CN110139930B - 突变型腈水合酶及其应用 - Google Patents

突变型腈水合酶及其应用 Download PDF

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Abstract

突变型腈水合酶，其是包含α亚基和β亚基的来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶，所述突变型腈水合酶中含有选自由α亚基的N末端起第40位及第43位以及β亚基的N末端起第205位、第206位及第215位组成的组中的至少1个位置处的氨基酸残基取代为特定氨基酸残基的取代。

Description

突变型腈水合酶及其应用
技术领域
本公开文本涉及突变型腈水合酶、编码该突变型腈水合酶的核酸、含有该核酸的表达载体及转化体、该突变型腈水合酶的制造方法、及酰胺化合物的制造方法。
背景技术
腈水合酶是具有通过水合将各种化合物的腈基转化为酰胺基的腈水合活性的酶，其被用于利用酶反应的工业性酰胺化合物制造工艺中。
近年来，针对工业性酰胺化合物制造技术的要求标准存在越来越高的趋势。鉴于这种情况，为了降低在酰胺化合物的制造成本中所占的腈水合酶的运转成本，迄今为止进行了各种研究。特别地，就腈水合酶而言，关于涉及能够提高该酶的每单位重量的活性值的突变体的技术已多有报道(日本特开平9-275978号公报、日本特开2004-194588号公报、日本特开2005-160403号公报、国际公开第2004/056990号、国际公开第2010/055666号、日本特开2007-143409号公报、日本特开2008-253182号公报等)。
此处，利用酶反应的工业性酰胺化合物的代表性制造工艺中，通常依次实施下述工序：反应工序，在以pH成为7～9的方式调节后的溶液中，利用腈水合酶的催化作用，进行由腈化合物合成酰胺化合物的反应；和纯化工序，将上述溶液的pH调节为3.5～6.5，在该pH下使用活性炭，利用吸附除去前述溶液中存在的腈水合酶，从而得到经纯化的酰胺化合物(日本特开2001-270857号公报)。
发明内容
发明所要解决的课题
为了提高利用腈水合酶的工业性酰胺化合物的制造效率以使其较之以往也有所增高，本申请的发明人进行了深入研究。结果发现，在酸性的pH范围内实施的前述纯化工序中也使利用腈水合酶的催化作用由腈化合物合成酰胺化合物的反应持续进行时，作为其设计方针而言是有效的。
然而，通常，野生型腈水合酶的最适pH为7～9，野生型腈水合酶的活性在pH3.5～6.5的条件下大幅度降低。因此，即使使用野生型腈水合酶，纯化工序中酶反应也不会进行至能够满足的程度。另外，虽然如上所述已报道了各种腈水合酶突变体，但它们的活性也在纯化工序中所应用的这样的酸性条件下大幅度降低。如此，迄今为止尚未报道涉及在酸性条件下的纯化工序中显示催化由腈化合物合成酰胺化合物的反应的酶活性的良好的pH稳定性的腈水合酶突变体的技术。尤其在pH5.0以下这样较强的酸性条件下，蛋白质失活的趋势更高，涉及在这样的pH条件下仍然良好地保持酶活性的腈水合酶突变体的技术迄今尚未有报道。
因此，本公开文本提供涉及催化由腈化合物合成酰胺化合物的反应的酶活性相对于pH的稳定性提高、具有新突变位点的突变型腈水合酶的技术。更具体而言，提供涉及在pH3.5～6.5这样的酸性范围内仍然良好地保持酶活性的突变型腈水合酶的技术。进一步具体而言，提供涉及在pH为3.5～5.0这样较强的酸性范围内仍然良好地保持酶活性的突变型腈水合酶的技术。
用于解决课题的手段
本公开文本包含以下方案。
＜1＞突变型腈水合酶，其是包含α亚基和β亚基的来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶，所述突变型腈水合酶中含有选自由下述氨基酸残基取代(a)～(e)组成的组中的至少1个氨基酸残基取代：
(a)α亚基的N末端起第40位的氨基酸残基取代为Asn的取代；
(b)α亚基的N末端起第43位的氨基酸残基取代为Val的取代；
(c)β亚基的N末端起第205位的氨基酸残基取代为Val的取代；
(d)β亚基的N末端起第206位的氨基酸残基取代为Gln的取代；
(e)β亚基的N末端起第215位的氨基酸残基取代为Asn的取代。
＜2＞如＜1＞所述的突变型腈水合酶，其含有选自由氨基酸残基取代(a)～(e)组成的组中的2个以上氨基酸残基取代。
＜3＞如＜1＞或＜2＞所述的突变型腈水合酶，其含有氨基酸残基取代(b)和选自由氨基酸残基取代(a)、(c)、(d)及(e)组成的组中的至少1个。
＜4＞如＜1＞～＜3＞中任一项所述的突变型腈水合酶，其中，α亚基的氨基酸序列中的N末端起第36位的氨基酸为Trp。
＜5＞如＜1＞～＜3＞中任一项所述的突变型腈水合酶，其中，α亚基的氨基酸序列中的N末端起第36位的氨基酸为Met、Ser、Gly或Ala。
＜6＞如＜1＞～＜5＞中任一项所述的突变型腈水合酶，其中，α亚基的氨基酸序列满足以下(1)～(13)中一者以上：
(1)N末端起第6位的氨基酸残基为Thr或Ala；
(2)N末端起第13位的氨基酸残基为Leu；
(3)N末端起第19位的氨基酸残基为Val；
(4)N末端起第27位的氨基酸残基为Ile；
(5)N末端起第48位的氨基酸残基为Gln；
(6)N末端起第71位的氨基酸残基为His；
(7)N末端起第92位的氨基酸残基为Glu；
(8)N末端起第94位的氨基酸残基为Ile；
(9)N末端起第126位的氨基酸残基为Tyr；
(10)N末端起第148位的氨基酸残基为Asp；
(11)N末端起第188位的氨基酸残基为Gly；
(12)N末端起第197位的氨基酸残基为Cys；
(13)N末端起第204位的氨基酸残基为Arg。
＜7＞如＜1＞～＜6＞中任一项所述的突变型腈水合酶，其中，β亚基的氨基酸序列满足以下(15)～(47)中至少一者：
(15)N末端起第4位的氨基酸残基为Met；
(16)N末端起第8位的氨基酸残基为Ala；
(17)N末端起第10位的氨基酸残基为Asp；
(18)N末端起第24位的氨基酸残基为Ile；
(19)N末端起第33位的氨基酸残基为Val或Met；
(20)N末端起第37位的氨基酸残基为Val或Leu；
(21)N末端起第40位的氨基酸残基为Ile、Val或Leu；
(22)N末端起第41位的氨基酸残基为Ile；
(23)N末端起第46位的氨基酸残基为Lys；
(24)N末端起第48位的氨基酸残基为Val；
(25)N末端起第51位的氨基酸残基为Val；
(26)N末端起第61位的氨基酸残基为Val、Gly、Trp、Ser、Leu或Thr；
(27)N末端起第79位的氨基酸残基为Asn；
(28)N末端起第96位的氨基酸残基为Arg；
(29)N末端起第107位的氨基酸残基为Met；
(30)N末端起第108位的氨基酸残基为Asp或Arg；
(31)N末端起第110位的氨基酸残基为Asn；
(32)N末端起第112位的氨基酸残基为Val或Ile；
(33)N末端起第118位的氨基酸残基为Val；
(34)N末端起第127位的氨基酸残基为Ser；
(35)N末端起第146位的氨基酸残基为Gly；
(36)N末端起第150位的氨基酸残基为Asn或Ser；
(37)N末端起第160位的氨基酸残基为Cys、Trp或Met；
(38)N末端起第168位的氨基酸残基为Glu；
(39)N末端起第176位的氨基酸残基为Ala、Thr、Met或Cys；
(40)N末端起第186位的氨基酸残基为Arg；
(41)N末端起第200位的氨基酸残基为Glu；
(42)N末端起第212位的氨基酸残基为Tyr；
(43)N末端起第217位的氨基酸残基为Val、His、Met、Gly、Ser、Leu或Cys；
(44)N末端起第218位的氨基酸残基为Met或Ser；
(45)N末端起第226位的氨基酸残基为Ile；
(46)N末端起第230位的氨基酸残基为Glu；
(47)N末端起第231位的氨基酸残基为Val。
＜8＞如＜1＞～＜7＞中任一项所述的突变型腈水合酶，其中，在下述[1]～[49]中任一种来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶中含有选自由所述(a)～(e)组成的组中的至少1个氨基酸残基取代：
[1]包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号2的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[2]包含具有序列号16的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号33的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[3]包含具有序列号17的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号33的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[4]包含具有序列号18的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号34的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[5]包含具有序列号19的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号34的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[6]包含具有序列号20的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号35的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[7]包含具有序列号20的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号36的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[8]包含具有序列号21的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号37的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[9]包含具有序列号21的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号38的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[10]包含具有序列号21的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号39的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[11]包含具有序列号21的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号40的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[12]包含具有序列号18的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号41的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[13]包含具有序列号18的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号42的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[14]包含具有序列号21的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号43的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[15]包含具有序列号22的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号44的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[16]包含具有序列号23的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号45的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[17]包含具有序列号24的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号46的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[18]包含具有序列号25的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号47的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[19]包含具有序列号18的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号48的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[20]包含具有序列号23的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号49的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[21]包含具有序列号16的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号50的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[22]包含具有序列号26的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号51的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[23]包含具有序列号27的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号52的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[24]包含具有序列号28的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号53的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[25]包含具有序列号17的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号54的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[26]包含具有序列号29的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号55的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[27]包含具有序列号18的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号56的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[28]包含具有序列号18的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号57的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[29]包含具有序列号30的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号58的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[30]包含具有序列号29的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号59的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[31]包含具有序列号31的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号60的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[32]包含具有序列号18的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号61的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[33]包含具有序列号32的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号62的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[34]包含具有序列号30的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号63的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[35]包含具有序列号30的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号64的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[36]包含具有序列号30的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号65的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[37]包含具有序列号25的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号54的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[38]包含具有序列号30的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号66的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[39]包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号67的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[40]包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号68的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[41]包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号69的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[42]包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号70的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[43]包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号71的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[44]包含具有序列号21的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号72的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[45]包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号73的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[46]使所述[1]～[45]的腈水合酶中任一者中的α亚基的N末端起第36位的氨基酸残基为Trp残基而得到的腈水合酶；
[47]腈水合酶，其包含：所述[1]～[46]中任一种腈水合酶(A)的α亚基、或包含与该α亚基具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列的α亚基变体；和所述腈水合酶(A)的β亚基、或包含与该β亚基具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列的β亚基变体，其中，α亚基及β亚基中的至少一者为α亚基变体或β亚基变体；
[48]腈水合酶，其中，在所述[1]～[46]中任一种腈水合酶(B)的α亚基中添加、取代、缺失、及/或插入的氨基酸残基(不包括所述(a)及(b)的被取代的氨基酸残基)的总数为1～10个，并且，在所述腈水合酶(B)的β亚基中添加、取代、缺失、及/或插入的氨基酸残基(不包括所述(c)～(e)的被取代的氨基酸残基)的总数为1～10个。
＜9＞核酸，所述核酸编码＜1＞～＜8＞中任一项所述的突变型腈水合酶。
＜10＞载体，所述载体含有＜9＞所述的核酸。
＜11＞如＜10＞所述的载体，所述载体为表达载体。
＜12＞转化体，所述转化体含有＜11＞所述的表达载体。
＜13＞突变型腈水合酶的制造方法，所述制造方法包括下述工序：在培养基中培养＜12＞所述的转化体的工序；以及，从培养后的转化体及培养基中的至少一者中回收＜1＞～＜8＞中任一项所述的突变型腈水合酶的工序。
＜14＞突变型腈水合酶，其是利用＜13＞所述的制造方法得到的。
＜15＞酰胺化合物的制造方法，所述制造方法包括使＜1＞～＜8＞及＜14＞中任一项所述的突变型腈水合酶与腈化合物接触的工序。
＜16＞如＜15＞所述的酰胺化合物的制造方法，所述制造方法还包括在pH3.5～pH6.5的条件下从含有酰胺化合物的溶液中除去杂质的工序。
＜17＞如＜15＞或＜16＞所述的酰胺化合物的制造方法，所述制造方法还包括利用活性炭将酰胺化合物进行纯化的工序。
发明效果
根据本公开文本，可提供涉及催化由腈化合物合成酰胺化合物的反应的酶活性相对于pH的稳定性提高、具有新突变位点的突变型腈水合酶的技术。更具体而言，可提供涉及在pH3.5～6.5这样的酸性范围内仍然良好地保持酶活性的突变型腈水合酶的技术。进一步具体而言，可提供涉及在pH为3.5～5.0这样较强的酸性范围内仍然良好地保持酶活性的突变型腈水合酶的技术。
具体实施方式
＜突变型腈水合酶＞
本公开文本提供突变型腈水合酶(以下也称为突变型腈水合酶A)，其是包含α亚基和β亚基的来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶，所述突变型腈水合酶中含有选自由下述氨基酸残基取代(a)～(e)组成的组中的至少1个氨基酸残基取代：
(a)α亚基的N末端起第40位的氨基酸残基取代为Asn的取代；
(b)α亚基的N末端起第43位的氨基酸残基取代为Val的取代；
(c)β亚基的N末端起第205位的氨基酸残基取代为Val的取代；
(d)β亚基的N末端起第206位的氨基酸残基取代为Gln的取代；
(e)β亚基的N末端起第215位的氨基酸残基取代为Asn的取代。
迄今为止尚未报道含有上述(a)～(e)的氨基酸残基取代中的至少一个以上的突变体。即，可以说前述突变型腈水合酶所含有的(a)～(e)的氨基酸残基取代均是迄今未曾报道的突变。以下，也将上述(a)～(e)的氨基酸残基取代称为氨基酸残基取代组A。并且，含有上述突变的本公开文本涉及的突变型腈水合酶是对于由腈化合物合成酰胺化合物的反应而言能够显示在与以往的腈水合酶突变体相比更宽泛的pH范围内具有稳定性的酶活性的酶。针对这一点，在实施例中进行详细说明。
一直以来，为了获得来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的突变体而进行了尝试，但这些尝试主要以提高酶的最适pH条件下的酶活性作为目标，而没有对在与酶的最适pH条件相反的酸性条件下的酶活性进行研究。本申请的发明人首次着眼于脱离最适条件的酸性条件下的腈水合酶的酶活性，并且发现上述的新的氨基酸残基突变是有效的。
以下，对本公开文本涉及的突变型腈水合酶更详细地进行说明。对于本公开文本中的核苷酸序列的说明而言，即使在保持该核苷酸序列的核酸链形成了双链的情况下，也存在着眼于一条链上的序列进行说明的情况，而在双链中的另一条链中，这样的序列的说明应该与其互补序列互换读出而适用。
本公开文本中的术语“工序”并非仅指独立的工序，即使在无法与其他工序明确区分的情况下，只要能达成该工序所期望的目的，则也包含于本术语中。
本公开文本中使用“～”示出的数值范围表示将“～”前后所记载的数值分别作为最小值及最大值包含在内的范围。
本公开文本中，对于组合物中的各成分的量而言，在属于组合物中各成分的物质存在多种的情况下，只要没有特别说明，则表示组合物中存在的该多种物质的总量。
本公开文本中，来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的概念不仅包括包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基和具有序列号2的氨基酸序列的β亚基的来源于野生型的嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶，还包括以本领域技术人员能够将其识别为来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的修饰序列的程度、对来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶施以修饰而得到的修饰腈水合酶。来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的概念中所包括的修饰腈水合酶中，也包括对来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶施以选自由下述(i)～(v)组成的组中的1种以上修饰而得到的修饰腈水合酶：(i)1个以上氨基酸残基取代为其他氨基酸残基的取代、(ii)上述(a)～(e)以外的1个以上氨基酸残基的缺失、(iii)氨基酸残基的插入、(iv)向α亚基的氨基酸序列的N末端及C末端中的一者或两者添加氨基酸残基、(v)向β亚基的氨基酸序列的N末端及C末端中的一者或两者添加氨基酸残基。
前述修饰腈水合酶的α亚基中，被取代的氨基酸残基的数量为例如1～20个、或者1～15个、或者1～10个、或者1～8个、或者1～7个、或者1～6个、或者1～5个、或者1～4个、或者1～3个、或者1～2个、或者1个。被取代的氨基酸残基的数量也可以是0。
前述修饰腈水合酶的β亚基中，被取代的氨基酸残基的数量为例如1～20个、或者1～15个、或者1～10个、或者1～8个、或者1～7个、或者1～6个、或者1～5个、或者1～4个、或者1～3个、或者1～2个、或者1个。被取代的氨基酸残基的数量也可以是0。
前述修饰腈水合酶的α亚基中，缺失的氨基酸残基的数量为例如1～10个、或者1～7个、或者1～4个、或者1～2个、或者1个。缺失的氨基酸残基的数量也可以是0。
前述修饰腈水合酶的β亚基中，缺失的氨基酸残基的数量为例如1～10个、或者1～7个、或者1～4个、或者1～2个、或者1个。缺失的氨基酸残基的数量也可以是0。
前述修饰腈水合酶的α亚基中，插入的氨基酸残基的数量为例如1～10个、或者1～7个、或者1～4个、或者1～2个、或者1个。插入的氨基酸残基的数量也可以是0。
前述修饰腈水合酶的β亚基中，插入的氨基酸残基的数量为例如1～10个、或者1～7个、或者1～4个、或者1～2个、或者1个。插入的氨基酸残基的数量也可以是0。
前述修饰腈水合酶的α亚基中，取代、缺失或插入的氨基酸残基的总数为例如1～20个、或者1～14个、或者1～8个、或者1～4个、或者1～2个、或者1个。存在末端添加等情况下，取代、缺失或插入的氨基酸残基的总数也可以是0。
前述修饰腈水合酶的β亚基中，取代、缺失或插入的氨基酸残基的总数为例如1～20个、或者1～14个、或者1～8个、或者1～4个、或者1～2个、或者1个。存在末端添加等情况下，取代、缺失或插入的氨基酸残基的总数也可以是0。
前述修饰腈水合酶的α亚基中，末端添加的氨基酸残基的数量为例如每一个末端为1～60个、或者1～40个、或者1～20个、或者1～10个、或者1～5个、或者1～3个、或者1个。添加的氨基酸残基的数量也可以是0。
前述修饰腈水合酶的β亚基中，末端添加的氨基酸残基的数量为例如每一个末端为1～60个、或者1～40个、或者1～20个、或者1～10个、或者1～5个、或者1～3个、或者1个。添加的氨基酸残基的数量也可以是0。
末端添加氨基酸残基也可以是例如分泌信号序列。末端添加氨基酸残基可以仅存在于N末端，或者仅存在于C末端，或者存在于N末端及C末端这两者。
前述修饰腈水合酶与来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的相似性也可以通过序列同一性来表示。
前述修饰腈水合酶的α亚基的氨基酸序列与序列号1所示的来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的α亚基的氨基酸序列之间具有例如70％以上的序列同一性，或者具有80％以上的序列同一性，或者具有85％以上的序列同一性，或者具有90％以上的序列同一性，或者具有95％以上的序列同一性，或者具有96％以上的序列同一性，或者具有97％以上的序列同一性，或者具有98％以上的序列同一性，或者具有99％以上的序列同一性。
前述修饰腈水合酶的β亚基的氨基酸序列与序列号2所示的来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的β亚基的氨基酸序列之间具有例如70％以上的序列同一性，或者具有80％以上的序列同一性，或者具有85％以上的序列同一性，或者具有90％以上的序列同一性，或者具有95％以上的序列同一性，或者具有96％以上的序列同一性，或者具有97％以上的序列同一性，或者具有98％以上的序列同一性，或者具有99％以上的序列同一性。
需要说明的是，序列之间的比对可使用ClustalW(1.83)来进行，并且可使用初始参数(包括空位开放罚分：10，空位延伸罚分：0.05)来进行。
将修饰腈水合酶的氨基酸序列与来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的氨基酸序列比对的情况下，根据修饰腈水合酶的修饰方式，即使是在比对上对应的氨基酸残基彼此，也存在上述那样规定的亚基的N末端起的距离不同的情况。本公开文本中，在这样的情况下，对于修饰腈水合酶而言，所谓亚基的N末端起第X位的氨基酸残基，是指与来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的该亚基的N末端起第X位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。例如，本公开文本中的所谓“α亚基的N末端起第40位的氨基酸残基”、“α亚基的N末端起第40位的Asp残基”或“α亚基的N末端起第40位的氨基酸残基即Asp残基”，有时会在修饰腈水合酶的氨基酸序列上位于α亚基的N末端起第40位以外的位置。例如，作为插入氨基酸残基的结果，修饰腈水合酶的α亚基的N末端起第41位的氨基酸残基(并非必须是Asp)有时会与来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的α亚基的N末端起第40位的氨基酸残基即Asp残基对应。在这样的情况下，本公开文本中的说明中的所谓“α亚基的N末端起第40位的氨基酸残基”、“α亚基的N末端起第40位的Asp残基”或“α亚基的N末端起第40位的氨基酸残基即Asp残基”，是指修饰腈水合酶中的α亚基的N末端起第41位的氨基酸残基。
来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶中，位于序列号1的最前头的Met残基为α亚基的氨基酸序列的N末端起第1位的氨基酸残基，α亚基的氨基酸序列的N末端起第40位的氨基酸残基为Asp残基，α亚基的氨基酸序列的N末端起第43位的氨基酸残基为Ala残基。另外，来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶中，位于序列号2的最前头的Met残基为β亚基的氨基酸序列的N末端起第1位的氨基酸残基，β亚基的氨基酸序列的N末端起第205位的氨基酸残基为Gly残基，β亚基的氨基酸序列的N末端起第206位的氨基酸残基为Pro残基，β亚基的氨基酸序列的N末端起第215位的氨基酸残基为Tyr残基。
可用作氨基酸残基取代(a)～(e)中一者以上的导入对象的修饰腈水合酶的序列可以从美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information(NCBI))提供的GenBank中所登记的腈水合酶的序列、或者已知文献中记载的腈水合酶的序列中选择使用。另外，可以从上述的日本特开平9-275978号公报、日本特开2004-194588号公报、日本特开2005-160403号公报、国际公开第2004/056990号、国际公开第2010/055666号中记载的修饰腈水合酶的序列中选择使用。这种情况下，在上述专利文献中记载的改良的基础上，通过导入氨基酸残基取代(a)～(e)中一者以上，还能够得到提高pH稳定性这样的新效果。
需要说明的是，可用作氨基酸残基取代(a)～(e)中一者以上的导入对象的修饰腈水合酶也可以是N末端起第36位的氨基酸残基(与来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的氨基酸序列中的N末端起第36位的Thr残基在比对上对应的氨基酸残基)为Trp残基(后文中也称为氨基酸残基取代(f))的修饰腈水合酶。从得到具有进一步提高的pH稳定性的突变型腈水合酶的观点考虑，除了氨基酸残基取代(a)～(e)中一者以上之外还具有氨基酸残基取代(f)是优选的。换言之，存在氨基酸残基取代(f)时，存在由氨基酸残基取代(a)至(e)带来的效果进一步增强的趋势。
另外，例如，国际公开第2010/055666号中记载了向来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的氨基酸序列中导入以下这样的氨基酸残基取代(以下，也称为氨基酸残基取代组B)。
α亚基的氨基酸序列中的氨基酸残基取代(以将α亚基的N末端作为基准的位置来表示)：
将第6位的氨基酸残基即Leu取代为Thr或Ala；
将第13位的氨基酸残基即Ile取代为Leu；
将第19位的氨基酸残基即Ala取代为Val；
将第27位的氨基酸残基即Met取代为Ile；
将第36位的氨基酸残基即Thr取代为Met、Ser、Gly或Ala；
将第48位的氨基酸残基即Asn取代为Gln；
将第71位的氨基酸残基即Arg取代为His；
将第92位的氨基酸残基即Asp取代为Glu；
将第94位的氨基酸残基即Met取代为Ile；
将第126位的氨基酸残基即Phe取代为Tyr；
将第148位的氨基酸残基即Gly取代为Asp；
将第188位的氨基酸残基即Thr取代为Gly；
将第197位的氨基酸残基即Gly取代为Cys；
将第204位的氨基酸残基即Val取代为Arg。
β亚基的氨基酸序列中的氨基酸残基取代(以将β亚基的N末端作为基准的位置来表示)：
将第4位的氨基酸残基即Val取代为Met；
将第8位的氨基酸残基即Gly取代为Ala；
将第10位的氨基酸残基即Thr取代为Asp；
将第24位的氨基酸残基即Val取代为Ile；
将第33位的氨基酸残基即Ala取代为Val或Met；
将第37位的氨基酸残基即Phe取代为Val或Leu；
将第40位的氨基酸残基即Thr取代为Ile、Val或Leu；
将第41位的氨基酸残基即Phe取代为Ile；
将第46位的氨基酸残基即Met取代为Lys；
将第48位的氨基酸残基即Leu取代为Val；
将第51位的氨基酸残基即Phe取代为Val；
将第61位的氨基酸残基即Ala取代为Val、Gly、Trp、Ser、Leu或Thr；
将第79位的氨基酸残基即His取代为Asn；
将第96位的氨基酸残基即Gln取代为Arg；
将第107位的氨基酸残基即Pro取代为Met；
将第108位的氨基酸残基即Glu取代为Asp或Arg；
将第110位的氨基酸残基即Glu取代为Asn；
将第112位的氨基酸残基即Lys取代为Val或Ile；
将第118位的氨基酸残基即Phe取代为Val；
将第127位的氨基酸残基即Leu取代为Ser；
将第146位的氨基酸残基即Arg取代为Gly；
将第150位的氨基酸残基即Ala取代为Asn或Ser；
将第160位的氨基酸残基即Arg取代为Cys、Trp或Met；
将第168位的氨基酸残基即Thr取代为Glu；
将第176位的氨基酸残基即Tyr取代为Ala、Thr、Met或Cys；
将第186位的氨基酸残基即Leu取代为Arg；
将第200位的氨基酸残基即Ala取代为Glu；
将第206位的氨基酸残基即Pro取代为Leu；
将第212位的氨基酸残基即Ser取代为Tyr；
将第217位的氨基酸残基即Asp取代为Val、His、Met、Gly、Ser、Leu或Cys；
将第218位的氨基酸残基即Cys取代为Met或Ser；
将第226位的氨基酸残基即Val取代为Ile；
将第230位的氨基酸残基即Ala取代为Glu；
将第231位的氨基酸残基即Ala取代为Val。
可用作氨基酸残基取代(a)～(e)中一者以上的导入对象的修饰腈水合酶在与来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的氨基酸序列进行比较时，可以含有选自上述氨基酸残基取代组B中的1个以上氨基酸残基取代，其中也可以进一步具有氨基酸残基取代(f)。上述氨基酸残基取代也可以组合含有2个以上。这样的组合的例子也在国际公开第2010/055666号中记载了许多。另外，修饰腈水合酶当然应具有腈水合酶活性。
例如，组合含有3个的情况下，作为例子可举出：
α亚基中的Thr36Ser及Asp92Glu以及β亚基中的Ala33Val的组合；
α亚基中的Met94Ile以及β亚基中的Ala61Gly及Ala150Asn的组合；
β亚基中的Val4Met、Tyr176Ala及Asp217Val的组合；
β亚基中的Ala33Met、His79Asn及Tyr176Thr的组合；
β亚基中的Thr40Val、Cys218Met及Val226Ile的组合；等等。
另外，例如组合含有8个的情况下，作为例子可举出：
α亚基中的Ile13Leu、Ala19Val、Arg71His及Phe126Tyr以及β亚基中的Phe37Leu、Gln96Arg、Glu108Asp及Ala200Glu的组合(国际公开第2010/055666号：59号转化体)；
α亚基中的Leu6Thr、Met27Ile、Thr36Met及Phe126Tyr以及β亚基中的Thr10Asp、Pro107Met、Phe118Val及Ala200Glu的组合(国际公开第2010/055666号：68号转化体)；
α亚基中的Leu6Thr、Thr36Met及Phe126Tyr以及β亚基中的Thr10Asp、Phe118Val、Ala200Glu、Pro206Leu及Ala230Glu的组合(国际公开第2010/055666号：92号转化体)；
α亚基中的Leu6Thr、Ala19Val及Phe126Tyr以及β亚基中的Leu48Val、His79Asn、Glu108Arg、Ser212Tyr及Ala230Glu的组合(国际公开第2010/055666号：85号转化体)；
α亚基中的Thr36Met、Gly148Asp及Val204Arg以及β亚基中的Phe41Ile、Phe51Val、Glu108Asp、Pro206Leu及Ala230Glu的组合(国际公开第2010/055666号：93号转化体)。
另外，可用作氨基酸残基取代(a)～(e)中一者以上的导入对象的修饰腈水合酶的氨基酸序列与来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的氨基酸序列进行比较时，也可以含有上述例示的位点(氨基酸残基取代组B及氨基酸残基取代(f))以外的氨基酸残基处的氨基酸残基取代。即使针对这样的在氨基酸残基取代组B中1个以上氨基酸残基取代及/或氨基酸残基取代(f)的基础上、或者在没有氨基酸残基取代组B的氨基酸残基取代和氨基酸残基取代(f)的情况下含有除了氨基酸残基取代组B及氨基酸残基取代(f)以外的氨基酸残基处的氨基酸残基取代的修饰腈水合酶而导入氨基酸残基取代(a)～(e)中一者以上，仍然可如后述那样通过立体结构上的稳定化而起到提高修饰腈水合酶所具有的pH稳定性的效果。
针对上述的来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶或修饰腈水合酶而导入氨基酸残基取代(a)～(e)中一者以上，从而能够得到本公开文本涉及的突变型腈水合酶。
前述突变腈水合酶也可以含有氨基酸残基取代(a)～(e)及(f)中的、表I所示的2个氨基酸残基取代的组合。
[表1]
表I
前述突变腈水合酶也可以含有氨基酸残基取代(a)～(e)及(f)中的、表II所示的3个氨基酸残基取代的组合。
[表2]
表II
前述突变腈水合酶也可以含有氨基酸残基取代(a)～(e)及(f)中的、表III所示的4个氨基酸残基取代的组合。
[表3]
表III
前述突变腈水合酶也可以含有氨基酸残基取代(a)～(e)及(f)中的、表IV所示的5个氨基酸残基取代的组合。
[表4]
表IV
前述突变腈水合酶也可以含有氨基酸残基取代(a)～(e)及(f)全部(表V所示的6个氨基酸残基取代)的组合。
[表5]
表V
可用作氨基酸残基取代(a)～(e)中一者以上的导入对象的修饰腈水合酶的氨基酸序列也可以是国际公开第2010/055666号等中制备的修饰腈水合酶的氨基酸序列或与其相似的序列。因此，本公开文本涉及的突变型腈水合酶也可以是例如将下述取代中的至少一者导入以下腈水合酶(1)～(47)中任一者而得到的腈水合酶(以下也称为突变型腈水合酶B)：
α亚基的N末端起第40位的氨基酸残基取代为Asn的取代；
α亚基的N末端起第43位的氨基酸残基取代为Val的取代；
β亚基的N末端起第205位的氨基酸残基取代为Val的取代；
β亚基的N末端起第206位的氨基酸残基取代为Gln的取代；
β亚基的N末端起第215位的氨基酸残基取代为Asn的取代，
(1)包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号2的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(2)包含具有序列号16的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号33的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(3)包含具有序列号17的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号33的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(4)包含具有序列号18的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号34的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(5)包含具有序列号19的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号34的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(6)包含具有序列号20的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号35的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(7)包含具有序列号20的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号36的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(8)包含具有序列号21的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号37的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(9)包含具有序列号21的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号38的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(10)包含具有序列号21的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号39的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(11)包含具有序列号21的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号40的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(12)包含具有序列号18的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号41的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(13)包含具有序列号18的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号42的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(14)包含具有序列号21的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号43的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(15)包含具有序列号22的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号44的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(16)包含具有序列号23的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号45的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(17)包含具有序列号24的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号46的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(18)包含具有序列号25的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号47的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(19)包含具有序列号18的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号48的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(20)包含具有序列号23的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号49的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(21)包含具有序列号16的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号50的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(22)包含具有序列号26的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号51的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(23)包含具有序列号27的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号52的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(24)包含具有序列号28的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号53的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(25)包含具有序列号17的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号54的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(26)包含具有序列号29的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号55的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(27)包含具有序列号18的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号56的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(28)包含具有序列号18的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号57的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(29)包含具有序列号30的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号58的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(30)包含具有序列号29的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号59的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(31)包含具有序列号31的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号60的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(32)包含具有序列号18的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号61的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(33)包含具有序列号32的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号62的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(34)包含具有序列号30的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号63的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(35)包含具有序列号30的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号64的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(36)包含具有序列号30的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号65的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(37)包含具有序列号25的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号54的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(38)包含具有序列号30的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号66的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(39)包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号67的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(40)包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号68的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(41)包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号69的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(42)包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号70的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(43)包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号71的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(44)包含具有序列号21的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号72的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(45)包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号73的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
(46)使上述(1)～(45)的腈水合酶中任一者中的α亚基的N末端起第36位的氨基酸残基为Trp残基而得到的腈水合酶；
(47)修饰腈水合酶，其包含：作为上述(1)～(46)的腈水合酶中任一者的特定腈水合酶的α亚基的氨基酸序列、或包含与该氨基酸序列具有70％以上的序列同一性的氨基酸序列的α亚基变体；和前述特定腈水合酶的β亚基的氨基酸序列、或包含与该氨基酸序列具有70％以上的序列同一性的氨基酸序列的β亚基变体，其中，α亚基的氨基酸序列及β亚基的氨基酸序列中的至少一者为α亚基变体或β亚基变体的氨基酸序列。
需要说明的是，上述的腈水合酶(2)～(45)与包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基和具有序列号2的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶(1)进行比较时，在以下表6～表13中记载的氨基酸残基处不同，在国际公开第2010/055666号中与转化体编号一同记载。在以下表中，突变位点栏的数字表示对应亚基的氨基酸序列的N末端起的位置。另外，转化体编号为国际公开第2010/055666号中标示的编号。
[表6]
[表7]
[表8]
[表9]
[表10]
[表11]
[表12]
[表13]
可用作氨基酸残基取代(a)～(e)中一者以上的导入对象的修饰腈水合酶的氨基酸序列优选为上述(2)～(45)的44个之中任一腈水合酶的氨基酸序列，更优选为上述(3)、(11)、(18)、(19)、(25)、(27)、(28)、(29)、(32)、(33)、(34)、(35)、(36)、(37)、(38)、(39)、(40)、(41)、(42)、(43)、(44)、及(45)之中任一腈水合酶的氨基酸序列。
上述(47)中，α亚基变体的氨基酸序列相对于特定腈水合酶的α亚基的序列同一性可以为80％以上，或者可以为85％以上，或者可以为90％以上，或者可以为95％以上，或者可以为96％以上，或者可以为97％以上，或者可以为98％以上，或者可以为99％以上。同样地，上述(47)中，β亚基变体的氨基酸序列相对于特定腈水合酶的β亚基的序列同一性可以为80％以上，或者可以为85％以上，或者可以为90％以上，或者可以为95％以上，或者可以为96％以上，或者可以为97％以上，或者可以为98％以上，或者可以为99％以上。另外，所谓α亚基变体，是指满足上述中规定的序列同一性、但具有与特定腈水合酶的α亚基不同的氨基酸序列的α亚基。所谓β亚基变体，是指满足上述中规定的序列同一性、但具有与特定腈水合酶的β亚基不同的氨基酸序列的β亚基。
上述(2)～(45)的腈水合酶是其活性已在国际公开第2010/055666号中的实施例中得到确认(5、62、68、95及111号转化体)的腈水合酶，另外，上述(1)的腈水合酶是来源于野生型的嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶。(2)～(46)的腈水合酶也可用作氨基酸残基取代(a)～(e)中一者以上的导入对象。另外，具有与该腈水合酶的氨基酸序列相似的氨基酸序列的其他修饰腈水合酶也可用作氨基酸残基取代(a)～(e)中一者以上的导入对象。因此，关于针对修饰腈水合酶与来源于野生型的嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶之间的氨基酸序列的差异所说明的事项(包括对于序列修饰的程度、例子的说明)，可以将“来源于野生型的嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶”与上述(1)～(46)中任一腈水合酶互换读出而直接适用。另外，修饰腈水合酶当然应具有腈水合酶活性。
例如，对于上述突变型腈水合酶B可能含有的氨基酸残基取代及其组合、以及腈水合酶的α亚基的N末端起第36位的氨基酸残基而言，前述突变型腈水合酶B可以含有选自由前述表I中记载的氨基酸残基组合a～o、前述表II中记载的氨基酸残基组合p～ai、前述表III中记载的氨基酸残基组合aj～ax、前述表IV中记载的氨基酸残基组合ay～bd、及前述表V中记载的氨基酸残基组合be组成的组中的氨基酸残基的组合。即，可以向上述(1)～(46)的腈水合酶的氨基酸序列中导入这样的氨基酸残基取代的组合。
另外，例如，上述(47)的腈水合酶也可以是对上述(1)～(46)的腈水合酶中的任一者施以选自由下述(i)～(v)组成的组中的1种以上修饰而得到的修饰腈水合酶：(i)1个以上氨基酸残基取代为其他氨基酸残基的取代、(ii)上述(a)～(e)以外的1个以上氨基酸残基的缺失、(iii)氨基酸残基的插入、(iv)向α亚基的氨基酸序列的N末端及C末端中的一者或两者添加氨基酸残基、(v)向β亚基的氨基酸序列的N末端及C末端中的一者或两者添加氨基酸残基。
前述(47)的腈水合酶的α亚基中，以上述(1)～(46)中任一腈水合酶的α亚基作为基准时，被取代的氨基酸残基的数量为例如1～20个、或者1～15个、或者1～10个、或者1～8个、或者1～7个、或者1～6个、或者1～5个、或者1～4个、或者1～3个、或者1～2个、或者1个。被取代的氨基酸残基的数量也可以是0。
前述(47)的腈水合酶的β亚基中，以上述(1)～(46)中任一腈水合酶的β亚基作为基准时，被取代的氨基酸残基的数量为例如1～20个、或者1～15个、或者1～10个、或者1～8个、或者1～7个、或者1～6个、或者1～5个、或者1～4个、或者1～3个、或者1～2个、或者1个。被取代的氨基酸残基的数量也可以是0。
前述(47)的腈水合酶的α亚基中，以上述(1)～(46)中任一腈水合酶的α亚基作为基准时，缺失的氨基酸残基的数量为例如1～10个、或者1～7个、或者1～4个、或者1～2个、或者1个。缺失的氨基酸残基的数量也可以是0。
前述(47)的腈水合酶的β亚基中，以上述(1)～(46)中任一腈水合酶的β亚基作为基准时，缺失的氨基酸残基的数量为例如1～10个、或者1～7个、或者1～4个、或者1～2个、或者1个。缺失的氨基酸残基的数量也可以是0。
前述(47)的腈水合酶的α亚基中，以上述(1)～(46)中任一腈水合酶的α亚基作为基准时，插入的氨基酸残基的数量为例如1～10个、或者1～7个、或者1～4个、或者1～2个、或者1个。插入的氨基酸残基的数量也可以是0。
前述(47)的腈水合酶的β亚基中，以上述(1)～(46)中任一腈水合酶的β亚基作为基准时，插入的氨基酸残基的数量为例如1～10个、或者1～7个、或者1～4个、或者1～2个、或者1个。插入的氨基酸残基的数量也可以是0。
前述(47)的腈水合酶的α亚基中，以上述(1)～(46)中任一腈水合酶的α亚基作为基准时，取代、缺失或插入的氨基酸残基的总数为例如1～20个、或者1～14个、或者1～8个、或者1～4个、或者1～2个、或者1个。存在末端添加等情况下，取代、缺失或插入的氨基酸残基的总数也可以是0。
前述(47)的修饰腈水合酶的β亚基中，以上述(1)～(46)中任一腈水合酶的β亚基作为基准时，取代、缺失或插入的氨基酸残基的总数为例如1～20个、或者1～14个、或者1～8个、或者1～4个、或者1～2个、或者1个。存在末端添加等情况下，取代、缺失或插入的氨基酸残基的总数也可以是0。
前述(47)的腈水合酶的α亚基中，以上述(1)～(46)中任一腈水合酶的α亚基作为基准时，末端添加的氨基酸残基的数量为例如每一个末端为1～60个、或者1～40个、或者1～20个、或者1～10个、或者1～5个、或者1～3个、或者1个。添加的氨基酸残基的数量也可以是0。
前述(47)的腈水合酶的β亚基中，以上述(1)～(46)中任一腈水合酶的β亚基作为基准时，末端添加的氨基酸残基的数量为例如每一个末端为1～60个、或者1～40个、或者1～20个、或者1～10个、或者1～5个、或者1～3个、或者1个。添加的氨基酸残基的数量也可以是0。
前述(47)的腈水合酶也可以是在与(1)～(46)中任一腈水合酶的氨基酸序列进行比较时、含有选自上述氨基酸残基取代组B中的1个以上氨基酸残基取代的腈水合酶。上述氨基酸残基取代可以组合含有2个以上。
上述中(47)的α/β亚基变体也可以是在与特定腈水合酶的α/β亚基的氨基酸序列进行比较时不含有氨基酸的插入或氨基酸残基的缺失、而仅含有氨基酸残基的取代或末端添加的亚基变体。对于(47)的α/β亚基变体中的氨基酸残基的位置而言，与前述同样地，是指与特定腈水合酶的α/β亚基中的指定的氨基酸残基在比对上对应的位置。
本公开文本涉及的突变型腈水合酶也可以是将以下氨基酸残基取代中至少一者导入至作为上述腈水合酶(1)～(46)中任一腈水合酶的特定腈水合酶，或者
导入至修饰腈水合酶(其包含相对于特定腈水合酶的α亚基具有70％以上的序列同一性的修饰α亚基、及相对于特定腈水合酶的β亚基具有70％以上的序列同一性的修饰β亚基，但不是特定腈水合酶自身)而得到的突变型腈水合酶(以下也称为突变型腈水合酶C)：
与前述特定腈水合酶的α亚基的N末端起第40位的氨基酸残基对应的氨基酸残基取代为Asn的取代；
与前述特定腈水合酶的α亚基的N末端起第43位的氨基酸残基对应的氨基酸残基取代为Val的取代；
与前述特定腈水合酶的β亚基的N末端起第205位的氨基酸残基对应的氨基酸残基取代为Val的取代；
与前述特定腈水合酶的β亚基的N末端起第206位的氨基酸残基对应的氨基酸残基取代为Gln的取代；
与前述特定腈水合酶的β亚基的N末端起第215位的氨基酸残基对应的氨基酸残基取代为Asn的取代。
上述说明中，前述导入前的腈水合酶为前述修饰腈水合酶的情况下，所谓“与特定腈水合酶的α亚基的N末端起第A位的氨基酸残基对应的氨基酸残基”，是指将前述修饰腈水合酶的α亚基的氨基酸序列与特定腈水合酶的α亚基的氨基酸序列进行比对时，与特定腈水合酶的α亚基的氨基酸序列的N末端起第A位的氨基酸残基对应的修饰腈水合酶的α亚基的氨基酸序列上的氨基酸残基，同样地，所谓“与特定腈水合酶的β亚基的N末端起第A位的氨基酸残基对应的氨基酸残基”，是指将前述修饰腈水合酶的β亚基的氨基酸序列与特定腈水合酶的β亚基的氨基酸序列进行比对时，与特定腈水合酶的β亚基的氨基酸序列的N末端起第A位的氨基酸残基对应的修饰腈水合酶的β亚基的氨基酸序列上的氨基酸残基。另外，前述导入前的腈水合酶为特定腈水合酶的情况下，所谓“与特定腈水合酶的α亚基的N末端起第A位的氨基酸残基对应的氨基酸残基”，是指特定腈水合酶的α亚基的N末端起第A位的氨基酸残基，所谓“与特定腈水合酶的β亚基的N末端起第A位的氨基酸残基对应的氨基酸残基”，是指特定腈水合酶的β亚基的N末端起第A位的氨基酸残基。
上述修饰腈水合酶中，其α亚基相对于特定腈水合酶的α亚基的序列同一性可以为80％以上，或者可以为85％以上，或者可以为90％以上，或者可以为95％以上，或者可以为96％以上，或者可以为97％以上，或者可以为98％以上，或者可以为99％以上。同样地，其β亚基相对于上述特定腈水合酶的β亚基的序列同一性可以为80％以上，或者可以为85％以上，或者可以为90％以上，或者可以为95％以上，或者可以为96％以上，或者可以为97％以上，或者可以为98％以上，或者可以为99％以上。特别地，上述修饰腈水合酶中，其α亚基相对于特定腈水合酶的α亚基的序列同一性优选为90％以上，更优选为95％以上。同样地，上述修饰腈水合酶中，其β亚基相对于特定腈水合酶的β亚基的序列同一性优选为90％以上，更优选为95％以上。关于针对修饰腈水合酶与来源于野生型的嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶之间的氨基酸序列的差异所说明的事项(包括对于序列修饰的程度、例子的说明)，可以将“来源于野生型的嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶”与特定腈水合酶互换读出而直接适用。上述中修饰腈水合酶的α/β亚基的氨基酸序列也可以是在与特定腈水合酶的α/β亚基的氨基酸序列进行比较时不含有氨基酸的插入或氨基酸残基的缺失、而仅含有氨基酸残基的取代或末端添加的氨基酸序列。另外，修饰腈水合酶当然应具有腈水合酶活性。
对于上述突变型腈水合酶C可能含有的氨基酸残基取代及其组合、以及与前述特定腈水合酶的α亚基的N末端起第36位对应的氨基酸残基而言，前述突变型腈水合酶C可以含有选自由前述表I中记载的氨基酸残基组合a～o、前述表II中记载的氨基酸残基组合p～ai、前述表III中记载的氨基酸残基组合aj～ax、前述表IV中记载的氨基酸残基组合ay～bd、及前述表V中记载的氨基酸残基组合be组成的组中的氨基酸残基的组合。即，可以向特定腈水合酶或修饰腈水合酶的氨基酸序列中导入这样的氨基酸残基取代的组合。
另外，例如，前述修饰腈水合酶也可以是在与(1)～(46)中任一腈水合酶的氨基酸序列进行比较时、含有选自上述氨基酸残基取代组B中的1个以上氨基酸残基取代的腈水合酶。上述氨基酸残基取代组合含有2个以上。
需要说明的是，以上说明的修饰腈水合酶也可以是包含向上述中限定的α亚基或者其N末端或C末端或这两者添加附加序列而得到的多肽、和向上述中限定的β亚基或者其N末端或C末端或这两者添加附加序列而得到的多肽的腈水合酶。前述修饰腈水合酶的α亚基中，末端添加的氨基酸残基的数量为例如每一个末端为1～60个、或者1～40个、或者1～20个、或者1～10个、或者1～5个、或者1～3个、或者1个。添加的氨基酸残基的数量也可以是0。前述修饰腈水合酶的β亚基中，末端添加的氨基酸残基的数量为例如每一个末端为1～60个、或者1～40个、或者1～20个、或者1～10个、或者1～5个、或者1～3个、或者1个。添加的氨基酸残基的数量也可以是0。
修饰腈水合酶的α亚基中，含有添加、取代、缺失、及/或插入的氨基酸序列(不包括前述(a)及(b)的被取代的氨基酸残基)的情况下，取代、缺失、及/或插入的氨基酸残基的总数优选为1～10个，更优选为1～5个。同样地，修饰腈水合酶的β亚基中，含有添加、取代、缺失、及/或插入的氨基酸序列(不包括前述(c)～(e)的被取代的氨基酸残基)的情况下，取代、缺失、及/或插入的氨基酸残基的总数优选为1～10个，更优选为1～5个。
本公开文本涉及的突变型腈水合酶通常是2个如上述规定的α亚基与2个如上述规定的β亚基进行缔合而发挥功能的腈水合酶。
本公开文本涉及的突变型腈水合酶与以往的腈水合酶突变体不同，即使在pH3.5～6.5等酸性条件下，仍然对于由腈化合物合成酰胺化合物的反应显示良好的酶活性。本公开文本涉及的突变型腈水合酶所具有的在前述酸性条件下的酶活性的稳定性的提高在pH5.0以下的范围内尤为显著。因此，根据前述突变型腈水合酶，在利用腈水合酶的工业性酰胺化合物制造工艺中，除了使由腈化合物合成酰胺化合物的反应进行的反应工序以外，在pH3.5～6.5等酸性条件下使用活性炭、将该溶液中存在的蛋白质等杂质吸附除去而得到经纯化的酰胺化合物的纯化工序中，也能够使作为底物的腈化合物转化为酰胺化合物的该酰胺化合物的合成反应充分地进行。因此，利用前述突变型腈水合酶，较之使用以往的酶的情况而言，在工业性酰胺化合物制造工艺中，能够飞跃性地提高作为目标产物的酰胺化合物的制造效率。对于前述酸性条件而言，为了更高效地除去不需要的蛋白质，也可以在5.0以下的pH、例如pH3.5～pH5.0的条件下实施。
另外，优选的是，已施以酸处理(例如pH4.0、30℃、30小时的处理)的突变型腈水合酶的反应初速度与未施以酸处理的突变型腈水合酶的反应初速度之比(酸处理后的反应初速度/酸处理前的反应初速度)的值相对于已施以酸处理的来源于野生型的嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的反应初速度与未施以酸处理的来源于野生型的嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的反应初速度之比(酸处理后的反应初速度/酸处理前的反应初速度)的值而言显示为1.1倍以上的值。
需要说明的是，上述突变型腈水合酶或来源于野生型的嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的pH稳定性可以通过例如以下方法进行评价。
作为反应条件，使用含有2.5％(v/v)作为底物的丙烯腈的50mM Tris盐酸水溶液(pH8.0)，使其于反应温度20℃反应15分钟至60分钟。反应结束后，对生成的丙烯酰胺进行定量。丙烯酰胺量可利用HPLC进行分析。另外，酸处理可以例如在pH4.0左右、于30℃处理30小时。具体而言，可以通过实施例中pH稳定性的评价栏中记载的方法进行评价。
例如，将生产腈水合酶的转化体的培养结束液40μL悬浮于740μL的54mM Tris盐酸水溶液(pH8.0)中，向其中添加20μL丙烯腈，一边于20℃缓缓搅拌一边使其反应15分钟至60分钟，在反应结束后使用HPLC分析反应液，测定生成的酰胺化合物的量(P)(或者也可以由消耗的腈化合物的量计算)。另外，取前述转化体的培养结束液1000μL进行离心分离，向回收的菌体中添加50mM柠檬酸缓冲液(pH4.0)1000μL，一边搅拌一边于30℃处理30小时(酸处理)。处理后，将780μL进行离心分离并回收菌体，悬浮于780μL的54mM Tris盐酸水溶液(pH8.0)中，向其中添加20μL的丙烯腈，一边于20℃缓缓搅拌一边使其反应15分钟至60分钟，在反应结束后使用HPLC分析反应液，测定生成的酰胺化合物的量(Q)(或者也可以由消耗的腈化合物的量计算)。反应及分析针对各条件实施3次以上。将利用酸处理后的腈水合酶得到的酰胺化合物的量(Q)除以利用酸处理前的腈水合酶得到的酰胺化合物的量(P)，求出商(R)。针对来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶、及作为试验对象的腈水合酶分别求出商R，求出作为试验对象的腈水合酶的R值与来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的R之比(试验对象/野生型)。若该比大于1.0，则表示较之来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶而言，pH稳定性提高。
本公开文本涉及的突变型腈水合酶是较之来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶而言通过上述求出的R值更高的突变型腈水合酶，突变型腈水合酶的R值优选为来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的R值的1.1倍以上，更优选为1.2倍以上，更优选为1.3倍以上，更优选为1.4倍以上。
另外，如上所述，前述突变型腈水合酶从对于由腈化合物合成酰胺化合物的反应、在与以往的突变型腈水合酶相比更宽泛的pH范围内显示酶活性这一点来看是pH稳定性优异的酶。并且，本申请的发明人对上述(a)～(e)的氨基酸残基取代均可提高腈水合酶的酶活性的pH稳定性的重要因素进行了调查，结果判明，与上述(a)～(e)的氨基酸残基取代相关的氨基酸均存在于酶的底物口袋(pocket)附近。认为通过含有上述(a)～(e)的氨基酸残基取代中的一者以上，从而蛋白质的立体结构(折叠状态)在宽泛的pH范围内保持为良好的状态。因此，认为上述(a)至(e)的氨基酸残基取代是一组氨基酸残基取代(氨基酸残基取代组A)。
另外，对于前述突变型腈水合酶而言，α亚基与β亚基缔合而成的二聚体成为其基本结构单元，该二聚体进一步缔合形成四聚体。α亚基的N末端起第111位的氨基酸残基即半胱氨酸残基被翻译为半胱亚磺酸(cysteine sulfinic acid)(Cys-SOOH)、N末端起第113位的氨基酸残基即半胱氨酸残基被翻译为半胱次磺酸(cysteine sulfenic acid)(Cys-SOH)后，分别受到修饰，通过该修饰氨基酸残基，使得α亚基的多肽链与钴原子键合，形成活性中心。
作为能够将来源于野生型的嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)的腈水合酶在转化体内大量表达的质粒及利用该质粒进行转化而得到的细胞株，可使用MT-10822(于1996年2月7日保藏在茨城县筑波市东1-1-1独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号为FERM BP-5785)。另外，修饰腈水合酶可使用通常的基因操作技术获得。对于蛋白质的立体结构而言，通常，氨基酸序列的同源性高的情况下，认为不受含有该蛋白质的菌株种属的影响，具有类似结构的可能性高，因此，对于包括修饰腈水合酶在内的上述中规定的来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶通常可发挥通过导入氨基酸残基取代(a)～(e)中一者以上而得到的效果。并且，对于得到的突变型腈水合酶而言，例如，通过与pH8.0时的酶活性相较而言的pH4.0时的酶活性进行评价的pH稳定性较之导入氨基酸残基取代(a)～(e)中一者以上之前可以有所提高。
另外，前述突变型腈水合酶是含有上述(a)～(e)的氨基酸残基取代中至少一者的突变型腈水合酶。前述突变型腈水合酶可以仅含有(a)～(e)的氨基酸残基取代中的1个，也可以含有2个以上。例如，2个的组合的情况下，可举出(a)和(b)的组合、(a)和(c)的组合、(a)和(d)的组合、(a)和(e)的组合、(b)和(c)的组合、(b)和(d)的组合、(b)和(e)的组合、(c)和(d)的组合、(c)和(e)的组合、(d)和(e)的组合、及(d)和(f)的组合。
3个的组合的情况下，可举出例如(a)、(b)及(c)的组合、(a)、(b)及(d)的组合、(a)、(b)及(e)的组合、(a)、(c)及(d)的组合、(a)、(c)及(e)的组合、(a)、(d)及(e)的组合、(b)、(c)及(d)的组合、(b)、(c)及(e)的组合、(b)、(d)及(e)的组合、以及(c)、(d)及(e)的组合。
4个的组合的情况下，可举出例如(a)、(b)、(c)及(d)的组合、(a)、(b)、(c)及(e)的组合、(a)、(b)、(d)及(e)的组合、(a)、(c)、(d)及(e)的组合、以及(b)、(c)、(d)及(e)的组合。
当然，(a)～(e)也可将5个组合进行取代。
一个实施方式中，前述突变型腈水合酶含有上述(b)的氨基酸残基取代、及除此以外的由上述(a)及(c)～(e)的氨基酸残基取代组成的组中的1个以上氨基酸残基取代。与上述(b)的氨基酸残基取代一同被含有的、由上述(a)及(c)～(e)的氨基酸残基取代组成的组中的1个以上氨基酸残基取代可以是2个氨基酸残基取代，也可以是3个氨基酸残基取代，也可以是4个氨基酸残基取代(即，(a)及(c)～(e)中的全部)。另外，该实施方式中，前述突变型腈水合酶可以还具有前述(f)的氨基酸残基取代。
并且，如上所述，作为导入(a)～(e)的氨基酸残基取代中至少一者的对象的修饰腈水合酶也可以是相对于来源于野生型的嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶或上述的(1)～(5)的特定序列而言含有氨基酸的取代等修饰的修饰腈水合酶。因此，突变型腈水合酶也可以在与来源于野生型的嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶或上述的(1)～(5)的特定序列比较时、除了上述(a)～(e)的氨基酸残基取代以外还含有上述(a)～(e)的氨基酸残基取代以外的位置的氨基酸残基取代。即使是这样含有其他氨基酸残基取代的突变型腈水合酶，仍然能够得到由位于立体结构上的特定位置的氨基酸残基取代组A带来的效果。
一个实施方式中，本公开文本涉及的突变型腈水合酶不仅pH稳定性提高，在由腈化合物生成酰胺化合物的反应的初速度方面也具有提高。即，通过将(a)～(e)的氨基酸残基取代中至少一者导入来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶或修饰腈水合酶，从而可得到显示较之导入前的反应初速度而言有所提高的反应初速度的腈水合酶。反应初速度例如可通过下述方法求出：将生产突变型腈水合酶的转化体的培养结束液40μL悬浮于740μL的54mM Tris盐酸水溶液(pH8.0)中，向其中添加20μL的丙烯腈，一边于20℃缓缓搅拌一边使其反应15分钟至60分钟，在反应结束后使用HPLC分析反应液。另外，本公开文本涉及的突变型腈水合酶优选于pH8.0时显示比来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶更高的反应初速度，更优选显示高达1.1倍以上的反应初速度，更优选显示高达1.2倍以上的反应初速度，更优选显示高达1.3倍以上的反应初速度，更优选显示高达1.4倍以上的反应初速度。
前述突变型腈水合酶可以通过以下方法进行制造。
例如，准备含有编码前述突变型腈水合酶的DNA的表达载体，利用该表达载体对任意的宿主细胞进行转化，获得转化体或细胞株，接着，将前述转化体、细胞株进行培养，从而能够生产突变型腈水合酶。
此处，编码来源于野生型的嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的基因包含序列号3所示的核苷酸序列、和序列号4所示的核苷酸序列。需要说明的是，序列号3所示的核苷酸序列与由序列号1组成的氨基酸序列对应，序列号4所示的核苷酸序列与由序列号2组成的氨基酸序列对应。
并且，编码前述突变型腈水合酶的DNA至少在序列号3所示的核苷酸序列或序列号4所示的核苷酸序列中的、与上述(a)～(e)的氨基酸残基取代位置对应的密码子(共计5处)中一者以上处含有下述这样的核苷酸取代，在其他位置处也含有与修饰腈水合酶对应的核苷酸取代。
具体而言，例如，在制备将来源于野生型的嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的α亚基的N末端起第40位的氨基酸残基即Asp残基取代为Asn而得到的突变体的情况下，使用将序列号3所示的核苷酸序列的5’末端起第118～120位的核苷酸即GAC取代为AAC或AAT而得到的DNA即可。
在制备将来源于野生型的嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的α亚基的N末端起第43位的氨基酸残基即Ala残基取代为Val而得到的突变体的情况下，使用将序列号3所示的核苷酸序列的5’末端起第127～129位的核苷酸即GCC取代为GTT、GTC、GTA或GTG而得到的DNA即可。
在制备将来源于野生型的嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的β亚基的N末端起第205位的氨基酸残基即Gly残基取代为Val而得到的突变体的情况下，使用将序列号4所示的核苷酸序列的5’末端起第613～615位的核苷酸即GGG取代为GTT、GTC、GTA或GTG而得到的DNA即可。
在制备将来源于野生型的嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的β亚基的N末端起第206位的氨基酸残基即Pro残基取代为Gln而得到的突变体的情况下，使用将序列号4所示的核苷酸序列的5’末端起第616～618位的核苷酸即CCG取代为CAA或CAG而得到的DNA即可。
在制备将来源于野生型的嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的α亚基的N末端起第215位的氨基酸残基即Tyr残基取代为Asn而得到的突变体的情况下，使用将序列号4所示的核苷酸序列的5’末端起第643～645位的核苷酸即TAC取代为AAC或AAT而得到的DNA即可。
另外，关于氨基酸残基取代(f)，在制备将来源于野生型的嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的α亚基的N末端起第36位的氨基酸残基即Thr残基取代为Trp而得到的突变体的情况下，使用将序列号3所示的核苷酸序列的5’末端起第106～108位的核苷酸即ACG取代为TGG而得到的DNA即可。
前述表达载体含有编码突变型腈水合酶的α亚基的基因及编码突变型腈水合酶的β亚基的基因，另外，根据需要而含有各基因的表达所需的调控区及自主复制所需的区域等能够实现利用转化体、细胞株生产突变型腈水合酶的要素。供表达载体导入的宿主细胞可以是任意的细胞，可举出例如大肠杆菌。
作为表达所需的调控区，可举出启动子序列(包括调控转录的操纵序列)、核糖体结合序列(SD序列)、转录终止序列等。作为具体的启动子序列的例子，可举出来源于大肠杆菌的色氨酸操纵子的trp启动子、乳糖操纵子的lac启动子、来源于λ噬菌体的PL启动子及PR启动子等。另外，也可以利用tac启动子或trc启动子之类的人为设计·改良的序列。
作为核糖体结合序列，优选序列号74中所含的具有TAAGGAGGT的序列，对于上述调控区在表达载体上的序列顺序而言，启动子序列和核糖体结合序列优选位于比编码突变型腈水合酶的基因更靠5’末端侧上游，转录终止序列优选位于比编码突变型腈水合酶的基因更靠3’末端侧下游。另外，突变型腈水合酶的α亚基基因及β亚基基因可以利用如上所述的调控区而以各自独立的顺反子形式进行表达，也可以利用共同的调控区而以多顺反子形式进行表达。
作为满足以上条件的载体的例子，可举出包含能够在大肠杆菌中进行自主复制的区域的pBR322、pUC18、pBluescript、pKK223-3、pSC101。
关于通过将编码前述突变型腈水合酶的基因与该突变型腈水合酶的活性的表达所需的区域一同插入如上所述的载体中来构建本公开文本涉及的表达载体的方法、将该表达载体转化至所期望的宿主细胞的方法、以及在该转化体内使腈水合酶产生的方法等，可采用例如“分子克隆第三版(Molecular Cloning 3rd Edition)”(J.Sambrook等人；ColdSpring Harbor Laboratory Press,2001)等中记载的分子生物学、生物工程、及基因工程的领域中已知的常规方法、宿主细胞。
对于将上述的表达载体转化至所期望的宿主细胞而得到的转化体而言，通过在培养基中进行培养，可以生产基于前述表达载体所含有的腈水合酶基因的突变型腈水合酶。在宿主细胞为大肠杆菌的情况下，作为对前述转化体进行培养的培养基，一般使用LB培养基、M9培养基等，更优选为使这样的培养基中含有0.1μg/mL以上的Fe离子及Co离子作为成分而得到的培养基。将前述转化体接种至培养基后，使其在适当的培养温度(一般而言为20℃～50℃)下生长即可。
在使编码前述突变型腈水合酶的基因表达、生产具有所期望的酶活性的突变型腈水合酶的情况下，也可使编码参与腈水合酶的激活的蛋白质的基因一同表达。
该参与腈水合酶的激活的蛋白质是指具有该蛋白质是否表达直接影响腈水合酶的激活的性质的蛋白质，作为其代表例，可举出日本特开平11-253168号公报中记载的参与来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶激活的蛋白质(腈水合酶激活蛋白质)。前述腈水合酶激活蛋白质的序列示于序列号75。
＜核酸＞
本公开文本涉及的核酸具有编码前述突变型腈水合酶的氨基酸序列的核苷酸序列。
作为合成编码前述突变型腈水合酶的氨基酸序列的核苷酸序列的方法，可举出向编码对应的来源于野生型的嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的核苷酸序列中导入突变位点的方法、化学合成含有突变位点的全长核苷酸序列的方法等。作为以编码来源于野生型的嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的核苷酸序列作为模板、使基因发生突变的方法，可举出例如位点特异性突变法(Kramer,W.和frita,H.J.,Methods in Enzymology,vol.154,P.350(1987))、重组PCR法(PCR Technology,Stockton Press(1989))、化学合成特定部分的DNA的方法、对基因进行羟基胺处理的方法、对保有基因的菌株进行紫外线照射的方法、用亚硝基胍、亚硝酸等化学药剂进行处理的方法、使用市售的突变导入试剂盒的方法等。本公开文本涉及的核酸可以是DNA，也可以是RNA。
＜载体＞
本公开文本涉及的载体只要是含有编码前述突变型腈水合酶的氨基酸序列的核苷酸序列所示的核酸的载体即可，没有特别限定，作为例子，可举出向已知的载体中导入前述突变型腈水合酶而得到的载体。另外，前述载体可以是噬菌体载体，也可以是质粒载体。
＜表达载体＞
本公开文本涉及的表达载体只要是含有编码前述突变型腈水合酶的氨基酸序列的核苷酸序列所示的核酸的表达载体即可，没有特别限定，从提高转化效率、翻译效率等的观点考虑，更优选为呈现以下所示那样的构成的质粒载体、噬菌体载体。
〔表达载体的基本构成〕
表达载体只要是含有编码前述突变型腈水合酶的核苷酸序列、能够转化前述宿主细胞的表达载体即可，没有特别限定。根据需要，除了该核苷酸序列以外，也可以含有构成其他区域的核苷酸序列(以下也简称为“其他区域”)。
作为其他区域，例如，可举出对于前述转化体生产前述突变型腈水合酶而言必需的调控区、自主复制所需的区域等。
另外，从使前述转化体的筛选容易的观点考虑，可进一步含有编码能够成为筛选标记的筛选基因的核苷酸序列。
作为对于生产前述突变型腈水合酶而言必需的调控区，可举出启动子序列(包括调控转录的操纵子序列)、核糖体结合序列(SD序列)、转录终止序列等。
〔以酵母作为宿主细胞的情况下的表达载体〕
在以酵母作为宿主细胞的情况下，作为表达载体，优选除了编码前述突变型腈水合酶的核苷酸序列以外，还含有启动子序列。作为启动子序列，只要是能够在以酵母作为宿主细胞的转化体中表达前述突变型腈水合酶的启动子序列，则均可使用。
可使用例如乙醇脱氢酶(ADH1)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK1)启动子、肽链延伸因子(TEF)启动子、甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)启动子、半乳糖激酶(GAL1)启动子、金属硫蛋白(CUP1)启动子、抑制性酸性磷酸酶(PHO5)启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子等启动子序列。
需要说明的是，上述启动子序列的来源不限于作为宿主细胞的酵母。
也可使用巨细胞病毒(CMV)启动子等这样的外源的启动子。这些可根据使用的酶的来源、种类而适当选择。
另外，前述表达载体也可以含有分泌信号。由此，在转化体生产前述突变型腈水合酶的情况下，能够将前述突变型腈水合酶分泌至细胞外。
作为分泌信号，只要是能够从作为宿主细胞的酵母中分泌前述突变型腈水合酶的分泌信号即可，没有特别限定。从分泌效率的观点考虑，优选使用α因子信号序列、转化酶信号序列、酸性磷酸酶信号序列、葡糖淀粉酶信号序列等。
作为含有以上那样的启动子序列、分泌信号的表达载体，具体可举出pRS423、pRS424、YEplac195等。
〔以丝状菌作为宿主细胞的情况下的表达载体〕
在以丝状菌作为宿主细胞的情况下，作为表达载体，优选除了编码前述突变型腈水合酶的核苷酸序列以外，还含有启动子序列。作为启动子序列，只要是能够在以丝状菌作为宿主细胞的转化体中表达前述突变型腈水合酶的启动子序列，则均可使用。
对于丝状菌而言合适的表达载体记载于van den Hondel,C.A.M.J.J.等人(1991)In:Bennett,J.W.和Lasure,L.L.(eds.)More gene Manipulations in Fungi.AcademicPress,pp.396-428中。
另外，也可使用pUC18、pBR322、pUC100、pSL1180(Pharmacia Inc.制)、pFB6及曲霉属(Aspergillus)pRAX、木霉属(Trichoderma)pTEX等这样通常使用的其他表达载体。
〔以原核生物作为宿主细胞的情况下的表达载体〕
在以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、放线菌等原核生物作为宿主细胞的情况下，表达载体优选除了编码前述突变型腈水合酶的核苷酸序列以外，还含有启动子序列。另外，除了启动子序列以外还可以含有核糖体结合序列、转录终止序列等。
作为启动子序列的例子，可举出来源于大肠杆菌的色氨酸操纵子的trp启动子、乳糖操纵子的lac启动子、来源于λ噬菌体的PL启动子及PR启动子、来源于枯草芽孢杆菌的葡糖酸合成酶启动子(gnt)、碱性蛋白酶启动子(apr)、中性蛋白酶启动子(npr)、α-淀粉酶启动子(amy)等。
另外，也可利用tac启动子之类的独自经过改良或设计的启动子序列。
作为核糖体结合序列，可举出来源于大肠杆菌或来源于枯草芽孢杆菌的序列，但只要是能够在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等所期望的宿主细胞内发挥功能的序列即可，没有特别限定。
作为前述核糖体结合序列，可举出例如通过DNA合成来制备与16S核糖体RNA的3’末端区域互补的序列之中的、连续4个核苷酸以上的共有序列而得到的序列等。
转录终止序列不一定是必需的，但可利用ρ因子非依赖性的转录终止序列、例如脂蛋白终止子、trp操纵子终止子等。
上述调控区在表达载体上的序列顺序没有特别限制，考虑转录效率时，期望自5’末端侧上游起以启动子序列、核糖体结合序列、编码目标蛋白质的基因、转录终止序列的顺序排列。
作为此处所谓的表达载体的具体例，可利用包含能够在大肠杆菌中进行自主复制的区域的pBR322、pUC18、Bluescript II SK(+)、pKK223-3、pSC101、包含能够在枯草芽孢杆菌中进行自主复制的区域的pUB110、pTZ4、pC194、ρ11、φ1、φ105等作为表达载体。
另外，作为能够在2种以上宿主内进行自主复制的表达载体的例子，可以利用pHV14、TRp7、YEp7及pBS7等作为表达载体。
〔转化体的制备方法〕
本公开文本涉及的转化体可以利用已知的方法进行制备。例如，可举出构建含有编码本公开文本涉及的突变型腈水合酶的核苷酸序列、和前述其他区域(根据需要)的前述表达载体并将该表达载体转化至所期望的宿主细胞的方法等。具体而言，可利用Sambrook，J.等人，“分子克隆实验手册第三版(Molecular Cloning A Laboratory Manual,3rdEdition)”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(2001)
等中记载的分子生物学、生物工程及基因工程的领域中已知的常规方法。
对于本公开文本涉及的转化体而言，除了将前述表达载体组入前述宿主细胞中以外，还可以根据需要而一并实施导入沉默突变(使得前述宿主细胞中使用频率低的密码子成为使用频率高的密码子)的步骤等来进行制备。
由此，可能会增加来源于组入表达载体后的前述突变型腈水合酶的蛋白质的生产量。
关于沉默突变的导入，只要是对应于宿主细胞中的密码子使用频率而对位于表达载体上的该腈水合酶基因及用于使该腈水合酶基因分泌至细胞外的信号序列的密码子进行调节的方法即可，导入沉默突变的方法、突变位点、变更的核苷酸的种类等没有特别限制。
＜突变型腈水合酶的制造方法＞
本公开文本涉及的突变型腈水合酶的制造方法包括下述工序：在培养基中培养前述转化体的工序；以及，从培养后的转化体及培养基中的至少一者中回收前述突变型腈水合酶的工序。
〔转化体的培养方法〕
使用前述表达载体转化得到的转化体的培养条件与转化前的宿主细胞的培养条件相同，可使用已知的条件。
作为培养基，只要是含有适量的碳源、氮源、无机物及其他营养素的培养基，则合成培养基或天然培养基均可使用。作为培养基中使用的成分，可使用已知的成分。例如，可适当组合使用肉提取物、酵母提取物、麦芽提取物、蛋白胨、NZ胺及马铃薯等有机营养源、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉及有机酸等碳源、硫酸铵、尿素及氯化铵等氮源、磷酸盐、镁、钾及铁等无机营养源、维生素类。
需要说明的是，在利用前述含有筛选标记的表达载体转化得到的转化体的培养中，例如，在前述筛选标记具有耐药性时，使用含有与其对应的药剂的培养基，在前述筛选标记为营养缺陷性时，使用不含有与其对应的营养素的培养基。培养基的pH在pH4～pH8的范围内选择即可。
可在含有前述培养基的液体培养基中，使用振荡培养、通气搅拌培养、连续培养、分批补料式培养等通常的培养方法对前述转化体进行培养。
培养条件可根据前述转化体、培养基、培养方法的种类适当选择，只要是转化体生长、能够生产本公开文本涉及的突变型腈水合酶的条件即可，没有特别限制。
关于培养温度，于20℃～45℃、优选24℃～37℃进行好氧性培养。
关于培养时间，在1天～7天的范围内培养至具有目标的突变型腈水合酶活性的蛋白质的含量成为最大即可。
突变型腈水合酶回收工序
突变型腈水合酶回收工序是从培养后的转化体及培养后的培养基中的至少一者中回收前述突变型腈水合酶的工序。
在对转化后的转化体进行培养之后回收本公开文本涉及的前述突变型腈水合酶的方法可使用该领域中惯用的方法。
本公开文本涉及的前述突变型腈水合酶分泌至转化后的转化体外的情况下，可通过对该转化体的培养物进行离心分离、过滤等而容易地得到粗酶液。另外，本公开文本涉及的前述突变型腈水合酶在转化后的转化体内蓄积的情况下，利用离心分离等手段将培养后的该转化体回收，将回收的该转化体悬浮于缓冲液中，按照溶菌酶处理、冻融、超声波破碎等已知的方法将该转化体的细胞膜破坏，由此回收粗酶液即可。
可以利用超滤法等将前述粗酶液浓缩，添加防腐剂等，以浓缩酶的形式利用。另外，也可以在浓缩后利用喷雾干燥法等得到前述突变型腈水合酶的酶粉末。
对于回收的具有腈水合酶活性的粗酶液而言，需要分离纯化的情况下，例如，可适当组合利用硫酸铵等的盐析、利用醇等的有机溶剂沉淀法、利用透析及超滤等的膜分离法、或者离子交换色谱法、反相高效色谱法、亲和色谱法、凝胶过滤色谱法等已知的色谱分离法而实施。
本公开文本涉及的酰胺化合物的制造方法包括使前述突变型腈水合酶与腈化合物接触的工序。前述突变型腈水合酶催化由腈化合物合成酰胺化合物的反应。以下对酰胺化合物的制造方法更具体地进行说明。
首先，培养生产前述突变型腈水合酶的转化体、细胞株，使得到的培养液、细胞或细胞处理物在介质中与腈化合物接触。由此，前述突变型腈水合酶与腈化合物接触，前述突变型腈水合酶将腈化合物转化为对应的酰胺化合物。此处所谓细胞处理物，表示来自该转化体的提取物或粉碎物、分离上述提取物或粉碎物的腈水合酶活性级分而得到的粗酶制备物或进一步纯化而得到的酶纯化物等后分离物、使用适当的手段将该转化体或该转化体的提取物、粉碎物或后分离物固定化而得到的固定化物。
上述的接触温度优选为前述突变型腈水合酶不会失活的温度范围内，更优选为0℃～60℃，更优选为15℃～35℃。例如，可以将对生产前述突变型腈水合酶的转化体、细胞株进行培养得到的培养液直接添加至含有腈化合物的水溶液中，或者也可以对培养液进行离心处理而分离菌体，将菌体添加至含有腈化合物的水溶液中。反应时的水溶液的pH优选为7～9，更优选为7.5～8.5。腈化合物在水溶液中可以以例如0.25体积％～20.0体积％、更优选2.0体积％～5.0体积％的浓度存在。关于转化体的培养的详情如突变型腈水合酶的制造方法项中所述。
作为上述腈化合物的具体例，只要是前述突变型腈水合酶能够作为底物施加作用的化合物即可，没有特别限定，可优选举出乙腈、丙腈、丙烯腈、甲基丙烯腈、正丁腈、异丁腈、丁烯腈、α-羟基异丁腈等这样的碳原子数2～4的腈化合物作为其代表例。由于腈化合物中的腈基通过水合而转化为酰胺基，因此，例如，丙烯腈可转化为丙烯酰胺。
接着，在不使前述突变型腈水合酶失活的情况下，向介质中添加活性炭，从而在不使将前述突变型腈水合酶用作催化剂的由腈化合物合成酰胺化合物的反应结束的情况下将生成的酰胺化合物纯化。
需要说明的是，通过与前述突变型腈水合酶的接触而由腈化合物制造酰胺化合物的反应根据腈水合酶的最适pH而在例如pH7～9这样的中性～碱性的条件下进行。pH可通过在缓冲液中根据需要使用例如氨、氢氧化钠这样的碱性物质来进行调节。另一方面，酰胺化合物的纯化优选在例如pH3.5～6.5这样的酸性条件下进行。这是为了高效地除去含酰胺化合物的液体中所含有的杂质、尤其是蛋白质。可通过使用乙酸、丙酸、辛酸、戊酸、盐酸、丙烯酸、甲基丙烯酸等酸而变更为酸性pH。如此，前述酰胺化合物的制造方法优选包括在pH3.5～6.5的条件下从含有生成的酰胺化合物的溶液中除去杂质的纯化工序。该工序中，优选为了除去杂质而使用活性炭。即，一个实施方式中，本公开文本涉及的酰胺化合物的制造方法还包括利用活性炭将酰胺化合物进行纯化的工序。因此，前述突变型腈水合酶优选在pH3.5～6.5的条件下具有较之导入前述(a)～(e)的氨基酸残基取代中的至少一者之前而言有所提高的酶活性。对于前述pH条件而言，为了更高效地除去不需要的蛋白质，也可在5.0以下的pH条件下实施。
如上所述，对于本公开文本涉及的突变型腈水合酶而言，由于其提高的pH稳定性，从而能够在由腈化合物制造酰胺化合物的整个工艺中达成高的转化效率。以上对实施方式进行了叙述，但这些是示例，也可采用上述以外的各种构成。
实施例
通过以下的实施例更详细地说明实施方式，但本发明不受以下实施例的任何限定。需要说明的是，以下实施例中所谓“突变位点”，是指与包含具有序列号1所示的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号2所示的氨基酸序列的β亚基的来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶在氨基酸序列上的差异的位置。
[比较例1]来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的获得(1)
在30mL的试验管中制备10mL的LB液体培养基，利用高压釜将该液体培养基灭菌(121℃、20分钟)。向该液体培养基中添加氨苄西林，使最终浓度为100μg/mL，然后，接种一白金环的上述细胞株MT-10822，于37℃以300rpm培养约20小时。然后，将得到的培养液1mL分取至合适的离心管中后，通过离心分离(15000rpm×5分钟)将该菌体分离。
接着，利用碱性SDS提取法，由分离得到的菌体制备质粒pPT-DB1。将制备的质粒转化至大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺公司制)，得到转化体(1)。转化体(1)生产作为来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的腈水合酶(1)。
[比较例2]突变型腈水合酶的获得(2)
为了获得表达如表14所示的将来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的α亚基的N末端起第92位的氨基酸残基即Asp取代为Glu而得到的突变型腈水合酶的转化体(2)，使用宝酒造公司制的“LA PCR in vitro mutagenesis Kit”(后文中称为诱变试剂盒)进行位点特异性诱变。以表达来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的质粒pPT-DB1作为模板进行PCR反应。
PCR反应No.1使用含有序列号5的引物及M13引物M4(序列记载于序列号12)各50pmol的总量为50μL的体系(组成根据诱变试剂盒中记载的条件而不同)，通过将热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、延伸反应(72℃)120秒的条件重复25个循环而进行。
PCR反应No.2使用含有MUT4引物(序列记载于序列号14)及M13引物RV(序列记载于序列号13)各50pmol的总量为50μL的体系(组成根据诱变试剂盒中记载的条件而不同)，通过与PCR反应No.1同样的操作而进行。
通过使用了PCR反应No.1及No.2的反应结束液各5μL的琼脂糖电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)来分析DNA扩增产物，结果可确认存在扩增DNA产物。
使用Microcon100(宝酒造公司制)从各PCR反应结束液中除去过量的引物及dNTP，然后加入TE，配制各50μL的溶液。配制含有该TE溶液各0.5μL的总量为47.5μL的退火溶液(组成根据诱变试剂盒中记载的条件而不同)，进行10分钟的热变性处理(98℃)，然后以恒定的速度经60分钟冷却至37℃，接着于37℃保持15分钟，由此进行退火处理。
在退火处理液中加入0.5μL的TaKaRa LA Taq，于72℃加热处理3分钟，从而完成杂合双链。
向其中添加M13引物M4(序列记载于序列号12)及M13引物RV(序列记载于序列号13)各50pmol，使总量为50μL后，将热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、延伸反应(72℃)120秒的条件重复25个循环，由此进行PCR反应No.3。
通过使用了PCR反应No.3的反应结束液5μL的琼脂糖电泳(使用Sigma公司制的VII型低熔点琼脂糖；琼脂糖浓度为0.8重量％)来分析DNA扩增产物，结果可确认存在约2kb的扩增DNA产物。
接着，从琼脂糖凝胶中仅切出约2Kb的DNA片段，将该琼脂糖片(约0.1g)微细地粉碎并悬浮于1mL的TE溶液中，然后于55℃保温1小时使琼脂糖完全熔化。
对该熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，由此纯化该DNA片段，最后溶解于10μL的TE中。
利用限制酶EcoRI及HindIII对经纯化的约2kb的扩增DNA片段进行切割，然后对该限制酶处理液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，由此纯化该DNA片段，最后溶解于10μL的TE中。
同样地，利用EcoRI及HindIII对表达腈水合酶的质粒pPT-DB1进行切割，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma公司制的VII型低熔点琼脂糖；琼脂糖浓度为0.7％)，从琼脂糖凝胶中仅切出约2.7Kb的DNA片段。
将切出的琼脂糖片(约0.1g)微细地粉碎并悬浮于1mL的TE溶液中，然后于55℃保温1小时使琼脂糖完全熔化。
对该熔化液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀，由此纯化该DNA片段，最后溶解于10μL的TE中。
使用DNA连接试剂盒(宝酒造公司制)使如此得到的约2kb和约2.7Kb的DNA片段连接后，对大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)进行转化，得到转化体(2)。另外，利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，使用DNA测序仪确定腈水合酶基因部分的核苷酸序列，确认到在实施例1记载的质粒pPT-DB1中具有使α亚基的N末端起第92位的氨基酸残基即Asp成为Glu的突变。转化体(2)生产具有表14中记载的突变的腈水合酶(2)。
〈pH稳定性的比较〉
利用以下方法，对使用了如上所述地得到的转化体(2)、及含有成为其基础的pPT-DB1的转化体(1)制造酰胺化合物时的pH稳定性进行比较。由此，可对腈水合酶(2)与腈水合酶(1)比较得到的相对pH稳定性进行评价。
在试管中制备含有40μg/mL的硫酸铁·七水合物及10μg/mL的氯化钴·二水合物的5mL的LB液体培养基，利用高压釜进行灭菌(121℃、20分钟)。
向该培养基中添加氨苄西林，使最终浓度为100μg/mL，然后，接种一白金环的各转化体，于37℃以200rpm各自培养约20小时。
取该培养结束液40μl，悬浮于740μL的54mM Tris盐酸水溶液(pH8.0)中，向其中添加20μL的丙烯腈，一边于20℃缓缓搅拌一边使其反应15分钟至60分钟。反应结束后，使用HPLC分析反应液，求出由腈化合物生成酰胺化合物的酶活性。反应及分析针对各转化体实施3次以上，对分注操作等导致的数据偏差进行了校正。
同样地，取前述培养结束液1000μL进行离心分离，向回收的菌体中添加50mM柠檬酸缓冲液(pH4.0)1000μL，一边搅拌一边于30℃处理30小时(酸处理)。处理后，将780μL进行离心分离并回收菌体，悬浮于780μL的54mM Tris盐酸水溶液(pH8.0)中，向其中添加20μL的丙烯腈，一边于20℃缓缓搅拌一边使其反应15分钟至60分钟。反应结束后，使用HPLC分析反应液，求出由腈化合物生成酰胺化合物的酶活性。反应及分析针对各转化体实施3次以上，对分注操作等导致的数据偏差进行了校正。
〈分析条件〉
分析仪器：日本分光HPLC
柱：YMC Pack ODS-A(150×6.00mm)
分析温度：40℃
流动相：3％乙腈、10mM磷酸
取使用50mM柠檬酸缓冲液(pH4.0)处理后的菌体的活性与未处理的菌体的酶活性之比作为pH稳定性。转化体(2)的pH稳定性较之野生型(1)而言为0.82倍。
上述的结果表明，即使是被认为在腈水合酶的最适条件下使反应初速度上升的突变(参见国际公开第2010/055666号)，也并非必然带来pH稳定性的提高。
[实施例1]突变型腈水合酶的获得(3)
为了获得表达具有如表14所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(3)，除了使用序列号7的引物代替序列号5的引物以外，与比较例2同样地操作而获得质粒，得到转化体(3)。转化体(3)生产具有表14中记载的突变的腈水合酶(3)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(3)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表14。
[实施例2]突变型腈水合酶的获得(4)
为了获得表达具有如表14所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(4)，除了使用序列号8的引物代替序列号5的引物以外，与比较例2同样地操作而获得质粒，得到转化体(4)。转化体(4)生产具有表14中记载的突变的腈水合酶(4)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(4)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表14。
[实施例3]突变型腈水合酶的获得(5)
为了获得表达具有如表14所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(5)，除了使用序列号9的引物代替序列号5的引物以外，与比较例2同样地操作而获得质粒，得到转化体(5)。转化体(5)生产具有表14中记载的突变的腈水合酶(5)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(5)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表14。
[实施例4]突变型腈水合酶的获得(6)
为了获得表达具有如表14所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(6)，除了使用序列号10的引物代替序列号5的引物以外，与比较例2同样地操作而获得质粒，得到转化体(6)。转化体(6)生产具有表14中记载的突变的腈水合酶(6)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(6)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表14。
[实施例5]突变型腈水合酶的获得(7)
为了获得表达具有如表14所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(7)，除了使用序列号11的引物代替序列号5的引物以外，与比较例2同样地操作而获得质粒，得到转化体(7)。转化体(7)生产具有表14中记载的突变的腈水合酶(7)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(7)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表14。
[表14]
由表14所示的结果可知，属于氨基酸残基取代组A的各氨基酸残基取代单独即可带来腈水合酶的pH稳定性的提高。另一方面，不属于氨基酸残基取代组A的、α亚基中的N末端起第92位的Asp残基取代为Glu的取代并未带来较之来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶而言的pH稳定性的提高。
[实施例6]突变型腈水合酶的获得(8)
为了获得表达具有如表15所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(8)，使用实施例1的质粒作为模板，使用序列号6的引物代替序列号5的引物，除此以外，与比较例2同样地操作，得到转化体(8)。转化体(8)生产具有表15中记载的突变的腈水合酶(8)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(8)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表15。
[实施例7]突变型腈水合酶的获得(9)
为了获得表达具有如表15所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(9)，使用实施例2的质粒作为模板，使用序列号6的引物代替序列号5的引物，除此以外，与比较例2同样地操作，得到转化体(9)。转化体(9)生产具有表15中记载的突变的腈水合酶(9)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(9)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表15。
[实施例8]突变型腈水合酶的获得(10)
为了获得表达具有如表15所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(10)，使用实施例3的质粒作为模板，使用序列号6的引物代替序列号5的引物，除此以外，与比较例2同样地操作，得到转化体(10)。转化体(10)生产具有表15中记载的突变的腈水合酶(10)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(10)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表15。
[实施例9]突变型腈水合酶的获得(11)
为了获得表达具有如表15所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(11)，使用实施例4的质粒作为模板，使用序列号6的引物代替序列号5的引物，除此以外，与比较例2同样地操作，得到转化体(11)。转化体(11)生产具有表15中记载的突变的腈水合酶(11)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(11)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表15。
[实施例10]突变型腈水合酶的获得(12)
为了获得表达具有如表15所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(12)，使用实施例5的质粒作为模板，使用序列号6的引物代替序列号5的引物，除此以外，与比较例2同样地操作，得到转化体(12)。转化体(12)生产具有表15中记载的突变的腈水合酶(12)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(12)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表15。
[实施例11]突变型腈水合酶的获得(13)
为了获得表达具有如表15所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(13)，使用实施例1的质粒作为模板，使用序列号8的引物代替序列号5的引物，除此以外，与比较例2同样地操作，得到转化体(13)。转化体(13)生产具有表15中记载的突变的腈水合酶(13)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(13)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表15。
[实施例12]突变型腈水合酶的获得(14)
为了获得表达具有如表15所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(14)，使用实施例1的质粒作为模板，使用序列号9的引物代替序列号5的引物，除此以外，与比较例2同样地操作，得到转化体(14)。转化体(14)生产具有表15中记载的突变的腈水合酶(14)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(14)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表15。
[实施例13]突变型腈水合酶的获得(15)
为了获得表达具有如表15所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(15)，使用实施例2的质粒作为模板，使用序列号9的引物代替序列号5的引物，除此以外，与比较例2同样地操作，得到转化体(15)。转化体(15)生产具有表15中记载的突变的腈水合酶(15)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(15)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表15。
[实施例14]突变型腈水合酶的获得(16)
为了获得表达具有如表15所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(16)，使用实施例2的质粒作为模板，使用序列号10的引物代替序列号5的引物，除此以外，与比较例2同样地操作，得到转化体(16)。转化体(16)生产具有表15中记载的突变的腈水合酶(16)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(16)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表15。
[实施例15]突变型腈水合酶的获得(17)
为了获得表达具有如表15所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(17)，使用实施例2的质粒作为模板，使用序列号11的引物代替序列号5的引物，除此以外，与比较例2同样地操作，得到转化体(17)。转化体(17)生产具有表15中记载的突变的腈水合酶(17)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(17)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表15。
[实施例16]突变型腈水合酶的获得(18)
为了获得表达具有如表15所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(18)，使用比较例1的质粒作为模板，使用序列号15的引物代替序列号5的引物，除此以外，与比较例2同样地操作，得到转化体(18)。转化体(18)生产具有表15中记载的突变的腈水合酶(18)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(18)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表15。
[实施例17]突变型腈水合酶的获得(19)
为了获得表达具有如表15所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(19)，使用实施例3的质粒作为模板，使用序列号11的引物代替序列号5的引物，除此以外，与比较例2同样地操作，得到转化体(19)。转化体(19)生产具有表15中记载的突变的腈水合酶(19)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(19)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表15。
[实施例18]突变型腈水合酶的获得(20)
为了获得表达具有如表15所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(20)，使用实施例4的质粒作为模板，使用序列号11的引物代替序列号5的引物，除此以外，与比较例2同样地操作，得到转化体(20)。转化体(20)生产具有表15中记载的突变的腈水合酶(20)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(20)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表15。
[表15]
由表15所示的结果可知，属于氨基酸残基取代组A的各氨基酸残基取代即使彼此组合也能够带来腈水合酶的pH稳定性的提高。另外可知，在将属于氨基酸残基取代组A的氨基酸残基取代彼此组合的情况下，或者在与氨基酸残基取代(f)组合的情况下，存在其pH稳定性进一步提高的趋势。
[实施例19]突变型腈水合酶的获得(21)
为了获得表达具有如表16所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(21)，使用实施例7的质粒作为模板，使用序列号9的引物代替序列号5的引物，除此以外，与比较例2同样地操作，得到转化体(21)。转化体(21)生产具有表16中记载的突变的腈水合酶(21)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(21)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表16。
[实施例20]突变型腈水合酶的获得(22)
为了获得表达具有如表16所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(22)，使用实施例11的质粒作为模板，使用序列号9的引物代替序列号5的引物，除此以外，与比较例2同样地操作，得到转化体(22)。转化体(22)生产具有表16中记载的突变的腈水合酶(22)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(22)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表16。
[实施例21]突变型腈水合酶的获得(23)
为了获得表达具有如表16所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(23)，使用实施例7的质粒作为模板，使用序列号11的引物代替序列号5的引物，除此以外，与比较例2同样地操作，得到转化体(23)。转化体(23)生产具有表16中记载的突变的腈水合酶(23)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(23)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表16。
[表16]
由表16所示的结果可知，属于氨基酸残基取代组A的各氨基酸残基取代即使组合2个以上、并且即使进一步与氨基酸残基取代(f)组合，也可带来腈水合酶的pH稳定性的提高。另外可知，稳定化的程度存在通过组合而提高的趋势。
[实施例22]突变型腈水合酶的获得(24)
为了获得表达具有如表17所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(24)，使用实施例7的质粒作为模板，使用序列号15的引物代替序列号5的引物，除此以外，与比较例2同样地操作，得到转化体(24)。转化体(24)生产具有表17中记载的突变的腈水合酶(24)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(24)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表17。
[表17]
由表17所示的结果可知，属于氨基酸残基取代组A的各氨基酸残基取代即使组合3个以上，也可带来腈水合酶的pH稳定性的提高。另外可知，该提高的程度存在进一步升高的趋势。
[实施例23]突变型腈水合酶的反应初速度
对于来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶及具有表18所示的氨基酸残基取代的腈水合酶的反应初速度，通过对“pH稳定性的比较”中记载的酸处理前的酰胺化合物生成的测定时的反应初速度进行测定来调查并将结果示于表18。反应初速度的值以相对于来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的反应初速度的值而言的相对值示出。
[表18]
由表18所示的结果可知，属于氨基酸残基取代组A的氨基酸残基取代也可带来腈水合酶的反应初速度的提高。
[比较例3]腈水合酶突变体的获得(25)
使用含有如表19所示的使氨基酸取代位点处发生突变而得到的腈水合酶突变体的质粒(参见日本专利第5551081号92号转化体)，利用与比较例2中记载的转化同样的方法，得到转化体(25)。转化体(25)生产具有表19中记载的突变的腈水合酶(25)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(25)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表19。
[实施例24]腈水合酶突变体的获得(26)
为了获得表达具有如表19所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(26)，使用比较例3的质粒作为模板，使用序列号8的引物代替序列号5的引物，除此以外，与比较例2同样地操作而获得质粒，得到转化体(26)。转化体(26)生产具有表19中记载的突变的腈水合酶(26)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(26)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表19。
[表19]
由表19所示的结果可知，属于氨基酸残基取代组A的氨基酸残基取代不仅可提高来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的pH稳定性，而且还可带来来自来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的具有修饰氨基酸序列的腈水合酶的pH稳定性的提高。
[实施例25]腈水合酶突变体的反应初速度
对于如表20所示的使氨基酸取代位置处发生突变而得到的腈水合酶突变体的反应初速度，通过对“pH稳定性的比较”中记载的酸处理前的酰胺化合物生成的测定时的反应初速度进行测定来调查并将结果示于表20。反应初速度的值以相对于腈水合酶(25)的反应初速度的值而言的相对值示出。
[表20]
由表20所示的结果可知，属于氨基酸残基取代组A的氨基酸残基取代不仅可提高来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的反应初速度，而且还可带来来自来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的具有修饰氨基酸序列的腈水合酶的反应初速度的提高。
[比较例4]腈水合酶突变体的获得(27)
使用含有如表21所示的使氨基酸取代位置处发生突变而得到的腈水合酶突变体的质粒(参见日本专利第5551081号114号转化体)，利用与比较例2中记载的转化同样的方法得到转化体(27)。转化体(27)生产具有表21中记载的突变的腈水合酶(27)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(27)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表21。
[实施例26]腈水合酶突变体的获得(28)
为了获得表达具有如表21所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(28)，使用比较例4的质粒作为模板，使用序列号8的引物代替序列号5的引物，除此以外，与比较例2同样地操作而获得质粒，得到转化体(28)。转化体(28)生产具有表21中记载的突变的腈水合酶(28)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(28)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表21。
[表21]
由表21所示的结果可知，属于氨基酸残基取代组A的氨基酸残基取代不仅可提高来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的pH稳定性，而且还可带来来自来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的具有修饰氨基酸序列的腈水合酶的pH稳定性的提高。
[实施例27]腈水合酶突变体的反应初速度
对于如表21所示的使氨基酸取代位置处发生突变而得到的腈水合酶突变体的反应初速度，通过对“pH稳定性的比较”中记载的酸处理前的酰胺化合物生成的测定时的反应初速度进行测定来调查并将结果示于表22。反应初速度的值以相对于腈水合酶(27)的反应初速度的值而言的相对值示出。
[表22]
由表22所示的结果可知，属于氨基酸残基取代组A的氨基酸残基取代不仅可提高来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的反应初速度，而且还可带来来自来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的具有修饰氨基酸序列的腈水合酶的反应初速度的提高。
[比较例5]腈水合酶突变体的获得(29)
使用含有如表23所示的使氨基酸取代位置处发生突变而得到的腈水合酶突变体的质粒(参见日本专利第5551081号33号转化体)，利用与比较例2中记载的转化同样的方法得到转化体(29)。转化体(29)生产具有表23中记载的突变的腈水合酶(29)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(29)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表23。
[实施例28]腈水合酶突变体的获得(30)
为了获得表达具有如表23所示的氨基酸残基取代的突变型腈水合酶的转化体(30)，使用比较例5的质粒作为模板，使用序列号8的引物代替序列号5的引物，除此以外，与比较例2同样地操作而获得质粒，得到转化体(30)。转化体(30)生产具有表23中记载的突变的腈水合酶(30)。
通过上述“pH稳定性的比较”中记载的方法对腈水合酶(30)的pH稳定性进行评价。得到的结果示于表23。
[表23]
由表23所示的结果可知，属于氨基酸残基取代组A的氨基酸残基取代不仅可提高来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的pH稳定性，而且还可带来来自来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的具有修饰氨基酸序列的腈水合酶的pH稳定性的提高。
[实施例29]腈水合酶突变体的反应初速度
对于如表23所示的使氨基酸取代位置处发生突变而得到的腈水合酶突变体的反应初速度，通过对“pH稳定性的比较”中记载的酸处理前的酰胺化合物生成的测定时的反应初速度进行测定来调查并将结果示于表24。反应初速度的值以相对于腈水合酶(29)的反应初速度的值而言的相对值示出。
[表24]
由表24所示的结果可知，属于氨基酸残基取代组A的氨基酸残基取代不仅可提高来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的反应初速度，而且还可带来来自来源于野生型嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶的具有修饰氨基酸序列的腈水合酶的反应初速度的提高。
将于2016年12月28日提出申请的日本专利申请2016-256050号的公开内容整体作为参照引入本说明书中。
本说明书中记载的所有文献、专利申请和技术标准作为参照引入本说明书中，各个文献、专利申请和技术标准作为参照被引入的程度与具体且分别地记载的情况的程度相同。

Claims (16)

1.突变型腈水合酶，其是包含α亚基和β亚基的来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶，所述突变型腈水合酶中含有选自由下述氨基酸残基取代(a)～(e)组成的组中的至少1个氨基酸残基取代：
(a)α亚基中与序列号1的N末端起第40位的氨基酸残基对应的氨基酸残基取代为Asn的取代；
(b)α亚基中与序列号1的N末端起第43位的氨基酸残基对应的氨基酸残基取代为Val的取代；
(c)β亚基中与序列号2的N末端起第205位的氨基酸残基对应的氨基酸残基取代为Val的取代；
(d)β亚基中与序列号2的N末端起第206位的氨基酸残基对应的氨基酸残基取代为Gln的取代；
(e)β亚基中与序列号2的N末端起第215位的氨基酸残基对应的氨基酸残基取代为Asn的取代。
2.如权利要求1所述的突变型腈水合酶，其含有选自由氨基酸残基取代(a)～(e)组成的组中的2个以上氨基酸残基取代。
3.如权利要求1或2所述的突变型腈水合酶，其含有氨基酸残基取代(b)和选自由氨基酸残基取代(a)、(c)、(d)及(e)组成的组中的至少1个。
4.如权利要求1或2所述的突变型腈水合酶，其中，α亚基的氨基酸序列中的与序列号1的N末端起第36位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Trp。
5.如权利要求1或2所述的突变型腈水合酶，其中，α亚基的氨基酸序列中的与序列号1的N末端起第36位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Met、Ser、Gly或Ala。
6.如权利要求1或2所述的突变型腈水合酶，其中，α亚基的氨基酸序列满足以下(1)～(13)中一者以上：
(1)与序列号1的N末端起第6位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Thr或Ala；
(2)与序列号1的N末端起第13位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Leu；
(3)与序列号1的N末端起第19位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Val；
(4)与序列号1的N末端起第27位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Ile；
(5)与序列号1的N末端起第48位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Gln；
(6)与序列号1的N末端起第71位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为His；
(7)与序列号1的N末端起第92位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Glu；
(8)与序列号1的N末端起第94位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Ile；
(9)与序列号1的N末端起第126位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Tyr；
(10)与序列号1的N末端起第148位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Asp；
(11)与序列号1的N末端起第188位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Gly；
(12)与序列号1的N末端起第197位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Cys；
(13)与序列号1的N末端起第204位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Arg。
7.如权利要求1或2所述的突变型腈水合酶，其中，β亚基的氨基酸序列满足以下(15)～(47)中至少一者：
(15)与序列号2的N末端起第4位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Met；
(16)与序列号2的N末端起第8位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Ala；
(17)与序列号2的N末端起第10位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Asp；
(18)与序列号2的N末端起第24位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Ile；
(19)与序列号2的N末端起第33位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Val或Met；
(20)与序列号2的N末端起第37位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Val或Leu；
(21)与序列号2的N末端起第40位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Ile、Val或Leu；
(22)与序列号2的N末端起第41位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Ile；
(23)与序列号2的N末端起第46位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Lys；
(24)与序列号2的N末端起第48位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Val；
(25)与序列号2的N末端起第51位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Val；
(26)与序列号2的N末端起第61位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Val、Gly、Trp、Ser、Leu或Thr；
(27)与序列号2的N末端起第79位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Asn；
(28)与序列号2的N末端起第96位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Arg；
(29)与序列号2的N末端起第107位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Met；
(30)与序列号2的N末端起第108位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Asp或Arg；
(31)与序列号2的N末端起第110位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Asn；
(32)与序列号2的N末端起第112位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Val或Ile；
(33)与序列号2的N末端起第118位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Val；
(34)与序列号2的N末端起第127位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Ser；
(35)与序列号2的N末端起第146位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Gly；
(36)与序列号2的N末端起第150位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Asn或Ser；
(37)与序列号2的N末端起第160位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Cys、Trp或Met；
(38)与序列号2的N末端起第168位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Glu；
(39)与序列号2的N末端起第176位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Ala、Thr、Met或Cys；
(40)与序列号2的N末端起第186位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Arg；
(41)与序列号2的N末端起第200位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Glu；
(42)与序列号2的N末端起第212位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Tyr；
(43)与序列号2的N末端起第217位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Val、His、Met、Gly、Ser、Leu或Cys；
(44)与序列号2的N末端起第218位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Met或Ser；
(45)与序列号2的N末端起第226位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Ile；
(46)与序列号2的N末端起第230位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Glu；
(47)与序列号2的N末端起第231位的氨基酸残基对应的氨基酸残基为Val。
8.如权利要求1或2所述的突变型腈水合酶，其中，在下述[1]～[48]中任一种来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶中含有选自由所述(a)～(e)组成的组中的至少1个氨基酸残基取代：
[1]包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号2的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[2]包含具有序列号16的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号33的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[3]包含具有序列号17的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号33的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[4]包含具有序列号18的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号34的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[5]包含具有序列号19的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号34的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[6]包含具有序列号20的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号35的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[7]包含具有序列号20的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号36的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[8]包含具有序列号21的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号37的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[9]包含具有序列号21的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号38的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[10]包含具有序列号21的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号39的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[11]包含具有序列号21的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号40的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[12]包含具有序列号18的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号41的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[13]包含具有序列号18的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号42的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[14]包含具有序列号21的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号43的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[15]包含具有序列号22的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号44的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[16]包含具有序列号23的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号45的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[17]包含具有序列号24的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号46的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[18]包含具有序列号25的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号47的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[19]包含具有序列号18的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号48的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[20]包含具有序列号23的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号49的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[21]包含具有序列号16的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号50的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[22]包含具有序列号26的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号51的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[23]包含具有序列号27的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号52的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[24]包含具有序列号28的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号53的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[25]包含具有序列号17的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号54的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[26]包含具有序列号29的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号55的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[27]包含具有序列号18的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号56的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[28]包含具有序列号18的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号57的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[29]包含具有序列号30的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号58的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[30]包含具有序列号29的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号59的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[31]包含具有序列号31的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号60的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[32]包含具有序列号18的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号61的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[33]包含具有序列号32的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号62的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[34]包含具有序列号30的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号63的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[35]包含具有序列号30的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号64的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[36]包含具有序列号30的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号65的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[37]包含具有序列号25的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号54的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[38]包含具有序列号30的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号66的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[39]包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号67的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[40]包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号68的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[41]包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号69的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[42]包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号70的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[43]包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号71的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[44]包含具有序列号21的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号72的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[45]包含具有序列号1的氨基酸序列的α亚基、和具有序列号73的氨基酸序列的β亚基的腈水合酶；
[46]使所述[1]～[45]的腈水合酶中任一者中的α亚基的N末端起第36位的氨基酸残基为Trp残基而得到的腈水合酶；
[47]腈水合酶，其包含：所述[1]～[46]中任一种腈水合酶的α亚基、或包含与所述α亚基具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列的α亚基变体；和所述腈水合酶的β亚基、或包含与所述β亚基具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列的β亚基变体，其中，α亚基及β亚基中的至少一者为α亚基变体或β亚基变体；
[48]腈水合酶，其具有下述α亚基和β亚基，
所述α亚基相对于所述[1]～[46]中任一种腈水合酶的α亚基而言具有添加、取代、缺失、及/或插入的氨基酸残基，其中，除所述(a)及(b)的被取代的氨基酸残基之外的添加、取代、缺失、及/或插入的氨基酸残基的总数为1～10个，
所述β亚基相对于所述腈水合酶的β亚基而言具有添加、取代、缺失、及/或插入的氨基酸残基，其中，除所述(c)～(e)的被取代的氨基酸残基之外的添加、取代、缺失、及/或插入的氨基酸残基的总数为1～10个。
9.核酸，所述核酸编码权利要求1～8中任一项所述的突变型腈水合酶。
10.载体，所述载体含有权利要求9所述的核酸。
11.如权利要求10所述的载体，所述载体为表达载体。
12.转化体，所述转化体含有权利要求11所述的表达载体。
13.突变型腈水合酶的制造方法，所述制造方法包括下述工序：在培养基中培养权利要求12所述的转化体的工序；以及，从培养后的转化体及培养基中的至少一者中回收权利要求1～8中任一项所述的突变型腈水合酶的工序。
14.酰胺化合物的制造方法，所述制造方法包括使权利要求1～8中任一项所述的突变型腈水合酶与腈化合物接触的工序。
15.如权利要求14所述的酰胺化合物的制造方法，所述制造方法还包括在pH3.5～pH6.5的条件下从含有酰胺化合物的溶液中除去杂质的工序。
16.如权利要求14或15所述的酰胺化合物的制造方法，所述制造方法还包括利用活性炭将酰胺化合物进行纯化的工序。
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109593750B (zh) * 2019-01-16 2020-01-21 江南大学 一种腈水合酶突变体、含该突变体的基因工程菌及其应用
WO2020147031A1 (zh) * 2019-01-16 2020-07-23 江南大学 一种腈水合酶突变体、含该突变体的基因工程菌及其应用
CN110938616B (zh) * 2019-10-31 2021-01-29 江南大学 一种温泉热碱芽孢杆菌来源的腈水合酶的突变体
CN114790452B (zh) * 2020-11-20 2024-03-26 江南大学 一种对腈类化合物具有高稳定性的腈水合酶突变体
CN113151233B (zh) * 2021-04-13 2022-08-12 浙江工业大学 腈水合酶赖氨酸突变体hba-k2h2、编码基因及应用
CN113151234B (zh) * 2021-04-13 2022-08-12 浙江工业大学 腈水合酶赖氨酸突变体hba-k2h2r、编码基因及应用
CN113122526B (zh) * 2021-04-14 2023-09-22 浙江工业大学 腈水合酶赖氨酸突变体hba-k1、编码基因及应用
CN114317507A (zh) * 2021-11-30 2022-04-12 清华大学 腈水合酶突变体及其应用
CN114277022B (zh) * 2021-12-03 2023-08-08 江南大学 一种高活性和高热稳定性的腈水合酶突变体
WO2024004661A1 (ja) * 2022-06-30 2024-01-04 三井化学株式会社 変異型ニトリルヒドラターゼ、該変異型ニトリルヒドラターゼをコードする核酸、該核酸を含むベクター及び形質転換体、該変異型ニトリルヒドラターゼの製造方法、並びにアミド化合物の製造方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1340101A (zh) * 1999-10-26 2002-03-13 昭和电工株式会社 新型红球菌属细菌、源自于红球菌属细菌的腈水解酶基因、腈水合酶基因和酰胺酶基因,以及利用它们生产羧酸的方法
JP2005328787A (ja) * 2004-05-21 2005-12-02 Mitsubishi Rayon Co Ltd ニトリルヒドラターゼ活性を有する新規な微生物、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子及びアミド化合物の製造方法
WO2006062189A1 (ja) * 2004-12-09 2006-06-15 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体
CN101892211A (zh) * 2002-12-19 2010-11-24 三井化学株式会社 新型腈水合酶
CN102216455A (zh) * 2008-11-14 2011-10-12 三井化学株式会社 腈水合酶突变体
CN102575273A (zh) * 2009-04-30 2012-07-11 三井化学株式会社 制造3-巯基丙酸或其盐的方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3380133B2 (ja) * 1996-02-14 2003-02-24 三井化学株式会社 新規なニトリルヒドラターゼ
CN1240833C (zh) 1996-02-14 2006-02-08 三井化学株式会社 新型腈水合酶
JP4959059B2 (ja) 2000-01-17 2012-06-20 三井化学株式会社 アミド化合物の精製方法
DE60133691T2 (de) 2000-01-17 2009-05-28 Mitsui Chemicals, Inc. Verfahren zur reinigung von amiden
JP4216700B2 (ja) * 2003-11-10 2009-01-28 三井化学株式会社 ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の改変方法
DE102004013847A1 (de) * 2004-03-20 2005-10-06 Degussa Ag Cyanidtolerante Nitrilhydratasen
JP4916709B2 (ja) 2005-11-24 2012-04-18 三菱レイヨン株式会社 改良型ニトリルヒドラターゼ
EP1842907A1 (en) * 2006-04-07 2007-10-10 B.R.A.I.N. Ag A group of novel enantioselective microbial nitrile hydratases with broad substrate specificity
JP5069032B2 (ja) 2007-04-04 2012-11-07 ダイヤニトリックス株式会社 改良型ニトリルヒドラターゼ
JPWO2011145687A1 (ja) * 2010-05-21 2013-07-22 三井化学株式会社 不飽和結合を有するアミド化合物の安定化方法
KR101734797B1 (ko) * 2011-05-31 2017-05-24 미쯔비시 케미컬 주식회사 개량형 니트릴 히드라타제
CN103635574B (zh) * 2011-06-07 2016-04-13 三菱丽阳株式会社 改良型腈水合酶
JP6489013B2 (ja) * 2014-06-06 2019-03-27 三菱ケミカル株式会社 改良型ニトリルヒドラターゼ

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1340101A (zh) * 1999-10-26 2002-03-13 昭和电工株式会社 新型红球菌属细菌、源自于红球菌属细菌的腈水解酶基因、腈水合酶基因和酰胺酶基因,以及利用它们生产羧酸的方法
CN101892211A (zh) * 2002-12-19 2010-11-24 三井化学株式会社 新型腈水合酶
JP2005328787A (ja) * 2004-05-21 2005-12-02 Mitsubishi Rayon Co Ltd ニトリルヒドラターゼ活性を有する新規な微生物、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子及びアミド化合物の製造方法
WO2006062189A1 (ja) * 2004-12-09 2006-06-15 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体
CN102216455A (zh) * 2008-11-14 2011-10-12 三井化学株式会社 腈水合酶突变体
CN102575273A (zh) * 2009-04-30 2012-07-11 三井化学株式会社 制造3-巯基丙酸或其盐的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mutational and structural analysis of cobalt-containing nitrile hydratase on substrate and metal binding;Akimasa Miyanaga等;《European Journal of Biochemistry》;20040131;第271卷(第2期);第429-438页 *

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