JP2005278468A - 光学活性アミノ酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】光学活性な、チロシン、トリプトファン、O-ベンジルセリン等のアミノ酸を高効率、高収率で工業的に有利に製造する方法を提供する。
【解決手段】５−置換ヒダントインを基質として、ヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼ、並びに任意にヒダントインラセマーゼを含む酵素による反応により光学活性アミノ酸を生成する工程を含む光学活性アミノ酸の製造方法において、前記反応を、溶存酸素量１．５ｐｐｍ以下の水溶液中で行うことを特徴とする製造方法。
【選択図】 なし
【解決手段】５−置換ヒダントインを基質として、ヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼ、並びに任意にヒダントインラセマーゼを含む酵素による反応により光学活性アミノ酸を生成する工程を含む光学活性アミノ酸の製造方法において、前記反応を、溶存酸素量１．５ｐｐｍ以下の水溶液中で行うことを特徴とする製造方法。
【選択図】 なし
Description
本発明は、微生物由来のもの等の酵素を用いた光学活性アミノ酸の製造方法に関するものである。
光学活性アミノ酸は、食品、医薬品の原料や合成中間体として有用な物質である。
光学活性アミノ酸の製造方法としては、微生物、あるいは酵素を用いた方法が知られている。例えば、特許文献１〜３には、５−置換ヒダントインを基質としたＬ−アミノ酸の製造方法が記載されている。また、特許文献４〜７及び非特許文献１には、微生物、あるいは酵素を用いたＤ−アミノ酸の製造方法が種々開示されている。
しかしながら、これらの製造方法にはいずれも、Ｄ−チロシンの蓄積濃度がきわめて低い、またはＤ−チロシンの光学純度が低い等の問題点があり、工業的なＤ−チロシンの製造方法としては満足のいかないものであった。
本発明の目的は、光学活性アミノ酸を高効率、高収率で工業的に有利に製造する方法を提供することにある。
本発明者らは、上記目的を解決するために鋭意研究を進めたところ、５−置換ヒダントインを基質として用い、これをヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼを含む酵素群により光学活性アミノ酸に変換する反応において、低酸素状態の水溶液中で行うことにより、着色した不溶性生成物の生成を抑制し、著しく優れた収率が達成されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］ ５−置換ヒダントインを基質として、ヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼを含む酵素による反応により光学活性アミノ酸を生成する工程を含む光学活性アミノ酸の製造方法において、前記工程を溶存酸素濃度1.5ppm以下の水溶液中で行うことを特徴とする製造方法。
［２］ 前記酵素がさらにヒダントインラセマーゼを含む、上記［１］に記載の製造方法。
［３］ 前記ヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼが、ヒダントイナーゼ遺伝子及びカルバモイラーゼ遺伝子を有する細胞により産生されたものである、上記［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］ 前記ヒダントインラセマーゼが、ヒダントインラセマーゼ遺伝子を有する細胞により産生されたものである、上記［２］又は［３］に記載の製造方法。
［５］ 前記水溶液を不活性ガス置換環境下に置いた状態で前記工程を行う、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］ 前記細胞が、エシェリヒア コリ(Esherichia coli)である、上記［３］〜［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］ 前記光学活性アミノ酸がチロシンである、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］ 前記チロシンがＤ−チロシンである、上記［７］に記載の製造方法。
［１］ ５−置換ヒダントインを基質として、ヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼを含む酵素による反応により光学活性アミノ酸を生成する工程を含む光学活性アミノ酸の製造方法において、前記工程を溶存酸素濃度1.5ppm以下の水溶液中で行うことを特徴とする製造方法。
［２］ 前記酵素がさらにヒダントインラセマーゼを含む、上記［１］に記載の製造方法。
［３］ 前記ヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼが、ヒダントイナーゼ遺伝子及びカルバモイラーゼ遺伝子を有する細胞により産生されたものである、上記［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］ 前記ヒダントインラセマーゼが、ヒダントインラセマーゼ遺伝子を有する細胞により産生されたものである、上記［２］又は［３］に記載の製造方法。
［５］ 前記水溶液を不活性ガス置換環境下に置いた状態で前記工程を行う、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］ 前記細胞が、エシェリヒア コリ(Esherichia coli)である、上記［３］〜［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］ 前記光学活性アミノ酸がチロシンである、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］ 前記チロシンがＤ−チロシンである、上記［７］に記載の製造方法。
本発明にかかる光学活性アミノ酸の製造方法は、目的生産物である光学活性アミノ酸の収率を著しく高めることができるという効果を有する。
本発明の光学活性アミノ酸の製造方法では、５−置換ヒダントインを基質として用いる。５−置換ヒダントインとは、５−位に置換基を有するヒダントイン誘導体であり、この５−位の置換基を適宜選択することにより、所望のアミノ酸を得ることができる。具体的には例えば、５−（４−ハイドロキシベンジル）ヒダントインを基質として用いることによりチロシンを製造することができ、５−（（３−インドリル）メチル）ヒダントインを基質として用いることによりトリプトファンを製造することができ、５−（フェノキシメチル）ヒダントインを基質として用いることによりO-ベンジルセリンを製造することができるが、これらに限定されず任意の５−位置換基を有するヒダントイン誘導体により、対応する任意のアミノ酸を製造することができる。また、５−置換ヒダントインは、Ｄ−体、Ｌ−体及びこれらの混合物（ＤＬ体）のうちのいずれをも用いることができる。
本発明の製造方法では、前記５−置換ヒダントインを基質として用い、特定の酵素による反応を行う。反応のための前記酵素は、ヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼを含む。また、所望の光学異性体と対掌の異性体の５−置換ヒダントイン（即ちＬ−アミノ酸の製造においてはＤ−５−置換ヒダントイン、Ｄ−アミノ酸の製造においてはＬ−５−置換ヒダントイン）が基質中に存在している場合であってもそれを有効に反応に供させる点から、前記反応のための酵素がさらにヒダントインラセマーゼを含むことが特に好ましい。ここで、かかる複数の酵素による反応の態様は、前記特定の酵素が反応に関与する限りにおいて特に限定されず、例えば、所望の２種又は３種の酵素が一つの反応混合物中に存在し連続して反応が行われる系であってもよい。または、所望の２種又は３種の酵素が別々の反応混合物中に存在し、別々に酵素反応を行う態様であってもよい。
本発明の製造方法における反応は、具体的にはＤ−アミノ酸の製造方法の場合、下記の反応(I)〜(III)を含む反応を例示することができる：
上記反応式中、Ｒは任意の置換基であり、好ましくは既知のアミノ酸の側鎖（例えばチロシンの側鎖であれば４−ハイドロキシベンジル基、トリプトファンの側鎖であれば３−インドリルメチル基、O-ベンジルセリンであればフェノキシメチル基）を表す。
本発明における反応の工程は、具体的には例えば、反応(II)及び(III)が一つの反応混合物中で行われるものでもよく、反応(II)及び(III)が別々の反応混合物中で行われるものでもよい。また、反応(I)は本発明の製造方法におけるより好ましい態様において行われるものである。
Ｌ−アミノ酸を製造する場合であれば、例えば上記反応中のＤ−ヒダントイナーゼ及びＤ−カルバモイラーゼの代わりにＬ−ヒダントイナーゼ及びＬ−カルバモイラーゼを用いた反応により製造を行うことができる。
Ｌ−アミノ酸を製造する場合であれば、例えば上記反応中のＤ−ヒダントイナーゼ及びＤ−カルバモイラーゼの代わりにＬ−ヒダントイナーゼ及びＬ−カルバモイラーゼを用いた反応により製造を行うことができる。
ここでＤ−ヒダントイナーゼとは、Ｄ−５−置換ヒダントインを、Ｎ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸に変換する反応を触媒する酵素をいう。また、Ｄ−カルバモイラーゼとは、Ｎ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に変換する反応を触媒する酵素をいう。Ｄ−アミノ酸の製造においては、これらヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼの２つの酵素は、その少なくとも一方がＤ−体を基質とする反応のみを選択的に触媒し、Ｌ−体を基質とする反応は実質的に触媒しないことが好ましく、より好ましくは両方がＤ−体を基質とする反応のみを選択的に触媒する。
また、Ｌ−ヒダントイナーゼとは、Ｌ−５−置換ヒダントインを、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−アミノ酸に変換する反応を触媒する酵素をいう。また、Ｌ−カルバモイラーゼとは、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−アミノ酸をＬ−アミノ酸に変換する反応を触媒する酵素をいう。Ｌ−アミノ酸の製造においては、これらヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼの２つの酵素は、その少なくとも一方がＬ−体を基質とする反応のみを選択的に触媒し、Ｄ−体を基質とする反応は実質的に触媒しないことが好ましく、より好ましくは両方がＬ−体を基質とする反応のみを選択的に触媒する。
さらに、ヒダントインラセマーゼとは、ヒダントイン及びその誘導体をラセミ化する反応を触媒する酵素をいう。
前記各酵素としては、それぞれの酵素を発現する遺伝子を有する細胞により産生されたものを用いることができる。即ち、ヒダントインラセマーゼ遺伝子、ヒダントイナーゼ遺伝子及びカルバモイラーゼ遺伝子を有する細胞により産生された酵素を用いることができる。例えば、これら３種の遺伝子を全て含む１種の細胞を用いて各酵素を同時に得ることができる。または、これら３種の遺伝子の１つ又は２つのみを含む細胞を適宜組み合わせ用いることもできる。より具体的には例えば、ヒダントインラセマーゼ遺伝子及びヒダントイナーゼ遺伝子を有する細胞と、カルバモイラーゼ遺伝子を有する細胞とからそれぞれ各遺伝子に由来する酵素を得、これらを組み合わせて用いることができる。ヒダントインラセマーゼ遺伝子、ヒダントイナーゼ遺伝子及びカルバモイラーゼ遺伝子、これらを有する細胞、並びに当該細胞を用いた酵素の産生については、後に別途詳述する。
前記反応は、具体的には例えば、前記細胞を培地中で培養して所望の酵素を含む培養物を得、当該培養物と基質とを混合することにより行うことができる。または、培養物から分離した菌体、菌体の洗浄物、細胞を破砕処理あるいは溶菌処理等した処理物、これらから酵素を回収した粗酵素液、又はそれを精製した酵素液等を、基質と混合して反応を行うこともできる。さらには、前記細胞を培養しながら光学活性アミノ酸を生成する反応を同時に行うこともできる。この場合は、細胞の生育に必要な炭素源、窒素源、無機イオン等の栄養素、及びビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を反応混合物に添加することができる。また基質は、反応開始時に全て反応混合物中に添加する必要はなく、分割添加してもよい。
本発明の製造方法では、前記反応により光学活性アミノ酸を生成する工程を、溶存酸素濃度1.5ppm以下、好ましくは0.3ppm以下の水溶液中で行う。水溶液中の溶存酸素量は、具体的には例えば、酸素電極計（株式会社バイオット製 S-1型）、酸化還元電位計（Broadly James社製）等により測定することができる。また、相対的な酸素濃度を酸化還元電位計(Broadly James社製)等により測定することができる。このような低い溶存酸素濃度での反応は、前記水溶液を不活性ガス置換環境下に置いた状態とすることにより達成することができる。
より具体的には例えば、不活性ガス雰囲気下で、前記水溶液中に不活性ガスを流入させながら反応を行うことにより、低い溶存酸素濃度における反応を達成することができる。前記不活性ガスとしては、例えば窒素、アルゴン等を用いることができる。密閉された反応槽に前記不活化ガスを流入した場合には、流出口から流出するガスを酸素ガス分析装置（株式会社バイオット製 DEX-1562-2型）等により測定することができる。
また、水溶液中の酸化還元電位（ＯＲＰ）を測定し、低酸素状態の反応が達成されていることを確認することができる。
一般的に、水溶液中の溶存酸素濃度は、温度や溶質の種類及び量により変化するが、例えば純水37℃の場合、十分な撹拌、及び通気が行われている状態、すなわち飽和溶存酸素濃度は6.86ppm程度である(生物工学実験書（日本生物工学会編 培風館）のデータによる)。これに対して、本発明の製造方法においては、溶存酸素濃度を1.5ppm以下、好ましくは0.3ppm以下という低い値として反応を行う。このような低酸素状態で反応を行うことにより、不溶性物質が反応系内に生成する等して目的生成物である光学活性アミノ酸の収率が低下することを防ぐことができる。また、反応のための酵素源として細胞、細胞破砕物等を用いた場合等において、反応系に酸素を基質とする不所望な副反応を触媒する酵素が混入することがありうるが、そのような場合であっても、このような低酸素状態で反応を行うことにより、それら不所望な副反応を抑制し、良好に反応を行うことができる。具体的には例えば、本発明の光学活性アミノ酸の製造方法は、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ(EC1.4.3.2)、及びＤ−アミノ酸オキシダーゼ(EC1.4.3.3)等の酵素の共存下であっても、良好に行うことができる。
なお、反応を行う水溶液中の反応基質、反応生産物の酸化を防止するためには、酸化防止剤、もしくは還元剤を加える方法もある。かかる酸化防止剤もしくは還元剤としては、具体的にはジチオスレイトールや、亜硫酸ソーダなどが挙げられる。反応に際してこれら酸化防止剤もしくは還元剤を添加する量は目的の反応を阻害しない範囲で適宜調節することができ、当業者であれば予備的な実験により適切な濃度を決定できる。
前記反応の条件については、溶存酸素量を前記所定の範囲とすること以外には特に制限はないが、具体的には例えば２５〜４０℃の適当な温度に調整し、ｐＨ５〜９に保ちつつ、８時間〜５日間静置又は撹拌することにより行うことができる。ｐＨの維持は、例えばｐＨをモニタしながら酸及びアルカリ、例えばＮａＯＨとＨ2ＳＯ4を適宜添加することにより行うことができる。
反応工程により生成する光学活性アミノ酸の定量は、周知の方法を用いて速やかに行うことができる。すなわち、簡便にはMerck製のTPTLC CHIRなどを利用した薄層クロマトグラフィーを利用することができ、より高い分析精度が求められる場合は、ダイセル化学工業製のCHIRALPAK WHなどの光学分割カラムを利用した高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いればよい。
生成した光学活性アミノ酸は、公知の手法により分離精製することができる。例えば、反応終了後の反応混合物をイオン交換樹脂に接触させて光学活性アミノ酸を吸着させ、これを溶離後晶析する方法、又は溶離後、活性炭により脱色ろ過し晶析する方法等が挙げられる。
本発明の製造方法で製造される光学活性アミノ酸は、特に限定されないが、チロシン、トリプトファン及びO-ベンジルセリン等を挙げることができる。また本発明の製造方法では、上記の通りヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼを適宜選択することにより、Ｄ−体、Ｌ−体のいずれのアミノ酸をも製造することができる。
続いて以下に、本発明に用いるための、ヒダントインラセマーゼ遺伝子、ヒダントイナーゼ遺伝子及びカルバモイラーゼ遺伝子、これらを有する細胞、並びに当該細胞を用いた酵素の産生について詳述する。
ヒダントインラセマーゼ遺伝子、ヒダントイナーゼ遺伝子及びカルバモイラーゼ遺伝子としては、既知のものを用いてよい。例えば、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子、Ｄ−カルバモイラーゼ遺伝子及びヒダントイラセマーゼ遺伝子として、それぞれ下記（Ａ）〜（Ｃ）のＤＮＡによりコードされる遺伝子を用いることもできる。
（Ａ）．Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ
以下の(i)〜(iv)から選ばれるＤＮＡ：
(i)配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
(ii)配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、
(iii)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、及び
(iv)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
以下の(i)〜(iv)から選ばれるＤＮＡ：
(i)配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
(ii)配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、
(iii)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、及び
(iv)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（Ｂ）．Ｄ−カルバモイラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ
以下の(v)〜(viii)から選ばれるＤＮＡ：
(v)配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
(vi)配列表の配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、
(vii)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、及び
(viii)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
以下の(v)〜(viii)から選ばれるＤＮＡ：
(v)配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
(vi)配列表の配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、
(vii)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、及び
(viii)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）．ヒダントインラセマーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ
以下の(ix)〜(xii)から選ばれるＤＮＡ：
(ix)配列表の配列番号５に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
(x)配列表の配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、
(vii)配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、及び
(viii)配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
以下の(ix)〜(xii)から選ばれるＤＮＡ：
(ix)配列表の配列番号５に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
(x)配列表の配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、
(vii)配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、及び
(viii)配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。具体的には、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
また、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や、ヒダントイナーゼ活性又はカルバモイラーゼ活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。
なお、配列表配列番号１および３のＤＮＡは、フラボバクテリウム エスピー(Flavobacterium sp.)ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）株の染色体ＤＮＡより単離、取得されたものである（特公昭５６−０２５１１９号公報）。フラボバクテリウム エスピー(Flavobacterium sp.)ＡＪ１１１９９（ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）株は、当初アルカリゲネス アクアマリヌス(Alcaligenes aquamarinus)として１９７７年９月２９日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された微生物であるが、再同定の結果、フラボバクテリウム エスピー(Flavobacterium sp.)に分類されることが判明したため、フラボバクテリウム エスピー(Flavobacterium sp.)ＡＪ１１１９９（国内寄託番号ＦＥＲＭ−Ｐ４２２９）株として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託され、さらに２００２年５月３０日のブダペスト条約に基づく寄託への移管請求により、国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８０６３として同センターに寄託されている（ブダペスト条約上の原寄託日 １９８１年５月１日）。
また、配列表の配列番号５のＤＮＡは、マイクロバクテリウム リクエファシエンス(Microbacterium liquefaciens)ＡＪ３９１２株から単離・精製されたものである。マイクロバクテリウム リクエファシエンス(Microbacterium liquefaciens)ＡＪ３９１２株は、当初フラボバクテリウム エスピー．(Flavobacterium sp.)ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）株として１９７５年６月２７日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されたが、再同定の結果オーレオバクテリウム リクエファシエンス(Aureobacterium liquefaciens)に分類されることが判明した。さらに種名変更により、オーレオバクテリウム リクエファシエンス(Aureobacterium liquefaciens)はマイクロバクテリウム リクエファシエンス(Microbacterium liquefaciens)に分類され、マイクロバクテリウム リクエファシエンス(Microbacterium liquefaciens)ＡＪ３９１２（国内寄託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、さらに２００１年６月２７日のブダペスト条約に基づく寄託への移管請求により、国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４３として同センターに寄託されている（ブダペスト条約上の原寄託日 １９８１年５月１日）。
上記（Ａ）〜（Ｃ）のＤＮＡのそれぞれは、必要に応じて、その上流及び下流のそれぞれにプロモーター及びターミネーター等の他の配列を連結し、さらに他の配列と連結し、形質転換のためのプラスミドを構築し、これを細胞内に導入することにより、それぞれの酵素を発現させることができる。
前記プロモーターとしては、ラムノースプロモーター、ｔｒｐプロモーター等を用いることができるが、ｔｒｐプロモーターを特に好ましく用いることができる。ｔｒｐプロモーターは、トリプトファンの生合成に関与するいくつかの酵素をコードする遺伝子群の上流に存在するプロモーターであり、大腸菌などに存在する。本発明では、ｔｒｐプロモーターとして既に知られているものを用いてもよい。ｔｒｐプロモーターは、ｔｒｐプロモーターを含むクローニング用ベクターあるいはこのようなベクターを含む細胞の形態で市販されている。ｔｒｐプロモーターを用いることにより、ヒダントイナーゼおよびカルバモイラーゼの発現量を十分に得ることができる。また、ｔｒｐプロモーターはラムノースプロモーターにおけるラムノース添加のような誘導剤を添加を要しない。したがって、アミノ酸製造を行う生産工程において誘導剤添加に伴う種々の工程または処理を省くことができる。さらに、ｔｒｐプロモーターは、グルコースによって抑制されないので、工業的規模でのアミノ酸製造で形質転換微生物を高密度培養するためにグルコースを用いても、酵素の発現量が抑制されずにすむ。
前記ターミネーターとしては、ｒｒｎＢターミネーター、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーターなどが挙げられる。ｒｒｎＢターミネーターなどは、プラスミドの安定性を良くするという点で好ましい。
また、形質転換体を選別するために、前記プラスミドはアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性などのマーカーを有することが好ましい。
前記（Ａ）〜（Ｃ）のＤＮＡ、及び必要に応じて連結するプロモーター、ターミネーター及びマーカー等の他の配列を、既知のベクター等に連結することにより、形質転換のためのプラスミドを構築することができる。そのようなベクターとしては、具体的な例を挙げると、ｐＨＳＧ系（宝酒造（株）製）、ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック社製）、ｐＳＴＶ系（宝酒造（株）製）、ｐＴＷＶ系（宝酒造（株）製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック社製）、ｐＢＲ３２２系のプラスミド、あるいはその誘導体などが挙げられる。ここで「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。上記プラスミド並びにその誘導体は、複製開始点の種類により、宿主細胞内でのコピー数が異なり、高コピープラスミドとしては、ｐＨＳＧ系、ｐＵＣ系、ｐＰＲＯＫ系のプラスミドが挙げられ、低コピープラスミドとしては、ｐＳＴＶ系、ｐＴＷＶ系、ｐＫＫ２３３系、ｐＢＲ３２２系のプラスミドが挙げられる。
上記のようにして得られた形質転換のためのプラスミドを宿主細胞に導入して形質転換体が得られる。組換えＤＮＡ技術を用いてタンパク質を大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞などを用いることができる。一般には、大腸菌を用いてタンパク質を大量生産する技術について数多くの知見があるため、大腸菌、好ましくはエシェリヒア コリが用いられる。特に、エシェリヒア コリ ＪＭ１０９株、特に（ＤＥ３）株が好ましい。
前記（Ａ）〜（Ｃ）のＤＮＡを３つとも一つのプラスミドに搭載するのは酵素遺伝子の大きさ等の点から実用性が低いため、（Ａ）〜（Ｃ）のＤＮＡのうち１つ又は２つを有するプラスミドを構築し、これらを必要に応じて組み合わせて宿主に導入して、所望の遺伝子を有する形質転換体細胞を得ることが好ましい。複数種のプラスミドを構築した場合、それらは１種の宿主に全て導入して１種の形質転換体を得てその単独培養により所望の酵素をまとめて得てもよく、別々の宿主に導入して複数種の形質転換体を得てそれらを培養することによりそれぞれに由来する所望の酵素を得、それらを組み合わせて用いてもよい。具体的には例えば、（Ａ）〜（Ｃ）のＤＮＡのうちの２つを搭載したプラスミドと、残りの１つを搭載したプラスミドとを構築し、これら２種のプラスミドを１種の宿主に導入して１つの形質転換体を得てこれを培養するか、又はこれら２種のプラスミドを別々の宿主に導入して２つの形質転換体を得てこれらを共培養するか若しくは別々に培養して、所望の酵素を得ることができる。
なお、本発明におけるプラスミド、ＤＮＡ断片、種々の酵素、形質転換体の作製、形質転換体の選抜などを扱う諸操作については、MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Edition, J. Sambrookら編、1989、COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS等に記載された既知の手法に従って行うことができる。
また、ヒダントインラセマーゼ遺伝子、ヒダントイナーゼ遺伝子及びカルバモイラーゼ遺伝子を有する細胞としては、上記のような形質転換体のほかに、ヒダントインラセマーゼ、ヒダントイナーゼ及び／又はカルバモイラーゼを産生する公知の菌株を用いることもできる。
ヒダントイナーゼを産生する公知の菌株としては、具体的には例えば、バチルス属細菌であって耐熱性の酵素を産生するものが知られている。例えば、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)ＡＴＣＣ３１１９５株からＤ−ヒダントイナーゼを得ることができる。ＡＴＣＣ３１１９５株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection、住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America)から入手することができる。また、Ｌ−ヒダントイナーゼは、例えば、バチルス・エスピー(Bacillus sp.)ＡＪ １２２９９株にその存在が知られている（特許文献８：特開昭６３−２４８９４号公報）。バチルス・エスピーＡＪ １２２９９株は、１９８６年７月５日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ８８３７が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブダペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４６が付与された微生物である。
カルバモイラーゼを産生する公知の菌株としては、具体的には例えば、シュードモナス エスピー(Pseudomonas sp.)ＡＪ １１２２０株が知られている（特公昭５６−００３０３４号公報）。再同定の結果、シュードモナス エスピー(Pseudomonas sp.)ＡＪ １１２２０株は、アグロバクテリウム エスピー（Agrobacterium sp.）に属することが判明している。アグロバクテリウム エスピー ＡＪ １１２２０株は１９７７年１２月２０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ４３４７が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４５が付与された微生物である（ブダペスト条約上の原寄託日 １９８１年５月１日）。Ｌ−カルバモイラーゼは、例えば、バチルス・エスピー(Bacillus sp.)ＡＪ １２２９９株にその存在が知られている（特許文献８：特開昭６３−２４８９４号公報）。バチルス・エスピーＡＪ １２２９９株は、１９８６年７月５日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ８８３７が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブダペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４６が付与された微生物である。
上記のような、ヒダントイナーゼ遺伝子及びカルバモイラーゼ遺伝子、並びに必要に応じてヒダントインラセマーゼ遺伝子を有する細胞を培養することにより、ヒダントイナーゼ、カルバモイラーゼ、さらにヒダントインラセマーゼをコードするＤＮＡを導入した場合にはヒダントインラセマーゼが発現生産される。生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。より具体的な培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、宿主菌などの種類に応じて適宜選択する。
培養した細胞を遠心分離操作などにより回収した後、破砕あるいは溶菌させ、酵素を回収し、粗酵素液として使用することができる。破砕には超音波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕などの方法を用いることができ、また溶菌させる場合には卵白リゾチームや、ペプチターゼ処理、または、これらを適宜組み合わせた方法が用いられる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィーなどの手法により、これらの酵素を精製して用いることも可能である。この場合、これらの酵素の抗体を利用した精製法も利用できる。
また、タンパク質を組み換えＤＮＡ技術を用いて大量生産するには、該タンパク質を生産する形質転換体内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体(inclusion body)を形成させることも好ましい形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
このようにして得られるタンパク質封入体は、タンパク質変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特許文献４参照）等多くの例がある。
タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモーターの制御下、目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。
さらに、融合タンパク質として発現させた後に、目的のタンパク質を切り出すため、制限プロテアーゼの認識配列を適当な位置に配しておくことも有効である。
タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤で融合タンパク質として回収されたタンパク質封入体を可溶化する。菌体タンパク質とともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク質封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパク質として再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
再生工程時のタンパク質濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生した酵素タンパク質が自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
以下、実施例に基づき、本発明についてさらに詳細に説明する。なお、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
（実施例１）ＡＪ３９１２株由来ヒダントインラセマーゼ遺伝子、ＡＪ１１１９９株由来Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子共発現Ｅ．ｃｏｌｉの作製とＮ−カルバモイル−Ｄ−チロシンの生産
１−１．ヒダントインラセマーゼ遺伝子搭載プラスミドの構築
エシェリヒア コリ(Esherichia coli)Ｗ３１１０株染色体ＤＮＡ上のｔｒｐオペロンのプロモーター領域を表１に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（表１の(1)と(2)の組み合わせ）により目的遺伝子領域を増幅し、得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ製）にライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中からｔｒｐプロモーターがｌａｃＺ遺伝子と反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。
エシェリヒア コリ(Esherichia coli)Ｗ３１１０株染色体ＤＮＡ上のｔｒｐオペロンのプロモーター領域を表１に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（表１の(1)と(2)の組み合わせ）により目的遺伝子領域を増幅し、得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ製）にライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中からｔｒｐプロモーターがｌａｃＺ遺伝子と反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。
次にこのプラスミドをＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩにて処理して得られるｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡ断片と、ｐＵＣ１９（Ｔａｋａｒａ製）のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＥｃｏＲＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ１と命名した。
次にｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）をＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩにて処理し、得られたｒｒｎＢターミネーターを含むＤＮＡ断片とｐＴｒｐ１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｖｕＩＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ２と命名した。
次にｐＴｒｐ２を鋳型として表１に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（表１の(1)と(3)の組み合わせ）によりｔｒｐプロモーター領域を増幅した。このＤＮＡ断片をＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＮｄｅＩにより処理し、ｐＴｒｐ２のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＮｄｅＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐ４と命名した。
ｐＳＴＶ２８（Ｔａｋａｒａ製）のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＰｖｕＩ処理して得られる２．４ｋｂのＤＮＡ断片、ｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）をＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｖｕＩにて処理して得られる０．９ｋｂのＤＮＡ断片、及びｐＴｒｐ４のＥｃｏＯ１０９Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理によって得られる０．３ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、クロラムフェニコール耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、そのプラスミドをｐＴｒｐ８と命名した。
マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２株の染色体ＤＮＡを鋳型として表２に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。この断片をＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐ４のＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、そのプラスミドをｐＴｒｐ４Ｒと命名した（図１）。なお、図中においては、ｔｒｐプロモーターを「Ｐｔｒｐ」、ｒｒｎＢターミネーターを「ＴｒｒｎＢ」、アンピシリン耐性遺伝子を「ＡＭＰr」、ヒダントインラセマーゼ遺伝子を「ＨＲａｓｅ ｇｅｎｅ」と表示している。
１−２．ヒダントインラセマーゼ及びＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子搭載プラスミドの構築
フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ１１１９９株の染色体ＤＮＡを鋳型として、表３に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的とするＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子を増幅した。これらの断片をＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片をＨ−ＮＥと命名した。
フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ１１１９９株の染色体ＤＮＡを鋳型として、表３に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的とするＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子を増幅した。これらの断片をＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片をＨ−ＮＥと命名した。
上記工程１−１で得たＡＪ３９１２株由来ヒダントインラセマーゼ遺伝子搭載プラスミドｐＴｒｐ４Ｒを鋳型として、表４に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的とするＳＤ配列を含むヒダントインラセマーゼ遺伝子を増幅した。得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ製）にライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中からｌａｃＺ遺伝子と反対向きに挿入されたプラスミドを有する株を選択した。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩにて処理し、得られたヒダントインラセマーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＲ−ＥＢとした。
ｐＴｒｐ８のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ処理物とＨ−ＮＥ及びＲ−ＥＢをライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、クロラムフェニコール耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、そのプラスミドをｐＴｒｐ８ＨＲと命名した（図２）。
１−３．Ｎ−カルバモイル−Ｄ−チロシンの生産
ｐＴｒｐ８ＨＲを有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ培地（５０ｍｌ）で３０℃、１６時間培養した。得られた培養液１ｍｌを５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む３００ｍｌの培地Ｉ（グルコース２．５％、硫酸アンモニウム０．５％、燐酸２水素１カリウム０．１４％、クエン酸３ナトリウム２水和物０．２３％、硫酸鉄（ＩＩ）７水和物０．００２％、硫酸マグネシウム７水和物０．１％、硫酸マンガン５水和物０．００２％、チアミン塩酸塩０．０００１％（ｐＨ７．０））に移し、Ｊａｒ培養装置にてｐＨ７．０、溶存酸素濃度１．５ｐｐｍ以上に制御しながら３３℃にて２４時間培養した。得られた培養液１５ｍｌを５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む培地ＩＩ（グルコース２．５％、硫酸アンモニウム０．５％、燐酸０．３％、クエン酸３ナトリウム２水和物０．２３％、硫酸マグネシウム７水和物０．１％、硫酸鉄（ＩＩ）７水和物０．００２％、硫酸マンガン５水和物０．００２％、チアミン塩酸塩０．０００１％（ｐＨ７．０））に移し、Ｊａｒ培養装置にてｐＨ７．０、溶存酸素濃度１．５ｐｐｍ以上に制御し、培養９時間以降グルコース５０％水溶液を３．５ｍｌ／ｈｒにて添加を行いながら、３５℃にて２４時間培養した。得られた培養液２２５ｍｌ（乾燥菌体重量約９ｇ）を４．２７５Ｌの基質溶液（２．６ｇ／ｄｌ ＤＬ−５−（４−ハイドロキシベンジル）ヒダントイン、１．０５ｍＭ 硫酸マグネシウム、２１ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５））に添加し、反応液のｐＨ９．０に保ちながら（８Ｎ ＮａＯＨにて調整）、３７℃にて、窒素雰囲気下で反応液中に窒素ガスを流入させながら反応を行った。反応中、反応液の酸化還元電位を、酸化還元電位計（商品名F-935-B120-DH、Broadly James社製）を用いてモニタしたところ、図３−２に示される通りに推移した。反応中を通して、水溶液中の溶存酸素量を測定した溶存酸素計の指示値は0.3ppm以下を示した。また、反応開始後数回にわたり反応液中に生成したＮ−カルバモイル−Ｄ−チロシン量を測定し変換収率（モル％）を求めたところ、図３−１に示される通りに推移し、反応３０時間後、２．９ｇ／ｄｌのＮ−カルバモイル−Ｄ−チロシン（モル収率９７％）が得られた。
ｐＴｒｐ８ＨＲを有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ培地（５０ｍｌ）で３０℃、１６時間培養した。得られた培養液１ｍｌを５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む３００ｍｌの培地Ｉ（グルコース２．５％、硫酸アンモニウム０．５％、燐酸２水素１カリウム０．１４％、クエン酸３ナトリウム２水和物０．２３％、硫酸鉄（ＩＩ）７水和物０．００２％、硫酸マグネシウム７水和物０．１％、硫酸マンガン５水和物０．００２％、チアミン塩酸塩０．０００１％（ｐＨ７．０））に移し、Ｊａｒ培養装置にてｐＨ７．０、溶存酸素濃度１．５ｐｐｍ以上に制御しながら３３℃にて２４時間培養した。得られた培養液１５ｍｌを５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む培地ＩＩ（グルコース２．５％、硫酸アンモニウム０．５％、燐酸０．３％、クエン酸３ナトリウム２水和物０．２３％、硫酸マグネシウム７水和物０．１％、硫酸鉄（ＩＩ）７水和物０．００２％、硫酸マンガン５水和物０．００２％、チアミン塩酸塩０．０００１％（ｐＨ７．０））に移し、Ｊａｒ培養装置にてｐＨ７．０、溶存酸素濃度１．５ｐｐｍ以上に制御し、培養９時間以降グルコース５０％水溶液を３．５ｍｌ／ｈｒにて添加を行いながら、３５℃にて２４時間培養した。得られた培養液２２５ｍｌ（乾燥菌体重量約９ｇ）を４．２７５Ｌの基質溶液（２．６ｇ／ｄｌ ＤＬ−５−（４−ハイドロキシベンジル）ヒダントイン、１．０５ｍＭ 硫酸マグネシウム、２１ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５））に添加し、反応液のｐＨ９．０に保ちながら（８Ｎ ＮａＯＨにて調整）、３７℃にて、窒素雰囲気下で反応液中に窒素ガスを流入させながら反応を行った。反応中、反応液の酸化還元電位を、酸化還元電位計（商品名F-935-B120-DH、Broadly James社製）を用いてモニタしたところ、図３−２に示される通りに推移した。反応中を通して、水溶液中の溶存酸素量を測定した溶存酸素計の指示値は0.3ppm以下を示した。また、反応開始後数回にわたり反応液中に生成したＮ−カルバモイル−Ｄ−チロシン量を測定し変換収率（モル％）を求めたところ、図３−１に示される通りに推移し、反応３０時間後、２．９ｇ／ｄｌのＮ−カルバモイル−Ｄ−チロシン（モル収率９７％）が得られた。
（実施例２）ＡＪ３９１２株由来ヒダントインラセマーゼ遺伝子、ＡＪ１１１９９株由来Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子及びＤ−カルバモイラーゼ遺伝子共発現E.coliの作製とＤ−チロシンの生産
２−１．Ｄ−ヒダントイナーゼ及びＤ−カルバモイラーゼ遺伝子搭載プラスミドの構築
ｐＨＳＧ２９８（Ｔａｋａｒａ製）をＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｔｒｐプロモーターカセット（図４）をライゲーションし、このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、目的のプラスミドをｐＴｒｐ２９８ＥＫと命名した。なお、配列表配列番号１０には、図４に示されるｔｒｐプロモーターカセットの上側の鎖の配列を記載した。
ｐＨＳＧ２９８（Ｔａｋａｒａ製）をＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｔｒｐプロモーターカセット（図４）をライゲーションし、このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、目的のプラスミドをｐＴｒｐ２９８ＥＫと命名した。なお、配列表配列番号１０には、図４に示されるｔｒｐプロモーターカセットの上側の鎖の配列を記載した。
フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ１１１９９株の染色体ＤＮＡを鋳型として、表５に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的とするＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子を増幅した。この断片をＫｐｎＩ／ＸｂａＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐ２９８ＥＫのＫｐｎＩ／ＸｂａＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、そのプラスミドをｐＴｒｐ２９８ＤＨＨａｓｅ３と命名した。
フラボバクテリウム エスピー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＡＪ１１１９９株の染色体ＤＮＡを鋳型として、表６に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的とするＤ−カルバミラーゼ遺伝子を増幅した。この断片をＫｐｎＩ／ＸｂａＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐ２９８ＥＫのＫｐｎＩ／ＸｂａＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、そのプラスミドをｐＴｒｐ２９８ＤＣＨａｓｅ１と命名した。
次にｐＴｒｐ２９８ＤＣＨａｓｅ１をＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩにて処理し、ｔｒｐプロモーターとＤ−カルバミラーゼ遺伝子が連結したＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片をｐＨＳＧ２９９（Ｔａｋａｒａ社製）のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、そのプラスミドをｐＴｒｐ２９９ＤＣＨａｓｅ１と命名した。
ｐＴｒｐ２９８ＤＨＨａｓｅ３を鋳型として、表７に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＸｂａＩ／ＰｓｔＩ処理後、ｐＴｒｐ２９９ＤＣＨａｓｅ１のＸｂａＩ／ＰｓｔＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、そのプラスミドをｐＴｒｐＨｒＣｒと命名した（図５）。なお、図中においては、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子を「ＤＨＨａｓｅ」若しくは「ＤＨＨａｓｅ ｇｅｎｅ」、Ｄ−カルバミラーゼ遺伝子を「ＤＣＨａｓｅ」若しくは「ＤＣＨａｓｅ ｇｅｎｅ」、カナマイシン耐性遺伝子を「Ｋｍ」と表示している。
ｐＴｒｐＨｒＣｒを鋳型として表８に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を増幅した。この断片をＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩにて処理し、得られたＤＮＡ断片とｐＴｒｐ８のＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ処理物をライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、クロラムフェニコール耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、そのプラスミドをｐＴｒｐ８ＣＨと命名した（図６）。なお、図中においては、クロラムフェニコール耐性遺伝子を「Ｃｍr」と表示している。
２−２．Ｄ−チロシンの生産
実施例１の工程１−１で調製したｐＴｒｐ４Ｒ、及び上記工程で調製したｐＴｒｐ８ＣＨの２プラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９をＬＢ培地（５０ｍｌ）で３０℃、１６時間培養した。得られた培養液１ｍｌを３００ｍｌの培地Ｉ（グルコース２．５％、硫酸アンモニウム０．５％、燐酸２水素１カリウム０．１４％、クエン酸３ナトリウム２水和物０．２３％、硫酸鉄（ＩＩ）７水和物０．００２％、硫酸マグネシウム７水和物０．１％、硫酸マンガン５水和物０．００２％、チアミン塩酸塩０．０００１％（ｐＨ７．０））に移し、Ｊａｒ培養装置にてｐＨ７．０、溶存酸素濃度１．５ｐｐｍ以上に制御しながら３３℃にて２４時間培養した。得られた培養液１５ｍｌを３００ｍｌの培地ＩＩ（グルコース２．５％、硫酸アンモニウム０．５％、燐酸０．３％、クエン酸３ナトリウム２水和物０．２３％、硫酸マグネシウム７水和物０．１％、硫酸鉄（ＩＩ）７水和物０．００２％、硫酸マンガン５水和物０．００２％、チアミン塩酸塩０．０００１％（ｐＨ７．０））に移し、Ｊａｒ培養装置にてｐＨ７．０、溶存酸素濃度１．５ｐｐｍ以上に制御し、培養９時間以降グルコース５０％水溶液を３．５ｍｌ／ｈｒにて添加を行いながら、３５℃にて２４時間培養した。
実施例１の工程１−１で調製したｐＴｒｐ４Ｒ、及び上記工程で調製したｐＴｒｐ８ＣＨの２プラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９をＬＢ培地（５０ｍｌ）で３０℃、１６時間培養した。得られた培養液１ｍｌを３００ｍｌの培地Ｉ（グルコース２．５％、硫酸アンモニウム０．５％、燐酸２水素１カリウム０．１４％、クエン酸３ナトリウム２水和物０．２３％、硫酸鉄（ＩＩ）７水和物０．００２％、硫酸マグネシウム７水和物０．１％、硫酸マンガン５水和物０．００２％、チアミン塩酸塩０．０００１％（ｐＨ７．０））に移し、Ｊａｒ培養装置にてｐＨ７．０、溶存酸素濃度１．５ｐｐｍ以上に制御しながら３３℃にて２４時間培養した。得られた培養液１５ｍｌを３００ｍｌの培地ＩＩ（グルコース２．５％、硫酸アンモニウム０．５％、燐酸０．３％、クエン酸３ナトリウム２水和物０．２３％、硫酸マグネシウム７水和物０．１％、硫酸鉄（ＩＩ）７水和物０．００２％、硫酸マンガン５水和物０．００２％、チアミン塩酸塩０．０００１％（ｐＨ７．０））に移し、Ｊａｒ培養装置にてｐＨ７．０、溶存酸素濃度１．５ｐｐｍ以上に制御し、培養９時間以降グルコース５０％水溶液を３．５ｍｌ／ｈｒにて添加を行いながら、３５℃にて２４時間培養した。
得られた培養液１５ｍｌ（乾燥菌体重量約６００ｍｇ）を２８５ｍｌの基質溶液（３．１ｇ／ｄｌ ＤＬ−５−（４−ハイドロキシベンジル）ヒダントイン、１．０５ｍＭ 硫酸マンガン、２１ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．５））に添加し、反応液のｐＨを７．５に保ちながら（１Ｎ ＮａＯＨと２Ｎ Ｈ2ＳＯ4にて調整）、３７℃にて、窒素雰囲気下で反応液中に窒素ガスを流入させながら反応を行った。反応中、反応液の酸化還元電位（ＯＲＰ）を、酸化還元電位計（商品名F-935-B120-DH、Broadly James社製）を用いてモニタしたところ、図７−２の「窒素ガス置換あり」の曲線で示される通りに推移した。反応中を通して、水溶液中の溶存酸素量を測定した溶存酸素計の指示値は0.3ppm以下を示した。また、反応開始後数回にわたり反応液中に生成したＤ−チロシン量を測定し変換収率（モル％）を求めたところ、図７−１の「窒素ガス置換あり」の曲線で示される通りに推移し、反応２４時間後、３．０ｇ／ｄｌのＤ−チロシン（モル収率９９％）が得られた。
（比較例１）
培養液と基質溶液との反応を、窒素ガスを流入させずに反応液を空気中に置いて行った他は実施例１と同様に操作し、Ｄ−チロシンを製造した。反応液の酸化還元電位は、図７−２の「窒素ガス置換なし」の曲線で示された通りに推移した。また、Ｄ−チロシンの変換収率は図７−１の「窒素ガス置換なし」の曲線で示される通りに推移し、反応２４時間後、０．６ｇ／ｄｌのＤ−Ｔｙｒ（モル収率２２％）が得られた。
培養液と基質溶液との反応を、窒素ガスを流入させずに反応液を空気中に置いて行った他は実施例１と同様に操作し、Ｄ−チロシンを製造した。反応液の酸化還元電位は、図７−２の「窒素ガス置換なし」の曲線で示された通りに推移した。また、Ｄ−チロシンの変換収率は図７−１の「窒素ガス置換なし」の曲線で示される通りに推移し、反応２４時間後、０．６ｇ／ｄｌのＤ−Ｔｙｒ（モル収率２２％）が得られた。
以上のように、本発明にかかる光学活性アミノ酸の製造方法は、光学活性アミノ酸の効率的な生産に有用であり、特にＤ−体又はＬ−体のチロシン、トリプトファン、O-ベンジルセリン等の光学活性アミノ酸の工業的な生産に適している。
配列番号１：Ｄ−ヒダントイナーゼ(DHHase)遺伝子
配列番号２：Ｄ−ヒダントイナーゼ
配列番号３：Ｄ−カルバモイラーゼ(DCHase)遺伝子
配列番号４：Ｄ−カルバモイラーゼ
配列番号５：ヒダントインラセマーゼ(HRase)遺伝子
配列番号６：ヒダントインラセマーゼ
配列番号７：プライマー７
配列番号８：プライマー８
配列番号９：プライマー９
配列番号１０：プライマー１０
配列番号１１：プライマー１１
配列番号１２：プライマー１２
配列番号１３：プライマー１３
配列番号１４：プライマー１４
配列番号１５：プライマー１５
配列番号１６：プライマー１６
配列番号１７：プライマー１７
配列番号１８：プライマー１８
配列番号１９：プライマー１９
配列番号２０：プライマー２０
配列番号２１：プライマー２１
配列番号２２：プライマー２２
配列番号２３：プライマー２３
配列番号２４：プライマー２４
配列番号２：Ｄ−ヒダントイナーゼ
配列番号３：Ｄ−カルバモイラーゼ(DCHase)遺伝子
配列番号４：Ｄ−カルバモイラーゼ
配列番号５：ヒダントインラセマーゼ(HRase)遺伝子
配列番号６：ヒダントインラセマーゼ
配列番号７：プライマー７
配列番号８：プライマー８
配列番号９：プライマー９
配列番号１０：プライマー１０
配列番号１１：プライマー１１
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配列番号１４：プライマー１４
配列番号１５：プライマー１５
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配列番号１７：プライマー１７
配列番号１８：プライマー１８
配列番号１９：プライマー１９
配列番号２０：プライマー２０
配列番号２１：プライマー２１
配列番号２２：プライマー２２
配列番号２３：プライマー２３
配列番号２４：プライマー２４
Claims (8)
- ５−置換ヒダントインを基質として、ヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼを含む酵素による反応により光学活性アミノ酸を生成する工程を含む光学活性アミノ酸の製造方法において、前記工程を溶存酸素濃度1.5ppm以下の水溶液中で行うことを特徴とする製造方法。
- 前記酵素がさらにヒダントインラセマーゼを含む、請求項１に記載の製造方法。
- 前記ヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼが、ヒダントイナーゼ遺伝子及びカルバモイラーゼ遺伝子を有する細胞により産生されたものである、請求項１又は２に記載の製造方法。
- 前記ヒダントインラセマーゼが、ヒダントインラセマーゼ遺伝子を有する細胞により産生されたものである、請求項２又は３に記載の製造方法。
- 前記水溶液を不活性ガス置換環境下に置いた状態で前記工程を行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
- 前記細胞が、エシェリヒア コリ(Esherichia coli)である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
- 前記光学活性アミノ酸がチロシンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
- 前記チロシンがＤ−チロシンである、請求項７に記載の製造方法。
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