CN102604921B

CN102604921B - 改良型腈水合酶

Info

Publication number: CN102604921B
Application number: CN201210081580.2A
Authority: CN
Inventors: 渡边文昭; 氏原大; 酒井美纪; 汤不二夫; 中村哲二
Original assignee: Dia Nitrix Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp; Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 2004-05-26
Filing date: 2005-05-26
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2025-05-26
Also published as: CN103146670A; EP1767624B1; KR20070056006A; AU2005248259A1; CN103146670B; CN1961072A; CN1961072B; KR101265508B1; JPWO2005116206A1; CN102604921A; US7803578B2; US20070231868A1; JP4922757B2; US7645605B2; US20090162894A1; WO2005116206A1; AU2005248259B2; EP1767624A4; EP1767624A1; EP1767624A8

Abstract

本发明提供具有改良型腈水合酶活性的蛋白质，该蛋白质通过改变腈水合酶的氨基酸序列得到，与野生型腈水合酶活性相比耐热性提高；本发明还提供编码该蛋白质的基因DNA，具有该基因DNA的重组载体，具有该重组载体的转化体或转导体，提取自该转化体或转导体培养物的腈水合酶及其制备方法，以及酰胺化合物的制备方法。

Description

改良型腈水合酶

本申请为下述申请的分案申请。

发明名称：改良型腈水合酶

申请日：2005年5月26日

申请号：200580016665.0(PCT/JP2005/010107)

技术领域

本发明涉及具有耐热性提高或底物特异性改变的改良型腈水合酶活性的蛋白质；编码该蛋白质的基因DNA；具有该基因DNA的重组载体；具有该重组载体的转化体或转导体；提取自该转化体或转导体培养物的腈水合酶及其制备方法；以及使用了该培养物或该处理物的酰胺化合物的制备方法。

背景技术

近年来，人们发现了具有腈水合活性的酶——腈水合酶，该酶可通过水合作用将腈基转换为酰胺基，并且公开了利用该酶或具有该酶的微生物菌体以腈化合物制备对应的酰胺化合物的方法。与以往的化学合成方法相比，这种制备方法因具有高度的由腈化合物转化成对应的酰胺化合物的转化率和选择率而为人所知。

生产腈水合酶的微生物，可列举例如属于棒杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、根瘤菌属(Rhizobium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假诺卡氏属(Pseudonocardia)等的微生物。其中玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodochrous)J-1株已用于丙烯酰胺的工业生产，其有效性已被证实。另外，编码生产该菌株的腈水合酶的基因也已查明(请参考专利文献1)。从降低反应时酶的用量和降低成本的观点出发，期待能获取耐热性进一步提高的酶。

另一方面，不仅是利用从自然界存在的微生物离析得到的腈水合酶或其基因，出于改变腈水合酶的活性、底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性等目的，人们尝试对腈水合酶引入突变。(参考专利文献2和3)

专利文献1：特许第3162091号公报

专利文献2：国际公开2004/056990号手册(pamphlet)

专利文献3：特开2004-222538号公报

发明内容

腈水合酶是已用于丙烯酰胺工业生产的酶，但获取耐热性等性质较目前所使用的酶进一步提高的酶可降低酶反应时的成本。

因此，本发明的目的在于进一步改良腈水合酶，提供耐热性更为提高的具有腈水合酶活性的蛋白质，编码该蛋白质的基因DNA，具有该基因DNA的重组载体，具有该重组载体的转化体或转导体，提取自该转化体或转导体培养物的腈水合酶及其制备方法以及使用了该培养物或处理物的酰胺化合物的制备方法。

另外，玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J-1株的腈水合酶虽然已用于以丙烯腈为原料的丙烯酰胺的工业生产，但对于芳香腈反应活性低，在期待开发出对于芳香腈反应活性高的酶的同时，从降低催化剂成本的观点出发，也期待开发出热稳定、不易失活的酶。因此，本发明以改良腈水合酶获得耐热性提高的酶以及/或者获得对芳香腈反应活性提高的酶为目的。

本发明人为解决上述课题经过深入研究，发现在来源于玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodochrous)J-1株的腈水合酶的氨基酸序列中，通过将其中至少一个以上的氨基酸残基用选自天然氨基酸组的残基取代，该酶耐热性得以提高以及/或者对芳香腈的反应活性得以提高，从而完成了本发明。即，本发明如下所述：

(1)以下(a)的蛋白质：

(a)由下述氨基酸序列组成并且具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质，所述氨基酸序列指野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列上，第42位天冬酰胺残基、第80位丙氨酸残基、第118位丙氨酸残基及第132位天冬氨酸残基中至少有一个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列，所述野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如SED ID NO：4所示；

(2)以下(a)、(b)的蛋白质：

(a)由下述氨基酸序列组成并且具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质，所述氨基酸序列指野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列上第167位天冬酰胺残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列上，第144位亮氨酸残基或第219位缬氨酸残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列，所述野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列如SED ID NO：2所示；

(b)由下述氨基酸序列组成并且具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质，所述氨基酸序列指野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列上第167位天冬酰胺残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列以及野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列上第129位缬氨酸残基或第196位亮氨酸残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列，所述野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列如SED ID NO：2所示，所述野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如SED IDNO：4所示；

(3)一种基因DNA，该基因DNA编码如权利要求1-2中任一项所述的蛋白质。

(4)以下(a)的基因DNA：

(a)由下述碱基序列组成并且编码具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质的基因DNA，所述碱基序列指编码野生型腈水合酶的α亚基的基因的碱基序列上，第124～126位、第238～240位、第352～354位及第394～396位的碱基中至少有一个被其他不同的碱基取代的碱基序列，所述编码野生型腈水合酶的α亚基的基因的碱基序列如SED ID NO：3所示；

(5)以下(a)、(b)的基因DNA：

(a)由下述碱基序列组成并且编码具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质的基因DNA，所述碱基序列指编码野生型腈水合酶的β亚基的基因的碱基序列上第499～501位碱基中至少有一个被其他不同的碱基取代的碱基序列上，第430～432位及第655～657位的碱基中至少有一个碱基被其他不同的碱基取代的碱基序列，所述编码野生型腈水合酶的β亚基的基因的碱基序列如SED ID NO：1所示；

(b)由下述碱基序列组成并且编码具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质的基因DNA，所述碱基序列指编码野生型腈水合酶的β亚基的基因的碱基序列上第499～501位碱基以及编码野生型腈水合酶的α亚基的基因的碱基序列上第385～387位以及第586～588位的碱基中至少有一个碱基被其他不同的碱基取代的碱基序列，所述编码野生型腈水合酶的β亚基的基因的碱基序列如SED ID NO：1所示，所述编码野生型腈水合酶的α亚基的基因的碱基序列如SED ID NO：3所示；

(6)一种重组载体，该重组载体含有如权利要求3-5中任一项所述的基因DNA。

(7)一种转化体或转导体，该转化体或转导体含有如权利要求6所述的重组载体。

(8)一种制备腈水合酶的方法，该方法培养如权利要求7所述的转化体或转导体，从所得培养物提取腈水合酶。

(9)一种制备酰胺化合物的方法，该方法培养如权利要求7所述的转化体，使所得的培养物或处理物与腈基化合物接触，提取通过该接触生成的酰胺化合物。

本发明提供与野生型腈水合酶相比耐热性提高以及/或者对于芳香腈反应活性提高的突变型腈水合酶以及编码该酶的基因。本发明进一步提供具有上述突变型腈水合酶基因的重组DNA，具有该重组DNA的转化(转导)体，使用该转化(转导)体制备酰胺化合物的方法。

通过本发明，可以高效制备丙烯酰胺。

附图说明

图1为质粒pJH601的组成图。

图2为质粒p3R的组成图。

图3为质粒pMH301的组成图。

图4为质粒p52的组成图。

图5A为质粒pCF002的组成图。

图5B为质粒pFY529的组成图。

具体实施方式

以下详细说明本发明。本说明书中所引用的文献、公开公报、国际公开公报等其他专利公报作为参照并入本说明书。

<腈水合酶>

本发明通过使野生型腈水合酶的氨基酸序列部分突变，提供与野生型腈水合酶相比耐热性和/或底物特异性提高的改良型腈水合酶。

“腈水合酶”是催化腈化合物转化为对应酰胺化合物的水合反应(RCN+H₂O→RCONH₂)的酶。另外，“腈水合酶”的结构是由α亚基与β亚基聚合形成的高级结构。“野生型腈水合酶”指具有来源于作为酶源的微生物的野生株(亲株)的氨基酸序列的腈水合酶以及来源于野生株(亲株)的基因序列编码所得的腈水合酶。“野生型β亚基”或“野生型α亚基”指具有来源于野生株(亲株)的氨基酸序列的β亚基或α亚基以及来源于野生株(亲株)的基因序列编码所得的β亚基或α亚基。

“野生型腈水合酶”可列举来源于各种微生物野生型的腈水合酶。微生物不仅限于具有编码腈水合酶的基因的微生物。优选具有来源于红球菌属微生物的氨基酸序列的腈水合酶以及来源于红球菌属微生物的基因序列编码所得的腈水合酶，所述红球菌属微生物例如可列举玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J-1(FERM BP-1478)、玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)M8(SU1731814)、玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)M33(VKM Ac-1515D)或玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC39484(特开平2001-292772)等。或者是来源于史密氏杆菌(Bacillus smithii)(特开平09-248188)的腈水合酶亦可。特别优选的是具有来源于玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J-1或玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)M8的氨基酸序列的腈水合酶以及来源于这两株的基因序列编码所得的腈水合酶。另外，玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)M33(VKM Ac-1515D)菌是由M8(SU1731814)菌通过自然突变产生的作为腈水合酶表达株而被筛选出的菌株。该菌株的腈水合酶本身的氨基酸序列和基因序列没有突变(美国专利第5827699号)。

在此，耐热性提高指来源于突变株的加热处理后的酶的残留活性比来源于亲株的经相同处理的酶的残留活性高10％以上。“残留活性”指用经加热处理后的菌体进行活性测定时酰胺化合物的生成量与用等量未经处理的菌体进行活性测定时酰胺化合物的生成量的比值。作为加热处理方法可将培养液和收集、洗净的培养菌体置于容器中，将此容器置于水浴或培养箱等加热装置中保温一定时间即可。此时，为提高酶稳定性也可添加腈化合物或酰胺化合物后进行加热处理。加热处理的条件应适当研究处理温度与处理时间，优选设定使亲株活性降低至50％以下的条件。具体而言指在50℃至70℃的范围内进行5分钟至30分钟的处理。未处理菌体使用4℃下冷藏的培养液和收集、洗净的培养菌体。活性测定使用加热处理或未处理的菌体，使底物腈化合物与该菌体接触，转化为对应的酰胺化合物后定量该酰胺化合物。底物可使用可与腈水合酶发生反应的任何腈化合物，优选丙烯腈。反应条件例如在底物浓度为2.5％、反应温度为10℃至30℃、反应时间为10分钟至30分钟的范围内进行。添加磷酸使酶反应终止，利用HPLC和气相色谱分析生成的丙烯酰胺。

本发明的改良型腈水合酶，例如，可通过改变来源于玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodochrous)J-1株的腈水合酶的氨基酸序列，筛选与亲株腈水合酶活性相比耐热性提高的改良型腈水合酶而得到。上述改变方法可以采用使羟胺或亚硝酸等作为变异源的药物与J1菌接触或作用的方法、紫外线照射突变诱导法、在编码来源于J1菌的腈水合酶的基因(以下称为：腈水合酶基因)中用PCR引入随机突变的方法等。

本发明中，发现了野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列(例如序列编号2)中第167位天冬酰胺被丝氨酸取代的改良型腈水合酶。本发明不仅筛选出上述这种改良型腈水合酶，还筛选出耐热性进一步提高的改良型腈水合酶。该筛选方法是通过筛选符合上述“耐热性”定义的突变体(突变基因)进行的。

由此得到的酶，是具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列指腈水合酶的β亚基的氨基酸序列(例如序列编号2)上，第24位苯丙氨酸残基、第88位异亮氨酸残基、第92位谷氨酸残基、第93位谷氨酸残基、第96位组氨酸残基、第103位谷氨酸残基、第167位天冬酰胺残基及第225位酪氨酸残基中至少有一个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列。

还包括具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列指腈水合酶的α亚基的氨基酸序列(例如序列编号4)上，第42位天冬酰胺残基、第80位丙氨酸残基、第118位丙氨酸残基及第132位天冬氨酸残基中至少有一个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列。

本发明进一步包括具有下述氨基酸序列并且具有腈水合酶活性的蛋白质，所述氨基酸序列指野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列(序列编号2)上第167位天冬酰胺残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列中，β亚基的氨基酸序列的第144位亮氨酸残基、第219位缬氨酸残基以及α亚基的氨基酸序列(序列编号4)上第129位缬氨酸残基及第196位亮氨酸残基中至少有一个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列。

上述的复合突变体可通过任意方法制备，例如，可通过一条合成的核苷酸链进行特定位置的取代的方法或将多个含有不同单突变的DNA片断利用限制性内切酶切割再重新连接的方法制备。

只要不破坏耐热性，允许在上述突变基础上出现1个或多个(例如1个或者数个)氨基酸的取代、缺失以及/或者增加。例如，野生型腈水合酶β亚基的氨基酸序列(例如序列编号2)中或野生型腈水合酶α亚基的氨基酸序列(例如序列编号4)中的1～2个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代是允许的，或者，编码野生型腈水合酶β亚基的基因(例如序列编号3)或编码野生型腈水合酶α亚基的基因(例如序列编号3)所示的碱基序列编码所得的氨基酸序列中1～2个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代也是允许的。

以下，说明优选的氨基酸突变形态。本发明中，为叙述方便，可以使用氨基酸的单字母字符号及α或β亚基的氨基酸序列的氨基酸编号说明突变的形态。例如，Fβ24L这一标记表示β亚基(例如序列编号2)的氨基酸序列中的第24位氨基酸由苯丙氨酸被取代为亮氨酸。又如，Nβ167S这一标记表示β亚基(例如序列编号2)的氨基酸序列中的第167位氨基酸由天冬酰胺被取代为色氨酸。

<突变与取代的形态(1)>

此形态为使腈水合酶的α或β亚基的至少一个的氨基酸残基突变。

单突变

1.Fβ24L

2.Iβ88F

3.Eβ92K

4.Eβ93G

5.Hβ96R

6.Eβ103D

7.Nβ167S

8.Yβ225H

9.Nα42D

10.Aα80T

11.Aα118V

12.Dα132N

复合突变

1.Eβ93G，Eβ103D

2.Eβ93G，Dα132N

3.Hβ96R，Nα42D

4.Eβ92K，Aα80T

产生上述的氨基酸取代时的碱基取代如下所述。应予说明，编码β亚基、α亚基的基因DNA，分别以序列编号1、序列编号3所示的序列为例予以说明。

单突变1：序列编号1中，第70～72位的碱基序列“TTC”被取代为CTT、CTC、CTA或CTG。特别优选第70位的T被取代为C(TTC→CTC)。

单突变2：序列编号1所示的碱基序列中，第262～264位的碱基序列“ATC”被取代为TTT或TTC。特别优选第262位的A被取代为T(ATC→TTC)。

单突变3：序列编号1所示的碱基序列中，第274～276位的碱基序列“GAA”被取代为AAA或AAG。特别优选第274位的G被取代为A(GAA→AAA)。

单突变4：序列编号1所示的碱基序列中，第277～279位的碱基序列“GAG”被取代为GGG、GGC、GGA或GGT。特别优选第278位的A被取代为G(GAG→GGG)。

单突变5：序列编号1所示的碱基序列中，第286～288位的碱基序列“CAC”被取代为CGC、CGG、CGA或CGT。特别优选第287位的A被取代为G(CAC→CGC)。

单突变6：序列编号1所示的碱基序列中，第307～309位的碱基序列“GAG”被取代为GAC或GAT。特别优选第309位的G被取代为T(GAG→GAT)。

单突变7：序列编号1所示的碱基序列中，第499～501位的碱基序列“AAC”被取代为AGC或AGT。特别优选第500位的被A取代为G(AAC→AGC)。

单突变8：序列编号1所示的碱基序列中，第673～675位的碱基序列“TAC”被取代为CAC或CAT。特别优选第673位的T被取代为C(TAC→CAC)。

单突变9：序列编号3所示的碱基序列中，第124～126位的碱基序列“AAC”被取代为GAC或GAT。特别优选第124位的A被取代为G(AAC→GAC)。

单突变10：序列编号3所示的碱基序列中，第238～240位的碱基序列“GCC”被取代为ACC、ACG、ACA或ACT。特别优选第238位的G被取代为A(GCC→ACC)。

单突变11：序列编号3所示的碱基序列中，第352～354位的碱基序列“GCC”被取代为GTC、GTG、GTA或GTT。特别优选第353位的C被取代为T(GCC→GTC)。

单突变12：序列编号3所示的碱基序列中，第394～396位的碱基序列“GAC”被取代为AAC或AAT。特别优选第394位的G被取代为A(GAC→AAC)。

复合变异1～4的碱基序列的取代与单变异的取代相同。

<突变与取代形态(2)>

此形态为使腈水合酶的β亚基的氨基酸序列至少2处发生突变或者β亚基的氨基酸序列至少1处并且α亚基的氨基酸序列至少1处发生突变。

1.Nβ167S，Lβ144H

2.Nβ167S，Vβ219A

3.Nβ167S，Vα129A

4.Nβ167S，Lβ144H，Vβ219A

5.Nβ167S，Lβ144H，Vβ219A，Vα129A，Lα196P

产生上述的氨基酸取代时的碱基取代如下所述

Nβ167S：序列编号1所示的碱基序列中，第499～501位的碱基序列“AAC”被取代为AGC或AGT。特别优选第500位的A被取代为G(AAC→AGC)。

Lβ144H：序列编号1所示的碱基序列中，第430～432位的碱基序列“CTC”被取代为CAC或CAT。特别优选第431位的T被取代为A(CTC→CAC)。

Vβ219A：序列编号1所示的碱基序列中，第655～657位的碱基序列“GTC”被取代为GCT、GCC、GCA或GCG。特别优选第656位的T被取代为C(GTC→GCC)。

Vα129A：序列编号3所示的碱基序列中，第385～387位的碱基序列“GTG”被取代为GCT、GCC、GCA或GCG。特别优选第386位的T被取代为C(GTG→GCG)。

Lα196P：序列编号3所示的碱基序列中，第586～588位的碱基序列“CTC”被取代为CCT、CCC、CCA或CCG。特别优选第587位的T被取代为C(CTC→CCC)。

<突变与取代的形态(3)>

此变异形态是腈水合酶的β亚基的氨基酸序列中至少第26位或第48位氨基酸残基被其他氨基酸取代。

即，本发明提供对于芳香腈反应活性提高以及/或者耐热性提高的腈水合酶。“腈水合酶”是催化腈化合物转化为对应酰胺化合物的水合反应(RCN+2H₂O→RCONH₂)的酶。

在此，“对于芳香腈反应活性提高的腈水合酶”是指对3-氰基吡啶的比活性提高1.5倍以上的酶。

筛选方法为筛选符合上述“突变”定义的突变体(突变基因)。

通过上述方法得到的对于芳香腈反应活性提高的酶是具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列为序列编号2(β亚基)的氨基酸序列上，第48位色氨酸残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列。

耐热性提高的酶是具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列为序列编号2(β亚基)的氨基酸序列上，第26位组氨酸残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列。

序列编号2所示的氨基酸序列(野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列)的第48位色氨酸被精氨酸取代时，不仅具有使腈水合酶耐热性提高的效果，在对丙烯腈(短链脂肪族腈)具有底物特异性的基础上，还使腈水合酶对3-氰基吡啶(芳香腈)的反应活性提高。

以下说明优选的氨基酸突变形态。例如，Wβ48R这一标记表示β亚基(序列编号1)的第48位氨基酸残基由色氨酸被取代为组氨酸。

(1)对于芳香腈反应活性提高的突变

Wβ48R

(2)耐热性提高的突变

Hβ26R

(3)复合突变

Wβ48R，Hβ26R

产生上述的氨基酸取代时的碱基取代如下所述。

Wβ48R：序列编号1中，第142～144位的碱基序列“TGG”被取代为CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG。特别优选第142位的T被取代为C(TGG→CGG)。

Hβ26R：序列编号1中，第76～78位的碱基序列“CAC”被取代为CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG。特别优选第77位的A被取代为G(CAC→CGC)。

<复合突变>

进一步，通过将上述<突变与取代的形态>中(1)～(3)中所记载的多个突变组合起来制备复合突变体的方法，可以制得同时具备两种性质的突变酶。

复合突变体可通过任意方法制备，例如，可通过一条合成的核苷酸链进行特定位置的取代的方法或将多个分别含有单个突变的DNA片断利用限制性内切酶切割再重新连接的方法获得。

只要不破坏突变的性质，允许在上述突变基础上出现氨基酸序列的缺失、被取代、增加等。例如，在上述已实施突变的氨基酸序列上，允许缺失1个或多个(例如1～10个，优选1～5个)氨基酸残基，允许增加1个或多个(例如1～10个，优选1～5个)氨基酸残基，或者，允许1个或多个(如1～10个，优选1～5个)氨基酸残基被其他氨基酸残基所取代。

<引入突变的方法>

上述的引入单个突变或复合突变的腈水合酶基因的制备方法，通过Kunkel法及Gappedduplex法等公知的方法实现，例如使用具有定点突变功能的试剂盒，如QuickChange XLSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司生产)、GeneTailor^TM Site-Directed MutagenesisSystem(Invitrogen公司生产)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：宝生物工程公司生产)来实现突变的引入[Nucleic.Acid.Res.10，6487(1982)；Molecular Cloning 2nd Edt，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]。

在J1以外菌株的腈水合酶中，通过上述的突变位点、突变的氨基酸种类、DNA序列也可引起耐热性的提高。这些菌株包括上述的玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)M8(SU1731814)、玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)M33(VKM Ac-1515D)、玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC39484(特开平2001-292772)、史密氏杆菌(Bacillus smithii)(特开平09-248188)等。

进一步，本发明的基因DNA还包括上述序列编号1或3所示的碱基序列中引入突变所得的碱基序列的互补碱基序列所得的DNA和严谨条件下可杂交的DNA。严格条件指：例如盐(钠)浓度150～900mM，温度55～75℃，优选盐(钠)浓度250～450mM，温度在68℃。

<酰胺化合物耐受性>

本发明的改良型腈水合酶还具有酰胺化合物耐受性的性质。在此，酰胺化合物耐受性指与其他来源于野生株的腈水合酶相比，可以在酰胺化合物存在下保持腈水合酶活性。本发明的突变型腈水合酶所耐受的酰胺化合物并无特别限制，可列举例如用以下化学式所表示的化合物：

R-CONH2

(在此，R为取代或未被取代的烷基、取代或未被取代的烯基、取代或未被取代的环烷基、取代或未被取代的芳香基或者取代或未被取代饱和或不饱和杂环基)等。特别的，优选式中R为CH₂＝CH的丙烯酰胺。

酰胺化合物耐受性，例如，可通过以下方法来评价，即在丙烯酰胺等酰胺化合物(例如30～50％等高浓度)存在下，分析具有本发明改良型腈水合酶的转化体的培养物或从转化体中分离的腈水合酶对丙烯腈等腈化合物底物的消耗量或消耗速度。与来源于母体株的腈水合酶相比，例如，当消耗量或消耗速度超过1.1倍时，可评价为具有酰胺化合物耐受性。

<重组载体及转化(转导)体的制备>

以下说明具有上述腈水合酶基因的载体和转化(转导)体的制备方法。

为使腈水合酶基因能够在被转化或转导的宿主生物中表达，须将其重组入载体。

例如，作为载体可列举质粒DNA、噬菌体DNA、反转座子DNA、人工染色体DNA等。

作为宿主，可使用大肠杆菌、枯草杆菌等细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等。

大肠杆菌作为宿主时，优选使用表达效率高的表达载体，例如具有trc启动子的表达载体pKK233-2(安玛西亚生物科技公司生产)或pTrc99A(安玛西亚生物科技公司生产)等。

载体中除腈水合酶基因外还可连接启动子、终止子、增强子、拼接信号、polyA插入信号、筛选标记、核糖体结合序列(SD序列)等。另外，作为筛选标记可列举例如卡那霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因、氨苄西林抗性基因、新霉素抗性基因等。

以下，说明宿主的种类以及重组载体转化宿主的方法。

细菌作宿主时，大肠杆菌可列举例如大肠杆菌(Escherichia coli)等，红球菌(Rhodococcus)可列举例如玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC12674、玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC17895、玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodochrous)ATCC19140等。这些ATCC菌株从美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)得到。

重组载体转化细菌的方法并无特别限制，只要是将DNA导入细菌的方法即可，可使用例如钙离子法、电穿孔法等。

酵母作宿主时，可使用例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、毕赤酵母(Pichia pastoris)等。重组载体转化酵母的方法并无特别限制，只要是将DNA导入酵母的方法即可，可使用例如电穿孔法、原生质球转染法、醋酸锂法等。

动物细胞作宿主时可使用绿猴COS-7细胞、Vero、CHO细胞、小鼠L细胞、大鼠GH3细胞、人FL细胞等。重组载体转化动物细胞的方法可使用例如电穿孔法、磷酸钙法、脂质转染法等。

昆虫细胞作宿主时可使用Sf9细胞、Sf21细胞等。重组载体转化昆虫细胞的方法可使用例如磷酸钙法、脂质转染法、电穿孔法等。

植物细胞作宿主时可列举烟草BY-2细胞等，但并不仅限于此。重组载体转化植物细胞的方法可使用例如农杆菌介导法、粒子枪法、PEG法、电穿孔法等。

<腈水合酶的制备>

下面说明腈水合酶及其制备方法。

本发明的腈水合酶可通过培养以上述方法制备的具有腈水合酶基因的转化(转导)体，从其培养物提取而得到。

在此，培养物任指培养上清、培养细胞或培养菌体和细胞或菌体的破碎物。

培养本发明的转化(转导)体的方法，可使用以下例举的宿主依常法进行。

培养以大肠杆菌、酵母菌等微生物为宿主的转化体的培养基含有可以资化微生物的碳源、氮源、无机盐类等，只要其可有效培养转化体，可使用任意天然培养基、合成培养基。作为碳源，可列举葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉等碳水化合物，醋酸、丙酸等有机酸，乙醇、丙醇等醇类。作为氮源，除可用氨水、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等无机酸或有机酸铵盐或其他含氮化合物外还可列举蛋白胨、肉糜、玉米浆等。作为无机物，可列举磷酸氢亚钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。培养通常在振荡培养或通气搅拌培养等需氧条件下、30-40℃下进行。pH的调整使用无机或有机酸、碱溶液等。培养中根据需要可在培养基中添加氨苄西林或四环素等抗生素。

培养基中也可添加腈水合酶的补缺金属即钴离子或铁离子，还可添加腈类或酰胺类作为酶诱导剂。

以诱导性启动子作启动子，用表达载体培养转化的微生物时，可根据需要在培养基中添加诱导物。例如，培养用具有可被异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子的表达载体转化的微生物时，可在培养基中添加IPTG。又如，培养用具有可被吲哚乙酸(IAA)诱导的trp启动子的表达载体转化的微生物时，可在培养基中添加IAA。

培养以动物细胞作宿主等到的转化体所用的培养基，可列举常用的RPMI1640培养基、DMEM培养基或在这些培养基中添加胎牛血清的培养基等。培养通常在5％CO₂下，37℃培养1～30天。培养中可根据需要在培养基中添加卡那霉素、青霉素等抗生素。

从培养基中提取腈水合酶的方法可通过反复超声波处理、冷冻溶解后匀浆处理，将菌体或细胞破碎从而提取目标蛋白质。

转化体为植物细胞或植物组织时，培养可使用常用的植物培养用培养基，例如MS基础培养基、LS基础培养基进行。培养方法可采用任意常用的固体培养法或液体培养法。

从培养物中提取腈水合酶的方法是，首先，通过以纤维素酶、蛋白酶等酶进行的细胞溶解处理、超声破碎处理、磨碎处理等破坏细胞。然后，过滤或离心除去不溶物，得到粗蛋白质溶液。从上述粗溶液纯化本发明的蛋白质，通过单独或适当结合使用盐析、各种色谱(例如凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和色谱)、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法进行。

另外，在菌体外或细胞外生产本发明的蛋白质时，使用培养液本身或通过离心除去菌体或细胞。然后，通过单独或适当结合使用常用的蛋白质分离纯化生物化学方法，例如硫酸铵沉淀、凝胶色谱、离子交换色谱、亲和色谱等，可从上述培养物中分离纯化本发明的蛋白质。

另外，本发明中，也可以利用编码本发明的腈水合酶的基因DNA或上述载体，通过完全不使用生物细胞的无细胞蛋白质合成体系合成并提取目标蛋白质。

无细胞蛋白质合成体系是使用细胞提取液在试管等人工容器内合成蛋白质的体系，例如读取mRNA的信息，在核糖体上合成蛋白质的体系。应予说明，本发明所使用无细胞蛋白质合成体系也包含以DNA为模版合成RNA的无细胞转录体系。

上述细胞提取液，可使用来源于真核细胞或来源于原核细胞的提取液，例如，小麦胚芽、兔网状红血球、小鼠L-细胞、HeLa细胞、CHO细胞、出芽酵母、大肠杆菌等的萃取液。应予说明，这些提取液可以经过浓缩或不经浓缩。

在此，DNA上密码化的遗传信息通过转录转化为mRNA，进而翻译转化为蛋白质。为在人工容器内再现这一过程合成蛋白质，需要核糖体、tRNA、各种蛋白质因子等，还需要构建可稳定翻译酶系并根据目的生产mRNA的系统。细胞提取液，例如可通过超滤、透析、聚乙二醇(PEG)沉淀等得到。

本发明的无细胞蛋白质合成也可使用市售试剂盒进行。所述试剂盒可列举例如PROTEIOS^TM(东洋纺织)，TNT^TM System(Promega普洛麦格)、PG-Mate^TM合成装置(东洋纺织)、RTS(Roche Diagnostics罗氏诊断)等。

通过无细胞蛋白质合成得到的突变型腈水合酶可以选择适当的色谱纯化。另外，突变型腈水合酶的纯化可用SDS-PAGE等确认，活性测定可以通过测定腈化合物转化为酰胺化合物的转化率来进行。

<酰胺化合物的制备>

下面，说明利用转化(转导)体制备酰胺化合物的方法。

上述培养法得到的培养物、酶等作为将腈化合物转化为对应酰胺化合物时的生物催化剂所使用。作为转换反应的底物使用的腈化合物，可根据生物催化剂的底物特异性适当选择。例如，来源于玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J-1株的腈水合酶适合的底物为丙烯腈。

生物催化剂的使用形态、反应方式可根据生物催化剂的种类适当选择。例如，作为生物催化剂的使用形态，既可以使用上述培养物、纯化酶本身，也可以将它们固定于合适的载体上作为固定酶使用。

实施例

下面通过实施例对本发明进行更加详细地说明，但本发明并不限于以下实施例。另外应予说明，玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J-1株，以FERM BP-1478为编号保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1丁目1番地-1中央第6)(原保藏日：1987年9月18日)。

[实施例1]改良型腈水合酶基因的获得(I)

(1)染色体DNA的制备

玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J-1株接种于100ml MYK培养基(0.5％多聚蛋白胨、0.3％酵母提取物、0.3％麦芽提取物、1％葡萄糖、0.2％K₂HPO₄、0.2％KH₂PO₄、pH7.0)中，30℃振荡培养72小时。

培养后，收集菌体，将收集的菌体悬浮于4ml Saline-EDTA溶液(0.1M EDTA、0.15MNaCl(pH8.0))中。混悬液中加入8mg溶菌酶，在37℃下振荡1～2小时后，在-20℃下冷冻。

接着，边平稳振荡边加入10ml的Tris-SDS溶液(1％SDS、0.1M NaCl、0.1M Tris-HCl(pH9.0))，之后再加入蛋白酶K(Merck公司)(最终浓度0.1mg)，37℃振荡1小时。

接着，加入等量的用TE饱和的苯酚溶液并搅拌(TE：10mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH8.0))，离心，取上层溶液，加入2倍量的乙醇后，用玻璃棒卷取DNA。以90％、80％、70％的乙醇依次脱除苯酚。

接着，将DNA溶解于3ml的TE缓冲液中，加入核糖核酸酶A溶液(已经100℃15分钟加热处理)至最终浓度10μg/ml，并在37℃下振荡30分钟。然后，加入蛋白酶K，在37℃下振荡30分钟后，加入等量的用TE饱和的苯酚溶液，离心使上层溶液与下层溶液分离。

同样的操作对上层溶液重复两次之后，加入等量的氯仿(含4％异戊醇)，重复同样的提取操作(以下该操作称为苯酚处理)。之后取上层溶液加入2倍量的乙醇，用玻璃棒卷取回收DNA，得到染色体DNA样品。

(2)质粒的构建

首先，为了用作耐热性评价的对照，利用通常的PCR方法对野生型的腈水合酶基因进行扩增。

PCR反应以下面记载的反应液组成、反应条件进行。

应予说明，引物JH1-02(序列编号5)及引物NH-17(序列编号6)各自的序列上已预先引入了限制性内切酶NcoI和限制性内切酶HindIII的识别位点，扩增的DNA产物在两种限制性内切酶的切割下，可轻松地插入后述表达载体pTrc99A的NcoI部位-HindIII部位之间。

<反应液组成>

<引物>

JH1-02：GGAATGAGGCCATGGATGGTATCC(序列编号5)

NH-17：GCGTAAGCTTCCGCGAGATCAGTATCCACCG(序列编号6)

PCR使用Thermalcycler personal(宝酒造)，以94℃30秒、65℃30秒、72℃3分钟为一个循环，进行30个循环。

PCR结束后，取反应液5μl进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，分析确认存在3kb扩增片断。最终反应液利用GFX column(安玛西亚生物科技公司)纯化，以限制性内切酶NcoI和HindIII切割。将用限制性内切酶处理过的PCR的产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，回收3kb附近的条带。回收的PCR产物，利用Ligation试剂盒(宝酒造)与载体(pTrc99A的NcoI-HindIII部位)连接，转化JM109。从所得的转化体菌落中选取数个克隆接种于1.5mlLB-Amp培养基中，37℃振荡培养12小时。培养后，通过离心分离收集菌体之后，利用Flexi Prep(安玛西亚生物科技公司生产)，提取质粒DNA。所得的质粒DNA用限制性内切酶NcoI和HindIII切割后，进行0.7％琼脂糖凝胶电泳检验后，筛选腈水合酶基因片断(3kb)正确连接的克隆命名为pJH601(图1)。利用pJH601转化JM109(JM109/pJH601)。

应予说明，质粒pJH601是用来表达野生型腈水合酶的质粒，以FERM ABP-10314为领取编号保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)(原保藏日：2002年12月26日)。

(3)突变基因文库构建

以上述工序(2)制得的质粒pJH601为基础，对野生型腈水合酶的基因引入随机突变。突变引入是利用PCR过程中的核苷酸的错误掺入所造成的碱基取代实现的。PCR反应以下面记载的反应液组成、反应条件进行。

<反应液组成>

<引物>

TRC-02：GGAATTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGC(序列编号7)

TRC-03：GGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCC(序列编号8)

PCR结束后，取反应液5μl进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，分析确认存在3kb扩增片断。最终反应液利用GFX column(安玛西亚生物科技)纯化，利用限制性内切酶NcoI以及HindIII切割。将用限制性内切酶处理过的PCR的产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，回收3kb附近的条带。回收的PCR产物，利用Ligation试剂盒(宝酒造)与载体(pTrc99A的NcoI-HindIII部位)连接，利用此连接产物转化JM109。

(4)耐热性腈水合酶的筛选及突变位点的确定

将上述工序(3)制得的含有突变的腈水合酶基因的JM109转化体以及JM109/pJH601，分别接种到每孔含1ml LB-Amp培养基(含1mM IPTG、5μg/ml CoCl₂)的96孔板中，37℃下液体培养12小时。所得的培养物，在55℃温度下，热处理30分钟，测定残留的腈水合酶活性。

活性测定用以下方法，取含5％丙烯腈的50mM pH7.7磷酸缓冲液，加入等量的菌体混悬液，30℃下反应30分钟。加入等量的0.1M磷酸终止反应，离心去除菌体，上清液用HPLC检测，分析生成的丙烯酰胺的浓度(WAKOSIL 5C8(和光纯药)，含5mM磷酸的10％的乙腈，流动相流速1ml/min，紫外检测波长260nm)。作为对照以未经热处理在4℃下冷藏的菌体作为各未处理菌体而求得残留活性。

对数千株的转化体进行筛选，结果得到16株比野生型酶残留活性高的菌株。接着，对这些菌株进行培养，回收质粒，并进行碱基测序。碱基测序使用BeckmanCEQ-2000XL。结果见表1。

表1

质粒名	残留活性(％)	突变位点
			pJH601(亲株)	40	无
p47	51	Fβ24L
			p31	89	Iβ88F
p70	87	Eβ92K
			p3	85	Eβ93G
p74	80	Hβ96R
			p76	69	Eβ103D
p52	70	Nβ167S
			p40	68	Yβ225H
p79	66	Nα42D
			p81	71	Aα80T
p32	63	Aα118V
			p84	64	Dα132N
p43	89	(Eβ93G，Eβ103D)
			p49	85	(Eβ93G，Dα132N)
p2	80	(Hβ96R，Nα42D)
			p23	75	(Eβ92K，Aα80T)

[实施例2]改良型腈水合酶的性质

利用实施例1制得的质粒p3再次转化JM109(JM109/p3)，所得菌落用LB培养基(含氨苄西林、IPTG、钴)37℃培养一晚。离心分离回收菌体，用50mM的磷酸缓冲液清洗两次并制成菌体混悬液。

取上述的菌体混悬液0.5ml置于试管中，在50℃～60℃的各水浴中保温5～20分钟，之后用冰冷却。

菌体活性测定采用实施例1(4)方法进行。

以JM109/pJH601作为对照，以未经热处理在4℃下冷藏的菌体作为各未处理菌体而求得残留活性。结果见表2。

表2

	无处理	50℃，20分钟	55℃，20分钟	60℃，5分钟
					JM109/pJH601	100	54	9	6
JM109/p3	100	80	97	105

野生型酶在60℃、5分钟的热处理后残留活性为6％，与之相比，改良型酶大致保持100％的残留活性，由此确认改良型酶的耐热性提高。

[实施例3]红球菌重组体的制备

以红球菌的重组体确定实施例1所得的改良型酶的性质。

(1)用于转化红球菌的质粒的构建

用以下方法构建用于转化红球菌的具有p3突变(Eβ93G)的质粒。突变引入采用定点突变引入法，使用市售试剂盒：QuickChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司生产)。实验操作遵循试剂盒说明。使用pSJ034作为引入突变的模版质粒。pSJ034是在红球菌中可以表达腈水合酶的质粒，pSJ034根据特开平10-337185号公报所示方法由pSJ023制得。应予说明，pSJ023以转化体「R.rhodochrous ATCC12674/pSJ023」的形式保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1-1-1中央第6)编号FERM BP-6232(原保藏日：1997年3月4日)。

为引入突变，合成2种引物。突变引入的位置以下划线标示。

NHM-F：gatcatcaccgaagaagggcgaaagcaccgtgtgc (序列编号9)

NHM-R：gcacacggtgctttcgcccttcttcggtgatgatc (序列编号10)

以引入突变为目的的PCR使用GeneAmp9700(PEbioscience公司生产)，以下述的条件进行反应：95℃1分钟、(95℃50秒、60℃50秒、68℃20分钟)×18个循环，68℃20分钟。

<反应液组成>

PCR结束后，取反应液10μl进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，分析确认存在约11kb扩增片断。确认存在扩增片断后，将1μl DpnI(试剂盒附带)加入PCR反应液，37℃反应1小时，除去模版DNA。

接着，利用XL10-GOLD ultracompetent cell(试剂盒附带)进行转化。将2μl经DpnI处理过的PCR反应液与45μl感受态细胞混合，4℃下保温30分钟，42℃迅速加热30秒后，加入0.5ml NZY+培养基(1％NZ胺、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、12.5mM MgCl₂、12.5mMMgSO₄、0.4％葡萄糖、pH7.5)，继续在37℃培养1小时。取培养液250μl涂布于LB平板培养基(1％NaCl、1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、2％琼脂、50mg/L氨苄西林)上，37℃平板培养1天。

将得到的数个菌落用1.5ml LB培养基(50mg/L氨苄西林)培养，使用FlexiPrep试剂盒(安玛西亚生物科技公司生产)制备质粒。最后，测定所得质粒的碱基序列，以确认目标突变被引入。由此得到引入Eβ93G突变的质粒：p3R(图2)。

(2)引入突变酶基因的重组红球菌(转化体)的获得

将处于对数增殖期的玫瑰色红球菌ATCC 12674菌株细胞离心分离收集菌体，用冰冷的灭菌水清洗3次，并使菌体混悬于灭菌水。取(1)中制备的质粒p3R 1μl与10μl菌体混悬液混合，冰水浴冷却。将DNA和菌体的混悬液置于电转杯(cuvette)中，利用电转化仪Gene Pulser(BIO RAD)，进行2.0KV、200 OHMS电击处理。将电击处理的液体于冰水浴中静置10分钟，37℃迅速加热10分钟，加入500μl MYK培养基(0.5％多聚蛋白胨、0.3％酵母提取物、0.3％麦芽提取物、0.2％K₂HPO₄、0.2％KH₂PO₄)，30℃静置5小时。之后，将培养液涂布于含有50μg/ml卡那霉素的MYK琼脂培养基，30℃培养3天。将以上方法得到的红球菌属重组细菌(ATCC 12674/p3R)接种于10ml MYK培养基(含有50μg/ml卡那霉素)，30℃预培养72小时。放大培养采用100ml MYK培养基(含有50μg/ml卡那霉素、5μg/ml CoCl₂、0.1％尿素)，取预培养液1％接种，30℃培养96小时。离心分离收集菌体，用100mM磷酸缓冲液(pH8.0)清洗菌体，最后用少量缓冲液将菌体混悬。

(3)红球菌重组体耐热性确证

利用制得的红球菌重组体进行耐热性考察。制备含有野生型腈水合酶的ATCC12674/pSJ034作为对照。

取上述得到的菌体混悬液0.5ml置于试管中，置于65℃、70℃各温度的水浴中保温10分钟，之后用冰水浴冷却。作为对照以未经热处理在4℃下冷藏的菌体作为各未处理菌体而求得残留活性。结果见表3。

活性测定方法除使反应在10℃下进行10分钟中的条件之外，其余操作同实施例1(4)。结果见表3。

表3

	无处理	65℃，10分钟	70℃，10分钟
				ATCC12674/pSJ034	100	50	4
ATCC 12674/p3R	100	80	46

ATCC12674/pSJ034在70℃经10分钟热处理后残留活性仅为4％，与之相比，ATCC12674/p3R保持46％残留活性，由此确认改良型酶的耐热性提高。

[实施例4]定点随机突变

在特定的突变位点上引入随机突变。

(1)定点随机突变的引入

使用实施例3中引入定点突变所使用的试剂盒，对pJH601引入随机突变。

选定β亚基的氨基酸序列中第93位为引入突变的位置，为引入突变合成了2种引物。下划线的位置为引入突变的位置。

β93RM-F：caagatcatcaccgaagaaNNScgaaagcaccgtgtgcaag (序列编号11)

β93RM-R：cttgcacacggtgctttcgSNNttcttcggtgatgatcttg (序列编号12)

N：A+T+G+C S：G+C

PCR使用GeneAmp9700(PEbioscience公司生产)，以下述的条件进行：95℃1分钟、(95℃50秒、60℃50秒、68℃14分钟)×18个循环，68℃7分钟。

<反应液组成>

PCR结束后，取反应液10μl进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，分析确认存在约6kb扩增片断。确认存在扩增片断后，将1μl DpnI(试剂盒附带)加入PCR反应液，37℃反应1小时，除去模版DNA。接着，利用XL10-GOLD ultracompetent cell(试剂盒附带)进行转化。将2μl经DpnI处理过的PCR反应液与45μl感受态细胞混合，4℃下保温30分钟，42℃迅速加热30秒之后，加入0.5ml NZY+培养基(1％NZ胺、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、12.5mM MgCl₂、12.5mM MgSO₄、0.4％葡萄糖、pH7.5)，继续在37℃培养1小时。取培养液250μl涂布于LB平板培养基(1％NaCl、1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、2％琼脂、50mg/L氨苄西林)上37℃平板培养1天。

(2)引入定点随机突变的菌株的评价

将上述工序(1)制得的各菌落以及XL10/pJH601，分别接种到每孔含1ml LB-Amp培养基(含1mM IPTG、5μg/ml CoCl₂)的96孔板中，37℃下液体培养12小时。所得的培养物，在55℃温度下，热处理30分钟，测定残留的腈水合酶活性。

活性测定以与实施例1(4)同样的方法进行。作为对照以未经热处理在4℃下冷藏的菌体作为各未处理菌体而求得残留活性。

与对照相比残留活性高的菌株，再对其进行碱基测序。

结果见表4。

表4氨基酸被取代的菌株的相对残留活性

质粒名

相对残留活性

碱基序列

氨基酸

	(％)
				pJH601	40	GAG	Glu
p3	85	GGG	Gly
				p104	88	CGC	Arg
p117	65	CAC	Gln
				p136	71	CAC	His
p139	62	CTC	Leu
				p145	87	AAC	Lys
p148	76	TTC	Phe
				p156	83	CCC	Pro
p181	89	TCC	Ser
				p186	69	ACG	Thr
p193	73	TAC	Tyr

表4表明，β亚基第93位的氨基酸被其他氨基酸取代也会使耐热性提高。

[实施例5]

在β亚基第167位的氨基酸处引入随机突变。

引入突变的操作方法除引物更换为以下2种引物外，与实施例4中的操作相同。下划线的位置为引入突变的位置。结果见表5

β167RM-F：gtgcccgaaatatgtgcgggNNSaagatcggggaaatcgtcg (序列编号13)

β167RM-R：cgacgatttccccgatcttSNNccgcacatatttcgggcac (序列编号14)

N：A+T+G+C S：G+C

表5氨基酸被取代的菌株的相对残留活性

表5表明，β亚基第167位的氨基酸被其他氨基酸取代会使耐热性提高。

[实施例6]对来源于玫瑰色红球菌M8株的腈水合酶引入突变

(1)腈水合酶基因的克隆

将玫瑰色红球菌M8株用实施例1中同样的方法培养，从培养所得菌体中制备染色体DNA。接着，以下述的反应条件进行PCR，扩增腈水合酶的基因。应予说明，玫瑰色红球菌M8株可从俄罗斯菌株中心IBFM(VKPM S-926)容易地得到。

<反应液组成>

<引物>

MH-01：ccatggatggtatccacgacacaggcggcatgacc (序列编号15)

MH-02：aagcttcacgctggcctcgagcgcctttgtccag (序列编号16)

PCR结束后，取反应液5μl进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，分析确认存在1.5kb扩增片断(序列编号17)。最终反应液利用GFX column(安玛西亚生物科技公司)纯化，利用限制性内切酶NcoI以及HindIII切割。将用限制性内切酶处理过的PCR产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，回收1.5kb附近的条带。回收的PCR产物，利用Ligation试剂盒(宝酒造)与载体(pTrc99A的NcoI-HindIII部位)连接，转化JM109。从所得的转化体菌落中选取数个克隆接种于1.5ml LB-Amp培养基中，37℃振荡培养12小时。培养后，通过离心分离收集菌体之后，利用Flexi Prep(安玛西亚生物科技公司生产)，从收集菌体中提取质粒DNA。所得的质粒DNA利用限制性内切酶NcoI和HindIII切割后，进行0.7％琼脂糖凝胶电泳检验，选择腈水合酶基因片断(1.5kb)正确连接的克隆命名为pMH301(图3)。利用pMH301进行JM109转化(JM109/pMH301)。

(2)定点突变的引入

采用实施例3所述方法进行引入定点突变，在β亚基的第93位引入突变。引物碱基序列中下划线部位即为突变引入的位置。

NHM-F：gatcatcaccgaagaagggcgaaagcaccgtgtgc (序列编号9)

NHM-R：gcacacggtgctttcgcccttcttcggtgatgatc (序列编号10)

PCR使用GeneAmp9700(PEbioscience公司生产)以下述的条件进行：95℃1分钟、(95℃50秒、60℃50秒、68℃14分钟)×18个循环，68℃7分钟。

<反应液组成>

PCR结束后，取反应液10μl进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，分析确认存在约5kb扩增片断。确认存在扩增片断后，将1μl DpnI(试剂盒附带)加入PCR反应液，37℃反应1小时，除去模版DNA。接着，利用XL10-GOLD ultracompetent cell(试剂盒附带)进行转化。将2μl经DpnI处理过的PCR反应液与45μl感受态细胞混合，4℃下保温30分钟，42℃迅速加热30秒之后，加入0.5ml NZY⁺培养基(1％NZ胺、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、12.5mM MgCl₂、12.5mM MgSO₄、0.4％葡萄糖、pH7.5)，继续在37℃培养1小时。取培养液250μl涂布于LB平板培养基(1％NaCl、1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、2％琼脂、50mg/L氨苄西林)上37℃平板培养1天。

将得到的数个菌落用LB培养基(50mg/L氨苄西林)培养，使用FlexiPrep试剂盒(安玛西亚生物科技公司)制备质粒。最后，测定所得质粒的碱基序列，以确认目标突变被引入。由此得到引入Eβ93G突变的质粒：pMH404。

用同样的方法，利用以下引物对β亚基的第167位进行突变引入。下划线部位即为突变引入的位置。

β167-F：cccgaaatatgtgcggagcaagatcggggaaatcg (序列编号18)

β167-R：cgatttccccgatcttgctccgcacatatttcggg (序列编号19)

将得到的数个菌落用LB培养基(50mg/L氨苄西林)培养，提取质粒。最后，测定所得质粒的碱基序列，以确认目标突变被引入。由此得到引入Nβ167S突变的质粒：pMH508

(3)活性测定

将工序(2)所得的XL10/pMH404、XL10-Gold/pMH508以及XL10-Gold/pMH301，分别接种于10ml LB-Amp培养基(含1mM IPTG、5μg/ml CoCl₂)，37℃下液体培养12小时。所得的培养物，在55℃温度下，热处理30分钟，测定残留的腈水合酶活性。

活性测定方法同实施例1(4)。作为对照以未经热处理在4℃下冷藏的菌体作为各未处理菌体而求得残留活性。结果见表6。

表6

质粒名	残留活性(％)	突变位点
			pMH301	45	无
pMH404	80	Eβ93G
			pMH508	76	Nβ167S

表6表明，在来源于玫瑰色红球菌M8株的腈水合酶上引入Eβ93G、Nβ167S突变，也会使耐热性提高。

[实施例7]改良型腈水合酶基因的获得(II)

(1)突变基因文库的构建

通过本实施例对来源于玫瑰色红球菌J-1菌株的腈水合酶基因引入随机突变。突变的引入是通过PCR过程中的核苷酸的错误掺入所造成的碱基取代实现的。使用野生型β亚基第167位氨基酸由天冬酰胺突变为丝氨酸的质粒p52(图4)作为模版质粒。

对腈水合酶基因进行随机突变引入的PCR反应以下面记载的反应液组成、反应条件进行。

<反应液组成>

<引物>

Trc-02：ggaattcgtataatgtgtggaattgtgagc (序列编号7)

Trc-03：ggctgaaaatcttctctcatccgcc (序列编号8)

PCR使用GeneAmp9700(PEbioscience公司生产)，以94℃30秒、65℃30秒、72℃3分钟为一个循环，进行30个循环。

PCR结束后、取反应液5μl进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，以分析确认存在3kb扩增片断。最终反应液利用GFX column(安玛西亚生物科技公司)纯化，利用限制性内切酶NcoI和HindIII切割。将用限制性内切酶处理过的PCR产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，回收3kb附近的条带。回收的PCR产物，利用Ligation试剂盒(宝酒造)与载体(pTrc99A的NcoI-HindIII部位)连接，用该连接物转化JM109。

(2)耐热性腈水合酶的筛选及突变位点的确定

选取上述工序(1)制得的含有突变的腈水合酶基因的JM109转化体以及生产野生型水合酶的菌株JM109/pJH601，测定残留的腈水合酶活性。

耐热性评价的方法，除热处理过程改为60℃下反应20分钟之外，其余操作与实施例1(4)中方法相同。

对数千株具有引入随机突变的腈水合酶基因的重组体进行筛选，结果筛得比野生型酶残留活性高的重组体。其残留活性测试结果见表7。

表7

对该重组体菌株进行培养，回收质粒，命名为质粒pA077，并进行碱基测序。碱基测序使用BeckmanCEQ-2000XL完成。以质粒pA077的突变基因序列所编码的氨基酸序列，具有Nβ167S、Lβ144H、Vβ219A、Vα129A及Lα196P 5处突变。

[实施例8]大肠杆菌重组体的制备和评价

(1)质粒的构建

以质粒p52(图4)为模版，以实施例7(2)中的突变位点信息为依据进行突变引入。突变的引入采用定点突变引入法，使用市售试剂盒：QuickChange XL Site-DirectedMutagenesis Kit(Stratagene公司)。实验操作遵循试剂盒说明。

为引入突变，已合成2种引物。突变引入的位置以下划线标示。

β144-F：ggagccgagtttctctcacggtgacaagatc (序列编号20)

β144-R：gatcttgtcaccgtgagagaaactcggctcc (序列编号21)

以引入突变为目的的PCR使用GeneAmp9700(PEbioscience公司生产)以下述的条件进行：95℃1分钟、(95℃50秒、60℃50秒、68℃14分钟)×18个循环，68℃7分钟。

<反应液组成>

PCR结束后，取反应液10μl进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，以分析确认存在约11kb扩增片断。确认存在扩增片断后，将1μl DpnI(试剂盒附带)加入PCR反应液，37℃反应1小时，除去模版DNA。

接着，利用XL10-GOLD ultracompetent cell(试剂盒附带)进行转化。将2μl经DpnI处理过的PCR反应液与45μl感受态细胞混合，4℃下保温30分钟，42℃迅速加热30秒。之后，加入0.5ml NZY+培养基(1％NZ胺、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、12.5mM MgCl₂、12.5mM MgSO₄、0.4％葡萄糖、pH7.5)，继续在37℃培养1小时。取培养液250μl涂布于LB平板培养基(1％NaCl、1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、2％琼脂、50mg/L氨苄西林)上37℃平板培养1天。

将得到的数个菌落用1.5ml LB培养基(含50mg/L氨苄西林)培养，使用FlexiPrep试剂盒(安玛西亚生物科技公司)制备质粒。最后，测定所得质粒的碱基序列，以确认目标突变被引入。由此得到可引入Lβ144H突变的质粒：pAB001。

接着，用上述同样的方法，以p52或pAB002为模板质粒引入Vβ219A突变或Vα129A突变。所用引物如下所示。

β219-F：gaaagacgtagtgtgcgccgatctctgggaacc (序列编号22)

β219-R：ggttcccagagatcggcgcacactacgtctttc (序列编号23)

α129-F：gagtaccggtcccgagcggtagcggaccctcg (序列编号24)

α129-R：cgagggtccgctcaccgctcgggaccggtactc (序列编号25)

所得质粒分别命名为pAB002(Nβ167S、Vβ219A)、pAB003(Nβ167S、Vα129A)、pAB004(Nβ167S、Lβ144H、Vβ219A)。

(2)耐热性评价

利用工序(1)所得的具有突变腈水合酶基因的各质粒分别对大肠杆菌JM109进行转化，得到重组菌。将这些重组菌分别接种到1.5ml LB-Amp培养基(含1mM IPTG、5μg/mlCoCl₂)，37℃下液体培养12小时。所得的细菌培养液，在60℃温度下，热处理20分钟，测定残留的腈水合酶活性。测定方法同实施例1(4)中的方法。残留活性测试结果见表8。

表8

质粒名	残留活性(％)	突变位点
			pJH601	10	无
p52	25	Nβ167S
			pAB001	36	(Nβ167S、Lβ144H)
pAB002	32	(Nβ167S、Vβ219A)
			pAB003	60	(Nβ167S、Vα129A)
pAB004	55	(Nβ167S、Lβ144H、Vβ219A)

表8清楚表明，引入Lβ144H、Vβ219A、Vβ219A突变耐热性提高。

[实施例9]红球菌(Rhodococcus)重组体的制备和评价

(1)质粒的构建

用以下方法构建用于转化红球菌(Rhodococcus)使之具有β亚基第167位突变(Nβ167S)的质粒。突变的引入采用定点突变法，使用市售试剂盒：QuickChange XLSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司)。实验操作遵循试剂盒说明。使用pSJ034作为突变引入的模版质粒。

为进行突变引入合成2种引物。引入突变的位置以下划线标示。

β167-F：cccgaaatatgtgcggagcaagatcggggaaatcg (序列编号18)

β167-R：cgatttccccgatcttgctccgcacatatttcggg (序列编号19)

以引入突变为目的的PCR与实施例3(1)中的条件相同。

<反应液组成>

PCR结束后，采用与实施例3(1)中相同的方法，由此得到具有Nβ167S突变用于转化红球菌(Rhodococcus)的质粒：p52R。

接着，用上述同样的方法，以p52R为模版质粒，引入Lβ144H、Vβ219A或Vα129A突变。突变所用的引物如下：

β144-F：ggagccgagtttctctcacggtgacaagatc (序列编号20)

β144-R：gatcttgtcaccgtgagagaaactcggctcc (序列编号21)

β219-F：gaaagacgtagtgtgcgccgatctctgggaacc (序列编号22)

β219-R：ggttcccagagatcggcgcacactacgtctttc (序列编号23)

α129-F：gagtaccggtcccgagcggtagcggaccctcg (序列编号24)

α129-R：cgagggtccgctcaccgctcgggaccggtactc (序列编号25)

所得质粒分别命名为pAR001(Nβ167S、Lβ144H)、pAR002(Nβ167S、Vβ219A)、pAR003(Nβ167S、Vα129A)。进一步，以质粒pAR001为模版，用上述同样的方法，引入Vβ219A突变。所得质粒命名为pAR004(Nβ167S、Lβ144H、Vβ219A)。

(2)红球菌(Rhodococcus)重组体的制备

将处于对数增殖期的玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochlrous)ATCC 12674菌株细胞用离心分离器收集菌体，用冰冷的灭菌水清洗3次，并使菌体混悬于灭菌水中。取(1)中制得的质粒1μl与菌体混悬液10μl混合，冰浴冷却。

之后的操作同实施例3(2)。

(3)红球菌(Rhodococcus)重组体的耐热性评价

将所得的红球菌(Rhodococcus)重组体利用实施例3(3)中的方法热处理后，考察残留的腈水合酶活性。

将各个红球菌(Rhodococcus)重组体分别接种于MYK培养基(含50μg/ml卡那霉素、50μg/ml CoCl₂、0.1％尿素)，30℃振荡培养3天。离心分离收集菌体，用100mM磷酸缓冲液(pH8.0)清洗菌体，最后混悬于少量缓冲液中。

将适当稀释的各菌体混悬液0.5ml置于试管中，在65℃温度的水浴中保温30分钟，之后用冰水浴冷却。

用实施例3(3)中的方法测定活性，残留活性结果见表9。

表9

质粒名

残留活性(％)

突变位点

pSJ034	31	无
			p52R	69	Nβ167S
pAR001	66	(Nβ167S、Lβ144H)
			pAR002	72	(Nβ167S、Vβ219A)
pAR003	74	(Nβ167S、Vα129A)
			pAR004	69	(Nβ167S、Lβ144H、Vβ219A)

ATCC12674/pSJ034经65℃、30分钟热处理后残留活性为31％，与之相比，ATCC12674/pAR001～pAR004保持60％以上的残留活性，由此确定改良型腈水合酶的耐热性提高。

(3)丙烯酰胺耐受性评价

利用实施例9(2)中所用的转化体进行丙烯酰胺耐受性评价。准备以下组成的反应液，30℃搅拌反应。应予说明，用于反应的各菌体混悬液中的菌量，根据实施例3(3)中的活性测定结果调节，使之在同一酶活性单位(U)上。以含有野生型腈水合酶的ATCC 12674/pSJ034菌株作为对照。

<反应液组成>

在反应起始(0小时)，反应0.5小时及20小时的时候分别对反应液取样1ml，用0.22μm的滤膜过滤。所得滤液进行气相色谱分析。(分析仪器：气相色谱仪GC-14B(岛津制作所生产)，检测器：FID，检测温度：200℃，色谱柱：填充Porapak PS(Waters公司生产的填料)的1.1m玻璃填充柱，柱温：190℃，载气：N₂。)

分析结果、滤液中残留的丙烯腈的比例(％)见表10。

表10滤液中残留的丙烯腈(％)

如上所述，改良型的腈水合酶相比作为对照的pSJ034消耗了更多的丙烯腈，由此可判断改良型腈水合酶在高浓度丙烯酰胺存在的条件下仍维持了活性，其丙烯酰胺耐受性提高了。

[实施例10]对来源于玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)M8株的腈水合酶引入突变、重组体的制备和评价

(1)引入突变的重组体的制备

对来源于玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)M8株的腈水合酶引入突变。定点突变的操作方法，除使用的质粒是具有来源于玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)M8株的腈水合酶编码基因(序列编号17)的表达质粒pMH301(图3)，其余操作与实施例6(2)方法相同。所得的质粒分别命名为pMH508(β167S)、pMH601(Nβ167S、Lβ144H)、pMH602(Nβ167S、Vβ219A)、pMH603(Nβ167S、Vα129A)。用这些质粒转化JM109，制得引入突变的重组菌。将得到的重组菌接种到10ml LB-Amp培养基(含1mM IPTG、5μg/ml CoCl₂)，37℃下液体培养12小时。

(2)耐热性评价

所得培养物在60℃下热处理20分钟后，测定残留活性。活性测定方法同实施例7(2)。作为对照以未经热处理在4℃下冷藏的菌体作为各未处理菌体而求得残留活性。残留活性见表11。

表11

质粒名	残留活性(％)	突变位点
			pMH301	10	无
pMH508	21	Nβ167S
			pMH601	42	(Nβ167S、Lβ144H)

pMH602	38	(Nβ167S、Vβ219A)
			pMH603	33	(Nβ167S、Vα129A)

改良型腈水合酶在玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)M8株中也显示出耐热性提高。

[实施例11]突变型腈水合酶基因的获得

(1)质粒的构建

利用实施例1中构建的pJH601质粒，使用实施例1(3)同样的方法对腈水合酶基因引入随机突变，并对其进行扩增，回收PCR反应的3Kb的产物。

回收的PCR产物，利用Ligation试剂盒(宝酒造)，将其插入质粒pFY529A的NcoI-HindIII的部位，转化JM109。应予说明，pFY529A的构建方法见参考例1。

(2)底物特异性的突变腈水合酶的获得及突变位点的确定

选取上述工序所得到的具有突变腈水合酶基因的JM109转化体以及JM109/pJH601，利用实施例1(4)同样的方法测定腈水合酶的活性。

对数百株转化体进行筛选后，结果得到1株与野生株相比对3-氰基吡啶催化活性明显提高的菌株(JM109/pNHM101)。接着，培养该菌株并回收质粒，进行碱基测序。碱基测序使用BeckmanCEQ-2000XL完成。该质粒上腈水合酶的基因序列中，β亚基的第48位的色氨酸残基(TGG)突变为精氨酸残基(CGG)。

[实施例12]红球菌重组体的制备

以红球菌重组体考察实施例11中得到的突变酶的性质。

(1)用于转化红球菌的质粒的构建

用以下方法构建可具有pNHM101突变(Wβ48R)的用于转化红球菌的质粒。突变的引入采用Kurosawa等人的方法进行(Gene.1991 15；102：67-70)。使用质粒pSJ034作为引入突变的模版质粒。pSJ034是在红球菌中可以表达腈水合酶的质粒，pSJ034是根据特开平10-337185号公报所示方法由pSJ023制得。应予说明，pSJ023以转化体「R.rhodochrousATCC12674/pSJ023」的形式保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1-1-1中央第6)，编号FERM BP-6232。

1stPCR

使用GeneAmp9700(PEbioscience公司生产)以下述的条件进行2种1stPCR：95℃1分钟、(95℃60秒、60℃60秒、72℃10分钟)×30个循环，72℃7分钟。

<反应液组成>

2种PCR，其中一种的引物组合采用引物1(NR-01)和引物2(NH-18)，另一种引物组合采用引物1(NOXbaI-1)和引物2(RE1-02)

NR-01：AACGTCGACACCGGTGGTGG (序列编号26)

NH-18：CCGCGACTTGTCCCGCCACGATATGCCC (序列编号27)(用于引入突变的引物、突变位点以下划线标示)

NOXbaI-1：GTACCCGGGGATCCACTAGA (序列编号28)

RE1-02：CCTTAGTCAGCTTCTGTCCG (序列编号29)

PCR结束后，取反应液1μl进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，以分析确认存在所需扩增片断。确认存在扩增片断后，剩余的PCR反应液以相同条件进行琼脂糖凝胶电泳，纯化扩增片断。

2ndPCR

利用1stPCR所制得的2种PCR片断，按下述条件进行2ndPCR。

<反应液组成>

在不加入酶的条件下，93℃下进行10分钟热处理，放置1小时使其冷却至37℃，37℃放置15分钟，加入酶放置1分钟，以95℃60秒、60℃60秒、72℃10分钟为一个循环，反应30个循环，72℃反应7分钟。

用琼脂糖凝胶电泳确认所得PCR产物后，利用XbaI和Sse8387I处理，通过琼脂糖凝胶电泳纯化DNA片断。

纯化的PCR片断，利用Ligation试剂盒(宝酒造)与载体pSJ034(XbaI-Sse8387I部位)连接，用于转化JM109。从所得的转化体菌落中选取数个克隆接种于1.5ml LB-Amp培养基中，37℃振荡培养12小时。培养后，通过离心分离收集菌体之后，利用Flexi Prep(安玛西亚生物科技公司生产)，从收集菌体中提取质粒DNA。所得的质粒DNA利用限制性内切酶XbaI和Sse8387I切割后，进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，选择腈水合酶基因片断(约2kb)正确连接的克隆。最后，对所得质粒进行碱基测序，以确认目标突变被正确引入。至此，得到引入Wβ48R突变的质粒pAJ001。

(2)引入突变酶基因的红球菌重组体的获得

将处于对数增殖期的玫瑰色红球菌ATCC 12674菌株细胞用离心分离器收集菌体，用冰冷的灭菌水清洗3次，并使菌体混悬于灭菌水。

取(1)中制备的质粒pAJ001 1μl与10μl菌体混悬液混合，冰水浴冷却。

之后按实施例3(2)中同样的方法进行，得到红球菌重组体。

(3)红球菌重组体的活性

对所得的红球菌重组体考察其对丙烯酰胺及3-氰基吡啶的活性。将红球菌重组体分别接种到每孔含1ml LB-Amp培养基(含1mM IPTG、5μg/ml CoCl₂)的96孔板中，37℃下液体培养12小时。所得的培养物，测定腈水合酶活性。

活性测定用以下方法，取菌体混悬液加入等量的5％丙烯腈/50mM pH7.7磷酸缓冲液或者等量的0.5％3-氰基吡啶/50mM pH7.7磷酸缓冲液，30℃下反应30分钟。反应结束后，向反应液中加入等量的0.1M磷酸，离心去除菌体，上清液适当稀释用HPLC检测，分析生成的酰胺的浓度(丙烯酰胺：WAKOSIL 5C8(和光纯药)，含5mM磷酸的10％乙腈，烟酰胺：WAKOSIL 5C8(和光纯药)，含50mM磷酸的35％乙腈)。

制备具有野生型腈水合酶的ATCC12674/pSJ034作为对照。

结果如表12所示

表12

丙烯酰胺

3-氰基吡啶

ATCC12674/pSJ034	100	20
			ATCC12674/pAJ001	80	223

[实施例13]

以pNHM101为模版，利用上述同样方法建立突变腈水合酶基因文库，以耐热性为指标进行筛选。

筛选方法同实施例1(4)的处理方法。

对数百株转化体进行筛选，结果得到1株与野生株相比显示更高残留活性的菌株(JM109/pNHM111)。培养该菌株并回收质粒，进行碱基测序。碱基测序使用BeckmanCEQ-2000XL完成。该质粒上腈水合酶的基因序列中，不但具有pNHM101的突变，而且β亚基的第26位的组氨酸残基(CAC)突变为精氨酸残基(CGC)。

[实施例14]

以红球菌重组体确定实施例13中得到的耐热酶突变(Hβ26R)的性质。

用NH-25代替NH-18作为突变引物，用与实施例12相同的方法构建质粒。该质粒命名为pAJ006，用与实施例12相同的方法转化玫瑰色红球菌ATCC12674。

NH-25：CCCTCCCACTCGTAGCGGAAGAAGGGCTCG (序列编号30)(用于引入突变的引物、突变位点以下划线标示)

使用所得的红球菌重组体，用与实施例3(3)相同的方法考察其耐热性。制备具有野生型腈水合酶的ATCC 12674/pSJ034作为对照。

将上述得到的菌体混悬液置于0.5ml试管中，置于65℃、70℃各温度的水浴中保温10分钟，之后用冰水浴冷却。残留活性以将未经热处理4℃冷藏的菌株(无处理区)的初始活性作为100％的相对活性进行评价。

ATCC12674/pSJ034在70℃经10分钟热处理后残留活性仅为4％，与之相比，ATCC12674/pAJ006保持40％残留活性，由此确认突变酶(Hβ26R)的耐热性提高。

[参考例1]

酯酶表达质粒pFY529的构建

质粒pFY529中具有来源于Pseudomonas fluorescens的酯酶基因，该质粒是以特开平1-67190中记载的质粒pFY520为模版构建的(图5A、图5B)。质粒pFY520以转化体「JM109/pFY520」的形式保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1-1-1中央第6)(编号FERM BP-1469)(原保藏日：1987年9月3日)。

将pFY520用限制性内切酶NaeI切割后，与HindIII连接子(Linker)连接，得到pFY520中NaeI部位已经置换成HindIII部位的质粒。该质粒命名为pCF001。pCF001使用限制性内切酶HindIII切割，制得含有酯酶基因的约0.8kb的DNA片断。将该片断插入表达载体pKK233-2的HindIII部位，插入方向与trc启动子方向相同，得到质粒pCF002。使质粒pUC18以限制性内切酶PvuII和ScaI切割得到的约1.55kb的片断与pCF002以限制性内切酶NaeI和ScaI切割得到的约1.96kb的片断连接，制得质粒pFY529。pFY529也像pCF002(pKK233-2载体)一样具有trc启动子，其特征为拥有更多的拷贝数。

工业适用性

本发明提供改良型腈水合酶。本发明的腈水合酶因耐热性高或底物特异性高可有效用于酰胺化合物的高效制备。

序列表的随意版本

序列编号5：合成DNA

序列编号6：合成DNA

序列编号7：合成DNA

序列编号8：合成DNA

序列编号9：合成DNA

序列编号10：合成DNA

序列编号11：合成DNA

序列编号11：n为a，c，g或t(存在位置为20-21)

序列编号12：合成DNA

序列编号12：n为a，c，g或t(存在位置为21-22)

序列编号13：合成DNA

序列编号14：合成DNA

序列编号14：n为a，c，g或t(存在位置为21-22)

序列编号15：合成DNA

序列编号16：合成DNA

序列编号18：合成DNA

序列编号19：合成DNA

序列编号20：合成DNA

序列编号21：合成DNA

序列编号22：合成DNA

序列编号23：合成DNA

序列编号24：合成DNA

序列编号25：合成DNA

序列编号26：合成DNA

序列编号27：合成DNA

序列编号28：合成DNA

序列编号29：合成DNA

序列编号30：合成DNA

Claims

1.一种蛋白质，由下述氨基酸序列组成并且具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质，所述氨基酸序列指由α亚基和β亚基组成的野生型腈水合酶的氨基酸序列，其中所述α亚基的氨基酸序列上的第42位天冬酰胺残基被天冬氨酸残基取代，所述野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如SED ID NO：4所示。

2.一种蛋白质，由下述氨基酸序列组成并且具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质，所述氨基酸序列指由α亚基和β亚基组成的野生型腈水合酶的氨基酸序列，其中所述α亚基的氨基酸序列上第42位天冬酰胺残基被天冬氨酸残基取代，所述β亚基的氨基酸序列上第96位组氨酸残基被精氨酸残基取代，所述野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列如SED IDNO：2所示，所述野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如SED ID NO：4所示。

3.一种DNA，该DNA编码如权利要求1或2所述的蛋白质。

4.一种重组载体，该重组载体含有如权利要求3所述的DNA。

5.一种转化体或转导体，该转化体或转导体含有如权利要求4所述的重组载体。

6.一种制备腈水合酶的方法，该方法培养如权利要求5所述的转化体或转导体，从所得培养物提取腈水合酶。

7.一种制备酰胺化合物的方法，该方法培养如权利要求5所述的转化体或转导体，使所得的培养物或处理物与腈基化合物接触，提取通过该接触生成的酰胺化合物。