JPWO2014045781A1 - ブタンジオール類の製造方法 - Google Patents

Abstract

アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡとから不可逆にアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセトアセチルＣｏＡ合成酵素、アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、及び３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからブタンジオール類を生成するための反応を触媒する酵素、をコードする遺伝子を含む微生物を培養するステップ、を含む、ブタンジオール類の製造方法。

Description

本発明はブタンジオール類の製造方法に関する。

近年、化石資源の枯渇や地球温暖化対策などの観点から、再生可能資源を原料とした化合物製造プロセスが注目されている。特に、バイオマスを原料として、生物化学的プロセスで種々のポリマー原料化合物や化学品原料化合物を製造する、所謂バイオリファイナリーが広く検討されている。

バイオマスの原料転換が期待されている化合物として、ブタンジオール類（１，３−ブタンジオール及び１，４−ブタンジオールを指す。）が挙げられる。例えば、１，４−ブタンジオールは、有機化学品の合成原料、ポリエステル及びエンジニアリングプラスチックのモノマー単位などに使用され、１，３−ブタンジオールは、有機溶媒や化粧品基材などで使用される。これらブタンジオール類の需要は大きく、バイオマスなどの再生可能資源を原料とした、生物化学的プロセスでのブタンジオール類の製造方法に対する要求が大きくなっている。

生物化学的プロセスを用いたブタンジオール類の製造方法としては、例えば、特許文献１乃至３及び非特許文献１に記載された方法が挙げられる。

特許第４３８０７０４号明細書 国際公開２００８／１１５８４０号公報 国際公開２０１０／１２７３１９号公報

Ｈａｒｒｙ Ｙｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ １，４−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ７， ４４５−４５２ （２０１１）．

しかしながら、特許文献１乃至３及び非特許文献１に記載された方法は、プロセスが複雑である。

上記課題に対して、経済的にブタンジオール類を得ることができる、新たなブタンジオール類の製造方法を提供する。

本発明は以下のものを含む。
［１］アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡとから不可逆にアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセトアセチルＣｏＡ合成酵素、
アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、及び
３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからブタンジオール類を生成するための反応を触媒する酵素、
をコードする遺伝子を含む微生物を培養するステップ、
を含む、ブタンジオール類の製造方法。
［２］３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからブタンジオール類を生成するための反応を触媒する酵素が、
３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡを生成する反応を触媒するエノイルＣｏＡヒドラターゼ、
クロトニルＣｏＡから４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する反応を触媒する４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、及び
４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから４−ヒドロキシブタナールを生成する反応を触媒するアルデヒドデヒドロゲナーゼ又は１，４−ブタンジオールを生成する反応を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼ、
である［１］に記載のブタンジオール類の製造方法。
［３］３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからブタンジオール類を生成するための反応を触媒する酵素が、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシブタナールを生成する反応を触媒するアルデヒドデヒドロゲナーゼ又は１，３−ブタンジオールを生成する反応を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼである［１］に記載のブタンジオール類の製造方法。
［４］アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡとから不可逆にアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセトアセチルＣｏＡ合成酵素をコードする遺伝子が、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の遺伝子である［１］乃至［３］のいずれかに記載のブタンジオール類の製造方法。

（ａ）配列番号１の塩基配列を有する遺伝子
（ｂ）配列番号１の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号１の塩基配列に対して９０％以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子
［５］前記微生物が、下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかに記載の４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子を含む、［１］、［２］又は［４］に記載のブタンジオール類の製造方法。

（ｄ）配列番号８の塩基配列を有する遺伝子
（ｅ）配列番号８の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号８の塩基配列に対して９０％以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
（ｆ）配列番号８に記載の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子
［６］前記微生物が更に、アセチルＣｏＡを基質としてマロニルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含む、
［１］乃至［５］のいずれかに記載のブタンジオール類の製造方法。
［７］前記培養するステップが、前記微生物を好気条件下で培養するステップを含む、［１］乃至［６］のいずれかに記載のブタンジオール類の製造方法。
［８］前記微生物が、大腸菌、酵母、コリネバクテリウム又はクロストリジウムである、
［１］乃至［７］のいずれかに記載のブタンジオール類の製造方法。

経済的にブタンジオール類を得ることができる、ブタンジオール類の製造方法を提供できる。

本実施形態に係るブタンジオール類の製造方法の例を説明するための、概略図である。

以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書において、ＣｏＡとは、コエンザイムＡを意味する。また、％は、特に記載のない限り、質量％を示す。

図１に、本実施形態に係るブタンジオール類の製造方法の例を説明するための概略図を示す。

本実施形態においては、
アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡとから不可逆にアセトアセチルＣｏＡを生成する反応（Ｓ１０１）を触媒するアセトアセチルＣｏＡ合成酵素、
アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する反応（Ｓ１０３）を触媒するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、及び
３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからブタンジオール類を生成するための反応を触媒する酵素、
をコードする遺伝子を形質転換などにより微生物体内で発現させ、この微生物体内にアセチルＣｏＡを供給することでブタンジオール類を得ることができる。なお、ここで「供給」には、外から物質を与えることの他、微生物体内でその物質を合成できる状態にすることも含む。また、後者の場合、本来、微生物が持っている遺伝子系を利用しても良く、新たに遺伝子系を導入して合成できるようにしても良い（以下、同様。）
ここで、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからブタンジオール類を生成するための反応とは、例えば図１のＳ１０５で示すように３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからブタンジオール類へと１段階で変換しても良く、図１のＳ１０７、Ｓ１０９及びＳ１１１で示すように、複数の段階で変換しても良い。

３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからブタンジオール類への反応が１段階の場合、例えば、
アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡとから不可逆にアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセトアセチルＣｏＡ合成酵素、
アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、及び
３−ヒドロキシブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシブタナールを生成する反応を触媒するアルデヒドデヒドロゲナーゼ又は１，３−ブタンジオールを生成する反応を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼ、
をコードする遺伝子を形質転換などにより微生物体内で発現させ、この微生物体内にアセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡを供給することでブタンジオール類を得ることができる。３−ヒドロキシブタナールを生成するアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いる場合、生じる３−ヒドロキシブタナールは宿主微生物のもつアルコールデヒドロゲナーゼの作用によってブタンジオール類に導かれてもよく、３−ヒドロキシブタナールをブタンジオール類に導くアルコールデヒドロゲナーゼを併せて微生物体内で発現させてもよい。

後述する微生物体内に、アセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡが供給されると、前記の遺伝子の作用により、アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡとから不可逆にアセトアセチルＣｏＡが生成し（Ｓ１０１）、生成したアセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡが生成し（Ｓ１０３）、生成した３−ヒドロキシブチリルＣｏＡから１，３−ブタンジオールが生成する（Ｓ１０５）。

３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからブタンジオール類への反応が複数の段階である場合、例えば、
アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡとから不可逆にアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセトアセチルＣｏＡ合成酵素、
アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、
３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡを生成する反応を触媒する３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、
クロトニルＣｏＡから４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する反応を触媒する４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、及び
４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから４−ヒドロキシブタナールを生成する反応を触媒するアルデヒドデヒドロゲナーゼ又は１，４−ブタンジオールを生成する反応を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼ、
をコードする遺伝子を形質転換などにより微生物体内で発現させ、この微生物体内にアセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡを供給することでブタンジオール類を得ることができる。４−ヒドロキシブタナールを生成するアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いる場合、生じる４−ヒドロキシブタナールは宿主微生物のもつアルコールデヒドロゲナーゼの作用によってブタンジオール類に導かれてもよく、４−ヒドロキシブタナールをブタンジオール類に導くアルコールデヒドロゲナーゼを併せて微生物体内で発現させてもよい。

図１に示されるように、後述する微生物体内に、アセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡが供給されると、前記の遺伝子の作用により、アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡとから不可逆にアセトアセチルＣｏＡが生成し（Ｓ１０１）、生成したアセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡが生成し（Ｓ１０３）、生成した３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡが生成し（Ｓ１０７）、生成したクロトニルＣｏＡから４−ヒドロキシブチリルＣｏＡが生成し（Ｓ１０９）、生成した４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから１，４−ブタンジオールが生成する（Ｓ１１１）。

次に、各々の反応を触媒する酵素と、該酵素をコードする遺伝子について、詳細に説明する。

（アセトアセチルＣｏＡ合成酵素をコードする遺伝子）
本実施形態で得られるブタンジオール類は、アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡとから不可逆にアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセトアセチルＣｏＡ合成酵素をコードする遺伝子を含む微生物を用いて、アセトアセチルＣｏＡから誘導される。

本実施形態で使用できるアセトアセチルＣｏＡ合成酵素は、アセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡを基質として、不可逆にアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒するものであれば、任意に選択することができる。具体例としては、例えば、Ｕｎｐｒｅｃｅｄｅｎｔｅｄ ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ−ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｉｏｌａｓｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ ｐａｔｈｗａｙ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｕ．Ｓ．Ａ． １０７， １１２６５−１１２７０ （２０１０）．に記載されたアセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ（ＥＣ番号）：２．３．１．１９４）又はそのホモログが挙げられる。

上述のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列は、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のアクセッションＮｏ．ＡＢ５４０１３１で参照することができる（配列番号１）。

従来、アセトアセチルＣｏＡを生成する酵素としては、β−ケトチオラーゼが知られている。β−ケトチオラーゼは、アセチルＣｏＡ２分子を基質として、アセトアセチルＣＯＡを生成する反応を触媒する酵素であり、ｔｈｉＬ、ｐｈａＡなどの遺伝子によってコードされる。しかしながら、β−ケトチオラーゼは、前述のアセトアセチルＣｏＡを合成する反応と、アセトアセチルＣｏＡを加水分解してアセチルＣｏＡ２分子を生成する反応と、を可逆的に触媒する酵素である。本実施形態のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素は、アセトセチルＣｏＡを合成する反応を不可逆的に触媒するため、この酵素を使用した本実施形態の製造方法においては、アセトアセチルＣｏＡの収率が高い。

また、本実施形態においては、アセチルＣｏＡを基質としてマロニルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子を使用しても良い。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを使用することで、マロニルＣｏＡの供給が増加するため、前述のアセトアセチルＣｏＡの不可逆反応が促進される。そのため、生成物への炭素フラックスを増大することができるため、より効率良くブタンジオール類を製造することができる。なお、本実施形態においてアセチルＣｏＡは、宿主が有する解糖系により、培養に用いる任意の炭素源、例えばグルコースなどの糖質を由来として、供給される。

本実施形態で用いられるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、アセチルＣｏＡを基質としてマロニルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素であれば、特に限定されない。具体例としては、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ （２Ｓ）−ｆｌａｖａｎｏｎｅｓ ｂｙ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６８ ４９８−５０４ （２００５）．の非特許文献に記載される、コリネバクテリウム由来アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ番号：６．４．１．２）又はそのホモログが挙げられる。コリネバクテリウム由来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、複数のサブユニットにより活性を発現することが知られている。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列の一例としては、ＤＤＢＪのアクセッションＮｏ．ＹＰ２２４９９９、ＣＣＨ２３８９０で参照することができる。

（アセトアセチルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子）
本実施形態で用いられるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼは、アセトアセチルＣｏＡを還元して３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素であれば、特に限定されない。具体例としては、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３６）、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３５）、３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．１５７）又はこれらのホモログなどが挙げられる。例えば、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（EC番号：１．１．１．３６）、及びその遺伝子についての詳細は、Ｐｏｌｙ−ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ Ｈ16. Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｂｅｔａ−ｋｅｔｏｔｈｉｏｌａｓｅ ａｎｄ ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ．， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２６４， １５２９３-１５２９７(１９８９)に記載されている。

なお、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３６）を使用した場合、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを得ることができ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３５）又は３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．１５７）を使用した場合、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを得ることができる。本実施形態では、１，３−ブタンジオールの製造において、所望のキラリティに応じて、上述の酵素を使い分けることができる。

（エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子）
本実施形態で用いられるエノイルＣｏＡヒドラターゼは、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを脱水してクロトニルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素であれば、特に限定されない。具体例としては、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素としては、エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１７）又はそのホモログなどが挙げられる。エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１７）をコードする遺伝子の詳細については、Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｏｆ ４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｔｏ ｃｒｏｔｏｎｙｌ ｃｏｅｎｚｙｍｅ． Ａ．， Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｐ， Ｄａｒｌｅｙ ＤＪ， Ｇｏｌｄｉｎｇ ＢＴ， Ｂｕｃｋｅｌ Ｗ．， Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００８ ４７（１７） ３２５４−３２５７ （２００８）．の非特許文献などで参照することができる。また、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素としては、エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１１９）又はそのホモログなどが挙げられる。エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１１９）をコードする遺伝子の詳細については、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｐｏｌｙ−ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ． ＩＩ． Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｄ−（−）−ｂｅｔａ ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｂｙ ａｎ ｅｎｏｙｌ ｈｙｄｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ．， Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ ＧＪ， Ｍｅｒｒｉｃｋ ＪＭ． Ｊｏｕｒｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．， ８ ２７４８−２７５５ （１９６９）．の非特許文献などで参照することができる。

前述した通り、アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼは、適用する酵素の種類によって、（Ｒ）体及び／又は（Ｓ）体の３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成することができる。また、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡを生成する反応を触媒するエノイルＣｏＡヒドラターゼも、同様の光学異性体の選択性を有する。即ち、本実施形態に係るブタンジオール類の製造方法では、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼとエノイルＣｏＡヒドラターゼの光学選択性を適切に組み合わせることができ、アセトアセチルＣｏＡからクロトニルＣｏＡを生成するまでの反応を制御することができる。

（４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子）
本実施形態では、クロトニルＣｏＡから４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子として、例えば、配列番号８で示す遺伝子を使用する。本実施形態では、クロトニルＣｏＡから４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子であれば、配列番号８で示す遺伝子のホモログでも良く、好ましくは配列番号８に記載の塩基配列又はその塩基の１若しくは数個が欠失、置換又は付加された塩基配列を有する遺伝子である。

配列番号８で示す遺伝子の、アミノ酸配列への翻訳結果は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッションＮｏ．ＡＪ２５０２６７で参照することができるクロストリジウム アミノブチリカム由来ａｂｆＤ遺伝子の翻訳結果と相同であった。

ａｂｆＤ遺伝子がコードする酵素の詳細は、Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ４−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒａｔｅ ｂｙ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ： ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｗｏ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｏｆ ４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ−ＣｏＡ， Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １７４（３） １８９−１９９ （２０００）．などの非特許文献に記載されている。配列番号８で示す遺伝子は、翻訳配列及び前記遺伝子が提供する反応から、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒトラターゼ活性を有する酵素をコードすると考えられる。しかしながら、比較例として、ａｂｆＤ遺伝子配列を含む組換え体を用いた場合では、ブタンジオール類を製造することができなかった。即ち、本実施形態においては、組換え体において、配列番号８の塩基配列を有する遺伝子と他の遺伝子との共発現によって、１，４−ブタンジオールを製造することができると考えられる。なお、本実施形態の配列番号８で示す遺伝子と前述のａｂｆＤ遺伝子とは、コードするアミノ酸配列は相同であるが、遺伝子情報処理ソフトウェア（ＧＥＮＥＴＹＸ；ＧＥＮＥＴＹＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製）を用いた塩基配列の相同性は７５％と大きく異なる。塩基配列が大きく異なる遺伝子を適用した本実施形態では、効率の良いブタンジオール類の製造方法を提供することができる。

（アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子）
本実施形態で用いられるアルデヒドデヒドロゲナーゼは、ヒドロキシブチリルＣｏＡを還元してヒドロキシブタナールを生成する反応を触媒する酵素であれば、特に限定されない。なお、生成されたヒドロキシブタナールは、宿主微生物由来のアルコールデヒドロゲナーゼにより更に還元され、ブタンジオール類が生成される。また、目的とするブタンジオールによって、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ及び／又は４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを基質とするものを選択することができる。アルデヒドデヒドロゲナーゼの一例としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ｓｔｒａｉｎ ＮＲＲＬ Ｂ５９２株のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．２．１．１０）又はそのホモログが挙げられる。アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．２．１．１０）をコードする遺伝子の塩基配列は、ＤＤＢＪのアクセッションＮｏ．ＡＹ２０８２１で参照することができる。

本実施形態で用いられるアルコールデヒドロゲナーゼは、ヒドロキシブチリルＣｏＡを還元してブタンジオール類を生成する反応を触媒する酵素であれば、特に限定されない。目的とするブタンジオールによって、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ及び／又は４‐ヒドロキシブチリルＣｏＡを基質とするものを選択することができる。アルコールデヒドロゲナーゼの一例としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ ８２４株のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．１）又はそのホモログが挙げられる。アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．１）をコードする遺伝子の塩基配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＧｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ．１１１６０４０で参照することができる。

本実施形態のブタンジオールの製造方法における、好ましい形態では、所望のブタンジオールに応じて選択される一連の酵素群を、遺伝子組み換えにより形質転換された微生物体内で共発現させる。例えば、１，３−ブタンジオールの製造においては、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼ又はこれらのホモログをコードする遺伝子を、個別に又は一連のクラスターとして任意のベクターに挿入し、宿主微生物を形質転換する。得られた形質転換体を、例えばグルコースを炭素源とする培地中で培養することにより、各遺伝子を発現させる。宿主で構成発現し得る遺伝子の場合には、培地中で形質転換体を培養することで、遺伝子が発現する。一方、各遺伝子をベクター上に配されたレギュレーターの制御下で構成した場合には、誘導基質を添加し、誘導的環境へ移行することにより、各々のコードする遺伝子が発現する。宿主の解糖系により供給されるアセチルＣｏＡを反応原料として反応が進行し、１，３−ブタンジオールなどのブタンジオール類が効率良く製造される。なお、本実施形態における培養とは、通常の微生物培養の培養条件を全て含み、また、培養するステップとは、微生物がブタンジオール類を製造するための十分な時間及び条件で培養することを意味する。

本実施形態で使用される各々の酵素をコードする遺伝子において、元の微生物に由来する塩基配列を有する遺伝子をそのまま使用する構成であっても良い。また、遺伝子が由来する微生物とは異なる宿主微生物を用いる場合、宿主微生物における遺伝子発現を良好にするために、一部の塩基配列が置換された遺伝子を使用しても良い。この場合、先ず、公知のデータベースに登録されている元の塩基配列を用いて、コドン利用頻度及び／又はＧＣ含量に応じて当業者が置換する塩基配列を決定する。当業者が決定した一部の塩基配列が置換された遺伝子は、化学的に合成することで得られる。

各々の酵素をコードする遺伝子の例としては、例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属微生物に由来するアセトアセチルＣｏＡ合成酵素（ＮｐｈＴ７）遺伝子、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属微生物に由来するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）遺伝子、クロストリジウム（Ｃｒｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属微生物に由来するアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ａｌｄ）遺伝子及び／又はアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＥ）遺伝子、コリネバクテリウム属微生物に由来するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（Ａｃｃ）遺伝子、クロストリジウム（Ｃｒｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属微生物に由来する３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ（Ｃｒｔ）遺伝子が挙げられる。

また、前述の通り、クロトニルＣｏＡから４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子としては、配列番号８で示す遺伝子を使用することができる。配列番号８で示す遺伝子は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子（ａｂｆＤ）の翻訳結果と相同する。

（微生物）
本実施形態で使用される形質転換宿主微生物の例としては、遺伝子組み換え技術を適用することができる微生物であれば、特に限定されない。産業上の利用の観点から、具体例としては、大腸菌、酵母、コリネ型細菌、クロストリジウム属細菌が挙げられる。酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、クリベロマイセス・ラクティス、クリベロマイセス・マルキシアヌス等が挙げられる。コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・エフィシエンス、ブレビバクテリウム・ディバリカタム、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム、ブレビバクテリウム・インマリオフィルム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、ブレビバクテリウム・ロゼウム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム、コリネバクテリウム・カルナエ、コリネバクテリウム・リリウム、コリネバクテリウム・メラセコーラ、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等が挙げられる。クロストリジウム属細菌としては、クロストリジウム・クリベリ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・アミノブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキー、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカムなどが挙げられる。これらの中でも、大腸菌、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、コリネバクテリウム・グルタミカムを使用することが、形質転換が容易であるため、好ましく、大腸菌を使用することが、より好ましい。

なお、本実施形態に係るブタンジオール類の製造方法においては、目的とする生合成経路を構成する酵素遺伝子の全てを、外来遺伝子として形質転換により提供する必要はなく、宿主が元来保有する酵素遺伝子を利用して、生合成経路を構成しても良い。また、本実施形態では、宿主由来の代謝経路を利用してアセチルＣｏＡを供給したが、遺伝子増幅又は外来遺伝子の導入、分岐経路のノックアウトなどの、代謝工学的手法を使用して、アセチルＣｏＡの供給能を向上させても良い。

なお、本実施形態において、各々の反応を触媒する酵素をコードする遺伝子は、前述で具体例を挙げた遺伝子に限定されず、そのホモログ遺伝子を使用しても良い。本明細書で言うホモログとは、オーソログ及びパラログを含む。オーソログとは、共通祖先の遺伝子から種分化により生じた種間で対応する遺伝子及びその遺伝子より得られる酵素の組を指す。パラログとは、同種内において、種分化でなく遺伝子重複によって生じた種間で対応する遺伝子及びその遺伝子より得られる酵素の組を指す。ホモログとは、オーソログ、パラログに関係なく配列に同一性を有する遺伝子及びその遺伝子より得られる酵素を指す。

本実施形態におけるホモログ遺伝子とは、より具体的には、９０％以上の同一性、好ましくは９５％以上の同一性のある塩基配列を有する遺伝子、より好ましくは、その遺伝子と全く同一又はその塩基の１個若しくは数個が欠失、置換又は付加された遺伝子及びその遺伝子より得られる酵素である。

また、前記ホモログ遺伝子は、対象の遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子を含む。具体的には、公知のデータベースに対するホモロジー検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ）を適用して、又は、同定遺伝子の少なくとも一部から成るプローブ（当該遺伝子の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ）を用いたストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーション若しくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの常法に基づいて、遺伝子又はその遺伝子による形質転換で得られる酵素として取得することができる。また、当業者であれば、塩基配列を置換等することによって、自ら設計することが可能である。なお、ここで言うストリンジェントな条件としては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ −Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｄａｖｉｄ Ｗ． Ｒｕｓｓｅｌｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）の非特許文献に記載されたハイブリダイズさせる条件が挙げられる。具体的には、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムで、ｐＨ：７．０）、０．５％ ＳＤＳ、５×デンハート溶液及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液に、プローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温保持し、ハイブリダイズさせる条件である。

なお、本実施形態で得られるブタンジオールの光学選択性は、ブタンジオールを得るための前駆体である有機酸ＣｏＡ体の光学選択性、又は、その有機酸ＣｏＡ体の生合成経路において、選択された酵素の光学選択性に依存する。つまり、有機酸ＣｏＡを得る反応経路のキラリティを選択することにより、所望の光学選択性を有するブタンジオールを製造することができる。例えば、アセトアセチルＣｏＡより、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属微生物に由来するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）を使用することにより、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡが得られる。また、例えばクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属微生物に由来するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ｈｂｄ）を使用することにより、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡが得られる。したがって、これらの酵素を、本実施形態の製造方法として選択することにより、（Ｒ）−１，３−ブタンジオール又は（Ｓ）−１，３−ブタンジオールを得ることができる。

（培養条件）
上で説明した遺伝子を形質転換などにより微生物体内に導入して発現させ、この微生物を培養することにより、ブタンジオール類を得ることができる。

本発明の反応は、もっとも簡便には、例えば形質転換体をLB培地などの栄養培地で15℃〜40℃、望ましくは18℃〜37℃の温度で24時間程度培養したのち、通常の炭素源、例えば0.01〜50%、望ましくは0.1〜30%のグルコースを炭素源とする培地に移殖し、引き続き同様の温度で1時間〜200時間程度培養し、その過程で培養液中にブタンジオール類を蓄積させることにより達せられる。また菌の増殖・反応の進行による炭素源の消費に応じて、連続的あるいは間欠的に炭素源を添加してもよく、この場合の炭素源の反応液中濃度は前記の限りではない。

微生物を培養するための培地炭素源としては、グルコースやシュークロース、フルクトース等の糖類、 グリセロール等のポリオール、エタノールや酢酸、クエン酸、コハク酸、乳酸、安息香酸、脂肪酸などの有機物またはこれらのアルカリ金属塩、n-パラフィンなどの脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、または例えばペプトン、肉エキス、魚エキス、大豆粉、ふすま等の天然有機物を、単独、あるいはこれらの組み合わせにより、通常0.01％〜30％、望ましくは0.1％〜20％程度の濃度で用いることができる。

微生物を培養するための培地窒素源としては、例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素化合物、また尿素、尿酸などの含窒素有機物、ペプトン、肉エキス、魚エキス、大豆粉等の天然有機物を単独、あるいはこれらの組み合わせにより、通常0.01％〜20％、望ましくは0.1％〜10％程度の濃度で用いることができる。

さらに必要に応じて、リン酸2水素カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、酢酸カルシウム、塩化マンガン、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、硫酸ニッケルなどの金属塩を菌の生育、酵素活性の改善のために添加することができる。添加濃度は培養条件により異なるが、通常、リン酸塩に関しては0.01％〜5％、マグネシウム塩においては10ppm〜1％、他の化合物では0.1ppm〜1,000ppm程度である。また選択する培地により、ビタミン類、アミノ酸、核酸などの供給源として例えば酵母エキス、カザミノ酸、酵母核酸を1ppm〜100ppm程度、菌の生育、酵素活性を改善のために添加することができる。

培地のpHは、4.5〜9、望ましくは5〜8に調整することが望ましい。また前記のような培地であらかじめ培養された微生物菌体を、遠心分離、膜ろ過などの方法により培養液から分取し、反応原料を含む水、生理食塩水、または培養のpHと同等のpHに調整されたリン酸、酢酸、ホウ酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどとこれらの塩よりなる緩衝液などに再度懸濁し、反応させることは、反応液中の夾雑物を低減し、後の生成物の分取を簡便にするために有用である。反応中のpHは、充分な濃度の緩衝液を用いる場合においては通常維持されうるが、反応の進行により上記pHを逸脱する場合においては、同様のpHとなるよう水酸化ナトリウム、アンモニアなどを用いて適宜調整することが望ましい。

反応液中に生成したブタンジオール類の分離回収および精製は、ブタンジオール類の生成量が実質的な量に達した時点で、反応液から菌体を遠心分離により除去してから、あるいはそのままの反応液に、一般の有機化合物の分離回収および精製の手段を用いることで行うことができる。例えば、培養液から菌体その他を除去したろ液より、適当な有機溶媒を用いて抽出する。この抽出物をそのまま留去するほか、更に適当な溶媒で再抽出する、あるいはシリカゲル等のクロマトグラフィーを用いて精製する、もしくは多段蒸留等に供することにより、高純度のブタンジオール類が得られる。

反応液中にブタンジオール類が蓄積することにより、反応速度が低下する場合、生成物の濃度に応じて反応液中に、水、生理食塩水、反応緩衝液等を追加し連続的に希釈してゆく方法は好適である。また反応速度が低下した時点で菌を分取し、上清を生産物溶液として回収し、分取した菌は再度反応原料を含む溶液あるいは懸濁液に戻すことにより、反応速度を回復することができる。この操作は、遠心分離器や分離膜等を用いて連続的に、あるいは回分的にも実施することができる。

（実施例１）
配列番号３で示される遺伝子配列（アルデヒドレダクターゼに対応）の、５'末端にＣＡＴ（開始コドンＡＴＧと合わせて制限酵素ＮｄｅＩサイト相当）を、３'末端にＧＡＧＣＴＣ（ＳａｃＩサイト相当）を付加した平滑末端断片を常法により全合成し、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイト中のＳｍａＩサイトに挿入したプラスミドを得た。得られたプラスミドを制限酵素処理し、配列３の領域を含むＮｄｅＩ−ＳａｃＩ断片を得た。この遺伝子断片を、発現ベクターｐＥＴ１７ｂ（ノバジェン社製）のマルチクローニングサイト中、ＮｄｅＩ−ＳａｃＩサイトに常法により挿入して、ｐＥＴＢＤ３を得た。

配列番号１で示される遺伝子配列（アセトアセチルＣｏＡシンターゼに対応）の平滑末端断片を常法により全合成し、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイト中のＳｍａＩサイトに挿入したプラスミドを得た。得られたプラスミドをテンプレートとしたＰＣＲにより、配列番号１領域前後にｐＥＴ１７ｂのマルチクローニングサイト中、ＮｄｅＩサイト前後に相補する配列を付加した増幅断片を調製し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）でｐＥＴ１７ｂのＮｄｅＩサイトに挿入することにより、配列１を含むｐＥＴＢＤ１を得た。

ｐＥＴＢＤ１と同様の方法により、配列番号２で示される遺伝子配列（アセトアセチルＣｏＡレダクターゼに対応）をｐＥＴ１７ｂに挿入した、配列２を含むｐＥＴＢＤ２を得た。

ｐＥＴＢＤ３の配列１の終止コドン下流に位置する、ｐＥＴ１７ｂマルチクローニングサイト由来のＥｃｏＲＩサイトを制限酵素処理により切断し、ｐＥＴＢＤ３の開環断片を調製した。次にｐＥＴＢＤ１の配列１の領域と上流のｐＥＴ１７ｂ由来Ｔ７プロモーターを含む領域の上下流に、前記ｐＥＴＢＤ３のＥｃｏＲＩサイトを含む上流側１５ｂｐ分、下流側１５ｂｐ分に対応する配列を付加した断片を、ＰＣＲにより調製した。得られた２つの断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔによりライゲーションし、配列３及び１を含むｐＥＴＢＤ３１を得た。同様に、ｐＥＴＢＤ３１の配列１の下流に位置するＸｈｏＩサイトを用いたｐＥＴＢＤ３１の開環断片に対し、ｐＥＴＢＤ２をテンプレートとして調製したＴ７プロモーターと配列２を含むＰＣＲ断片を挿入することで、配列３、１、２を含むｐＥＴＢＤ３１２を得た。

なお、各々の工程で用いたＰＣＲ増幅産物は、電気泳動により、所定のサイズのバンドを分画、切り出し及び精製して、ライゲーション工程で使用した。

得られたｐＥＴＢＤ３１２を用いて常法により、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株を形質転換した。形質転換体ｐＥＴＢＤ３１２／ＪＭ１０９（ＤＥ３）を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地５ｍＬで３７℃、１２時間、好気下で培養した。培養液０．１ｍＬを、グルコース１％、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、ＩＰＴＧ０．２ｍＭを含むＬＢ培地５ｍＬに移植し、３０℃、４８時間、好気下で培養した。培養液上清を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：カラム；Ｓｈｏｄｅｘ ＳＨ−１０１１（昭和電工製）、カラム温度：６０℃、溶離液：２５ｍＭ硫酸水溶液、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ、検出：示差屈折検出器）に供試した。培養液中には、１４０ｍｇ／Ｌの１，３−ブタンジオールが検出された。

（実施例２）
配列番号４で示される遺伝子配列（アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼに対応）の平滑末端断片を常法により全合成し、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイト中のＳｍａＩサイトに挿入したプラスミドを得た。得られたプラスミドをテンプレートとして、実施例１と同様の方法で調製したｐＥＴＢＤ３１２の、配列番号３に対応する部分の上流側・下流側各１５ｂｐを付加した平滑末端断片を、ＰＣＲにより調製した。

実施例１と同様の方法で調製したｐＥＴＢＤ３１２の、配列番号３に対応する部分の上流側・下流側より外向きにアニールするプライマーを用いたインバースＰＣＲにより、ｐＥＴＢＤ３１２から配列３が除かれた直鎖平滑断片を調製した。

得られた２つの平滑末端断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔにより結合して、ｐＥＴＢＤ３１２の配列３を配列４に置換したｐＥＴＢＤ４１２を調製した。得られたｐＥＴＢＤ４１２を用いて常法により大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株を形質転換した。

大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株を実施例１と同様の方法で培養・分析に供試した。培養液中には、９０ｍｇ／Ｌの１，３−ブタンジオールが検出された。

（実施例３）
配列番号５で示される遺伝子配列（アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのＤｔｓＲＩサブユニットに対応）の平滑末端断片を常法により全合成し、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイト中のＳｍａＩサイトに挿入したプラスミドを得た。得られたプラスミドをテンプレートとし、配列４の５'末端、３'末端各１５ｂｐに加え、各々、ｐＲＳＦＤｕｅｔ（ノバジェン社製）のマルチクローニングサイト２のＮｄｅＩサイト中「ＴＡ」を含む上流側１５ｂｐ分、下流側１５ｂｐ分に対応する配列を付加した両端各３０ｂｐのプライマーを調製して増幅反応を行い、配列５を含む平滑末端断片を得た。得られた平滑末端断片と、ｐＲＳＦＤｕｅｔを制限酵素ＮｄｅＩで制限酵素処理して得た直鎖断片とを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔによりライゲーションし、配列５を含むｐＲＳＢＤ０５を得た。

配列番号６で示される遺伝子配列（アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのＡｃｃＢＣサブユニットに対応）の平滑末端断片を常法により全合成し、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイト中のＳｍａＩサイトに挿入したプラスミドを得た。得られたプラスミドをテンプレートとし、配列６の５'末端、３'末端各１５ｂｐに加え、ｐＲＳＦＤｕｅｔのマルチクローニングサイト１のＮｃｏＩサイト中「ＣＣ」を含む上流側、「ＡＴＧＧ」を含む下流側に対応する配列を付加したプライマーを調製して増幅反応を行い、配列６を含む平滑末端断片を得た。得られた平滑末端断片と、ｐＲＳＢＤ０５を制限酵素ＮｃｏＩサイトの外向きにインバースＰＣＲした直鎖平滑断片とを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔによりライゲーションし、配列５、配列６を含むｐＲＳＢＤ６５を得た。

得られたｐＲＳＢＤ６５と実施例１で得られたｐＥＴＢＤ３１２とにより、常法を用いて大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株を形質転換した。

得られた形質転換体ｐＥＴＢＤ３１２＋ｐＲＳＢＤ６５／ＪＭ１０９（ＤＥ３）を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地５ｍＬで３７℃、１２時間、好気下で培養した。培養液０．１ｍＬを、グルコース１％、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ、ＩＰＴＧ０．２ｍＭを含むＬＢ培地５ｍＬに移植し、３０℃、好気下で４８時間培養した。培養液を、実施例１と同様の方法によりＨＰＬＣに供試した。培養液中には、３６０ｍｇ／Ｌの１，３−ブタンジオールが検出された。

（実施例４）
配列番号８で示される遺伝子配列（人工合成遺伝子、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼに対応）の、５'末端にＣＡＴＡＴＧ（ＮｄｅＩサイト相当）、３'末端にＡＡＧＣＴＴ（ＨｉｎｄＩＩＩサイト相当）を付加した平滑末端断片を常法により全合成し、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイト中のＳｍａＩサイトに挿入したプラスミドを得た。得られたプラスミドを制限酵素処理し、配列８の領域を含むＮｄｅＩ‐ＨｉｎｄＩＩＩ断片を得た。この遺伝子断片を、発現ベクターｐＥＴ１７ｂ（ノバジェン社製）のマルチクローニングサイト中、ＮｄｅＩ‐ＨｉｎｄＩＩＩサイトに、常法を用いて挿入して、ｐＥＴＳＤ８を得た。このｐＥＴＳＤ８をテンプレートとして、ｐＥＴＳＤ８のｐＥＴ１７ｂベクター由来Ｔ７プロモーター上流にアニールし、更にＧＧＡＴＣＣ（ＢａｍＨＩサイト相当）を５'側に追加したプライマー及びｐＥＴＳＤ８の配列８の３'末端を相補し、更にＧＡＧＣＴＣ（ＳａｃＩサイト相当）を５'側に追加したプライマーにより、ＰＣＲを行った。得られた増幅物をＳａｃＩ処理して、断片８を得た。

配列番号７で示される遺伝子配列（エノイルＣｏＡヒドラターゼに対応）の、５'末端にＣＡＴＡＴＧ（ＮｄｅＩサイト相当）、３'末端にＣＴＣＧＡＧ（ＸｈｏＩサイト相当）を付加した平滑末端断片を常法により全合成し、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイト中のＳｍａＩサイトに挿入したプラスミドを得た。得られたプラスミドを制限酵素処理し、配列７の領域を含むＮｄｅＩ‐ＸｈｏＩ断片を得た。得られた遺伝子断片を、発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ（ノバジェン社製）のマルチクローニングサイト２中、ＮｄｅＩ‐ＸｈｏＩサイトに、常法により挿入して、ｐＥＤＳＤ０７を得た。このｐＥＤＳＤ０７をテンプレートとして、ｐＥＤＳＤ０７のｐＥＴＤｕｅｔベクター由来Ｔ７Ｌａｃプロモーター上流にアニールし、更にＧＡＧＣＴＣ（ＳａｃＩサイト相当）を５'側に追加したプライマー及びｐＥＤＳＤ０７の配列７の３'末端を相補し、更にＧＧＡＴＣＣ（ＢａｍＨＩサイト相当）の相補配列を５'側に追加したプライマーとを用いてＰＣＲを行った。得られた増幅物をＳａｃＩ処理した断片７を得た。

断片８と断片７とを常法によりＳａｃＩサイト同士でライゲーションし、配列８及び配列７を含む一連の断片８７とした。断片８７を更にＰＣＲにより増幅した後、ＢａｍＨＩ処理したＢａｍＨＩ処理断片を得た。得られたＢａｍＨＩ処理断片と、ｐＥＴＢＤ３１２のＢａｍＨＩ処理断片とを常法でライゲーションしたのち、ＰＣＲを用いたマッピングによりインサート方向を確認し、すべての挿入配列の翻訳方向が同方向に構成されたｐＥＴＢＤ３８７１２を得た。

得られたｐＥＴＢＤ３８７１２を用いて、常法により大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ Ｂｌｕｅ（ＤＥ３）株（ノバジェン社製）を形質転換した。

形質転換体ｐＥＴＢＤ３８７１２／Ｒｏｓｅｔｔａ Ｂｌｕｅ（ＤＥ３）を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３２ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地５ｍＬで３７℃、好気下で１２時間培養した。培養液０．１ｍＬを、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３２ｍｇ／Ｌ、ＩＰＴＧ０．２ｍＭを含む５ｍＬの評価培地１中に移植し、３０℃、好気下で４８時間培養した。評価培地１の詳細は下記の通りである。

評価培地１の組成は：
２％ グルコース、
１％ ペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、
０．５％ 酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、
２．４％ Ｋ_２ＨＰＯ_４、
０．６％ ＫＨ_２ＰＯ_４、
６００ｐｐｍ クエン酸鉄、
１００ｐｐｍ リボフラビン ／蒸留水 ｐＨ ７．２、
である。

上述の組成物を全て混合し、常温下２時間撹拌した後、０．４５μｍのフィルターを用いてろ過滅菌した。

培養後の培養液を、実施例１と同様の方法により、ＨＰＬＣに供した。培養液中には、２２０ｍｇ／Ｌの１，３−ブタンジオール及び１８ｍｇ／Ｌの１，４−ブタンジオールが検出された。

（実施例５）
実施例３で得られたｐＲＳＢＤ６５と、実施例４で得られたｐＥＴＢＤ３８７１２により、常法を用いて大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ Ｂｌｕｅ（ＤＥ３）株を形質転換した。

得られた形質転換体ｐＲＳＢＤ６５＋ｐＥＴＢＤ３８７１２／Ｒｏｓｅｔｔａ Ｂｌｕｅ（ＤＥ３）を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３２ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地５ｍＬで３７℃、好気下で１２時間培養した。

培養液０．１ｍＬを、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３２ｍｇ／Ｌ、ＩＰＴＧ０．２ｍＭを含む、５ｍＬの評価培地１に移植し、３０℃、好気下で４８時間培養した。

培養液を、実施例１と同様の方法によりＨＰＬＣに供試した。培養液中には、４１０ｍｇ／Ｌの１，３−ブタンジオール及び５０ｍｇ／Ｌの１，４−ブタンジオールが検出された。

本出願は、２０１２年９月２４日に日本国特許庁に出願された特願２０１２−２０９９８１号に基づく優先権を主張するものであり、特願２０１２−２０９９８１号の全内容を本出願に援用する。

Claims (8)

1. アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡとから不可逆にアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセトアセチルＣｏＡ合成酵素、
   アセトアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、及び
   ３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからブタンジオール類を生成するための反応を触媒する酵素、
   をコードする遺伝子を含む微生物を培養するステップ、
   を含む、ブタンジオール類の製造方法。
2. ３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからブタンジオール類を生成するための反応を触媒する酵素が、
   ３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡを生成する反応を触媒するエノイルＣｏＡヒドラターゼ、
   クロトニルＣｏＡから４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する反応を触媒する４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ、及び
   ４−ヒドロキシブチリルＣｏＡから４−ヒドロキシブタナールを生成する反応を触媒するアルデヒドデヒドロゲナーゼ又は１，４−ブタンジオールを生成する反応を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼ、
   である請求項１に記載のブタンジオール類の製造方法。
3. ３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからブタンジオール類を生成するための反応を触媒する酵素が、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシブタナールを生成する反応を触媒するアルデヒドデヒドロゲナーゼ又は１，３−ブタンジオールを生成する反応を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼである請求項１に記載のブタンジオール類の製造方法。
4. アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡとから不可逆にアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセトアセチルＣｏＡ合成酵素をコードする遺伝子が、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の遺伝子である請求項１に記載のブタンジオール類の製造方法。
   （ａ）配列番号１の塩基配列を有する遺伝子
   （ｂ）配列番号１の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号１の塩基配列に対して９０％以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
   （ｃ）配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子
5. 前記微生物が、下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかに記載の４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子を含む、請求項１に記載のブタンジオール類の製造方法。
   （ｄ）配列番号８の塩基配列を有する遺伝子
   （ｅ）配列番号８の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号８の塩基配列に対して９０％以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
   （ｆ）配列番号８に記載の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子
6. 前記微生物が更に、アセチルＣｏＡを基質としてマロニルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含む、
   請求項１に記載のブタンジオール類の製造方法。
7. 前記培養するステップが、前記微生物を好気条件下で培養するステップを含む、請求項１に記載のブタンジオール類の製造方法。
8. 前記微生物が、大腸菌、酵母、コリネバクテリウム又はクロストリジウムである、
   請求項１に記載のブタンジオール類の製造方法。

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