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TECHNISCHES GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Reinigungsverfahren einer Amidverbindung.
Insbesondere betrifft sie ein Verfahren, um wirksam eine Amidverbindung
mit hoher Reinheit zu erhalten, indem eine Flüssigkeit, enthaltend eine Amidverbindung,
mit Aktivkohle behandelt wird.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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In
einer Herstellungsflüssigkeit
einer Amidverbindung, insbesondere einer Amidverbindung, erhalten durch
Hydratation einer Nitrilverbindung, sind gewöhnlich Verunreinigungen, wie
zum Beispiel eine polymere Verbindung, ein Tensid, eine Färbekomponente,
eine eluierte Komponente und Ähnliches
vorhanden, während deren
Spezies abhängig
vom Herstellungsverfahren unterschiedlich sind. Um sie zu entfernen
wird beispielsweise ein Reinigungsverfahren unter Verwendung von
Aktivkohle in
JP-A-11089575 ,
US-A-3923741 , Chem. Abs.
Bd. 127, Abstract-Nr. 346682,
JP-A-61-115495 und
JP-A-61-122253 (
EP-A-182578 ) beschrieben,
ein Reinigungsverfahren unter Verwendung einer Ionenaustauschermembran
ist in
JP-A-61-115058 offenbart
und ein Reinigungsverfahren durch einen porösen Hohlfaserfilm ist in
JP-A-61-122227 (
EP-A-188068 ) offenbart.
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Die
Reinigungsverfahren unter Verwendung einer Ionenaustauschermembran
und eines porösen Hohlfaserfilms
können
jedoch ökonomische
Nachteile bei der Durchführung
nicht vermeiden, wie zum Beispiel die Notwendigkeit von spezieller
Reinigungsausrüstung
und Ähnlichem.
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Bei
dem Reinigungsverfahren unter Verwendung von Aktivkohle sind in
dem erhaltenen Produkt noch Verunreinigungen vorhanden, während keine
spezielle Ausrüstung erforderlich
ist, und das Verfahren ist unzureichend vom Standpunkt der Effizienz
her. Insbesondere in dem Fall, wo eine Amidverbindung durch direktes
Hydratisieren einer Nitrilverbindung unter Verwendung einer Nitrilhydratase
hergestellt wird, die ein Enzym ist, welches die Fähigkeit
zum Hydratisieren eines Nitrils hat, oder Ähnliches, wird Protein, welches
aus Mikroorganismen herrührt,
das in der Reaktionslösung
untergemischt ist, durch das Reinigungsverfahren mit Aktivkohle
gemäß der herkömmlichen
Technik unzureichend entfernt, und als ein Ergebnis leidet die Reaktionslösung darunter,
dass sie schäumt,
wenn es eine Spurenmenge ist, oder dass die Reaktionslösung wolkig
wird, wenn die Menge groß ist,
wobei die Qualität
des Produkts nachteilig beeinträchtigt
wird.
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Daher
ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur wirksamen Entfernung
von Verunreinigungen zur Verfügung
zu stellen, die in einer Lösung,
enthaltend eine Amidverbindung, enthalten sind. Insbesondere ist
eine Aufgabe der Erfindung, ein einfaches und wirksames Reinigungsverfahren
in dem Falle zur Verfügung zu
stellen, wenn eine Amidverbindung enthaltende Lösung, die bei der Herstellung
einer korrespondierenden Amidverbindung aus einer Nitrilverbindung
erhalten wurde, mit Aktivkohle verarbeitet wird.
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OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Die
Erfinder haben ernsthafte Untersuchungen bezüglich eines Reinigungsverfahrens
einer Amidverbindung enthaltenden Lösung unter Verwendung von Aktivkohle
ausgeführt
und es wurde gefunden, dass wenn die Amidverbindung enthaltende
Lösung
unter sauren Bedingungen mit Aktivkohle in Kontakt gebracht wird
und wenn sie in einem Bereich eines spezifischen pHs mit Aktivkohle
in Kontakt gebracht wird, Verunreinigungen, die in der Amidverbindung
enthaltenden Lösung
enthalten sind, insbesondere Proteine, extrem wirksam entfernt werden
können.
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Es
war gemäß herkömmlichem
Kenntnisstand bekannt, dass eine Amidverbindung mit einer ungesättigten
Bindung (zum Beispiel Acrylamid, Methacrylamid und Ähnliches,
welche relativ wichtige Verbindungen in der Industrie sind) darunter
leidet, in saurem Bereich Polymerisationsreaktion zu verursachen,
was die Verbindungen instabil macht, und um ein solches Phänomen zu
vermeiden wurde festgehalten, dass es wichtig ist, dass die Lösung, enthaltend
eine Amidverbindung, neutral gehalten wird. Die Reinigungsverarbeitungstechnik
unter den folgenden Bedingungen ist von den herkömmlichen Techniken von diesen
Standpunkten her unerwartet.
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Das
heißt,
die Erfindung ist
- (1) Ein Reinigungsverfahren
einer Amidverbindung, dadurch gekennzeichnet, dass eine Amidverbindung enthaltende
Lösung
unter sauren Bedingungen bei einem pH von 3,5 bis 6,5 mit Aktivkohle
in Kontakt gebracht wird und Aktivkohle abgetrennt wird, wobei die
Amidverbindung von 2 bis 20 Kohlenstoffatome hat und eine ungesättigte Bindung,
und durch Hydratationsreaktion einer Nitrilverbindung unter Verwendung
eines Mikroorganismuspilzkörpers
hergestellt wurde, enthaltend Nitrilhydratase oder ein verarbeitetes
Produkt des Mikroorganismuspilzkörpers.
- (2) Ein Reinigungsverfahren gemäß Punkt 1, wobei der Mikoorganismuspilzkörper ein
Transformant ist, erhalten durch Exprimieren eines Nitrilhydratasegens,
geklont aus dem Mikroorganismus in einem beliebigen Wirt.
- (3) Ein Reinigungsverfahren gemäß Punkt 1 oder 2, wobei die
Amidverbindung Acrylamid oder Methacrylamid ist.
- (4) Ein Reinigungsverfahren gemäß Punkt 3, dadurch gekennzeichnet,
dass die Amidverbindung enthaltende Lösung sauer gemacht wird, indem
eine organische Säure
verwendet wird, die einen Säuredissoziationsexponenten
(pKa bei 25°C
in Wasser) von 3,5 bis 5,5 hat, oder unter Verwendung dieser organischen Säure und
einer Base.
- (5) Ein Reinigungsverfahren gemäß Punkt 4, wobei die organische
Säure Acrylsäure oder
Methacrylsäure ist.
- (6) Ein Reinigungsverfahren gemäß Punkt 5, wobei die Aktivkohle
Aktivkohle ist, die aus Holz oder Schalen von Palmfrüchten als
Rohmaterial hergestellt wurde.
- (7) Ein Reinigungsverfahren gemäß Punkt 6, wobei eine Temperatur
beim Kontakt mit dieser Aktivkohle von 10 bis 50°C beträgt.
- (8) Ein Reinigungsverfahren gemäß Punkt 7, dadurch gekennzeichnet,
dass nachdem diese Amidverbindung enthaltende Lösung in Kontakt mit dieser
Aktivkohle gebracht wurde, eine Flüssigkeit, die erhalten wird,
indem die Aktivkohle aus der Amid enthaltenden Lösung abgetrennt wurde, auf
eine Sättigungstemperatur
oder niedriger gebracht wird, um Kristalle abzuscheiden.
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BESTE ART, UM DIE ERFINDUNG AUSZUFÜHREN
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Die
erfindungsgemäße Amidverbindung
enthaltende Lösung
ist nicht besonders eingeschränkt
und insbesondere wird eine Amidverbindung enthaltende Lösung, erhalten
durch Hydratisieren einer Nitrilverbindung mit von 2 bis 20 Kohlenstoffatomen
beispielhaft angegeben. Die Nitrilverbindung, welche der Hydratationsreaktion
unterzogen werden soll, beinhaltet einen breiten Bereich von Nitrilen,
zum Beispiel ein aliphatisches Nitril, ein aromatisches Nitril und Ähnliches.
Beispiele des aliphatischen Nitrils beinhalten ein gesättigtes oder
ungesättigtes
Nitril mit von 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, zum Beispiel ein aliphatisches
gesättigtes
Mononitril, wie zum Beispiel Acetonitril, Propionitril, Butyronitril,
Isobutyronitril, Valeronitril, Isovaleronitril, Capronitril und Ähnliches,
ein aliphatisches gesättigtes
Dinitril, wie zum Beispiel Malonsäuredinitril, Succinonitril,
Adiponitril und Ähnliches,
sowie ein aliphatisches ungesättigtes
Nitril, wie zum Beispiel Acrylnitril, Methacrylnitril, Crotonitril
und Ähnliches.
Beispiele des aromatischen Nitrils beinhalten Benzonitril, o-, m-
und p-Chlorbenzonitril, o-, m- und p-Fluorbenzonitril, o-, m- und p-Nitrobenzonitril,
o-, m- und p-Tolunitril, Benzylcyanid und Ähnliches. Insbesondere ist
das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren
für eine
wässrige
Lösung,
enthaltend Acrylamid oder Methacrylamid bevorzugt, erhalten durch
Hydratisieren einer Nitrilverbindung mit einer ungesättigten
Bindung, wie zum Beispiel Acrylnitril und Methacrylnitril.
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Die
Amidverbindung enthaltende Lösung,
die erfindungsgemäß verarbeitet
werden soll, kann jene sein, die durch irgendein bekanntes Hydratisierungsverfahren
erhalten wurde. Das heißt,
sie kann irgendeine sein von jenen, die durch ein Hydratisierungsverfahren
durch Sulfonsäure,
ein Kontakthydratisierungsverfahren mit einem Katalysator, enthaltend
metallisches Kupfer, wie zum Beispiel einen Raney-Kupfer-Katalysator, ein
Hydratisierungsverfahren durch ein Enzym, welches die Fähigkeit
zur Hydratisierung einer Nitrilverbindung hat (Nitrilhydratase),
einen Mikroorganismuspilzkörper,
enthaltend das Gleiche, ein verarbeitetes Produkt des Enzyms und
den Mikroorganismuspilzkörper,
und Ähnliches
sein.
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Unter
diesen werden Amidverbindung enthaltende Lösungen, erhalten durch Verwendung
von Nitrilhydratase, welche ein Enzym ist, das die Fähigkeit
zur Hydratisierung einer Nitrilverbindung hat, ein verarbeitetes
Produkt der Nitrilhydratase, ein Mikroorganismuspilzkörper, enthaltend
die Nitrilhydratase, ein verarbeitetes Produkt des Mikroorganismuspilzkörpers oder Ähnliches
für das
erfindungsgemäße Reinigungsverfahren
bevorzugt.
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Die
hier angegebene Nitrilhydratase ist ein Enzym, welches die Fähigkeit
zur Hydrolisierung einer Nitrilverbindung hat, um eine korrespondierende
Amidverbindung herzustellen.
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Der
Mikroorganismus, enthaltend Nitrilhydratase, ist nicht besonders
eingeschränkt,
sofern er Nitrilhydratase herstellt, welche die Fähigkeit
hat, eine Nitrilverbindung zu hydrolisieren, um eine korrespondierende Amidverbindung
herzustellen, und eine Aktivität
als Nitrilhydratase in einer 30 gew.-%igen wässrigen Lösung von Acrylamid aufrecht
erhält.
Insbesondere bevorzugte Beispiele davon beinhalten Mikroorganismen,
die zu Nocardia, Corynebakterium, Bazillus, thermophilem Bazillus,
Pseudomonas, Mikrokokkus, Rhodekokkus, repräsentiert durch Rhodochrous,
Acinetobakter, Xanthobakter, Streptomyces, Rhizobium, Klebsiella,
Enterobakter, Erwinia, Aeromonas, Zitrobakter, Achromobakter, Agrobakterium
und Pseudonocardia, repräsentiert durch
Thermophilia, gehören.
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Ein
Transformant, der durch Exprimieren eines Nitrilhydratasegens erhalten
wurde, das aus dem Mikroorganismus in einem beliebigen Wirt geklont
wurde, ist ebenfalls in dem erfindungsgemäßen Mikroorganismus eingeschlossen.
Während
Escherichia coli beispielhaft genannt werden kann, wie später als
eine repräsentatives
Beispiel für
den beliebigen Wirt wie hier erwähnt
beschrieben, ist dies nicht besonders auf Escherichia coli eingeschränkt, sondern
Bazillus, wie zum Beispiel Bazillus subtilis und ähnliche,
sowie andere Mikroorganismenstämme,
wie zum Beispiel Hefe, Aktinomycet und Ähnliche, sind ebenfalls eingeschlossen.
Beispiele dafür
beinhalten MT-10822 (der Stamm wurde am National Institute of Bioscience
and Human Technology, Ministry of International Trade and Industry,
1–3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, am 7. Februar 1996 unter Empfangs-Nr.
FERM BP-5785, basierend auf dem Budapester Abkommen und Regulierungen zur
Internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum
Zwecke von Patentverfahren, hinterlegt). Der erfindungsgemäße Mikroorganismus
beinhaltet auch einen Transformanten, erhalten durch Exprimieren
einer mutierten Nitrilhydratase, die weiterhin in der Amidverbindungsbeständigkeit,
Nitrilverbindungsbeständigkeit
und Temperaturbeständigkeit
verbessert wurde, indem eine aus zwei oder mehreren konstitutionellen
Aminosäuren
des Enzyms durch andere Aminosäuren
unter Verwendung von DNA-Splicingtechnik ersetzt, deletiert, gelöscht oder
insertiert wird.
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Bei
der Herstellung einer Amidverbindung unter Verwendung des vorhergehenden
Mikroorganismusses wird im Allgemeinen ein Pilzkörper oder ein verarbeitetes
Produkt eines Pilzkörpers
verwendet. Der Pilzkörper
kann hergestellt werden unter Verwendung eines gewöhnlichen
Verfahrens, das auf den Gebieten der Molekularbiologie, Biotechnik
und Gentechnik bekannt ist. Zum Beispiel kann ein solches Verfahren
beispielhaft erwähnt
werden, in welchem er, nachdem der Mikroorganismus in ein gewöhnliches
flüssiges
Kulturmedium gepflanzt wurde, wie zum Beispiel ein LB-Medium, ein
M9-Medium und Ähnliches,
bei einer geeigneten Kultivierungstemperatur wachsen lassen wird
(die im allgemeinen von 20°C
bis 50°C
ist und für
Thermophile 50°C
oder höher
möglich
ist) und dann der Mikroorganismus abgetrennt und aus der Kulturflüssigkeit
durch Zentrifugenabtrennung wiedergewonnen wird.
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Das
verarbeitete Produkt des erfindungsgemäßen Mikroorganismuspilzkörpers bezeichnet
ein Extrakt und ein Zerreibungsprodukt des Mikroorganismuspilzkörpers, ein
danach abgetrenntes Produkt, erhalten durch Abtrennen und Reinigen
einer aktiven Nitrilhydratase-Fraktion des Extrakts und des Zerreibungsprodukt, sowie
ein fixiertes Produkt, erhalten durch Fixieren des Mikroorganismuspilzkörpers oder
des Extraktes, des Zerreibungsproduktes oder des danach abgetrennten
Produkts des Pilzkörpers
auf einem geeigneten Träger, und
diese sind in dem erfindungsgemäßen verarbeiteten
Produkt des Pilzkörpers
enthalten, sofern sie eine Aktivität als Nitrilhydratase haben.
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Bezüglich der
Amidverbindung, die erfindungsgemäß zu reinigen ist, kann die
Art und Weise der Reaktion, wenn eine Nitrilverbindung unter Verwendung
eines Mikroorganismuspilzkörpers,
enthaltend Nitrilhydratase oder ein verarbeitetes Produkt des Mikroorganismuspilzkörpers, hydratisiert
wird, um die Amidverbindung zu erhalten, ein Verfahren sein, bei
dem die korrespondierende Nitrilverbindung entweder einer Batch- Reaktion oder einer
kontinuierlichen Reaktion unterzogen wird. Der Modus der Reaktion
ist ebenfalls nicht besonders eingeschränkt und kann zum Beispiel entweder
mit einem Flugbett (suspended bed) oder einem Festbett (fixed bed)
ausgeführt
werden. Die Konzentration des Katalysators, wie zum Beispiel des
Pilzkörpers
des Mikroorganismus oder des verarbeiteten Produkts des Pilzkörpers, in
der Reaktionslösung
ist nicht besonders eingeschränkt,
sofern sie nicht die Mischung eines wässrigen Mediums und der Nitrilverbindung
beeinträchtigt.
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In
dem Vorhergehenden kann die Konzentration der Nitrilverbindung in
dem Fall, wenn die Nitrilverbindung beim Start der Reaktion zugegeben
wird, die Sättigungskonzentration
der Nitrilverbindung sein. Die obere Grenze der Konzentration ist
auf der anderen Seite nicht besonders eingeschränkt und kann zufällig abhängig von
der angenommenen Amidverbindungskonzentration und der angenommenen
Nitrilverbindungskonzentration bei Vollständigkeit der Reaktion bestimmt
werden.
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Die
unreagierte Nitrilverbindung kann nach der Reaktion durch solche
Mittel wie Destillation oder Ähnliches
aus der Reaktionslösung
entfernt werden. Daher ist es möglich,
dass die Nitrilverbindung in einer solchen Art und Weise zugegeben
wird, dass die Nitrilverbindung immer noch, sogar nachdem die angenommene Amidverbindungskonzentration
nach Vervollständigung
der Reaktion erhalten wird, im Überschuss
vorhanden ist.
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Insbesondere
in dem Fall, wenn die Nitrilverbindung Acrylnitril ist, ist die
Sättigungskonzentration
der Verbindung in Wasser etwa 7 Gew.-% bei 20°C und somit ist sie bevorzugt
etwa 7 Gew.-% oder mehr. In dem Fall, wenn die Nitrilverbindung
Methacrylnitril oder Crotonitril ist, ist die Sättigungskonzentration dieser
Verbindung in Wasser etwa 2 Gew.-% bei 20°C und demzufolge ist sie vorzugsweise
etwa 2 Gew.-% oder mehr.
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Die
vorhergehende Amidierungsreaktion wird allgemein unter gewöhnlichem
Druck ausgeführt
und sie kann unter erhöhtem
Druck ausgeführt
werden, um die Löslichkeit
der Nitrilverbindung in dem wässrigen
Medium zu erhöhen.
Die Reaktionstemperatur ist nicht besonders eingeschränkt, sofern
es der Gefrierpunkt des wässrigen
Mediums oder niedriger ist, und in dem Fall, wenn der Katalysator
Nitrilhydratase enthält,
wird sie vorzugsweise in dem Bereich von 0°C bis 50°C und stärker bevorzugt von 10°C bis 30°C ausgeführt.
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Der
pH der Reaktionslösung
bei der Amidierungsreaktion ist nicht besonders eingeschränkt, sofern
die Aktivität
der Nitrilhydratase aufrecht erhalten wird, und er ist vorzugsweise
in dem Bereich von pH 6 bis 10 und stärker bevorzugt im Bereich von
pH 7 bis 9.
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Die
erfindungsgemäße Reinigung
der Amidverbindung wird ausgeführt,
indem die Flüssigkeit,
enthaltend die Amidverbindung, unter sauren Bedingungen, vorzugsweise
pH 2 oder mehr und stärker
bevorzugt von pH 3,5 bis 6,5, mit der Aktivkohle in Kontakt gebracht
wird.
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Während um
die erfindungsgemäße Amidverbindung
enthaltende Lösung
sauer zu machen es allgemein notwendig ist, dass eine Säure zu der
Amidverbindung enthaltenden Lösung
zugegeben wird, können breite
Bereiche von Spezies von Säuren
verwendet werden, sofern sie nicht die Stabilität der Amidverbindung nachteilig
beeinträchtigen,
und Beispiele davon beinhalten eine Mineralsäure, wie zum Beispiel Schwefelsäure, Salpetersäure und Ähnliches,
eine organische Säure,
wie zum Beispiel Essigsäure
und Acrylsäure
und Ähnliches,
von denen zwei oder mehr Arten verwendet werden können. Unter
diesen ist erfindungsgemäß besonders
bevorzugt, dass der pH auf den vorher genannten Bereich unter Verwendung
von sowohl einer schwachen Säure
als auch einer Base eingestellt wird, da die Einstellung des pH
bequemer und stabiler ausgeführt werden
kann, die Verwendung einer schwachen Säure wirksam ist, um hohe Reinigungseffektivität zu erhalten und
die Stabilität
der Amidverbindung und der pH-Puffereffekt
erhalten werden kann.
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Eine
schwache Säure,
die vorzugsweise verwendet werden kann, hat vorzugsweise einen Säuredissoziationsexponenten
(pKa, bei 25°C
in Wasser) von 2,0 bis 6,0 und stärker bevorzugt von 3,5 bis
5,5. Repräsentative
Beispiele für
die Säure
beinhalten eine aliphatische gesättigte
Monocarbonsäure,
wie zum Beispiel Essigsäure,
Propionsäure,
Oktansäure,
Valeriansäure
und Ähnliches,
eine aliphatische ungesättigte
Monocarbonsäure,
wie zum Beispiel Acrylsäure,
Crotonsäure,
Methacrylsäure
und Ähnliches,
und eine aliphatische Polycarbonsäure, wie zum Beispiel Oxalsäure, Adipinsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure und Ähnliches,
sowie eine aromatische Carbonsäure,
wie zum Beispiel Benzoesäure
und Ähnliches.
Eine starke Base ist als Base bevorzugt und Beispiele dafür beinhalten
Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid und Ähnliches.
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In
dem Fall, wenn die Amidverbindung, die in der Erfindung verarbeitet
wird, eine ungesättigte
Bindung hat, werden Probleme verursacht, wenn sie nach der Reinigung
einer Polymerisationsreaktion unterzogen wird, wenn die Säure verbleibt
oder in dem resultierenden Polymer freigesetzt wird. Daher wird
in dem Fall, wenn die Amidverbindung, die eine ungesättigte Bindung
hat, gereinigt werden soll, vorzugsweise eine Säure mit einer ungesättigten
Bindung und die dazu fähig
ist, Copolymerisation mit der Amidverbindung einzugehen, insbesondere
Acrylsäure,
Methacrylsäure,
Crotonsäure
und Ähnliches,
verwendet.
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Die
Konzentration der Säure
oder die Konzentration der Säure
und der Base in der Erfindung ist allgemein in dem Bereich von 10
Gew.-ppm bis 5 Gew.-% bezüglich
der Säure,
basierend auf der Amidverbindung enthaltenden Lösung, während sie von der Art der Amidverbindung
enthaltenden Lösung
abhängt
und dem pKa der zu verwendenden Säure abhängt.
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Erfindungsgemäß gibt es
keine besondere Einschränkung,
während
die Amidverbindung enthaltende Lösung
unter sauren Bedingungen mit der Aktivkohle in Kontakt gebracht
wird, solange wie die Amidverbindung enthaltende Lösung sauer
ist oder eine Form hat, die beim Kontaktieren mit der Aktivkohle
sauer ist, und ein solches Verfahren kann eingesetzt werden ohne
das Problem, dass die Amidverbindung enthaltende Lösung unter
sauren Bedingungen gleichzeitig mit der Zugabe der Aktivkohle hergestellt
wird.
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Die
Aktivkohle, die erfindungsgemäß verwendet
wird, ist nicht besonders eingeschränkt und pulverige und körnige kann
verwendet werden. Für
die Apparatur zum Ausführen
des Reinigungsverfahrens kann solche verwendet werden, die für die Teilchengröße der Aktivkohle
geeignet ist. Zum Beispiel kann in dem Fall, wenn pulverige Aktivkohle
verwendet wird, das Verfahren ausgeführt werden entweder in einem
Batchsystem oder in einem kontinuierlichen System in einem Gefäß, das dazu
fähig ist,
Rühren
der Lösung
auszuführen.
In dem Falle, wenn körnige
Aktivkohle verwendet wird, kann eine kontinuierliche Verarbeitung
unter Verwendung eines gepackten Säulensystems zusätzlich zu
den vorhergehenden Systemen verwendet werden.
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Während Aktivkohle
allgemein solche beinhaltet, die Kohle, Holz, Palmfruchtschalen
und Ähnliches als
ein Rohmaterial verwendet, besteht keine besondere Einschränkung, solange
sie Adsorptionskraft hat, und jegliche Art davon kann verwendet
werden.
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In
dem Fall jedoch, wenn die Amidverbindung, die verarbeitet werden
soll, eine ungesättigte
Bindung hat, ist es bevorzugt, Aktivkohle zu verwenden, die einen
geringen Metallgehalt hat, wenn man die Lagerstabilität und die
Leichtigkeit der Polymerisation der Amidverbindung in Betracht zieht,
und es ist stärker
bevorzugt solche zu verwenden, die aus Holz oder Palmfruchtschalen
als ein Rohmaterial erhalten wurden.
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Bezüglich der
Menge der Aktivkohle, die beim Ausführen des erfindungsgemäßen Reinigungsverfahrens
verwendet wird, kann kein ausreichender Reinigungseffekt erhalten
werden, wenn sie zu gering ist, wohingegen es unökonomisch ist, wenn sie zu
groß ist,
und daher ist die davon verwendete Menge allgemein von 0,01 bis
20 Gew.-% und stärker
bevorzugt 0,05 bis 10 Gew.-%, basierend auf der Amidverbindung enthaltenden
Lösung.
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In
dem besonderen Fall, wenn pulverige Aktivkohle verwendet wird, kann
die Aktivkohle so wie sie ist direkt in die Amidverbindung enthaltende
Lösung
zugegeben werden, oder alternativ ist es möglich, dass die Aktivkohle
einmal in einem Medium, wie zum Beispiel Wasser oder Ähnlichem,
dispergiert wird, um eine Aufschlämmung zu bilden, die dann zu
der Amidverbindung enthaltenden Lösung zugegeben oder zugeführt wird.
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Die
Temperatur, wenn die Amidverbindung enthaltende Lösung dem
erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren
durch Aktivkohle unterzogen wird, ist nicht besonders eingeschränkt, sofern
die Amidverbindung sich nicht als Kristalle abscheidet und ihre
Stabilität
nicht beeinträchtigt
ist, und es wird allgemein in dem Bereich von 0°C bis 80°C ausgeführt. Insbesondere in dem Fall,
wenn eine Lösung
enthaltend eine Amidverbindung mit einer ungesättigten Bindung, wie zum Beispiel
Acrylamid und Methacrylamid, dem Reinigungsprozess unterzogen wird,
wird sie vorzugsweise mit der Aktivkohle bei 60°C oder niedriger und stärker bevorzugt in
dem Bereich von 10°C
bis 50°C
in Kontakt gebracht, um Gelieren, verursacht durch Auftreten einer
Polymerisationsreaktion, vorzubeugen. Die Zeitdauer, die für den Kontaktprozess
mit der Aktivkohle erforderlich ist, ist allgemein in dem Bereich
von 0,5 bis 20 Stunden, während
sie von der Art der Verarbeitung und der Menge der Aktivkohle abhängt.
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Anschließend wird
die Aktivkohle von der Amidverbindung enthaltenden Lösung, die
dem Kontaktprozess unterzogen wurde, abgetrennt, um eine gereinigte
Lösung
der Amidverbindung enthaltenden Lösung zu erhalten. Das Verfahren
zum Abtrennen der Aktivkohle ist nicht besonders eingeschränkt, sofern
es ein Verfahren ist, welches eine Fest-Flüssig-Abtrennapparatur verwendet,
die allgemein verwendet wird, von denen ein Beispiel eine Druckfilterapparatur,
eine Vakuumfilterapparatur, einen Zentrifugenseparator und Ähnliches beinhaltet,
und weiterhin kann es entweder ein Batchsystem oder ein kontinuierliches
System sein.
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Es
ist erfindungsgemäß auch möglich, dass
eine weiter gereinigte Amidverbindung in einer solchen Art und Weise
erhalten wird, dass die Amidverbindung enthaltende Lösung die
von der Aktivkohle abgetrennt worden ist, gekühlt wird, um die gewünschte Amidverbindung
aus der Lösung
zu kristallisieren.
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In
dem Beispiel wird das Erhalten eines mit Aminosäure substituierten Körpers, der
die Nitrilhydrataseaktivität
aufrecht erhält,
durch stellenspezifische Mutation ausgeführt. Die gleichen Ergebnisse
wie im Beispiel können
jedoch in einer solchen Art und Weise erhalten werden, dass ein
gesplictes Plasmid durch andere Verfahren erhalten wird als die
stellenspezifische Mutation, basierend auf dem Mutationspunkt und
den Spezies der substituierten Basen, die in dem Beispiel offenbart
sind, und dann in die Wirtszelle eingebracht wird.
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Zum
Beispiel kann ein DNA-Fragment mit einer solchen Basensequenz erhalten
werden, dass die Basensequenz der DNA in dem Bereich, der zu dem
Mutationspunkt korrespondiert, wie er in dem Beispiel offenbart
ist, die Sequenz nach der Substitution von Aminosäuren ist,
die durch einen DNA-Synthesizer oder Ähnliches hergestellt werden,
und das resultierende Fragment und der Bereich des pPT-DB1, der
korrespondierend zu dem Fragment abgetrennt wurde, gegenseitig ersetzt
werden, wobei das gesplicte Zielplasmid erhalten werden kann.
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BEISPIELE
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Die
Erfindung wird in größerem Detail
unten mit Bezugnahme auf die Beispiele beschrieben, aber die Erfindung
ist nicht dazu gedacht, auf die Beispiele eingeschränkt zu sein.
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Im
Folgenden wird HPLC-Analyse einer Reaktionslösung ausgeführt unter Verwendung von ULTRON 80HG
(50 mm × 8
mm im Durchmesser) als eine Säule
und einer wässrigen
10 mm Phosphorsäurelösung als Entwickler,
und Acrylamid wird durch optische Absorption bei 220 nm detektiert.
Um den Effekt der Erfindung zu bestätigen, werden Proteine, die
in der resultierenden Amidverbindung enthaltenden Lösung enthalten
sind, analysiert. Die Proteinkonzentration wird bestimmt durch Verwendung
eines Proteinanalysekits, hergestellt durch Biorat Laboratories,
Inc., nachdem die Amidverbindung, die in der Amidverbindung enthaltenden
Lösung enthalten
ist, durch Dialyse unter Verwendung einer semipermeablen Membran
entfernt wurde, wobei die Entfernungsgeschwindigkeit von Proteinen.
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BEISPIEL 1
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100
ml eines Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung werden in einem
500 ml Erlenmeyerkolben mit einer Trennwand hergestellt und in einem
Autoklaven bei 121°C
20 Minuten sterilisiert. Nach Zugabe von Ampicillin zu dem Kulturmedium,
um eine Endkonzentration von 50 μg/ml
herzustellen, wird eine Platinschleife des MT-10822-Stammes (FERM BP-5785)
gepflanzt und bei 37°C
und 130 Upm 20 Stunden kultiviert. Lediglich der Pilzkörper wird
aus der Kulturflüssigkeit
durch Zentrifugenabtrennung (15.000 G für 15 Minuten) separiert und
nach nochmaligem Suspendieren des Pilzkörpers in 50 ml physiologischer
Kochsalzlösung
wird ein feuchter Pilzkörper
durch nochmaliges Ausführen
von Zentrifugenabtrennung erhalten.
| Kulturmediumzusammensetzung | |
| Hefeextrakt | 5,0
g/l |
| Polypepton | 10,0
g/l |
| NaCl | 5,0
g/l |
| Kobaltchlorid-hexahydrat | 10,0
mg/l |
| Eisen(III)sulfat-heptahydrat | 40,0
mg/l |
| pH
7,5 | |
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1,5
g des feuchten Pilzkörpers,
der im Vorhergehenden erhalten wurde, werden in 98,5 g 0,3 mM wässriger
NaOH-Lösung
suspendiert und 36 g Acrylnitril werden auf einmal zu der Suspension
zugegeben, gefolgt von Ausführen
der Reaktion unter Rühren
bei 10°C.
Nach 24 Stunden vom Start der Reaktion an wird die Reaktionslösung durch
die HPLC-Analyse
analysiert. Als ein Ergebnis ist lediglich Acrylamid (Konzentration:
35 Gew.-%) in der Reaktionslösung
vorhanden, es wird aber kein Acrylnitril bestätigt. Der pH der Reaktionslösung ist
8,0.
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Die
Reaktionslösung
wird durch eine 10%ige wässrige
Schwefelsäurelösung auf
pH 5 eingestellt, zu welcher 2 Gew.-%, basierend auf der Reaktionslösung, Aktivkohle
(pulvrige Aktivkohle PM-SX, hergestellt von Mitsukura Chemical Co.,
Ltd.) zugegeben werden, und nach Rühren für 5 Stunden bei 25°C wird Filtration
unter Verwendung von Filterpapier ausgeführt. Die Proteinkonzentration
des resultierenden Filtrats wird gemessen und die Entfernungsrate
ist 99% oder mehr. Keine weiße
Trübung
wird verursacht, wenn 100 ml Methanol zu 10 ml des Filtrats zugegeben
werden und es wird kein Polymer beobachtet.
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BEISPIEL 2
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Ein
Filtrat wird in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 erhalten,
mit der Ausnahme, dass die Reaktionslösung, die in Beispiel 1 erhalten
wird, durch 10%ige wässrige
Acrylsäurelösung auf
pH 5 eingestellt wird. Die Proteinkonzentration des Filtrats wird
gemessen und die Entfernungsrate ist 99% oder mehr. Keine weiße Trübung wird
verursacht, wenn 100 ml Methanol zu 10 ml des Filtrats zugegeben
werden und es wird kein Polymer beobachtet.
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BEISPIEL 3
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Beschaffung
eines mit Aminosäure
substituierten Körpers,
der Nitrilhydrataseaktivität
aufrecht erhält.
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Um
das sechste Leu auf der α-Untereinheit
durch Met zu ersetzen, wird stellenspezifische Mutationseinbringung
unter Verwendung eines „LA
PCR in vitro Mutagenesekits",
hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd. unter Verwendung der pPT-DB1-Plasmid-DNA,
erhalten gemäß
JP-A-9-275978 als
ein Templat, ausgeführt.
Hier im Folgenden wird das „LA
PCR in vitro Mutageneskit" einfach
als ein Kit bezeichnet. Die folgenden Beispiele folgen im Wesentlichen
dem Prinzip und dem Arbeitsverfahren des Kits.
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10
ml eines flüssigen
LB-Kulturmediums werden in einem 30 ml Testrohr hergestellt und
in einem Autoklaven für
20 Minuten bei 121°C
sterilisiert. Nach Zugabe von Ampicillin zu dem Kulturmedium, um
eine Endkonzentration von 100 μg/ml
herzustellen, wird eine Platinschleife des MT-10822-Stammes gepflanzt
und bei 37°C
und 300 Upm für
20 Stunden kultiviert. Nach Fraktionieren von 1 ml der Kulturflüssigkeit
in ein geeignetes Zentrifugenrohr wird der Pilzkörper durch Zentrifugenabtrennung
(15.000 Upm für
5 Minuten) separiert. Anschließend
wird die Plasmid-DNA von pPt-DB1 aus dem Pilzkörper durch das alkalische SDS-Extraktionsverfahren
präpariert.
-
Zwei
Arten von PCR-Reaktionen werden ausgeführt unter Verwendung von 1 μg der Plasmid-DNA
von pPT-DB1 als ein Templat. Die PCR-Reaktion Nr. 1 wird ausgeführt durch
Wiederholung einer Prozedur von 15 Sekunden thermischer Denaturierung
(98°C),
30 Sekunden Tempern (55°C)
und 120 Sekunden Ausdehnungsreaktion (72°C) über 25 Zyklen in einem System
mit einer Gesamtmenge von 50 μl,
enthaltend 50 pmol von jedem des in der Sequenz Nr. 1 der Sequenztabelle
beschriebenen Primers und dem M13-Primer M4 (Anordnung offenbart
in der Sequenz Nr. 2 in der Sequenztabelle) (die Zusammensetzung
ist in Übereinstimmung mit
den Bedingungen, wie sie in dem Kit beschrieben sind). Die PCR-Reaktion
von Nr. 2 wird ausgeführt,
indem das gleiche Verfahren wie in der PCR-Reaktion Nr. 1 ausgeführt wird,
in einem System mit einer Gesamtmenge von 50 μl, enthaltend 50 pmol jeweils
von dem MUT4-Primer (Anordnung offenbart in der Sequenz Nr. 3 in
der Sequenztabelle) und dem M13-Primer RV (Anordnung offenbart in
der Sequenz Nr. 4 in der Sequenztabelle). Analyse des DNA-verstärkten Produkts
wird für
jeweils 5 μl
der vollständigen
Reaktionslösungen
der PCR-Reaktionen
Nr. 1 und Nr. 2 durch Agaroseelektrophorese ausgeführt (Agarosekonzentration:
1,0 Gew.-%) und die Gegenwart des DNA-verstärkten Produkts wird bestätigt. Die überschüssigen Primer
und das dNTP werden aus der jeweiligen fertigen PCR-Reaktionslösung unter
Verwendung von Microcon 100 entfernt (hergestellt von Takara Shuzo
Co., Ltd.) und dann wird TE dazu zugegeben, um 50 μl von jeder
der Lösungen
herzustellen. Temperlösungen
mit einer Gesamtmenge von 47,5 μl,
enthaltend jeweils 0,5 μl
der TE-Lösungen
(die Zusammensetzung ist in Übereinstimmung
mit den Bedingungen, wie sie in dem Kit beschrieben sind) werden
hergestellt und nach Ausführen
einer thermischen Denaturierungsbehandlung (98°C) für 10 Minuten wird Kühlen über 60 Minuten
mit einer konstanten Geschwindigkeit auf 37°C ausgeführt, gefolgt von Halten bei
37°C für 15 Minuten,
um die Temperbehandlung auszuführen.
0,5 μl TAKARALA-Taq werden zu der
Temperbehandlungslösung
zugegeben, die für
3 Minuten einer Wärmebehandlung
bei 72°C
unterzogen wurde, um einen Heterodoppelstrang zu komplettieren.
50 pmol jeweils von dem M13-Primer M4 (Anordnung offenbart in der
Sequenz Nr. 2 in der Sequenztabelle) und dem M13-Primer RV (Anordnung
offenbart in der Sequenz Nr. 4 in der Sequenztabelle) werden zugegeben,
um eine Gesamtmenge von 50 μl
zu erhalten, und dann wird die PCR-Reaktion Nr. 3 ausgeführt durch
Wiederholen einer Prozedur von 15 Sekunden thermischer Denaturierung (98°C), 30 Sekunden
Tempern (55°C)
und 120 Sekunden Ausdehnungsreaktion (72°C) über 25 Zyklen. Analyse des
DNA-verstärkten
Produkts wird ausgeführt
für 5 μl der vollständigen Reaktionslösungen der
PCR-Reaktion Nr. 3 durch Agaroseelektrophorese (unter Verwendung
von Agarose Typ VII mit niedrigem Schmelzpunkt, hergestellt von
Sigma Aldrich Japan, Inc., Agarosekonzentration: 0,8 Gew.-%) und
die Gegenwart von etwa 2,0 Kbp des DNA-verstärkten Produkts wird bestätigt. Anschließend wird
lediglich ein DNA-Fragment
von etwa 2,0 Kbp aus dem Agarosegel herausgeschnitten, und nachdem
das Agarosefragment fein pulverisiert wurde (etwa 0,1 g), was in
1 ml der TE-Lösung
suspendiert wurde, wird es 1 Stunde bei 55°C gehalten, um die Agarose vollständig zu
schmelzen. Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung werden
in gewöhnlichen Prozeduren
für die
geschmolzene Lösung
ausgeführt,
um das DNA-Fragment zu reinigen, und es wird letztendlich in 10 μl TE gelöst. Nach
Ausschneiden von etwa 2,0 kbp des gereinigten DNA-Fragments durch
die Restriktionsenzyme EcoRI und HindIII wird Phenol/Chloroform-Extraktion
und Ethanolfällung
für die
mit Restriktionsenzym behandelte Lösung ausgeführt, um das DNA-Fragment zu
reinigen, und es wird letztendlich in 10 μl TE gelöst. Ähnlich wird das pPT-DB1 durch
EcoRI und HindIII als die einzige Restriktionsenzymstelle auf dem
pPT-DB1 ausgeschnitten, und Agaroseelektrophorese wird ausgeführt (unter
Verwendung von Agarose Typ VII mit niedrigem Schmelzpunkt, hergestellt
von Sigma Aldrich Japan, Inc., Agarosekonzentration: 0,7 Gew.-%),
so dass lediglich etwa 2,7 Kbp des DNA-Fragments aus dem Agarosegel
ausgeschnitten werden. Nachdem das Agarosefragment (etwa 0,1 g),
das so ausgeschnitten wurde, fein pulverisiert und in der TE-Lösung suspendiert
wurde, wird es 1 Stunde bei 55°C
gehalten, um die Agarose vollständig
zu schmelzen. Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung werden
in gewöhnlichen
Prozeduren für
die geschmolzene Lösung
ausgeführt,
um das DNA-Fragment zu reinigen, und es wird letztendlich in 10 μl TE gelöst. Das
verstärkte DNA-Produkt,
das so erhalten wird, und das pPT-DB1-Fragment werden unter Verwendung
eines DNA-Ligationskits (hergestellt von Takara Shuzo Co. Ltd.)
ligiert und dann werden kompetente Zellen von Escherichia coli HB101
(hergestellt von Toyobo Co., Ltd.) transformiert, um eine Escherichia
coli-Bank herzustellen.
-
10
ml eines LB-Kulturmediums, enthaltend 40 μg/ml Eisen(III)sulfat-heptahydrat
und 10 μg/ml
Kobaltchlorid-dihydrat (hier im Folgenden bezeichnet als ein Aktivitäts-Expressions-Kulturmedium)
werden in einem 30 ml Testrohr hergestellt und in einem Autoklaven
bei 121°C
20 Minuten sterilisiert. Nach Zugabe von Ampicillin zu dem Kulturmedium,
um eine Endkonzentration von 100 μg/ml
herzustellen, wird eine Platinschleife von jeweils fünf Klonen,
die zufällig
aus der Escherichia coli-Bank ausgewählt wurden, gepflanzt und bei
37°C und 300
Upm 20 Stunden kultiviert. Nach Fraktionieren von 1 ml der Kulturflüssigkeit
in ein geeignetes Zentrifugenrohr wird der Pilzkörper durch Zentrifugenabtrennung
(15.000 Upm für
5 Minuten) separiert. Der Pilzkörper
wird in 200 μl
einer Kaliumphosphatpufferlösung
(pH 7,0) suspendiert und 1 Gew.-% Acrylnitril werden dazugegeben,
gefolgt von Reagieren bei 10°C
für 2 Minuten.
Die gleiche Menge wie die Reaktionslösung einer wässrigen
1 M Phosphorsäurelösung wird
zu der Reaktionslösung
zugegeben, um die Reaktion zu beenden, und die Konzentration von
Acrylamid, das so hergestellt wurde, wird durch die gleiche HPLC-Analyse wie in Beispiel
2 gemessen. Als ein Ergebnis wird Herstellung von Acrylamid in vier
Klonen unter den fünf
Klonen bestätigt
und somit wird bestätigt,
dass die Nitrilhydratase aufrecht erhalten wird.
-
Pilzkörper der
vier Klone werden aus jeweils 1 ml des Rückstandes des Kulturmediums
separiert, welches der Messung der Nitrilhydrataseaktivität unterzogen
wurde, Plasmid-DNA
der jeweiligen Klone wird durch das alkalische SDS-Extraktionsverfahren
hergestellt. Anschließend
werden die Basensequenzen der Nitrilhydratasestrukturggene der jeweiligen
Klone durch das Primerextensionsverfahren unter Verwendung eines
sequencing king und Autosequenzer 373A, hergestellt von ABI Inc.,
bestimmt. Als ein Ergebnis ist in dem Klon Nr. 1, gezeigt in Tabelle
1, das sechste Leu auf der α-Untereinheit
der Nitrilhydratase durch Met ersetzt. TABELLE 1
| Klon Nr. | Mutationspunkt | Änderung
der Aminosäuresequenz | Änderung
der Basensequenz |
| (in α-Untereinheit) | Vor
Substitution | Nach
Substitution | Vor
Substitution | Nach
Substitution |
| Nr.
1 | α-Sechste | Leu | Met | CTG | ATG |
-
Anschließend wird,
um das 126te Phe auf der α-Untereinheit
durch Tyr zu ersetzen, eine stellenspezifische Mutationseinbringung
ausgeführt
unter Verwendung der Plasmid-DNA des Klons Nr. 1 als ein Templat in
den gleichen Prozeduren wie im Vorhergehenden.
-
Das
heißt,
10 ml eines flüssigen
LB-Kulturmediums werden in einem 30 ml Testrohr hergestellt und
in einem Autoklaven bei 121°C
20 Minuten sterilisiert. Nach Zugabe von Ampicillin zu dem Kulturmedium,
um eine Endkonzentration von 100 μg/ml
herzustellen, wird eine Platinschleife des Klon Nr. 1-Stammes gepflanzt und
bei 37°C
und 300 Upm 20 Stunden kultiviert. Nachdem 1 ml der Kulturflüssigkeit
in ein geeignetes Zentrifugenrohr fraktioniert wurde, wird der Pilzkörper durch
Zentrifugenabtrennung (15.000 Upm für 5 Minuten) separiert. Anschließend wird
die Plasmid-DNA des Klons Nr. 1 aus dem Pilzkörper durch das alkalische SDS-Extraktionsverfahren
präpariert.
-
Zwei
Arten von PCR-Reaktionen werden unter Verwendung von 1 μg der Plasmid-DNA
des Klon Nr. 1-Stammes als ein Templat ausgeführt. Die PCR-Reaktion Nr. 4
wird durch Wiederholung einer Prozedur von 15 Sekunden thermischer
Denaturierung (98°C),
30 Sekunden Tempern (55°C)
und 120 Sekunden Ausdehnungsreaktion (72°C) über 25 Zyklen in einem System
mit einer Gesamtmenge von 50 μl,
enthaltend 50 pmol von jedem der Primer, die in der Sequenz Nr.
5 der Sequenztabelle beschrieben sind, und des M13-Primers M4 (Anordnung
offenbart in der Sequenz Nr. 2 in der Sequenztabelle), ausgeführt (die
Zusammensetzung ist in Übereinstimmung
mit den Bedingungen, wie sie in dem Kit beschrieben sind). Die PCR-Reaktion
Nr. 5 wird ausgeführt
durch Ausführen
der gleichen Prozedur wie in der PCR-Reaktion Nr. 4 in einem System
mit einer Gesamtmenge von 50 μl,
enthaltend 50 pmol von jeweils dem MUT4-Primer (Anordnung offenbart
in der Sequenz Nr. 3 in der Sequenztabelle) und dem M13-Primer RV
(Anordnung offenbart in der Sequenz Nr. 4 in der Sequenztabelle).
Analyse der DNA-verstärkten Produkte
wird für
jeweils 5 μl
der vollständigen
Reaktionslösungen
der PCR-Reaktionen
Nr. 4 und Nr. 5 durch Agaroseelektrophorese (Agarosekonzentration:
1,0 Gew.-%) ausgeführt
und die Gegenwart des DNA-verstärkten
Produktes wird bestätigt.
Es wird eine Escherichia coli-Bank in der gleichen Art und Weise
wie in dem Fall des Klons Nr. 1 hergestellt.
-
Eine
Platinschleife von jeweils fünf
Klonen, die zufällig
aus der Escherichia coli-Bank ausgewählt werden, wird in dem gleichen
Aktivierungs-Expressions-Kulturmedium wie in dem Fall des Klons
Nr. 1 gepflanzt und bei 37°C
und 300 Upm für
20 Stunden kultiviert. Nach Fraktionieren von 1 ml der Kulturflüssigkeit
in ein geeignetes Zentrifugenrohr wird die Nitrilhydrataseaktivität gemessen.
Als ein Ergebnis wird Herstellung von Acrylamid in vier Klonen unter
den fünf
Klonen bestätigt
und somit wird bestätigt,
dass die Nitrilhydratase aufrecht erhalten wird.
-
Pilzkörper der
vier Klone werden aus jeweils 1 ml des Rückstandes des Kulturmediums
abgetrennt, welches der Messung der Nitrilhydratase unterzogen wurde,
Plasmid-DNA der jeweiligen Klone wird hergestellt durch das alkalische
SDS-Extraktionsverfahren. Anschließend werden die Basensequenzen
der Nitrilhydratasestrukturgene der jeweiligen Klone durch das gleiche
Verfahren wie in dem Fall des Klons Nr. 1 bestimmt. Als ein Ergebnis
ist in dem Klon Nr. 2, wie in Tabelle 2 gezeigt, das sechste Leu
auf der α-Untereinheit der
Nitrilhydratase durch Met substituiert und das 126te Phe auf der α-Untereinheit
ist durch Tyr substituiert. TABELLE 2
| Klon Nr. | Mutationspunkt | Änderung
der Aminosäuresequenz | Änderung
der Basensequenz |
| (in
einer α-Untereinheit) | Vor
Substitution | Nach
Substitution | Vor
Substitution | Nach
Substitution |
| Nr.
2 | α-Sechste
α-126te | Leu
Phe | Met
Tyr | CTG
TTC | ATG
TAC |
-
Anschließend wird,
um das 212te Ser auf der β-Untereinheit
durch Tyr zu ersetzen, eine stellenspezifische Mutationseinbringung
ausgeführt
unter Verwendung der Plasmid-DNA des Klons Nr. 2 als Templat in den
gleichen Prozeduren wie im Vorhergehenden.
-
Das
heißt
10 ml eines flüssigen
LB-Kulturmediums werden in einem 30 ml Testrohr präpariert
und in einem Autoklaven bei 121°C
für 20
Minuten sterilisiert. Nach Zugabe von Ampicillin zu dem Kulturmedium,
um eine Endkonzentration von 100 μg/ml
herzustellen, wird eine Platinschleife des Klon Nr. 2-Stammes gepflanzt und
bei 37°C
und 300 Upm 20 Stunden kultiviert. Nach Fraktionieren von 1 ml der
Kulturflüssigkeit
in ein geeignetes Zentrifugenrohr wird der Pilzkörper durch Zentrifugenabtrennung
(15.000 Upm für
5 Minuten) separiert. Anschließend
wird die Plasmid-DNA des Klons Nr. 1 aus dem Pilzkörper durch
das alkalische SDS-Extraktionsverfahren präpariert.
-
Zwei
Arten von PCR-Reaktionen werden unter Verwendung von 1 μg der Plasmid-DNA
des Klon Nr. 2-Stammes als ein Templat ausgeführt. Die PCR-Reaktion Nr. 6
wird ausgeführt
durch Wiederholen einer Prozedur von 15 Sekunden thermischer Denaturierung
(98°C),
30 Sekunden Tempern (55°C)
und 120 Sekunden Ausdehnungsreaktion (72°C) über 25 Zyklen in einem System
mit einer Gesamtmenge von 50 μl,
enthaltend jeweils 50 pmol des Primers, der in der Sequenz Nr. 6
der Sequenztabelle beschrieben ist, und des M13-Primers M4 (Anordnung
offenbart in der Sequenz Nr. 2 in der Sequenztabelle) (die Zusammensetzung
ist in Übereinstimmung
mit den Bedingungen, wie sie in dem Kit beschrieben sind). Die PCR-Reaktion
Nr. 7 wird ausgeführt
durch Ausführen
der gleichen Prozedur wie in der PCR-Reaktion Nr. 6 in einem System
mit einer Gesamtmenge von 50 μl,
enthaltend 50 pmol von jeweils dem MUT4-Primer (Anordnung offenbart
in der Sequenz Nr. 3 in der Sequenztabelle) und dem M13-Primer RV
(Anordnung offenbart in der Sequenz Nr. 4 in der Sequenztabelle).
Analyse der DNA-verstärkten
Produkte wird ausgeführt
für jeweils
5 μl der
vollständigen
Reaktionslösungen
der PCR-Reaktionen Nr. 6 und Nr. 7 durch Agaroseelektrophorese (Agarosekonzentration:
1,0 Gew.-%) und die Gegenwart des DNA-verstärkten Produktes wird bestätigt. Eine
Escherichia coli-Bank wird in der gleichen Art und Weise wie in
dem Fall des Klons Nr. 1 hergestellt.
-
Eine
Platinschleife von jeweils fünf
Klonen, die zufällig
aus der Escherichia coli-Bank, ausgewählt werden, wird in das gleiche
Aktivierungs-Expressions-Kulturmedium wie in dem Fall des Klons
Nr. 1 gepflanzt und bei 37°C
und 300 Upm für
20 Stunden kultiviert. Nach Fraktionieren von 1 ml der Kulturflüssigkeit
in ein geeignetes Zentrifugenrohr wird die Nitrilhydrataseaktivität gemessen.
Als ein Ergebnis wird Herstellung von Acrylamid in vier Klonen unter
den fünf
Klonen bestätigt,
und somit wird bestätigt,
dass die Nitrilhydratase aufrecht erhalten wird.
-
Pilzkörper der
vier Klone werden aus jeweils 1 ml der Rückstände des Kulturmediums abgetrennt,
die der Messung der Nitrilhydrataseaktivität unterzogen wurden, Plasmid-DNA
der jeweiligen Klone wird hergestellt durch das alkalische SDS-Extraktionsverfahren.
Anschließend
wird die Basensequenz der Nitrilhydratasestrukturgene der jeweiligen
Klone durch die gleichen Verfahren bestimmt wie in dem Fall von
Klon Nr. 1. Als ein Ergebnis ist in dem Klon Nr. 3, gezeigt in Tabelle
3, das 212te Ser auf der β-Untereinheit
durch Tyr substituiert. TABELLE 3
| Klon Nr. | Mutationspunkt | Änderung
der Aminosäuresequenz | Änderung
der Basensequenz |
| | Vor
Substitution | Nach
Substitution | Vor
Substitution | Nach
Substitution |
| Nr. 3 | α-Sechste
α-126te
β-212te | Leu
Phe
Ser | Met
Tyr
Tyr | CTG
TTC
TCC | ATG
TAC
TAC |
-
Der
Pilzkörper
des Klons Nr. 3 wird in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel
1 kultiviert, um einen Pilzkörper,
der für
die Reaktion erforderlich ist, zu erhalten.
-
Weiterhin
werden 1,5 g des so erhaltenen feuchten Pilzkörpers in 98,5 g 0,3 mM wässriger
NaOH-Lösung
suspendiert und 60 g Acrylnitril werden auf einmal zu der Suspension
hinzu gegeben, gefolgt von Ausführen
der Reaktion unter Rühren
bei 10°C.
Nach 24 Stunden vom Start der Reaktion an wird die Reaktionslösung durch
die HPLC-Analyse analysiert. Als ein Ergebnis ist lediglich Acrylamid
(Konzentration: 50 Gew.-%) in der Reaktionslösung vorhanden, aber kein Acrylnitril
wird bestätigt.
Der pH der Reaktionslösung
ist 8,0.
-
Die
Reaktionslösung
wird mit einer 10%igen wässrigen
Schwefelsäurelösung, zu
welcher 2 Gew.-%, basierend auf der Reaktionslösung, Aktivkohle (pulvrige
Aktivkohle PM-SX, hergestellt von Mitsukura Chemical Co., Ltd.)
zugegeben wurden, auf pH 5 eingestellt, und nach Rühren bei
25°C für 5 Stunden
wird Filtration unter Verwendung von Filterpapier ausgeführt. Die
Entfernungsrate von Protein aus dem resultierenden Filtrat wird
gemessen und die Entfernungsrate ist 99% oder mehr. Es wird keine
weiße
Trübung
verursacht, wenn 100 ml Methanol zu 10 ml des Filtrats hinzugegeben
werden und es wird kein Polymer beobachtet.
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BEISPIEL 4 (Referenzbeispiel)
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Die
gleichen Prozeduren wie in Beispiel 1 werden ausgeführt, mit
der Ausnahme, dass die Hydratationsreaktionslösung, die in Beispiel 3 erhalten
wurde, mit einer 10%igen wässrigen
Schwefelsäurelösung auf pH
3 eingestellt wird, um ein Filtrat zu erhalten. Die Entfernungsrate
von Protein aus dem resultierenden Filtrat wird gemessen und die
Entfernungsrate ist 75%. Keine weiße Trübung wird verursacht, wenn
100 ml Methanol zu 10 ml des Filtrats zugegeben werden und es wird
kein Polymer beobachtet.
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VERGLEICHSBEISPIEL 1
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Die
gleichen Prozeduren wir in Beispiel 1 werden ausgeführt, mit
der Ausnahme, dass die Hydratationsreaktionslösung, die in Beispiel 3 erhalten
wurde, mit einer 10%igen wässrigen
Schwefelsäurelösung auf pH
7 eingestellt wird, um ein Filtrat zu erhalten. Die Entfernungsrate
von Protein aus dem resultierenden Filtrat wird gemessen und die
Entfernungsrate ist 25%.
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VORTEIL DER ERFINDUNG
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Wie
aus der vorhergehenden Beschreibung und den Ergebnissen der Beispiele
und den Vergleichsbeispielen deutlich wird, kann gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
Reinigung einer Amidverbindung mit weit höherer Effizienz im Vergleich
zu den herkömmlichen
Reinigungsverfahren mit Aktivkohle ausgeführt werden, indem unter sauren
Bedingungen mit Aktivkohle in Kontakt gebracht wird. Insbesondere
wenn Acrylamid, welches durch das erfindungsgemäße Verfahren gereinigt wurde,
polymerisiert wird, wird solches Polyacrylamid erhalten, das ein
hohes Molekulargewicht hat, ausgezeichnet in der Lagerungsstabilität ist und
hohe Löslichkeit
in Wasser hat.