JP4877227B2 - L−セリン誘導体の製造方法およびこれに用いる酵素 - Google Patents
L−セリン誘導体の製造方法およびこれに用いる酵素 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4877227B2 JP4877227B2 JP2007516340A JP2007516340A JP4877227B2 JP 4877227 B2 JP4877227 B2 JP 4877227B2 JP 2007516340 A JP2007516340 A JP 2007516340A JP 2007516340 A JP2007516340 A JP 2007516340A JP 4877227 B2 JP4877227 B2 JP 4877227B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- formula
- amino acid
- protein
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1014—Hydroxymethyl-, formyl-transferases (2.1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
- C12Y201/02—Hydroxymethyl-, formyl- and related transferases (2.1.2)
- C12Y201/02001—Glycine hydroxymethyltransferase (2.1.2.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
1)光学活性セリン誘導体とピバルアルデヒドより得られる光学活性オキサゾリジン化合物への不斉アルキル化による方法(非特許文献1)
2)光学活性金属触媒を用いるα−イソシアノカルボン酸エステルとパラホルムアルデヒドの不斉アルドール反応による方法(非特許文献2)
3)光学活性オキサゾリジンクロムカルベン錯体とオキサジン化合物から得られる光学活性β−ラクタム化合物への不斉アルキル化による方法(非特許文献3)
4)光学活性アジリジン化合物の不斉開環反応(非特許文献4)
5)光学活性バリン誘導体と光学活性アラニン誘導体から得られる光学活性ピラジノン化合物への不斉アルキル化による方法(非特許文献5)
6)2−メチル−2−プロペン酸誘導体にシャープレス不斉ジヒドロキシル化を行い、得られる光学活性ジオール化合物を光学活性アジド化合物に導き還元する方法(非特許文献6)
に示されるL−α−アミノ酸と、下記式(II):
に示されるアルデヒドとを反応させる、式(III):
に示されるL−セリン誘導体の製造方法。
〔2〕前記酵素が、ラルストニア(Ralstonia)属、バリオボラックス(Variovorax)属、ボセア(Bosea)属およびシリシバクター(Silicibacter)属からなる群より選ばれるいずれかの属に属する微生物に由来する、上記〔1〕に記載のL−セリン誘導体の製造方法。
〔3〕前記酵素が、下記(A)〜(L)からなる群より選ばれる1種または2種以上のタンパク質である、上記〔1〕に記載のL−セリン誘導体の製造方法。
(A)配列番号5に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号5に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(C)配列番号9に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(D)配列番号9に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(E)配列番号15に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(F)配列番号15に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(G)配列番号19に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(H)配列番号19に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(I)配列番号23に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(J)配列番号23に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(K)配列番号30に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(L)配列番号30に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
〔4〕式(I)で示されるアミノ酸が、L−α−アラニンであり、式(III)で示されるL−セリン誘導体がα−メチル−L−セリンである、上記〔1〕から〔3〕のいずれか一項に記載のL−セリン誘導体の製造方法。
〔5〕式(I)で示されるアミノ酸が、L−2−アミノ−n−酪酸*1であり、式(III)で示されるL−セリン誘導体がα−エチル−L−セリンである、上記〔1〕から〔3〕のいずれか一項に記載のL−セリン誘導体の製造方法。
〔6〕式(I)で示されるアミノ酸が、L−α−アラニンであり、式(III)で示されるL−セリン誘導体がα−メチル−L−スレオニンである、上記〔1〕から〔3〕のいずれか一項に記載のL−セリン誘導体の製造方法。
〔7〕ラルストニア(Ralstonia)属、バリオボラックス(Variovorax)属、ボセア(Bosea)属およびシリシバクター(Silicibacter)属からなる群より選ばれるいずれかの属に属する微生物に由来し、式(I):
に示されるL−α−アミノ酸と、下記式(II):
に示されるアルデヒドとから、下記式(III):
に示されるL−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
〔8〕式(I):
に示されるL−α−アミノ酸と、下記式(II):
に示されるアルデヒドとから、下記式(III):
に示されるL−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有する、下記(A)〜(L)のいずれかのタンパク質。
(A)配列番号5に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号5に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(C)配列番号9に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(D)配列番号9に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(E)配列番号15に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(F)配列番号15に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(G)配列番号19に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(H)配列番号19に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(I)配列番号23に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(J)配列番号23に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(K)配列番号30に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(L)配列番号30に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
〔9〕上記〔8〕に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔10〕下記(a)から(l)よりなる群から選ばれるポリヌクレオチド
(a)配列番号4に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(b)配列番号4に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式(I)のL−α−アミノ酸と式(II)のアルデヒドと反応させて、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号8に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(d)配列番号8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式(I)のL−α−アミノ酸と式(II)のアルデヒドと反応させて、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(e)配列番号14に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(f)配列番号14に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式(I)のL−α−アミノ酸と式(II)のアルデヒドと反応させて、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(g)配列番号18に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(h)配列番号18に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式(I)のL−α−アミノ酸と式(II)のアルデヒドと反応させて、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(i)配列番号22に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(j)配列番号22に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式(I)のL−α−アミノ酸と式(II)のアルデヒドと反応させて、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(k)配列番号29に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(l)配列番号29に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式(I)のL−α−アミノ酸と式(II)のアルデヒドと反応させて、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
〔11〕上記〔9〕または〔10〕に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド。
〔12〕上記〔11〕に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
また、本発明は、光学活性を有するL−セリン誘導体を生成する場合、L−型のアミノ酸を選択的に生成することができるため、L−アミノ酸の製法として効率がよい。
なお、以下に挙げる種々の遺伝子工学的な技法については、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Press(2001/01/15)、細胞工学ハンドブック、黒木登志夫ら編、羊土社(1992)、新遺伝子工学ハンドブック改訂第3版、村松ら編、羊土社(1999)など、多くの標準的な実験マニュアルがあり、これらの文献を参考にすることにより当業者であれば実施可能である。本明細書においては、特に断らない限り、配列番号は配列表中の配列番号を示す。また、本明細書において、酵素とは化学反応を触媒する活性を有するタンパク質のことをいう。
R1が炭素数1〜6のアルキル基である場合とは、具体例を示すと、メチル基、エチル基、nプロピル基、イソプロピル基、nブチル基、イソブチル基、secブチル基、tertブチル基、nペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、nヘキシル基、イソヘキシル基などが例示される。
R1が炭素骨格中にヘテロ原子を含む基である一形態には、複素環含有炭化水素基が含まれる。複素環含有炭化水素基とは、環式化合物の環にヘテロ原子を含む環系炭化水素基である。複素環含有炭化水素基としてはヘテロアリール基などが含まれ、芳香族性の有無には限定されず、また単環式であっても多環式であってもよい。複素環含有炭化水素基として具体的には、フリル基、チエニル基、ピリジル基、ピペリジル基、ピペリジノ基、モルホリノ基、インドリル基、イミダゾリル基、さらには、これらの複素環基により置換されたアルキル基等が例示される。
さらに、上記R1は、直鎖状であっても分岐を有していてもよい。また、R1は、上記の炭化水素基の一部に、ハロゲン原子、炭素数3までのアルキル基、炭素数3までのアルコキシル基、ケト基(=O)、水酸基(−OH)、チオール基(−SH)、アミノ基(−NH2)、アミド基(−CONH2)、イミノ基(=NH)、ヒドラジノ基(−NHNH2)等から選ばれる1種または2種以上が置換・付加されたものであってもよい。
R2が炭素数1〜6のアルキル基である場合とは、具体例を示すと、メチル基、エチル基、nプロピル基、イソプロピル基、nブチル基、イソブチル基、secブチル基、tertブチル基、nペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、nヘキシル基、イソヘキシル基などが挙げられる。
R2が炭素骨格中にヘテロ原子を含む基である一形態には、複素環含有炭素水素基が含まれる。複素環含有炭化水素基とは、環式化合物の環にヘテロ原子を含む環系炭化水素基である。複素環含有炭化水素基としてはヘテロアリール基などが含まれ、芳香族性の有無には限定されず、また単環式であっても多環式であってもよい。複素環含有炭化水素基として具体的には、フリル基、チエニル基、ピリジル基、ピペリジル基、ピペリジノ基、モルホリノ基、インドリル基、イミダゾリル基、さらには、これらの複素環基により置換されたアルキル基等が含まれる。
さらに、上記R2は、直鎖状であっても分岐を有していてもよい。また、R2は、上記の炭化水素基の一部に、ハロゲン原子、炭素数3までのアルキル基、炭素数3までのアルコキシル基、ケト基(=O)、水酸基(−OH)、チオール基(−SH)、アミノ基(−NH2)、アミド基(−CONH2)、イミノ基(=NH)、ヒドラジノ基(−NHNH2)等から選ばれる1種または2種以上が置換・付加されたものであってもよい。
酵素反応液のpHを下げ、加熱殺菌と共に、溶存タンパクの凝集を行った後、遠心分離、ろ過、UF(ウルトラフィルトレーション:限外ろ過)等の手段により、除菌・除タンパクを行う。この液中には、無機塩類が含まれるため、晶析時に、これらの析出を回避する為、脱塩を行う。方法は、NF(ナノフィルトレーション:ナノろ過)、電気透析、イオン交換樹脂等何れの方法を用いても構わない。
寄託番号:FERM ABP−10607
寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
寄託機関住所:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6
寄託された日:2005年3月8日
寄託番号:FERM ABP−10608
寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
寄託機関住所:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6
寄託された日:2005年3月8日
寄託番号:NBRC15149
寄託機関:独立行政法人製品評価技術基盤機構(NITE)バイオテクノロジー本部(DOB)生物遺伝資源部門(NBRC)
寄託機関住所:日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8
寄託番号:NBRC15150
寄託機関:独立行政法人製品評価技術基盤機構(NITE)バイオテクノロジー本部(DOB)生物遺伝資源部門(NBRC)
寄託機関住所:日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8
寄託番号:FERM ABP−10609
寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
寄託機関住所:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6
寄託された日:2005年3月8日
1)BARROW,(G.I.)and FELTHAM,(R.K.A):Cowan and Steel’s Manual for the Identificaation of Medical Bacteria. 3rd edition.1993,Cambridge University Press.
2)坂崎利一・吉崎悦郎・三木寛二:新細菌培地学講座・下〈第二版〉.1988,近大出版,東京.
3)細菌同定キットAPI20,NE,
(bioMerieux,France:http://www.biomerieux.fr/home_en.htm).
(A)配列番号5に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号5に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(C)配列番号9に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(D)配列番号9に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(E)配列番号15に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(F)配列番号15に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(G)配列番号19に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(H)配列番号19に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(I)配列番号23に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(J)配列番号23に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(K)配列番号30に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(L)配列番号30に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(a)配列番号4に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(c)配列番号8に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(e)配列番号14に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(g)配列番号18に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(i)配列番号22に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(k)配列番号29に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(d)配列番号8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式(I)のL−α−アミノ酸と式(II)のアルデヒドと反応させて、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(f)配列番号14に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式(I)のL−α−アミノ酸と式(II)のアルデヒドと反応させて、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(h)配列番号18に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式(I)のL−α−アミノ酸と式(II)のアルデヒドと反応させて、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(j)配列番号22に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式(I)のL−α−アミノ酸と式(II)のアルデヒドと反応させて、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(l)配列番号29に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式(I)のL−α−アミノ酸と式(II)のアルデヒドと反応させて、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
Nutrient Broth寒天培地(Difco社)で、表4に示した微生物をそれぞれ30℃、24時間培養した。得られた各微生物の菌体を3mlのNutrient Broth液体培地に1白金耳接種し、30℃、120往復/分で24時間培養した。得られた培養液0.15mlを0.2%α−メチル−DL−セリンを含む3mlのNutrient Broth液体培地に接種し、30℃、120往復/分で24時間培養した。
(1)無細胞抽出液の調製
Nutrient Broth寒天培地(Difco社)で30℃、25.5時間培養したラルストニア・スピーシーズの菌体を500ml容の坂口フラスコ内の50mlのNutrient Broth液体培地に接種し、30℃、120往復/分で21時間培養した。得られた培養液を0.2% α−メチル−DL−セリン、0.17% Yeast Nitrogen Base w/o amino acid and ammonium sulfate(pH7.0)液体培地2Lに接種し、500ml容の坂口フラスコに100mlずつ分注し、30℃、120往復/分で24時間培養した。得られた菌体を遠心分離(8,000g、10分)により集菌し、0.02mMピリドキサールリン酸を含む25mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)で2回洗浄し、50mlの菌体懸濁液を調製した。超音波破砕処理により菌体を破砕し、遠心分離(18,000g、10分)で得られる上清を超遠心分離(200,000g、30分)を行い、同緩衝液を用いて透析し、無細胞抽出液を得た。
上記(1)にて得られた無細胞抽出液を予め0.02mMピリドキサールリン酸を含む25mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)で平衡化したResourceQカラム(アマシャムバイオサイエンス製)にアプライし、0−1M塩化ナトリウムの直線的濃度勾配により酵素を溶出した。なお、この操作は無細胞抽出液を1/3づつ3回に分けて行った。
上記(2)で得られた酵素の活性画分を0.02mMピリドキサールリン酸を含む25mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.4)(以下、緩衝液Iとする)に透析し、等量の2M硫酸アンモニウムを含む緩衝液Iと混和し、予め1M硫酸アンモニウムを含む緩衝液Iと平衡化したPhenyl−Sepharoseカラム(アマシャムバイオサイエンス社製)にアプライし1−0M硫酸アンモニウムの直線的濃度勾配により、酵素を溶出した。
上記(3)で得られた酵素の活性画分を0.02mMピリドキサールリン酸を含む2.5mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に透析し、予め同緩衝液で平衡化されたCellulofineHApカラム(生化学工業製)にアプライした。2.5−500mMのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)にて酵素を溶出させた。
このようにして得られた酵素の活性画分は、比活性0.72U/mgであり、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、クーマシーブリリアントブルー染色液でゲルを染色させたところ、分子量約47,000の位置に均一なバンドが検出された。
実施例2で調製した精製酵素100pmol相当をSDS−ポリアクリルアミド電気泳動後、PVDF膜に転写し、プロテインシーケンサーに供し、30アミノ酸を決定した(配列番号1)。
pSKA04098を鋳型として、プライマーRal_Eco(配列番号6)、およびプライマーRal_ter_Pst(配列番号7)をもちいてPCRにより2−メチルセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子のORF領域1.3kbを増幅し、EcoRI/PstI処理した後、予めEcoRI/PstI処理したpUC18とライゲートし、Escherichia coli JM109を形質転換し、目的の遺伝子断片を含むプラスミド(pRal2)を有する形質転換体を得た。この形質転換体をJM109/pRal2と命名した。
100mMホルムアルデヒド、100mML−アラニン、0.1mMピリドキサールリン酸、100mMリン酸緩衝液(pH7.4)からなる溶液に実施例2で調製した精製酵素溶液を50μl添加し、30℃で20時間反応した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液[コード番号:16223−55]を用いた。反応終了後、反応混合物50μlに1mM硫酸銅水溶液を100μl、水50μl加え、SumichiralOA−6100(住化分析センター)によりHPLC分析を行った(移動相:0.5mM硫酸銅水溶液、カラム温度:30℃、流速:1ml/分、検出:UV215nm)。その結果27.5mMのα−メチル−L−セリンの生成が確認され、α−メチル−D−セリンは検出限界以下であった。なお、標準品としては、Acros Organics社製のα−メチル−L−セリン[コード番号:29001−2500]α−メチル−D−セリン[コード番号:29002−2500]を用いた。
JM109/pRal2を100mg/lのアンピシリンを含むLB培地で30℃、24時間前培養した後、アンピシリン100mg/l及びIPTG0.5mMを含むLB培地400mlで34℃、16時間前培養した。培養液400mlから得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、0.1mMピリドキサールリン酸を含む100mM 燐酸緩衝液(pH7.4)を用いて洗菌した。得られた菌体を100mlの反応液(300mML−アラニン、0.1mMピリドキサールリン酸、100mMリン酸緩衝液(pH7.4))に懸濁した。この反応液に30℃にて600mMホルムアルデヒド水溶液50.5mlを撹拌しながら24時間かけて添加した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液[コード番号:16223−55]を用いた。添加終了後、反応混合物50μlに1mM硫酸銅水溶液を50μl、水100μl加え、SumichiralOA−6100(住化分析センター)によりHPLC分析を行った(移動相:0.5mM硫酸銅水溶液、カラム温度:30℃、流速:1ml/分、検出:UV215nm)。その結果27.0mmolのα−メチル−L−セリンの生成が確認され、α−メチル−D−セリンは検出限界以下であった。
Ralstonia sp.AJ110405株由来ORF領域を実施例3と同様の方法により、PCRにより増幅した。このPCR産物をプローブとして、Variovorax paradoxus B2−B2株のゲノムDNAをPstIによって処理した後、サザン解析を行ったところ、約2kb長にポジティブシグナルが得られた。
Ralstonia sp.AJ110405株由来ORF領域を実施例3と同様の方法により、PCRにより増幅した。このPCR産物をプローブとして、Variovorax paradoxus NBRC15149のゲノムDNAをPstIによって処理した後、サザン解析を行ったところ、2kb長にポジティブシグナルが得られた。
Ralstonia sp.AJ110405株由来ORF領域を実施例3と同様の方法により、PCRにより増幅した。このPCR産物をプローブとして、Variovorax paradoxus NBRC15150のゲノムDNAをPstIによって処理した後、サザン解析を行ったところ、2kb長にポジティブシグナルが得られた。
Ralstonia sp.AJ110405株由来ORF領域を実施例3と同様の方法により、PCRにより増幅した。このPCR産物をプローブとして、Bosea sp. B2−R1株 ゲノムDNAをPstIによって処理した後、サザン解析を行ったところ、5kb長にポジティブシグナルが得られた。
なお、JM109/pUC18より上記の方法で得られる無細胞抽出液を用いた場合の活性は検出限界以下であった。
Silicibacter pomeroyi DSM15171株のゲノムDNAを鋳型としてプライマーSilici ATG EcoRI(配列番号27)、及びSilici_ter_Pst(配列番号28)によりPCR反応を行い1.3kbの配列番号29を含む増幅断片を得た。この断片をEcoRI/PstI処理し、pUC18のEcoRI/PstIサイトに挿入し、pUC18SHMTとした。このプラスミドによりEscherichia coli JM109を形質転換した。この形質転換体をJM109/pUCSHMTと命名した。
上記の実施例の方法で作製したJM109/pTVVHMT01、JM109/pTVVHMT02、JM109/pTVVHMT03をそれぞれ、100mg/lのアンピシリン、及び0.1mM IPTGを含むLB培地で37℃、16時間前培養した。培養液100mlから得られた菌体を遠心分離にて集菌した後、0.1mMピリドキサールリン酸を含む100mM 燐酸緩衝液(pH7.4)を用いて洗菌した。
Escherichia coli W3110染色体DNA上のtrpオペロンのプロモータ領域を、配列番号31、配列番号32に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRにより0.3kbの断片を増幅し、得られたDNA断片をpGEM―Teasyベクター(プロメガ製)にライゲーションした。このライゲーション溶液でE.coli JM109を形質
転換し、アンピシリン耐性株の中からtrpプロモータの方向がlacプロモータと反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをEcoO109I/EcoRIにて処理して得られるtrpプロモータを含むDNA断片と、pUC19(Takara製)のEcoO109I/EcoRI処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でEscherichia coli JM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このプラスミドをHindIII/PvuIIにて処理して得られるDNA断片と、pKK223−3(Amersham Pharmacia製)をHindIII/HincIIにて処理し、得られたTrrnBターミネータを含む0.7kbのDNA断片とライゲーションした。このライゲーション溶液でEscherichia coli JM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをptrp2とした。このptrp2を鋳型として、プライマー(配列番号31、配列番号33)を用いてtrpプロモータ領域を含む0.3kbの断片を増幅した。このPCR産物とptrp2のプロモータ領域を置換することを目的に、PCR産物をEcoO109I/NdeI消化によって得られる断片をptrp2のEcoRO109I/NdeI処理物とライゲーションしEscherichia coli JM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このプラスミドをptrp4とした。さらに、pTWV228(TaKaRa製)をNdeIで処理した後に末端の平滑化処理を行い、次いでAatIIで処理し1.9kbの断片を得た。この断片に、ptrp4をAatII/HindIIIで処理した0.4kbの断片とpKK223−3をPvuII/HindIIIで処理した0.7kbの断片とライゲーションした。このライゲーション溶液でEscherichia coli JM109を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択しこのプラスミドをptrp13とした。
Glucose 25.0
MgSO4・7H2O 1.0
(NH4)2SO4 5.0
H3PO4 3.5
FeSO4 7aq 0.05
MnSO4 7aq 0.05Thiamine HCl 0.001
Pyridoxyne HCl 0.01
GD113 0.1
アンピシリン 0.1
グルコースと硫酸マグネシウムは別々に滅菌した。他の組成分のpHはKOHで5.0に調整した。
フィード糖液の組成(g/l)
Glucose 500.0
pH 無調
上記の実施例13で作製したJM109/ptrp13BHMTの培養液30mlを用いてα―メチル−L−セリン生成反応を行った。300mlの反応液(1200mML−アラニン、0.1mMピリドキサールリン酸、100mMリン酸緩衝液(pH7.4)、JM109/ptrp13BHMTの培養液10%)に30℃にて2400mMホルムアルデヒド水溶液150mlを撹拌しながら48時間かけて添加した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液[コード番号:16223−55]を用いた。添加終了後、反応混合物50μlに1mM硫酸銅水溶液を950μl加え、水で5倍希釈してSumichiralOA−6100(住化分析センター)によりHPLC分析を行った(移動相:0.5mM硫酸銅水溶液、カラム温度:30℃、流速:1ml/分、検出:UV215nm)。その結果、327.3mmolのα―メチル−L−セリンの生成が確認され、α―メチル−D−セリンはいずれの場合も検出限界以下であった。
実施例14で作成した反応溶液から遠心分離により簡単に除菌を行った。得られた反応溶液451g(α―メチル−L−セリン:9.08%)に硫酸3.3gを加え、pHを3に調整し、50℃にて1時間、溶存タンパクの加熱凝集を行った。これを0.2μmのMFにて、ろ過を行い、残渣洗浄水を含め、482gの溶液(α―メチル−L−セリン:8.45%、D−アラニン:0.13%、L−アラニン:0.08%)を得た。この溶液の内165gを採り、5%のα―メチル−L−セリン濃度となる様、水で希釈した後、H型の強酸性カチオン交換樹脂(バイエル製 レバチットS−1468)120mlを充填した樹脂塔にフィードし、α―メチル−L−セリンを吸着させた。樹脂量の2倍量の水を貫流して洗浄した後、1Mのアンモニア水を用いて溶離を行い、352g(α―メチル―L−セリン含量:約3.8%)の水溶液を得た。
JM109/pUCBHMTを酵素菌体として100mlの反応液(150mM L−2−アミノ−n−酪酸、0.1mMピリドキサールリン酸、100mMリン酸緩衝液(pH7.4))に懸濁した。この反応液に30℃にて300mMホルムアルデヒド水溶液50.5mlを撹拌しながら24時間かけて添加した。なお、ホルムアルデヒドはナカライテスク株式会社製の特級ホルムアルデヒド液[コード番号:16223−55]を用いた。菌体分離(8,000g、10min)を行った反応液(50ml : a−エチル−セリンとして632mg、4.75mmol含有)を、予め50mlのメタノールでの活性化、及び100mlのH2Oでの平衡化を行ったMega Bond Elut SCX (10G) (Varian, Inc)にアプライした。100mlの水で洗浄した後、50mlの0.5N−HClで溶出し、2.5mlずつ分取した。各分取画分をHPLC分析によってa−エチル−セリン/(a−エチル−セリン + L−2−アミノ−n−酪酸)の存在比を確認し、存在比>99%である画分を分離画分とした。非分離画分については濃縮乾固した後、10ml程度の水に溶解し、NaOHでpH7.0付近に調整し、再び上記の条件で分離を行った。この操作を2回繰り返し、分離画分を集めて、濃縮乾固した。100ml程度の水に溶解し、陰イオン交換樹脂(DEAE−cellulose, whatman)を添加して、pHを6.0付近に調整した。その後、樹脂をろ過によって取り除き、ろ液に対してアセトンを滴下し、結晶を析出させ、乾燥し、白色の結晶を得た(348mg、2.6mmol)。NMRスペクトルとESI−MS分析によって、構造を確認後、日本分光製旋光度計(DIP−370)により旋光度を測定した([a]D 20=−3.4±0.4 (c=1, 5N−HCl)、[a]D 20=−4.5±0.04 (c=10, 5N−HCl))。文献記載値と比較することにより、酵素反応の主生成物は(−)体、すなわち(S)体であることが確認された(Journal of Peptide Science, 2001, 7, 619−625及びTetrahedron Letters, 1988, 29, 235−238)。
51mMアセトアルデヒド、50mML−アラニン、0.1mMピリドキサールリン酸、100mMリン酸緩衝液(pH7.4)からなる溶液に実施例2で調製した精製酵素溶液を50μl添加し、30℃で17.5時間反応した。反応終了後、遠心分離(18,000g、10分、4℃)により得られる上澄み液のESI−MS分析を行ったところ、α―メチルスレオニンの分子イオンピークが観測された。
配列番号2:プライマー
配列番号3:プライマー
配列番号6:プライマー
配列番号7:プライマー
配列番号10:プライマー
配列番号11:プライマー
配列番号12:プライマー
配列番号13:プライマー
配列番号16:プライマー
配列番号17:プライマー
配列番号20:プライマー
配列番号21:プライマー
配列番号24:プライマー
配列番号25:プライマー
配列番号26:プライマー
配列番号27:プライマー
配列番号28:プライマー
配列番号31:プライマー
配列番号32:プライマー
配列番号33:プライマー
配列番号34:プライマー
Claims (12)
- 酵素の存在下で、式(I):
に示されるL−α−アミノ酸と、下記式(II):
に示されるアルデヒドとを反応させる、式(III):
に示されるL−セリン誘導体の製造方法であって、
前記酵素が、下記(A)〜(L)からなる群より選ばれる1種または2種以上のタンパク質である、L−セリン誘導体の製造方法。
(A)配列番号5に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号5に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(C)配列番号9に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(D)配列番号9に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(E)配列番号15に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(F)配列番号15に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(G)配列番号19に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(H)配列番号19に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(I)配列番号23に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(J)配列番号23に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(K)配列番号30に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(L)配列番号30に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質 - 前記酵素が、ラルストニア(Ralstonia)属、バリオボラックス(Variovorax)属、ボセア(Bosea)属およびシリシバクター(Silicibacter)属からなる群より選ばれるいずれかの属に属する微生物に由来する、請求項1に記載のL−セリン誘導体の製造方法。
- R 1 が、炭素数1〜6のアルキル基であり、R 2 が、水素、または炭素数1〜6のアルキル基である、請求項1または2に記載のL−セリン誘導体の製造方法。
- 式(I)で示されるアミノ酸が、L−α−アラニンであり、式(III)で示されるL−セリン誘導体がα−メチル−L−セリンである、請求項1から3のいずれか一項に記載のL−セリン誘導体の製造方法。
- 式(I)で示されるアミノ酸が、L−2−アミノ−n−酪酸であり、式(III)で示されるL−セリン誘導体がα−エチル−L−セリンである、請求項1から3のいずれか一項に記載のL−セリン誘導体の製造方法。
- 式(I)で示されるアミノ酸が、L−α−アラニンであり、式(III)で示されるL−セリン誘導体がα−メチル−L−スレオニンである、請求項1から3のいずれか一項に記載のL−セリン誘導体の製造方法。
- 式(I):
に示されるL−α−アミノ酸と、下記式(II):
に示されるアルデヒドとから、下記式(III):
に示されるL−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有する、下記(A)〜(L)のいずれかのタンパク質。
(A)配列番号5に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号5に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(C)配列番号9に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(D)配列番号9に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(E)配列番号15に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(F)配列番号15に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(G)配列番号19に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(H)配列番号19に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(I)配列番号23に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(J)配列番号23に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質
(K)配列番号30に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(L)配列番号30に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する前記反応を触媒する活性を有するタンパク質 - ラルストニア(Ralstonia)属、バリオボラックス(Variovorax)属、ボセア(Bosea)属およびシリシバクター(Silicibacter)属からなる群より選ばれるいずれかの属に属する微生物に由来する、請求項7に記載のタンパク質。
- 請求項7または8に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 下記(a)から(l)よりなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
(a)配列番号4に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(b)配列番号4に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式(I)のL−α−アミノ酸と式(II)のアルデヒドと反応させて、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号8に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(d)配列番号8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式(I)のL−α−アミノ酸と式(II)のアルデヒドと反応させて、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(e)配列番号14に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(f)配列番号14に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式(I)のL−α−アミノ酸と式(II)のアルデヒドと反応させて、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(g)配列番号18に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(h)配列番号18に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式(I)のL−α−アミノ酸と式(II)のアルデヒドと反応させて、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(i)配列番号22に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(j)配列番号22に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式(I)のL−α−アミノ酸と式(II)のアルデヒドと反応させて、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(k)配列番号29に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド
(l)配列番号29に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、式(I)のL−α−アミノ酸と式(II)のアルデヒドと反応させて、式(III)に示されるL−セリン誘導体を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(上記(a)から(l)において、ストリンジェントな条件は、90%以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。)
- 請求項9または10に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド。
- 請求項11に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007516340A JP4877227B2 (ja) | 2005-05-20 | 2006-05-18 | L−セリン誘導体の製造方法およびこれに用いる酵素 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005148660 | 2005-05-20 | ||
JP2005148660 | 2005-05-20 | ||
PCT/JP2006/309949 WO2006123745A1 (ja) | 2005-05-20 | 2006-05-18 | L-セリン誘導体の製造方法およびこれに用いる酵素 |
JP2007516340A JP4877227B2 (ja) | 2005-05-20 | 2006-05-18 | L−セリン誘導体の製造方法およびこれに用いる酵素 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2006123745A1 JPWO2006123745A1 (ja) | 2008-12-25 |
JP4877227B2 true JP4877227B2 (ja) | 2012-02-15 |
Family
ID=37431317
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007516340A Expired - Fee Related JP4877227B2 (ja) | 2005-05-20 | 2006-05-18 | L−セリン誘導体の製造方法およびこれに用いる酵素 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7851187B2 (ja) |
EP (1) | EP1882737B1 (ja) |
JP (1) | JP4877227B2 (ja) |
WO (1) | WO2006123745A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018181774A1 (ja) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | 株式会社カネカ | 新規モノオキシゲナーゼおよびその利用 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2239335B1 (en) | 2008-01-18 | 2013-02-27 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for production of serine derivative, and protein for use in the process |
AR109844A1 (es) * | 2016-10-27 | 2019-01-30 | Syngenta Participations Ag | Proteínas insecticidas |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5212273A (en) * | 1975-07-19 | 1977-01-29 | Ishikawajima Harima Heavy Ind | Method and device for blow molding multiilayer molded article having reinforced structure |
JPS60172293A (ja) * | 1984-02-17 | 1985-09-05 | Mitsui Toatsu Chem Inc | L−セリンの製造法 |
JPH06125790A (ja) * | 1991-03-27 | 1994-05-10 | Celgene Corp | 2‐アミノ‐3‐ヒドロキシ‐3‐フェニルプロピオン酸の立体異性富化 |
JPH06181788A (ja) * | 1992-12-22 | 1994-07-05 | Mitsui Toatsu Chem Inc | L−セリンの製造方法 |
JPH11266881A (ja) * | 1998-01-12 | 1999-10-05 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるl−セリンの製造法 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5212273B1 (ja) | 1970-05-06 | 1977-04-06 | ||
US4782021A (en) | 1984-02-17 | 1988-11-01 | Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. | Method of producing L-serine |
JPH07327688A (ja) | 1994-06-06 | 1995-12-19 | Ajinomoto Co Inc | α−メチル−β−ヒドロキシフエニルアラニンまたはその誘導体の製造方法 |
JP4066543B2 (ja) | 1998-01-12 | 2008-03-26 | 味の素株式会社 | 発酵法によるl−セリンの製造法 |
JP4452914B2 (ja) | 2003-09-08 | 2010-04-21 | 味の素株式会社 | 新規トランスポータタンパク質 |
EP1743943A4 (en) | 2004-03-17 | 2012-01-18 | Ajinomoto Kk | PROCESS FOR PREPARING L-FUCULOSE AND METHOD FOR PRODUCING L-FUCOSE |
JP2005278468A (ja) | 2004-03-29 | 2005-10-13 | Ajinomoto Co Inc | 光学活性アミノ酸の製造方法 |
JP4655539B2 (ja) | 2004-08-06 | 2011-03-23 | 味の素株式会社 | アシラーゼを用いたβアミノ酸の製造方法 |
JP4806963B2 (ja) | 2005-05-20 | 2011-11-02 | 味の素株式会社 | β−ヒドロキシアミノ酸の製造方法およびこれに用いる酵素 |
-
2006
- 2006-05-18 EP EP06756354A patent/EP1882737B1/en not_active Not-in-force
- 2006-05-18 JP JP2007516340A patent/JP4877227B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-05-18 WO PCT/JP2006/309949 patent/WO2006123745A1/ja active Application Filing
-
2007
- 2007-11-20 US US11/942,873 patent/US7851187B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5212273A (en) * | 1975-07-19 | 1977-01-29 | Ishikawajima Harima Heavy Ind | Method and device for blow molding multiilayer molded article having reinforced structure |
JPS60172293A (ja) * | 1984-02-17 | 1985-09-05 | Mitsui Toatsu Chem Inc | L−セリンの製造法 |
JPH06125790A (ja) * | 1991-03-27 | 1994-05-10 | Celgene Corp | 2‐アミノ‐3‐ヒドロキシ‐3‐フェニルプロピオン酸の立体異性富化 |
JPH06181788A (ja) * | 1992-12-22 | 1994-07-05 | Mitsui Toatsu Chem Inc | L−セリンの製造方法 |
JPH11266881A (ja) * | 1998-01-12 | 1999-10-05 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるl−セリンの製造法 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018181774A1 (ja) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | 株式会社カネカ | 新規モノオキシゲナーゼおよびその利用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1882737B1 (en) | 2011-09-14 |
US20090170171A1 (en) | 2009-07-02 |
WO2006123745A1 (ja) | 2006-11-23 |
US7851187B2 (en) | 2010-12-14 |
EP1882737A1 (en) | 2008-01-30 |
EP1882737A4 (en) | 2010-01-27 |
JPWO2006123745A1 (ja) | 2008-12-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4670347B2 (ja) | 新規アルドラーゼおよび置換α−ケト酸の製造方法 | |
JP5246639B2 (ja) | 4−ヒドロキシ−l−イソロイシンの製造法 | |
US7354746B1 (en) | Method for producing optically active IHOG and monatin | |
JP6947634B2 (ja) | ヒドロキシ−l−ピペコリン酸の製造方法 | |
US7745182B2 (en) | Method for producing β-hydroxy amino acid and enzyme used therefor | |
JPWO2006041143A1 (ja) | 新規なd−セリン合成活性を有する酵素をコードするdna、該酵素の製造方法、及びこれを利用したd−セリンの製造方法 | |
JP5516664B2 (ja) | N−アセチル−(R,S)−β−アミノ酸アシラーゼ遺伝子 | |
JP4877227B2 (ja) | L−セリン誘導体の製造方法およびこれに用いる酵素 | |
JP5903298B2 (ja) | N−サクシニル−dl−アミノ酸に対する向上されたd体選択性を有する改変型d−サクシニラーゼ | |
JPWO2014045781A1 (ja) | ブタンジオール類の製造方法 | |
JP5532928B2 (ja) | セリン誘導体の製造方法及びこれに用いるタンパク質 | |
JP4797452B2 (ja) | 新規アルドラーゼ並びに光学活性ihog及びモナティンの製造方法 | |
JP5119783B2 (ja) | N−アセチル−(R,S)−β−アミノ酸アシラーゼ遺伝子 | |
WO2009096541A1 (ja) | システイン誘導体の製造方法 | |
EP1130108A1 (en) | Methods for racemizing N-acylamino acids and producing optically active amino acids | |
JP2009131254A (ja) | 4−ヒドロキシイソロイシン又は2−アミノ−3−メチル−4−ケトペンタン酸の製造法 | |
JP2004105152A (ja) | (r)−体のアミド結合を選択的に加水分解するアミダーゼ遺伝子及びその利用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090323 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110809 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111003 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20111101 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20111114 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4877227 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20141209 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20141209 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |