcgg tcgaccgagt cgtttcgtac tacgagaacg agatcggccc 840 gatgggcggt gccaaggtcg tggcgaagtc ctgggtggac cctgagtacc gcaagtggct 900 cgaagaggac gcgacggccg cgatggcgtc attgggctat gccggtgagc aggcacacca 960 aatttcggcg gtcttcaacg actcccaaac gcatcacgtg gtggtgtgca ctctgtgttc 1020 gtgctatccg tggccggtgc ttggtctccc gcccgcctgg tacaagagca tggagtaccg 1080 gtcccgagtg gtagcggacc ctcgtggagt gctcaagcgc gatttcggtt tcgacatccc 1140 cgatgaggtg gaggtcaggg tttgggacag cagctccgaa atccgctaca tcgtcatccc 1200 ggaacggccg gccggcaccg acggttggtc cgaggacgag ctggcgaagc tggtgagccg 1260 ggactcgatg atcggtgtca gtaatgcgct cacaccccag gaagtgatcg tatga 1315 <210> 45 <211> 1315 <212> DNA <213> Rhodococcus pyridinovorans S85-2 <400> 45 atggatggta tccacgacac aggcggcatg accggatacg gaccggtccc ctatcagaag 60 gacgagccct tcttccacta cgagtgggag ggtcggaccc tgtcgattct gacttggatg 120 catctcaagg gcatatcgtg gtgggacaag tcgcggttct tccgggagtc gatggggaac 180 gaaaactacg tcaacgagat tcgcaactcg tactacaccc actggctgag tgcggcagaa 240 cgtatcctcg tcgccgacaa gatcatcacc gaagaagagc gaaagcaccg tgtgcaagag 300 atccttgagg gtcggtacac ggacaggaag ccgtcgcgga agttcgatcc ggcccagatc 360 gagaaggcga tcgaacggct tcacgagccc cactccctag cacttccagg agcggagccg 420 agtttctctc tcggtgacaa gatcaaagtg aagagtatga acccgctggg acacacacgg 480 tgcccgaaat atgtgcggaa caagatcggg gaaatcgtca cctaccacgg ctgccagatc 540 tatcccgaga gcagctccgc cggcctcggc gacgatcctc gcccgctcta cacggtcgcg 600 ttttccgccc aggaactgtg gggcgacgac ggaaacggga aagacgtagt gtgcgtcgat 660 ctctgggaac cgtacctgat ctctgcgtga aaggaatacg atagtgagcg agcacgtcaa 720 taagtacacg gagtacgagg cacgtaccaa ggcgatcgaa accttgctgt acgagcgagg 780 gctcatcacg cccgccgcgg tcgaccgagt cgtttcgtac tacgagaacg agatcggccc 840 gatgggcggt gccaaggtcg tggccaagtc ctgggtggac cctgagtacc gcaagtggct 900 cgaagaggac gcgacggccg cgatggcgtc attgggctat gccggtgagc aggcacacca 960 aatttcggcg gtcttcaacg actcccaaac gcatcacgtg gtggtgtgca ctctgtgttc 1020 gtgctatccg tggccggtgc ttggtctccc gcccgcctgg tacaagagca tggagtaccg 1080 gtcccgagtg gtagcggacc ctcgtggagt gctcaagcgc gatttcggtt tcgacatccc 1140 cgatgaggtg gaggtcaggg tttgggacag cagctccgaa atccgctaca tcgtcatccc 1200 ggaacggccg gccggcaccg acggttggtc cgaggaggag ctgacgaagc tggtgagccg 1260 ggactcgatg atcggtgtca gtaatgcgct cacaccgcag gaagtgatcg tatga 1315 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> specific sequence according to the present invention <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 46 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Lys Ala Xaa Glu 1 5 10 <210> 47 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> specific sequence according to the present invention <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(14) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 47 Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa 1 5 10 15 Leu Cys <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> specific sequence according to the present invention <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 48 Xaa Trp Asp Ser Xaa Xaa Glu Xaa Arg Xaa Xaa Val 1 5 10 <210> 49 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> specific sequence according to the present invention <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 49 Val Xaa Asp Ser Xaa Xaa Glu Xaa Arg Xaa Xaa Val 1 5 10 <210> 50 <211> 203 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha subunit amino acids according to the present invention <220> <221> misc_feature <222> (8)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (88)..(91) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (93)..(101) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (103)..(103) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (153)..(154) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (157)..(158) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (160)..(160) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (162)..(163) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 50 Met Ser Glu His Val Asn Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Lys 1 5 10 15 Ala Xaa Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val 100 105 110 Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp 130 135 140 Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Xaa Xaa Asp Ser Xaa Xaa Glu Xaa 145 150 155 160 Arg Xaa Xaa Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser 165 170 175 Glu Glu Glu Leu Thr Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val 180 185 190 Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val 195 200 <210> 51 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NH-F primer <400> 51 gaagtgatcg tatgagtgaa gacacactca ctg 33 <210> 52 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NH-R primer <400> 52 gtggatacca tccatttcct cattcctttc atc 33 <210> 53 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a88T-F primer <400> 53 ccaaattacc gcggtcttca acgactc 27 <210> 54 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a88T-R primer <400> 54 gaccgcggta atttggtgtg cctgctc 27 <210> 55 <211> 6 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa stands for Ser or Thr <400> 55 Cys Xaa Leu Cys Ser Cys 1 5

Claims (13)

1. i) α 서브유닛에 있어서, 하기 서열 번호 46 내지 49로 표시되는 적어도 1개의 아미노산 서열을 포함하면서 서열 번호 48 또는 49을 포함할 경우, 둘 중 하나만 포함하거나,
   (a) 서열 번호 46: X₁X₂X₃X₄X₅X₆RX₇KAX₈E
   (단, R은 아르기닌, K는 리신, A는 알라닌, E는 글루탐산, X₁은 글리신 또는 발린이고, X₂는 T(트레오닌), X₃는 E(글루탐산), X₄는 Y(티로신), X₅는 E(글루탐산), X₆은 A(알라닌), X₇은 T(트레오닌), X₈은 I(이소류신) 을 나타냄);
   (b) 서열 번호 47: X₉X₁₀X₁₁X₁₂NX₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁CX₂₂LC
   (단, N은 아스파라긴, V는 발린, C는 시스테인, T는 트레오닌, L은 류신, X₉는 발린 또는 트레오닌이고, X₁₀은 A(알라닌), X₁₁은 V(발린), X₁₂는 F(페닐알라닌), X₁₃은 D(아스파라긴산), X₁₄는 S(세린), X₁₅는 Q(글루타민), X₁₆은 T(트레오닌), X₁₇은 H(히스티딘), X₁₈은 H(히스티딘), X₁₉는 V(발린), X₂₀은 V(발린), X₂₁은 발린, X₂₂는 트레오닌을 나타냄);
   (c) 서열 번호 48: X₂₃WDSX₂₅X₂₆EX₂₇RX₂₈X₂₉V
   (단, W는 트립토판, D는 아스파라긴산, S는 세린, E는 글루탐산, R은 아르기닌, V는 발린, X₂₃은 이소류신, 류신, 메티오닌 및 트레오닌으로 이루어지는 군에서 선택되고, X₂₅는 S(세린), X₂₆은 S(세린), X₂₇은 I(이소류신), X₂₈은 Y(티로신), X₂₉는 I(이소류신)을 나타냄);
   (d) 서열 번호 49: VX₂₄DSX₂₅X₂₆EX₂₇RX₂₈X₂₉V
   (단, V는 발린, D는 아스파라긴산, S는 세린, E는 글루탐산, R은 아르기닌, X₂₄는 류신이고, X₂₅는 S(세린), X₂₆은 S(세린), X₂₇은 I(이소류신), X₂₈은 Y(티로신), X₂₉는 I(이소류신)을 나타냄)
   또는,
   ii) α 서브유닛에 있어서, 하기 서열 번호 49의 배열을 포함하는, 고온 하에서의 아미드 화합물 내성이 야생형 니트릴 히드라타제보다 향상된 개량형 니트릴 히드라타제.
   서열 번호 49: VX₂₄DSX₂₅X₂₆EX₂₇RX₂₈X₂₉V
   (단, V는 발린, D는 아스파라긴산, S는 세린, E는 글루탐산, R은 아르기닌, X₂₄는 L(류신), X₂₅는 S(세린), X₂₆은 S(세린), X₂₇은 S(세린), X₂₈은 F(페닐알라닌), X₂₉는 V(발린)을 나타냄)
2. 제1항에 있어서, α 서브유닛에 있어서, 서열 번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는, 개량형 니트릴 히드라타제.
3. 제1항에 있어서, 서열 번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 개량형 니트릴 히드라타제이며, 하기 (ⅰ) 내지 (ⅳ)로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 변이를 갖는, 상기 개량형 니트릴 히드라타제.
   (ⅰ) X₁이 G(글리신) 또는 V(발린)
   (ⅱ) X₉가 V(발린) 또는 T(트레오닌)
   (ⅲ) X₂₃이 I(이소류신), L(류신), M(메티오닌) 및 T(트레오닌)로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산
   (ⅳ) X₂₄가 L(류신)
4. 제3항에 있어서, X₂가 T(트레오닌), X₃이 E(글루탐산), X₄가 Y(티로신), X₅가 E(글루탐산), X₆이 A(알라닌), X₇이 T(트레오닌), X₈이 I(이소류신), X₁₀이 A(알라닌), X₁₁이 V(발린), X₁₂가 F(페닐알라닌), X₁₃이 D(아스파라긴산), X₁₄가 S(세린), X₁₅가 Q(글루타민), X₁₆이 T(트레오닌), X₁₇이 H(히스티딘), X₁₈이 H(히스티딘), X₁₉가 V(발린), X₂₀이 V(발린), X₂₅가 S(세린), X₂₆이 S(세린), X₂₇이 I(이소류신), X₂₈이 Y(티로신), X₂₉가 I(이소류신)인, 개량형 니트릴 히드라타제.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 니트릴 히드라타제가 로도코커스속 세균 또는 노카르디아속 세균 유래인, 개량형 니트릴 히드라타제.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
7. 제6항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
8. 제7항에 기재된 재조합 벡터를 포함하는 형질 전환체.
9. 제8항에 기재된 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터 니트릴 히드라타제를 채취하는, 니트릴 히드라타제의 제조 방법.
10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제, 또는 상기 개량형 니트릴 히드라타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물 혹은 당해 배양물의 처리물을 니트릴 화합물에 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 아미드 화합물의 제조 방법.
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