JP5925355B2 - 不飽和結合を有するアミド化合物の安定化方法 - Google Patents
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Description
〔1〕ニトリル化合物からアミド化合物を生成できる酵素を含む触媒を用いて、ニトリル化合物を含む水溶液から、不飽和結合を有するアミド化合物を含む反応液を製造する際、および/または、該触媒を用いて、ニトリル化合物を含む水溶液から製造した不飽和結合を有するアミド化合物を含む反応液を保存する際、該反応液中の酸素を1重量ppm以上飽和酸素濃度以下とすることを特徴とする不飽和結合を有するアミド化合物の安定化方法。
〔2〕上記反応液中のニトリル化合物が1重量%未満の場合、該反応液中に酸素を1重量ppm以上飽和酸素濃度以下で溶存させることを特徴とする〔1〕に記載の安定化方法。
〔3〕上記反応液のpHが3以上7未満の場合に、酸素を1重量ppm以上飽和酸素濃度以下で溶存させる〔1〕または〔2〕に記載の安定化方法。
〔4〕上記ニトリル化合物が、(メタ)アクリロニトリルであり、上記アミド化合物が、(メタ)アクリルアミドである〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の安定化方法。
〔5〕上記反応液に含まれるポリペプチド濃度が、0.1重量ppm以上500重量ppm以下である〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の安定化方法。
〔6〕上記酵素がニトリルヒドラターゼである〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の安定化方法。
〔7〕上記ニトリルヒドラターゼが、シュードノカルディア属由来である〔6〕に記載の安定化方法。
〔8〕〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の安定化方法を経て得られることを特徴とする不飽和結合を有するアミド化合物。
〔9〕〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の安定化方法を経て得られた不飽和結合を有するアミド化合物を、重合させて得られることを特徴とするポリアミド化合物。
精製工程:反応工程で得られた反応液から、活性炭等を用いて触媒(精製酵素・粗精製酵素、酵素を含む微生物または微生物の培養液)に由来するタンパク質やポリペプチド等を除去する工程(以上をまとめて製造工程とする。);および/または、
保存工程:製造工程で得られた反応液を保存する工程。
また、菌体を破砕する時のpHは特に制限はないが、好ましくはpH4以上10以下、より好ましくはpH6以上8以下である。
驚くべきことに、ニトリルヒドラターゼは不飽和アミド化合物に対して重合促進効果を有することが、本発明者らによって初めて明らかにされた。
不飽和アミド化合物の保存温度は特に制限はないが、好ましくは−10℃〜50℃、より好ましくは10℃〜30℃が、安定性の観点から好ましい。
また、触媒として酵素を含む微生物を用いた場合、濾紙等により微生物を取り除いた後、活性炭等を用いて精製した不飽和アミド化合物含有液に含まれる残存ポリペプチド濃度は、好ましくは、約0.1ppm〜3ppm程度であり、通常は約0.5ppm〜1.5ppmである。
なお、ポリペプチド濃度分析として、実施例にその方法を詳述しているが、Bradford法を用いている。
[実施例(1-1)]
<ニトリルヒドラターゼを含む微生物触媒の調製>
特開2001−340091号公報の実施例1に記載の方法に従い、No.3クローン菌体を取得し、同じく、同実施例1の方法、すなわち下記の方法で培養してニトリルヒドラターゼを含む湿菌体を得た。
ポリペプトン 10.0 g/L
NaCl 5.0 g/L
塩化コバルト・六水和物 10.0mg/L
硫酸第二鉄・七水和物 40.0mg/L
pH7.5
最終製品として、水溶液中のアクリルアミド濃度が50重量%の製品を得るため、以下の条件で反応を行った。
(第一反応器を用いた第一反応工程)
第一反応器として用いた、撹拌器を備えた1Lガラス製フラスコに、予め400gの水を仕込んだ。この第一反応器には、その気相部に空気を1L/minの流量にて通気した。
第一反応器内を撹拌しながら、この懸濁液を、11g/hの速度で連続的にフィードした。アクリロニトリルは、32g/hの速度で、また、純水は37g/hの速度で連続的にフィードした。さらに反応pHが7.5〜8.5となるように、0.1M−NaOH水溶液をフィードした。これらの原料は、各々の貯槽から単独のラインで供給され、反応器内にフィードされるまで、他の原料に接触することはなかった。
なお、湿菌体の添加量は、第一反応器のアクリロニトリル転化率が97%となるように調整を行った。
第二反応器としては、内径5mmのテフロン(登録商標)製チューブ20mを用いた。
第二反応工程は、第一反応器から連続的に抜き出された反応液を、第二反応器に連続的にフィードし、さらに反応を進行させるものである。
なお、第一反応器および第二反応器ともに10〜20℃の温度の水浴中に浸漬し、各反応器内部の液温が15℃となるように温度制御を行った。
反応工程を開始してから30日目に各反応器の反応液をサンプリングし、HPLC分析を行ったところ、第一反応器出口でのアクリルアミドへの転化率が97%、第一反応器出口でのアクリロニトリル濃度は1重量%であり、かつ第二反応器出口でのアクリルニトリル濃度が検出限界以下(100重量ppm以下)、アクリルアミド濃度が53.5重量%となった。このとき、第一反応器出口の反応液における溶存酸素濃度は8ppmであり、第二反応器出口の反応液における溶存酸素濃度は7ppmであった。
メタノールテストは、反応液等10mLにメタノール90mLを加え、360nmにおける透過率を測定した結果、透過率が99.9%以上であった場合、アクリルアミドの重合物の存在は認めないとするテストである。
得られた濾液に対してメタノールテストを実施した結果、透過率が99.9%以上であったことから、アクリルアミド重合物は存在しないことがわかった。
ここで分析条件は以下のとおりであった。
アクリルアミド分析条件:
高速液体クロマトグラフ装置:LC−10Aシステム(株式会社島津製作所製)
分離カラム:SCR-101H (株式会社島津製作所製)
溶離液:0.05 %(容積基準)−リン酸水溶液
アクリロニトリル分析条件:
高速液体クロマトグラフ装置:LC−10Aシステム(株式会社島津製作所製)
(UV検出器波長200nm、カラム温度40℃)
分離カラム:Wakosil-II 5C18HG (和光純薬製)
溶離液:7%(容積基準)−アセトニトリル、0.1mM−酢酸、0.2mM−酢酸ナトリウムを各濃度で含有する水溶液
この反応を30日目に分析を実施して以降さらに約4日間継続した。この約4日間で約7500gの反応液が得られた。
なお、実施例および比較例において、精製工程後の残存ポリペプチド濃度はすべて0.1ppmから1.5ppmの範囲であった。本明細書において「ポリペプチド」とは、タンパク質、タンパク質を構成する1以上のポリペプチドおよび該ポリペプチドの断片を包含する用語である。
精製工程後の製品をサンプリングし、透析膜を用いてアクリルアミドを除去し、発色試薬を用いてポリペプチドの発色を行わせ、分光光度計により595nmの吸光度を測定した。
分析条件:
分光光度計 :U-2000(日立製)
透析膜 :Spectra/Por CE(日本ジェネティックス製)
発色試薬 :DYE試薬(バイオラッド製)
得られた製品に対してメタノールテストを実施した。すなわち、得られた製品10mLにメタノール90mLを加え、360nmにおける透過率を測定した。透過率は99.9%以上であり、重合物の存在は認められなかった。
上記のようにして得られたアクリルアミド水溶液に、水を加え濃度20重量%のアクリルアミド水溶液とした。この20重量%アクリルアミド水溶液500gを1Lポリエチレン容器に入れ、18℃に保ちながら、窒素を通じて液中の溶存酸素を除き、直ちに、発泡スチロール製の保温用ブロックの中に入れた。
水溶性テストとは、1Lビーカーに水600mLを入れ、定められた形状の撹拌羽根を用いて25℃で撹拌しながらアクリルアミド重合体0.6gを添加し、不溶解分を濾別し、その乾燥重量より不溶解分の含有率を求めたものである。
得られた乾燥粉末状のアクリルアミド重合体を篩に掛け、32〜42メッシュの重合体を分取した。この分取したアクリルアミド重合体を水溶性テストにより評価したところ、不溶解分の含有率は0.3%であり、良好な水溶性を示した。
精製工程で得られた活性炭処理後の製品(アクリルアミド濃度50.6%)500gに対し、20℃の恒温槽中にて、空気を1m3/hの流量にて10日間連続して通気処理を行い、保存処理液を得た。
精製工程の後に得られたアクリルアミドに対する重合体の製造方法と同様にして、乾燥粉末状のアクリルアミドの重合体を得た。
得られた乾燥粉末状のアクリルアミド重合体を篩にかけ、32〜42メッシュの重合体を分取した。この分取したアクリルアミド重合体を水溶性テストにより評価したところ、いずれも不溶解分の含有率は0.7%であり、良好な水溶性を示した。得られた結果を表1に示す。
実施例(1-1)において、第一反応工程の溶存酸素濃度を8ppmから4ppm(実施例(1-2)),2ppm(実施例(1-3))または1.2ppm(実施例(1-4))に変更した以外は実施例(1-1)と同様にしてアクリルアミドを製造し、種々のテストに供した。得られた結果を表1に示す。
実施例(1-1)において、精製工程の溶存酸素濃度を8ppmから4ppm(実施例(2-1)),2ppm(実施例(2-2))または1ppm(実施例(2-3))に変更した以外は実施例(1-1)と同様にしてアクリルアミドを製造し、種々のテストに供した。得られた結果を表1に示す。
実施例(1-1)において、第一反応工程のアクリロニトリル濃度が0.4重量%になった時点で酸素を溶存させた点および湿菌体の添加量を第一反応器のアクリロニトリル転化率が99%となるように調整を行った点以外は実施例(1-1)と同様にしてアクリルアミドを製造し、種々のテストに供した。得られた結果を表1に示す。
運転を開始してから30日目に各反応器の反応液をサンプリングし、HPLC分析を行ったところ、第一反応器出口でのアクリルアミドへの転化率が99%、第一反応器出口でのアクリロニトリル濃度は0.4重量%であり、かつ第二反応器出口でのアクリルニトリル濃度が検出限界以下(100重量ppm以下)、アクリルアミド濃度が53.3重量%となった。このとき第一反応器出口の反応液における溶存酸素濃度は8ppmであり、第二反応器出口の反応液における溶存酸素濃度は7ppmであった。
実施例(3-1)において、精製工程の溶存酸素濃度を8ppmから4ppm(実施例(4-1)),2ppm(実施例(4-2))または1ppm(実施例(4-3))に変更した以外は実施例(3-1)と同様にしてアクリルアミドを製造した。得られた結果を表1に示す。
実施例(1-1)において、第一反応工程の溶存酸素濃度を8ppmから1ppm未満に変更した以外は実施例(1-1)と同様にしてアクリルアミドを製造し、種々のテストに供した。得られた結果を表1に示す。
実施例(3-1)において、第一反応工程の溶存酸素濃度を8ppmから1ppm未満に変更した点および湿菌体の添加量を第一反応器のアクリロニトリル転化率が99%となるように調整を行った点以外は実施例(3-1)と同様にしてアクリルアミドを精製した。なお、この操作を複数回繰り返し実施した。得られた結果を表1に示す。
運転を開始してから30日目に各反応器の反応液をサンプリングし、HPLC分析を行ったところ、第一反応器出口でのアクリルアミドへの転化率が99%、第一反応器出口でのアクリロニトリル濃度は0.4重量%であり、かつ第二反応器出口でのアクリルニトリル濃度が検出限界以下(100重量ppm以下)、アクリルアミド濃度が53.3重量%となった。このときの第一反応器出口および第2反応器出口の反応液の溶存酸素濃度はともに1ppm未満であった。
実施例(3-1)において、精製工程の溶存酸素濃度を8ppmから1ppm未満に変更した点および湿菌体の添加量を第一反応器のアクリロニトリル転化率が99%となるように調整を行った点以外は実施例(3-1)と同様にしてアクリルアミドを精製した。得られた結果を表1に示す。
運転を開始してから30日目に各反応器の反応液をサンプリングし、上記HPLC条件にて分析を行ったところ、第一反応器出口でのアクリルアミドへの転化率が99%、第一反応器出口でのアクリロニトリル濃度は0.4重量%であり、かつ第二反応器出口でのアクリルニトリル濃度が検出限界以下(100重量ppm以下)、アクリルアミド濃度が53.3重量%となった。このとき第一反応器出口の反応液における溶存酸素濃度は8ppmであり、第二反応器出口の反応液の溶存酸素濃度は7ppmであった。
実施例(3-1)において、保存工程の溶存酸素濃度を8ppmから1ppm未満に変更した以外は実施例(3-1)と同様にしてアクリルアミドを製造した。得られた結果を表1に示す。
実施例(1-1)の第一反応工程において、湿菌体の添加量を、第一反応器のアクリロニトリル転化率が97%となるように調整を行った代わりに、該転化率が90%となるように調整を行った以外は実施例(1-1)と同様にしてアクリルアミドを製造し、種々のテストに供した。得られた結果を表1に示す。
運転を開始してから2日目に各反応器の反応液をサンプリングし、上記HPLC条件にて分析を行ったところ、第一反応器出口でのアクリルアミドへの転化率が90%、かつ第二反応器出口でのアクリルニトリル濃度が検出限界以下(100重量ppm以下)、アクリルアミド濃度が53.5重量%となった。このとき、第一反応器出口の反応液における溶存酸素濃度は8ppmであり、第二反応器出口の反応液における溶存酸素濃度は7ppmであった。
実施例5の保存工程において、空気を使用する代わりに、純度99.9%の窒素を使用した以外は、実施例5と同様の処理を行い、処理液を得た。この処理液の溶存酸素濃度は0.08ppmであった。得られた処理液10mLにメタノール90mLを加えたところ白濁し、重合物の存在が認められた。
実施例(1-1)において、第一反応工程のアクリロニトリル濃度が0.8重量%になった時点で酸素を溶存させた点および溶存酸素濃度を8ppmから1.2ppmに変更した点以外は実施例(1-1)と同様にしてアクリルアミドを製造した。このとき第二反応工程での溶存酸素濃度は1.0ppmだった。さらに実施例6を複数回実施した。
実施例(1-1)において、第一反応工程のアクリロニトリル濃度が0.8重量%になった時点で酸素を溶存させた点および溶存酸素濃度を8ppmから1ppm未満に変更した点以外は実施例(1-1)と同様にしてアクリルアミドを製造した。このとき第二反応工程での溶存酸素濃度は1.0ppm未満だった。さらに比較例6を複数回実施した。
Claims (9)
- ニトリル化合物からアミド化合物を生成できる酵素を含む触媒を用いて、ニトリル化合物を含む水溶液から、不飽和結合を有するアミド化合物を含む反応液を製造する反応工程および精製工程の際、
前記反応液中のニトリル化合物が1重量%未満の場合、該反応液中の酸素を1重量ppm以上飽和酸素濃度以下とし、且つ、上記反応工程の反応pHを7.5〜8.5とすることを特徴とする不飽和結合を有するアミド化合物の安定化方法。 - 前記反応液中のニトリル化合物が1重量%以上の場合にも、該反応液中の酸素を1重量ppm以上飽和酸素濃度以下とすることを特徴とする請求項1に記載の不飽和結合を有するアミド化合物の安定化方法。
- 前記触媒を用いて、ニトリル化合物を含む水溶液から製造した不飽和結合を有するアミド化合物を含む反応液を保存する際にも、該反応液中の酸素を1重量ppm以上飽和酸素濃度以下とすることを特徴とする請求項1または2に記載の不飽和結合を有するアミド化合物の安定化方法。
- 上記ニトリル化合物が、(メタ)アクリロニトリルであり、上記アミド化合物が、(メタ)アクリルアミドである請求項1〜3のいずれか一項に記載の安定化方法。
- 上記酵素がニトリルヒドラターゼである請求項1〜4のいずれか一項に記載の安定化方法。
- ニトリル化合物からアミド化合物を生成できる酵素を含む触媒を用いて、ニトリル化合物を含む水溶液から、不飽和結合を有するアミド化合物を含む反応液を製造する反応工程および精製工程の際、前記反応液中のニトリル化合物が1重量%未満の場合、該反応液中の酸素を1重量ppm以上飽和酸素濃度以下とし、且つ、上記反応工程の反応pHを7.5〜8.5とすることを特徴とする不飽和結合を有するアミド化合物の製造方法。
- 前記反応液中のニトリル化合物が1重量%以上の場合にも、該反応液中の酸素を1重量ppm以上飽和酸素濃度以下とすることを特徴とする請求項6に記載の不飽和結合を有するアミド化合物の製造方法。
- ニトリル化合物からアミド化合物を生成できる酵素を含む触媒を用いて、ニトリル化合物を含む水溶液から、不飽和結合を有するアミド化合物を含む反応液を製造する反応工程および精製工程の際、前記反応液中のニトリル化合物が1重量%未満の場合、該反応液中の酸素を1重量ppm以上飽和酸素濃度以下とし、且つ、上記反応工程の反応pHを7.5〜8.5として不飽和結合を有するアミド化合物を製造し、該アミド化合物を、重合させることを特徴とするポリアミド化合物の製造方法。
- 前記反応液中のニトリル化合物が1重量%以上の場合にも、該反応液中の酸素を1重量ppm以上飽和酸素濃度以下とすることを特徴とする請求項8に記載のポリアミド化合物の製造方法。
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