TW553922B - Method of purifying amide compound - Google Patents

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553922 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 __B7_ 五、發明説明（I ) 本發明涉及醯胺化合物的精製方法。更具體地說，本發明 涉及用活性炭處理含醯胺化合物的溶液高效率得到高純度醯 胺化合物的方法。 醯胺化合物，特別是在腈類化合物由水合反應得到的醯胺 化合物的生成液中，因製備方法的不同而不同，通常存在高分 子物質、表面活性劑、著色劑、溶出物或其他的不純物等。爲 除去這些雜質，已經公開了下述的方法，例如，特開昭 61 -115495 號和 61-122253 號(EP-A-182578)公開了用活性炭 精製處理的方法，而特開昭61-115058號公開了用離子交換膜 精製處理的方法，特開昭61-22227號(EP-188068)公開了用多 孔的中空纖維膜精製處理的方法。 但是，上述的離子交換膜或中空纖維膜精製處理的方法必 須有特殊的精製裝置等，在其實施中不可避免的存在經濟方面 的缺陷。 在用活性炭精製的方法中，通常不需要特殊的設備，但是 在製品中仍存在雜質，效果不好。特別是，用有腈類水合能酶的 腈類水合酶等直接水合腈類化合物製備醯胺化合物的情況下， 按照上述現有技術的活性炭精製方法，混入反應溶液中的來自 微生物的蛋白質等的除去不充分，其結果，即使其量是微量， 反應液也易發泡，其量爲大量時，反應液變成白濁狀，製品的 質量低劣。 因而，本發明的目的是提供高效率地除去醯胺化合物溶液 中不純物的方法。更具體地說，本發明是提供在從腈類化合物 3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ~ " 一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

553922 Δ7 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（7) 製備相應的醯胺化合物時，得到含醯胺化合物的溶液，用活性 炭處理該溶液，簡便而高效的精製方法。 本發明人對用活性炭精製上述含有醯胺化合物的溶液進 行了深入的研究，發現在酸性條件下，使含醯胺化合物的溶液 與活性炭相接觸，特別是在特定的pH值範圍與活性炭相接觸， 能夠高效率地除去該含醯胺化合物溶液中的不純物，特別是蛋 白質。 特別是從現有技術中可知，醯胺化合物是含有不飽和鍵的 物質時(例如，工業上比較重要的化合物是丙烯醯胺、甲基丙烯 醯胺等），在酸性範圍易發生聚合反應，化合物不穩定，爲了 避免聚合反應發生，含醯胺化合物的溶液必須保持中性。根據 這樣的觀點，在上述條件下的精製技術得到了現有技術怎麽也 想不到的效果。 艮P，本發明是： (1) 在酸性條件下，使含醯胺化合物的溶液與活性炭相接觸爲 特徵的精製醯胺化合物的方法。 (2) 按上述（1)所述的精製方法，含醯胺化合物的溶液是按 相應的腈類化合物的水合反應得到的生成溶液。 (3) 按上述（2)所述的精製方法，醯胺化合物的碳原子數是 2-20個碳原子。 (4) 按上述(3)所述的精製方法，醯胺化合物含有不飽和結合 的物質。 (5) 按上述（2)或（3)所述的方法，醯胺化合物是用含腈 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T .f. ί - - - —1 - In il -- > i 553922 7、發明説明（乃） 類水合酶齡生髓體，或__細_雜，按 合物的水合反應製備的。 ⑹按上n)臓的觀跑，微生糖體紐任意宿主 中麵_生_株___水合醜麵細形質轉換 ⑺按上述4 (^所獅_雜，醜彳始用含腈類水 合酶的微生或該微生物菌體的處理物，按腈類化合物 的水合反應製備的物質。 ⑻按上述的精製方法，微生物麵是在任意宿主 中發現_生幅株___水讀醜_質議 體。 (9) ，上述⑺臟的赖雜，_靴合煙_青或甲 基丙烯腈。 (10) 按上述（8)所述的精_士 _ ^ @ 精氣万法，醯胺化合物是丙烯腈或 甲基丙烯腈。 (11) 按上述（9)或（1〇)所饫 + 所迷的楕製万法，與活性炭相接 觸時的自酗胺化合物溶液pH值爲3 5—6 5 經 濟 (12) 按上述（11)所述的精士a甘 ^ 、棺氣万法，其特徵是用酸離解常數 爲3·5-5.5的有機酸或用該有施i 有祕1酸和鹼調g?含醢胺化合物的 溶y佼的酸性。 (13) 按上述（12)所述的精_士、+ 費 A7 B7 體, (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 丙稀酸 氣万法，有機酸是丙烯酸或甲基 (14) 按上述（13)臟_製趣，灘炭是以木質或棕櫚 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 553922 A7 B7 五、發明説明（今） 殼作原料的活性炭。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (15) 按上述（14)所述的精製方法，與活性炭相接觸時的溫 度爲 10-50Ό。 (16) 按上述（15)所述的精製方法，其特徵是含醯胺化合物 的溶液與活性炭接觸後，從含醯胺化合物的溶液中分離活性 炭，使分離出的溶液在飽和溫度以下析出結晶。 t. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明中含醯胺化合物的溶液沒有特別的限制，具體地 說，可以舉出碳原子數爲2-20的腈類化合物進行水合反應得 到的含醯胺化合物的生成溶液。供水合反應的腈類化合物，可 以是寬範圍的腈類化合物，例如脂肪族腈類化合物、芳香族腈 類化合物等的腈類化合物。脂肪族腈類化合物可舉出碳原子數 爲2-6的飽和或不飽和腈類，例如乙腈、丙腈、丁腈、異丁腈、 戊腈、異戊腈、己腈等脂肪族單腈類；乙二腈、丁二腈、己二 腈等脂肪族飽和二腈類；丙烯腈、甲基丙烯腈、丁烯腈等的脂 肪族不飽和腈等。芳香族腈類化合物可舉出苄腈、隣-、間-和對-氯苄腈、隣-、間-和對-氟苄腈、隣-、間-和對-腈類苄 腈、隣_、間-和對-甲基苄腈、苄基氰化物等，特別是對於由 丙烯腈和甲基丙烯腈等有不飽和鏈的腈類得到的含有丙烯醯 胺和甲基丙烯醯胺的水溶液，本發明的方法特別適合。 在本發明中，關於作爲處理物件的含醯胺化合物的溶液， 不管是從那種已知水合方法製備的含醯胺化合物的溶液。艮[]， 不管是由硫酸水合法或由含雷内銅催化劑等的金屬銅的催化 劑的接觸水合法製備的含醯胺化合物的溶丨夜用有水合能力使 6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 553922 A7 B7 五、發明説明（< ) 腈類化合物的酶（腈類水合酶）和含有這些酶的微生物菌體， 或用其酶和微生物體處理物等進行水合反應等都是可以的。 但是，用有使腈類化合物進行水合能力的酶即腈類水合 酶、腈類水合酶的處理物、含腈類水合酶的微生物菌體或該微 生物菌體處理物得到的含醯胺化合物的溶液本發明的方法是 特別適合的。 上述的腈類水合酶稱爲具有腈類化合物加水分解生成相 應的醯胺化合物能力的酶。 在本發明中，含有腈類水合酶的微生物沒有特別的限制， 只要具有使腈類化合物加水分解産生有生成相應醯胺化合物 能力的腈類水合酶，而且在30重量%的丙烯醯胺水溶液中保持 腈類水合酶活性的微生物就行。作爲適合的實例，可以具體舉 出諾卡氏菌屬、棒桿菌屬、芽孢菌屬、好熱性桿菌屬、假單胞 菌屬、微球菌屬、紅球菌種爲代表的紅球菌屬、不動桿菌屬、 黃色桿菌屬、鏈黴菌屬、根瘤菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、 歐文氏菌屬、氣單胞菌屬、檸檬酸桿菌屬、維氏無色桿菌屬、 瓊脂桿菌屬或嗜熱性菌種代表的假諾卡氏菌屬的微生物。 在本發明中，在任意宿主中發現的該微生物純菌株培養的 腈類水合酶遺傳因數的形質轉換體也含於本發明所述的微生 物中。而且，本申請中所述的任意宿主可列舉出後述實施例的 大腸桿菌作代表但是大腸桿菌並不特別限定包含枯草桿菌等 的桿菌屬菌、酵母菌或放線菌等，也含其他的微生物菌株。這 種微生物菌株的實例，可以舉出MT-10822(根據關於特許手續 7 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •β 、1Τ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210/ 297公f ) 553922 五、發明説明（w) 上的微生物寄存的國際承認的布達佩斯條約，該菌株於1996 年2月7日寄存在茨城縣築波市東1街第3号的通商產業省工 業技術院生命工學工業技術研究所，寄存号爲FERM BP-5785)。 另外，使用DNA重組技術，該酶構成中的一或兩個以上氨基 酸，可以用其他的氨基酸插入、置換、缺失、削除，發現提高 了醯胺化合物穩定性^溫度穩定性的變異型的腈類水合酶的形 質轉換體也包含在本發明所述的微生物中。 使用上述的微生物製備醯胺化合物時，通常利用該微生物 的菌體或菌體處理物。菌體優選利用分子生物學、生物工程 學、遺傳工程學區域内公知的一般方法調製。例如，可以舉出 在LB培養基或M9培養基的通常液體培養基植菌該微生物後， 在適當的培養溫度培養（一般情況下，爲20-50°C，但在嗜熱 菌的情況下，爲50°C以上），此後，用離心分離法使該微生物與 培養液分離、回收的方法。 本發明中的微生物菌體處理物，是指上述的微生物菌體的 提取物或磨碎物，分離精製該提取物或磨碎物的腈類水合酶活 性部分得到的後分離物，將該微生物菌體或該菌體的提取物、 磨碎物、後分離物用適當的擔體固定的固定化物，其中有腈類 水合酶活性的部分相當本發明菌體處理物。 作爲本發明精製物件的醯胺化合物中，利用包含腈類水合 酶的微生物菌體或該微生物菌體的處理物水合腈類化合物得 到酉胺化合物時的反應形式使相應的腈類化合物進行間歇式 反應的方法，或連續反應的方法。反應的形式沒有特別的限 8 i紙張尺度適i中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公羞1 " (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T .V. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 553922 A7 B7 五、發明説明（吖） 制，例如，可在沸騰床進行，也可在固定床進行。此時，在反 應液中的催化劑，例如微生物菌體或菌體處理物的濃度、水性 介質和腈類化合物的混合沒有障礙，沒特別的限制。 如上所述，在開始反應時添加腈類化合物的情況下，腈類 化合物的濃度爲該腈類化合物的飽和濃度以上。一方面，濃度 的上限沒有特別的限制，可根據反應結束時預定的酿胺化合物 的濃度和腈類化合物的濃度任意決定。 未反應的腈類化合物可以通過反應後蒸餾等方法從反應 液中除去。因此，即使達到預定反應結束時的醯胺化合物濃度 的時間點，也可以添加腈類化合物使腈類化合物過剩。 具體地說，例如，腈類化合物是丙烯腈的情況下，在20°C 溫度下本化合物對水的飽和濃度爲約7重量％，在約7重量％ 以上是非常適合的。在甲基丙烯腈或丁烯腈是腈類化合物的情 況下，在20°C溫度下這些化合物對水的飽和濃度爲約2重量 %，在約2重量％以上是非常適合的。 上述的醯胺化反應通常在常壓下進行，爲了提高在水介質 中腈類化合物的溶解度可在加壓下進行。反應溫度在水性介質 的凝固點以上沒有特別的限制，但是，在催化劑含腈類水合酶 時，優選在0-50°C、更優選10-30°C的溫度範圍内進行。 上述醯胺化反應時反應液的pH值，要求保持腈類水合酶 的活性，沒有特別的限制，但是，pH值優選在6-10、更優選 在7-9的範圍。 在本發明中醯胺化合物的精製，是在酸性條件下，優選 9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（^10X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T .t 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 553922 __— _________-^—一一**-" 五、發明説明（g ) pH 2以上、更優選ΡΗ 3· 5-6. 5範圍内與活性炭相接觸進行。 在本發明中，含醯胺化合物的溶液爲酸性，通常該含醯胺 化合物溶液必須添加酸，但是，酸的種類可以使用不影響醯胺 化合物的穩定性的各種各樣的酸，例如硫酸和硝酸等的無機 酸，或乙酸和丙烯酸之類的有機酸，可以兩種以上組合使用。 即使這樣，在本發明中，調節pH容易保持穩定，但是，從得 到更高的精製效果和醯胺化合物的穩定性上考慮是使用弱酸 的效果好，而且，從保持pH緩衝效果上考慮，優選用弱酸或 鹼或兩者調節上述的pH值。 考慮pH值控制的範圍，優選使用的弱酸是酸的離解常數 (Ka: 25°C，水中）優選爲2. 0-6.0,更優選爲3. 5-5· 5的酸。 這些酸的實例是乙酸、丙酸、辛酸、戊酸等脂肪族飽和一元竣 酸、丙烯酸、丁烯酸、甲基丙烯酸等的脂肪族不飽和單羧酸、 草酸、己二酸、丁二酸、馬來酸等的脂肪族多元酸、安息香酸 等的芳香族羧酸等。上述的鹼優選強鹼，例如氫氧化鈉和氫氧 化鉀。 在本發明中，作爲處理物件的醯胺化合物，特別是在持有 不飽和鍵的醯胺化合物作爲處理物件的情況下，在精製後進行 聚合反應時，得到的聚合物中殘存有酸，或發生游離不適合的 情況。爲此，以有上述不飽和結合物的醯胺化合物作精製物件 時，酸具有不飽和鍵時，可能與該醯胺化合物進行共聚合，具 體使用丙烯酸和甲基丙烯酸，或丁烯酸等。 在本發明中，上述的酸或上述的酸和鹼的濃度，根據含醯 10 ———————1#-------;T. t (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 553922 A7 B7 五、發明説明（0 ) 胺化合物溶液的性質和酸的pKa值相對含醯胺化合物溶液換 算成酸，酸的用量通常在1〇重量Ppm-5重量%範圍。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 不管是何種調節方法，在本發明中，在上述酸性條件下使 含醯胺化合物的溶液與活性炭相接觸，而活性炭與含醯胺化合 物的溶液接觸時該溶液變成酸性，或酸性的形式，沒有特別限 制，活性炭與含醯胺化合物的溶液同時添加調節酸性。 本發明中所使用的活性炭沒有特別地限制，粉末狀和粒狀 的活性炭都可使用。對於進行精製處理的裝置，根據所使用的 活性炭的粒度選用。例如，在使用粉末狀活性炭的情況下，溶 液可在槽中攪拌，可以使用間歇式和連續式的裝置進行。使用 粒狀活性炭時，除上述的形式外，也可使用填充塔進行連續處 理。 活性炭一般用煤、木材和椰子殼等爲原料，吸附能沒有特 別的限制，只要可以使用就行。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 但是，作爲處理物件的醯胺化合物含有不飽和鍵的情況 下，考慮該醯胺化合物的保存穩定性和聚合難易等因素，優選 使用金屬含量少的活性炭優選使用以木材或棕櫚殼爲原料的 活性炭。 在本發明中，醯胺化合物進行精製處理時所使用的活性炭 量太少時難得到優良的精製效果，太多時，也不經濟，相對含 醯胺化合物溶液，活性炭的用量通常爲0. 01-20重量%，更優選 爲0. 05-10重量％。 使用粉末狀活性炭時，活性炭可以任意直接添加入含醯胺 11 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） 553922 A7 B7 五、發明説明（^ ) 化合物的溶液中，或一旦將活性炭分散在水等的介質中，以漿 料的形式加入或提供給含醯胺化合物的溶液。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在本發明中，用活性炭精製處理含醯胺化合物溶液時的溫 度，以醯胺化合物不析出結晶，保持在不影響穩定性的範圍， 沒有特別地限制，但是，通常0-8CTC的溫度下進行。特別是 含丙烯醯胺或甲基丙烯醯胺化合物溶液，精製有不飽和鍵的醯 胺化合物溶液時，爲防止發生聚合反應引起凝膠化，溫度保持 在60°C以下，優選在1〇-50。(：溫度範圍進行與活性炭接觸。根 據處理形式和活性炭的用量，與活性炭接觸處理的必要時間， 通常在0· 5-20小時範圍。 接著，從活性炭中分離按本發明上述處理的含醯胺化合物 的溶液，得到精製的含醯胺溶液。分離活性炭的方法，一般採 用使用固液分離裝置的方法，沒有特別地限制，例如，一般使 用加壓篩檢程式、減壓篩檢程式或離心分離器，而且不管是間 歇式和連續式方法。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在本發明中，冷卻分離上述活性炭後的含醯胺化合物的溶 液，採用結晶析出溶液中目的醯胺方法，可以得到更精製的醯 胺化合物。 在本實施例中，可以將持有腈類水合酶活性的氨基酸置換 體進行部位特異的變異。但是，按照在實施例公開的變異點和 被置換的鹼基的種類中，用部位特異的變異以外的方法構築重 組的質體，將其導入宿主細胞中，可能得到與本實驗相同的結 果。 12 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 553922 A7 B7 --—----------—, 五、發明説明（丨\ ) 例如，在和實施例中公開的變異點相當區域的DNA鹼基序 列是在合成器中合成有和氨基酸置換後的序列的那樣的鹼基 序列的DNA碎片，將得到的碎片分離和相當區域的另一方法分 離的PPT-DB1的該碎片置換，就可以取得所需的重組質體。 實施例 下面，通過實施例更詳細地說明本發明，但是，本發明不 受以下實施例的限制。 在下文中，反應液的HPLC分析，使用ULTRON 80G (5〇X84>mm)柱進行，展開液是10mM磷酸水溶液，丙烯醯胺 & 220nm處檢出吸光度。爲了確認本發明的效果，分析得到含 酉壺胺化合物溶液的蛋白質。含醯胺化合物的溶液用半透膜透析 除去醯胺化合物後，蛋白質的濃度用百歐拉特3 ν卜） 社製的蛋白質分析儀定量，求出蛋白質的除去率。 實施例1 在5⑻毫升帶緩衝瓶的三角燒瓶中調製下述組成的培養 基10〇亳升，在121°C用滅菌器滅菌20分鐘。這種培養基的 最終濃度達50微克/毫升，添加氨苄青黴素後，將MT-10822 株（FERMBP-5785)的一白色菌耳植菌，在37°C於130轉/分 轉速下培養20分鐘。從培養液中離心分離（15000轉/分X 15 分鐘）菌體，接著用50毫升生理鹽水將該菌體再懸濁後再次 進行離心分離，得到濕菌體。 培養基的組成 13 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 553922 A7 B7 五、發明説明) 酵母提取液 5. 0克/升 細菌培養基用的腺 1〇.〇克/升 氯化鈉 5. 0克/升 氯化鈷六水合物 10. 0克/升 硫酸亞鐵七水合物 40. 0克/升 pH 7. 5 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將上述得到的濕菌體1· 5克在98· 5克的〇· 3mM氫氧化鈉水溶 液中懸濁，向這種懸濁液中總共添加36克丙烯腈，在l〇°C溫度 下攪拌並反應。從反應開始24小時後用HPLC對反應液進行分 析。其結果，反應液中只有丙烯醯胺存在（濃度=35重量％)， 認爲沒有丙烯腈。這種反應液的pH值是8.0。 § 用10%的硫酸水溶液將這種反應液調整pH值爲5相對反 應液添加2重量%的活性炭（三倉化成（株）製粉末狀活性炭 PM-SX)，在25°C溫度下攪拌5小時後，用濾紙進行過濾。測 定得到的濾液中的蛋白質濃度，除去率在99%以上。另外，向 10毫升這種濾液中加入100毫升甲醇，不生成白色沈澱，認爲 全部是聚合物。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實施例2 對實施例1中得到的反應液，除用10%的丙烯酸水溶液調 整pH值爲5外，得到的濾液進行與實施例1相同的處理。測 定得到的濾液中的蛋白質濃度，除去率在99%以上。另外，向 10毫升這種濾液中加入1⑻毫升甲醇，不生成白色沈澱，認爲 14 本紙張尺度適用中國國家標準丨^^^^丨八^見格丨^乂”了公釐） 553922 A7 五、發明説明（θ ) 全部是聚合物。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 實施例3 為了用Met置換含有腈類水合酶活性的氨基酸轉換體取 得的α亞單元的6號位元連接部分的Leu，按照特開平 9-275978得到的pPT-DB1質體DNA作爲模板，用宝酒造社製的 [LA PCR體外誘變儀組套（Kit)]進行部位特異的變異導入。 下文簡單稱[LA PCR體外誘變儀Kit]爲工具箱。在下述的實 施例中基本上按照工具箱的原理和操作方法。

I 在30毫升的試管中調製10毫升LB液體培養基在121°C 用自動滅菌器滅菌20分鐘。這種培養基的最終濃度達100微 克/毫升，添加氨苄青黴素後，與實施例1同樣將MT-10822株 的一白色菌耳植菌，在37°C溫度下於3⑻轉/分轉速培養20 小時。在適當的離心管中分取1毫升該培養液後，離心分離 (150⑻轉/分X 5分鐘）該菌體。接著用鹼SDS提取法調製該 菌體的pPT-DB1質體DNA。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將pPT-DB1質體DNA 1微克作爲模板進行兩種類型的PCR 反應。PCR反應1按照含序列表序列編號1記載的引物Μ13和 引物Μ4 (序列表的序列編號2記載的序列）各50mpol的全量 (體積）50微升體系（組成根據工具箱中記載的條件)，熱變 性處理（98°C)15秒鐘退火（55°C)30秒鐘伸長反應（72°C) 120秒鐘條件進行，反復進行25個迴圈。按照含MUT4引物（序 列表的序列編號3記載的序列）和M13引物-RV (序列表的序 列編號4記載的序列）各50mpol的全量（體積）50微升體系 (組成根據工具箱中記載的條件），與PCR反應1進行同樣的 15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 553922 A7 B7 五、發明説明) 操作，進行PCR反應2。用PCR反應1和PCR反應2反應終了 液各5微升，根據瓊脂電泳（瓊脂濃度1. 0重量％)分析DNA 增幅産物，可以確認DNA增幅産物的存在。用MicroconlOO (宝 酒造社製)除去各個反應終了液中過剩的引物和dNTP後，加入 TE調製各反應終了液的50微升溶液。調製含該TE溶液各0. 5 微升的全量（體積）47. 5微升的退火溶液(組成根據工具箱記 載的條件)，熱變性處理(98°C)進行10分鐘後，花費60分鐘的 一定速度進行冷卻直到37°C，接著在37°C保持15分鐘進行退 火處理。向退火處理液加入TAKARALAT水溶液0.5微升，在 72°C進行加熱處理3分鐘，完成雜（異）兩個鏈。向這種溶液 加入M13引物M4 (序列表序列編號2記載的序列）和13引物 -RV (序列表序列編號4記載的序列）各50pmol，使全量爲（體 積）50微升後，進行熱變性（98°C)處理5秒鐘，退火（55 °C)處理30秒鐘，伸長反應（72°C) 120秒，將PCR反應3 反復進行25個迴圈。用PCR反應3的反應終了液5微升的瓊 脂電游泳（使用西谷瑪夕7]社製VII型低融點瓊脂；瓊脂 濃度〇· 8重量％)進行DNA增幅産物分柝可確認約2. 0 Kbp DNA 增幅産物的存在。接著，從瓊脂凝膠切出約2. Okbp的DNA片 段，細細地粉碎該瓊脂片（約〇. 1克），在1毫升的TE溶液中 懸濁後，在55°C保溫1小時，使瓊脂完全融化。對該融化液用 現有技術的通常方法苯酚/氯仿抽出，並用乙醇進行沈澱，精製 該〇敵片段，最終在10微升的呢中溶解。精製的約2.01^1) 的DNA增幅片段用限制酶EcoRI和Hindlll切斷後，對這種限 制酶處理液用苯酚/氯仿抽出，並用乙醇進行沈澱，精製該DNA 片段，最終在10毫升TE中溶解。同樣，pPT-DBl上的唯一限 尺度適用中國國ϋ準（CNS )公釐） ----------------------IT------Λ9 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 553922 A7 _ B7__ 五、發明説明（< ) 制酶位置是用EcoRI和Hindlll切斷pPT-DB1，進行瓊脂凝膠 的電泳（使用西谷瑪θ1社製VII型低融點瓊脂；瓊脂濃 度0· 7重量％)，從瓊脂凝膠切出約2. 7 kbp的DNA片段。細細 地粉碎切出的瓊脂片段，在1毫升TE溶液中懸濁後，在55°C 保溫1小時，使瓊脂完全融化。對該融化液用苯酚/氯仿抽出， 並用乙醇進行沈澱，精製該DNA片段，最終在10微升的TE中 溶解。這樣得到的增幅DNA產物和pPT-DBl片段用DNA連結組 套（宝酒造社製）連接後，將大腸菌ίΙΒΙΟΙ (東洋紡績社製） 進行形質轉換，調製大腸桿菌群。 在30毫升試管中調製含40微克/毫升的硫酸亞鐵七水合 物和10微克/毫升的氯化鈷二水合物的10毫升LB液體培養基 (下文稱活性發現培養液)，在121°C溫度用滅菌器滅菌20分 鐘。這種培養液的最終濃度100微克/毫升，添加氨苄青黴素 後，用該大腸菌群任意選擇的5個菌株各植菌一白色菌耳，於 37°C溫度300轉/分下培養20小時。分取該培養終了液1毫升， 離心分離（15000轉/分X 5分鐘）菌體。該菌體在200微升的 磷酸鉀緩衝液（ρΗ7· 0)懸濁，向其中添加1重量％的丙烯腈， 在10°C反應2分鐘。向反應液中加入與其等量的1Μ磷酸水溶 液終止反應，生成丙烯醯胺的濃度用與實施例2相同的HPLC 分析測定。其結果，在5株中的4株檢測出丙烯醯胺的生成， 認爲保持了腈類水合酶的活性。 用提供測定腈類水合酶活性的上述培養液的殘餘部分1 毫升分別分離該4株的菌體用鹼SDS抽出法調製各株的質體 DNA。接着用ABI社製的司庫煙司古基特和歐特司庫煙 薩工 > シ > 夕、、今7卜ά才—卜シ_ク二 > 廿卜373A的引 17 本紙張尺度適用中國國&票準（CNS ) A4規格（2丨公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

553922 A7 B7 五、發明説明（心） 物伸縮法確定各株的腈類水合酶構造遺傳因子的鹼基序列。其 結果，表1示出了株1中的腈類水合酶的α亞單元編號6位 7U的Leu被Met置換。 表1

株 編 號 變異部位 氨基酸序列變化 鹼基序列變化 (α亞單元内） 置換前 置換後 置換前 置換後 1 α -6連接部分 Leu Met CTG ATG 接著，爲了使α亞單元的126連接部分的Phe被Tyr置換， 模板株1的質體DNA，按上述相同的操作進行部位特異的變異 導入。 艮P，在30毫升的試管内調製10毫升的LB流體培養基， 在121°C溫度用滅菌器滅菌20分鐘。這種培養液的最終濃度 100微克/毫升，添加氨苄青黴素後，將得到的克隆的株1植菌 一白色菌耳，於37°C溫度300轉/分下培養20小時。分取該 培養終了液1毫升，於適當的離心管中後，離心分離（15000 轉/分X5分鐘）菌體。接著按鹼SDS抽出法用該菌體調製克 隆的株1的質體DNA。 模板該克隆的株1的質體DNA 1微克進行兩種類型的PCR 反應。PCR反應4按照含序列表序列編號5記載的引物M13和 引物M4 (序列表的序列編號2記載的序列）各50mpol的全量 (體積）50微升體系（組成根據工具箱中記載的條件)，熱變 性處理（98。〇15秒鐘退火（55°C)30秒龜伸長反應（72°C) 120秒鐘條件進行，PCR反應4反復進行25個迴圈。按照含 18 本紙張尺度適用中國國家標準（) A4規格（2U)X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---^------訂-- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 553922 A7 B7 五、發明説明（Μ) MUT4引物（序列表的序列編號3記載的序列）和M13引物RV (序列表的序列編號4記載的序列）各50mpol的全量（體積) 50微升體系（組成根據工具箱中記載的條件)，進行與pcr反 應4同樣的操作，進行PCR反應5。用PCR反應4和PCR反應 5反應終了液各5微升的瓊脂電泳（瓊脂濃度1. 0重量％)進 行DNA增幅産物的分析，可以確認DNA增幅産物的存在。此後 用完全相同的操作調製克隆株1的大腸菌群。 該大腸菌群任意選擇的5個菌株在和克隆株1的情況和 相同的活性發現培養基10毫升中各植菌一白色菌耳，在37°C 於300轉/分轉速下培養約20小時。該培養終了液1毫升分別 分取於適當的離心管後，測定腈類水合酶的活性。其結果，在 5株中的4株中檢測出丙烯醯胺的生成，確認保持了腈類水合 酶的活性。 用提供測定腈類水合酶的活性的上述培養液的殘餘部分 1毫升分別分離該4株的菌體，用鹼SDS抽出法調製各克隆株 的質體DNA。接著用與克隆株1的情況同樣的操作決定克隆株 腈類水合酶構造遺傳因數的鹼基序列。其結果，表2列出了株 2中的腈類水合酶的CL亞單元的6號位元連接部分的Leu被 Met置換，α亞單元的126連接部分的Phe被Tyr置換。 :t -- -- ----- m if - - IT— s· 1 - 1—i I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 ii. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表2 株 編 號 變異部位 氨基酸序列變化 鹼基序列變化 (α亞單元内） 野生型 變異體 野生型 變異體 19 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 553922 A7 B7 五、發明説明（）

2 α -6連接部分 Leu Met CTG ATG a-126連接部分 Phe Tyr TTC YAC 接著，爲了使β亞單元的212連接部分的Ser被Tyr置換， 模板株2的質體DNA，用與上述相同的操作進行部位特異變異 導入。 艮P，在30毫升的試管内調製10毫升的LB流體培養基， 在121°C溫度用滅菌器滅菌20分鐘。這種培養液的最終濃度 100微克/毫升，添加氨苄青黴素後，將得到的克隆的株2植菌 一白色菌耳，於37°C溫度3⑻轉/分下培養20小時。分取該 培養終了液1毫升於適當的離心管中後，用離心分離（15000 轉/分X5分鐘）菌體。接著，按鹼SDS抽出法用該菌體調製 克隆株1的質體DNA。 模板的該克隆的株2的質體DNA 1微克進行兩種類型的 PCR反藤PCR反應6按照含序列表序列編號6記載的引物M13 和引物M4 (序列表編號2記載的序列）各50mpol的全量（體 積）50微升體系（組成根據工具箱中記載的條件)，熱變性處 理（98°C) 15秒鐘，退火（55°C) 30秒鐘，伸長反應（72°C) 120秒鐘條件進行，PCR反應6反復進行25個迴圈。按照含 MUT4引物（序列表的序列編號3記載的序列）和M13引物RV (序列表的序列編號4記載的序列）各50mpol的全量（體積) 50微升體系（組成根據工具箱中記載的條件)，進行與PCR反 應6同樣的操作，進行PCR反應7。用PCR反應6和PCR反應 7反應終了液各5微升的瓊脂電泳（瓊脂濃度1· 〇重量％)進 行DNA增幅産物的分析，可以確認DNA增幅産物的存在。此後 按克隆株1的情況完全相同的操作調製大腸菌群。 20 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 553922 A7 _B7 五、發明説明ΚΛ ) 該大腸菌群任意選擇的5個菌株在與克隆株1的情況的 相同活性發現培養基10毫升中各植菌一白色菌耳，在37°C於 300轉/分轉速下培養約20小時。該培養終了液1毫升分別分 取於適當的離心管後，測定腈類水合酶的活性。其結果，在5 株中的4株中檢測出丙烯醯胺的生成確認保持了腈類水合酶 的活性。 用提供測定腈類水合酶的活性的上述培養液的殘餘部分 1毫升分別分離該4株的菌體，按鹼SDS抽出法調製各株的質 體DNA。接著，用與克隆株的株1的情況同樣的操作決定各克 隆株腈類水合酶構造遺傳因數的鹼基序列。其結果，表3示出 了株3中的腈類水合酶的β亞單元的212連接部分的Ser被 Tyr置換。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 表3

株 變異部位 氨基酸序列變化 鹼基序列變化 編 號 (α亞單元内） 野生型 變異體 野生型 變異體 3 α -6連接部分 Leu Met CTG ATG α -126連接部分 Phe Tyr TTC TAC β -212連接部分 Ser Tyr TCC TAC 該克隆株3與實施例1同樣培養，得到在反應中必要的菌體。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 再者，得到的濕菌體1. 5克在98. 5克0· 3mM的氫氧化鈉 水溶液中懸濁，向該懸濁液中總共添加60克的丙烯腈，在10°C 攪拌並反應。從開始24小時後，按HPLC分析進行反應液的分 析。其結果，在反應液中只有丙烯醯胺存在（濃度=50重量％)， 認爲沒有丙烯腈。該反應的pH值是8.0。 21 ( CNS ) ( 210X 297^ ")~' ~ 553922 A7 B7 五、發明説明（f ) 用10%硫酸水溶液將該反應液的pH值調整爲&相對反應 液添加2重量％的活性炭（三倉化成（株）製粉末狀活性炭 PM-SX)，在25°C溫度下進行攪拌5小時，進行濾紙過濾。測 定得到的濾液中蛋白質的除去率，除去率在99%以上。此外， 該濾液10毫升加入甲醇1〇〇毫升也不白濁。認爲全部是聚合 物。 實施例4 對在實施例3中得到的水合反應液，除用10%的硫酸水溶 液調整pH值爲3外，進行與實施例1相同的處理得到濾液。 測定濾液中蛋白質的除去率爲75%。此外，向該濾液10毫升 加入100毫升甲醇也不白濁，認爲全部是聚合物。 比較例1 對在實施例3中得到的水合反應液用10%的硫酸調整PH 值爲7外，進行與實施例1相同的處理得到濾液。濾液中的蛋 白質除去率爲25%。 發明的效果 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁〕 以上的說明，特別是如上述的實施例和比較例表明的那 樣，按照本發明的方法，與現有技術中用活性炭精製的方法相 1：匕，在酸性條件下與活性炭接觸，可以高效地進行醯胺化合物 的精製。特別是，按照本發明的方法精製聚合的丙烯醯胺時， 可以得到高分子量、保存穩定性優良且具有高水溶性的聚丙烯 醯胺。 22 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）~~' ' ' '—- 553922 A7 _B7 五、發明説明（4 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 [序列表] <110〉三井化學股份有限公司 <120>醯胺化合物的精製方法 <130>F-1892 <150>JP 2000-00793 <151>2000-01-17 <160>6 <210>1 <211>18 <212>DNA <213>人工序列 <4 ⑻>1 AACATCATGC GCAAGTCG 18 <2102 <211>17 <212>DNA <213>人工序列 <4002 CAGGAAACAG CTATGAC 17 23 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 553922 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（夕） <210>3 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <4003 GGCCAGTGCC TAGCTTACAT 20 <2104 <211>17 <212>DNA <213> <400>4 GTTTTCCCAG TCACGAC 17 <210>5 <211>18 <212>DNA <213>人工序列 <400>5 AACTGGTACA AGGAGCCG 18 <210>6 <211>18 裝I— - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T # 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 553922 A7 五、發明説明（妁） <212>DNA <213>人工序列 <400>6 CCGAACTACA GCGTCTAC 18 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ψ —•訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）

Claims (1)

1. 53922 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 特徵是該醯胺化合物是丙烯醯胺或甲基丙烯醯胺。 10·如申請專利範圍第8項所述的醯胺化合物的精製方法，其 特徵是該醯胺化合物是丙烯醯胺或甲基丙烯醯胺。 11·如申請專利範圍第9或10項所述的醯胺化合物的精製方 法，其特徵是與該活性炭相接觸時，含該醯胺化合物溶液的pH 值爲 3. 5-6. 5。 12·如申請專利範圍第11項所述的醯胺化合物的精製方法， 其特徵是用酸離解常數爲3.5-5.5的有機酸或該有機酸和鹼 調節該含醯胺化合物溶液的酸性。 13·如申請專利範圍第12項所述的醯胺化合物的精製方法， 其特徵是該有機酸是丙烯酸或甲基丙烯酸。 14·如申請專利範圍第13項所述的醯胺化合物的精製方法， 其特徵是該活性炭是以木質或棕櫚殼作原料的活性炭。 15·如申請專利範圍第14項所述的醯胺化合物精製方法，其 特徵是與該活性炭相接觸時的溫度爲l〇-5〇°C。 16·如申請專利範圍第15項所述的醯胺化合物的精製方法， 其特徵是該含醯胺化合物的溶液與該活性炭接觸後，從含該醯 胺的溶液中分離該活性炭，使分離出的溶液在飽和溫度以下析 出結晶。 27 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 、可 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210X 297^^" 申請4利範圍 Α8 Β8 C8 D8 mJU- 經濟部智慧財是局員工消費合作社印製 1· 一種醯胺化合物的精製方法，其步驟包括： .- (a) 在酸性條件下，將含有驢胺化合物的溶液與活性炭接觸； (b) 將固體與液體分離；以及 (c) 結晶析出溶液中之目的醯胺化合物。 2·如申請專利範圍第1項所述的醯胺化合物的精製方法，其 特徵是該含醯胺化合物的溶液是由相應的腈類化合物水合反 應得到的生成液。 3·如申請專利範圍第2項所述的醯胺化合物的精製方法，其 特徵是該醯胺化合物的碳原子數是2-20。 4·如申請專利範圍第3項所述的醯胺化合物的精製方法，其 特徵是該醯胺化合物中含有不飽和鍵。 5·如申請專利範圍第2或3項所述的醯胺化合物的精製方 法，其特徵是該醯胺化合物是用含有腈類水合酶的微生物菌 體，或該微生物菌體的處理物按該腈類化合物的水合反應製 備的物質。 6·如申請專利範圍第5項所述的醯胺化合物的精製方法，其 特徵是該微生物菌體是在任意宿主中發現的微生物純株培養 的該腈類水合酶遺傳因數形質轉換體。 7·如申請專利範圍第4項所述的醯胺化合物的精製方法，其 特徵是該醯胺化合物用含腈類水合酶的微生物菌體或該微生 物菌體的處理物，按該腈類化合物的水合反應製備。 8·如申請專利範圍第7項所述的醯胺化合物的精製方法，其 特徵是該微生物菌體是在任意宿主中發現的微生物純株培養 的該腈類水合酶遺傳因數形質轉換體。 9·如申請專利範圍第7項所述的醯胺化合物的精製方法，其 26 請 先 閲 讀、 項 再 填 Μ 訂 仁纸张尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐）