WO2009096541A1 - システイン誘導体の製造方法 - Google Patents

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WO2009096541A1
WO2009096541A1 PCT/JP2009/051617 JP2009051617W WO2009096541A1 WO 2009096541 A1 WO2009096541 A1 WO 2009096541A1 JP 2009051617 W JP2009051617 W JP 2009051617W WO 2009096541 A1 WO2009096541 A1 WO 2009096541A1
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WO
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formula
cysteine
protein
represented
seq
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/051617
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Michihiko Kobayashi
Yoshiteru Hashimoto
Tomoko Abe
Hideaki Hosaka
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co., Inc. filed Critical Ajinomoto Co., Inc.
Publication of WO2009096541A1 publication Critical patent/WO2009096541A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine

Definitions

  • Acyl CoA synthase includes adenylation domain including acetyl-CoA synthase, allyl CoA synthase, long chain fatty acyl CoA synthase, firefly luciferase and non-ribosomal peptide synthase (NRPS) adenylation domain Belongs to the superfamily.
  • the X-ray crystal structures of all reported enzymes are very similar to each other and are composed of the same domain, a large N-terminal domain and a smaller C-terminal domain. Conventionally, the reaction mechanism and structure of acyl CoA synthase have been actively studied.
  • acyl CoA synthase involved in the nitrile pathway of Pseudomonas chlororaphis strain B23 (Non-patent Document 1).
  • This enzyme synthesizes acyl CoA by catalyzing the formation of a thiol ester bond between fatty acid and coenzyme A (CoA).
  • CoA coenzyme A
  • acetyl CoA is produced from acetic acid and CoA.
  • Formula (I) in the presence of a protein having acyl-CoA synthetase activity (In Formula (I), R 1 represents hydrogen or a saturated or unsaturated hydrocarbon group having 1 to 19 carbon atoms. R 1 may be linear or branched. R 1 is further a substituent. As an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • n represents an integer of 1 or 2.
  • a cysteine compound represented by formula (III) Equation ((III), R 1 is the same as R 1 in formula (I), R 2 is the same as R 2 in formula (II).)
  • a method for producing a cysteine derivative which produces a cysteine derivative represented by [2] the formula R 1 in (I) is a saturated or unsaturated hydrocarbon of 9 from 1 carbon atoms, wherein R 1 may be a linear or branched chain, cysteine according to the above [1] A method for producing a derivative.
  • cysteine compound of the formula (II) is one or more selected from the group consisting of cysteine, homocysteine, and cysteine methyl ester.
  • the protein according to any one of [1] to [5] above, wherein the protein having acyl CoA synthetase activity is a protein derived from a microorganism belonging to a genus selected from the group consisting of Pseudomonas and Saccharomyces. A method for producing the cysteine derivative as described.
  • a culture containing a microorganism producing a protein having an acyl CoA synthase activity is mixed with the carboxylic acid represented by the formula (I) and the cysteine compound represented by the formula (II) to be reacted.
  • a cysteine derivative represented by the formula (III) is produced by reacting the carboxylic acid represented by the formula (I) with the cysteine compound represented by the formula (II).
  • a cysteine derivative can be produced by a simple reaction system.
  • FIG. 1 is a diagram showing LC-MS / MS analysis of a ligation reaction product of isobutyrate and cysteine by AcsA.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of HPLC analysis of a ligation reaction product of isobutyrate and cysteine by AcsA.
  • FIG. 3 is a diagram showing a cysteine compound (Group I) that can be a substrate and a compound (Group II) that was not.
  • FIG. 4 is a diagram showing an LS-MS / MS analysis of the ligation reaction product of acetate and cysteine by acetyl CoA synthase derived from budding yeast.
  • FIG. 5 is a diagram showing an LS-MS / MS analysis of a reaction product of luciferin and L-cysteine by a firefly luciferase derived from Photinus pyralis.
  • an enzyme refers to a protein having an activity of catalyzing a chemical reaction.
  • acyl CoA synthetase (Acyl-CoA synthetase) forms a thiol ester by dehydrating and condensing a carboxyl group of fatty acid and a thiol group of coenzyme A (CoA) as at least one enzyme activity.
  • CoA coenzyme A
  • acyl CoA synthetase activity refers to enzyme activity that catalyzes a reaction that forms a thiol ester by dehydrating and condensing a carboxyl group of a fatty acid and a thiol group of coenzyme A (CoA).
  • CoA coenzyme A
  • cyste compound is used as a term encompassing both cysteine (ie, 2-amino-3-mercaptopropionic acid) and derivatives thereof.
  • the SEQ ID NO indicates the SEQ ID NO in the sequence listing.
  • an enzyme belonging to the adenylate synthase superfamily for example, a protein belonging to acyl CoA synthase or firefly luciferase can be used.
  • a carboxylic acid represented by formula (I) and a cysteine compound represented by formula (II) are mixed in the presence of a protein having acyl CoA synthase activity or luciferase activity.
  • a cysteine derivative represented by the formula (III) reaction formula (10)).
  • One type of protein may be used, or two or more types may be mixed and used.
  • the carboxyl group of isobutyrate and the amino group of cysteine are amide-bonded to produce N-isobutyryl-cysteine.
  • an ATP-dependent enzyme is used, ATP is added to the reaction system, and AMP and pyruvic acid (PPi) are generated after the reaction.
  • the protein having acyl-CoA synthetase activity that can be used in the present invention has at least two enzyme activities. That is, an enzyme activity that promotes a reaction for producing a cysteine derivative represented by the formula (III) from a carboxylic acid represented by the formula (I) and a cysteine compound represented by the formula (II), and an acyl CoA synthetase activity It is.
  • the protein used in the production method of the present invention has, as one enzyme activity, a cysteine derivative represented by the formula (III) from a carboxylic acid represented by the above formula (I) and a cysteine compound represented by the formula (II). It has an enzyme activity that promotes the reaction to be produced. Although the detailed reaction mechanism is not necessarily clear, the presence of this protein promotes the reaction starting from the cysteine compound represented by the formula (II) and the carboxylic acid represented by the formula (I). A cysteine derivative of formula (III) is produced.
  • a protein having acyl CoA synthase activity can have an action of promoting a reaction to form an amide bond (—CONH—) using a carboxylic acid and a cysteine compound as starting materials. It was n’t.
  • Acyl CoA synthase includes ATP-dependent and GTP-dependent enzymes, but proteins used in the production method of the present invention are not limited to these types.
  • acyl CoA synthase may be classified according to the length of the carbon chain of a fatty acid that can be used as a substrate.
  • proteins used in the production method of the present invention are not limited to these classifications. That is, the protein used in the production method of the present invention is not limited by the classification of acyl CoA synthase.
  • R 1 represents hydrogen or a saturated or unsaturated hydrocarbon group having 1 to 19 carbon atoms.
  • R 1 may be linear or branched.
  • Examples of the carboxylic acid represented by the formula (I) include saturated aliphatic monocarboxylic acid, methanoic acid (other name: formic acid), ethanoic acid (other name: acetic acid), propanoic acid (other name: propionic acid), butanoic acid ( Also known as butyric acid), isobutyric acid, pentanoic acid (also known as valeric acid), 2-methylbutanoic acid (also known as isovaleric acid), 2,2-dimethylpropanoic acid (also known as pivalic acid), hexanoic acid (also known as capron) Acid), heptanoic acid (also known as enanthic acid), dodecanoic acid (also known as lauric acid), hexadecanoic acid (also known as palmitic acid), octadecanoic acid (also known as stearic acid), and icosanoic acid (also known as arachidic acid).
  • methanoic acid other
  • R 1 may further have an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms as a substituent.
  • the carboxylic acid represented by the formula (I) includes hydrogen in the hydrocarbon skeleton of the carboxylic acid exemplified above. Also included are carboxylic acids in which one or more of the atoms are substituted with an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • Preferred examples of the carboxylic acid represented by the formula (I) include carboxylic acids in which R 1 is a saturated or unsaturated hydrocarbon having 1 to 9 carbon atoms.
  • R 1 may be linear or branched. More specifically, for example, ethanoic acid (other names: acetic acid, acetate), propanoic acid (other names: propionic acid, propionate), butanoic acid (other names: butyric acid, butyrate), isobutyric acid, pentanoic acid (other names: valeric acid, Valerate), hexanoic acid (other names: caproic acid, hexanoate), heptanoic acid (other names: enanthic acid, heptanoate), acrylic acid (other names: acrylate), crotonic acid (other names: crotonate), and the like.
  • a cysteine compound represented by the formula (II) is added to the reaction system.
  • R 2 represents a carboxyl group or an ester thereof.
  • R 2 is represented by the following formula (IV): -COOR 3 ... (IV) The group shown by these is mentioned.
  • R 3 represents hydrogen or an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms. More specific examples of the cysteine compound of the formula (II) include cysteine, homocysteine, and cysteine methyl ester.
  • each substrate can be appropriately selected based on a desired cysteine derivative. Moreover, as one form of the manufacturing method of this invention, you may mix and use 1 type, or 2 or more types of aliphatic carboxylic acid. Moreover, as one form of the manufacturing method of this invention, you may mix and use 1 type, or 2 or more types of cysteine compounds.
  • the reaction temperature is preferably 10 to 60 ° C, more preferably 20 to 40 ° C.
  • the pH of the reaction system is preferably 4 to 10, more preferably 6 to 8.
  • Acyl CoA synthase includes ATP-dependent or GTP-dependent enzymes. When these dependent enzymes are used, it is preferable to add ATP and / or GTP to the reaction system.
  • the acyl CoA synthase includes Mg-dependent enzymes, and when these dependent enzymes are used, it is preferable to add Mg to the reaction system.
  • the acyl CoA synthetase includes a salt-requiring type enzyme. When these required-type enzymes are used, it is preferable to add a salt to the reaction system.
  • the cysteine derivative can be isolated as follows. After lowering the pH of the enzyme reaction solution, heat sterilization, and aggregating the dissolved protein, contamination such as sterilization and protein removal by means of centrifugation, filtration, ultrafiltration (UF), etc. Remove objects. Since this solution contains inorganic salts, desalting is performed in order to avoid precipitation during crystallization.
  • any method such as NF (nanofiltration: nanofiltration), electrodialysis, or ion exchange resin may be used.
  • the reaction between the carboxylic acid of formula (I) and the cysteine compound of formula (II) is carried out in the presence of a protein having acyl CoA synthase activity.
  • Proteins that can catalyze the reaction between the two compounds can be obtained from microorganisms belonging to the genus Pseudomonas and Saccharomyces, for example. More specifically, for example, Pseudomonas chlororaphis and Saccharomyces cerevisiae can be obtained, more specifically, Pseudomonas chlororabis B23 strain and Saccharos 28 strain can be obtained.
  • the protein used in the reaction for producing the cysteine derivative represented by the formula (III) is more specifically exemplified by the following proteins (A) to (F).
  • a cysteine derivative represented by the formula (III) is produced by reacting an aliphatic carboxylic acid represented by the formula (I) with a cysteine derivative represented by the formula (II).
  • the amino acid sequence has an amino acid sequence containing a mutation of one or several amino acids selected from the group consisting of substitution, deletion, insertion, and addition, and the aliphatic carboxylic acid represented by the formula (I),
  • the protein (A) having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6 can be isolated from, for example, Pseudomonas chlorolafis.
  • the proteins (C) and (E) having the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 8 and 10 can be isolated from Saccharomyces cerevisiae. These amino acid sequences are described in the Sequence Listing, and can be obtained from databases such as NCBI (National Center for Biotechnology Information).
  • One of the acyl CoA synthases derived from Pseudomonas chlororafis is available, for example, under the accession number BAD90933.
  • Acyl CoA synthase derived from Saccharomyces cerevisiae is available, for example, under the accession numbers NP_009347 (or NC_001133) and NP_013254 (or NC_001144).
  • the reaction of the carboxylic acid of formula (I) and the cysteine compound of formula (II) is also carried out in the presence of a protein belonging to the adenylate-forming superfamily.
  • a protein belonging to the adenylate-forming superfamily examples include firefly luciferase derived from insects belonging to the genus Phtinus. More specifically, examples of insects belonging to the genus Phtinus include Photinus pyralis.
  • examples of the protein belonging to the adenylate synthase superfamily include the following proteins.
  • G a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12, and (H) one or several amino acids selected from the group consisting of substitution, deletion, insertion, and addition in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12
  • a cysteine derivative represented by the formula (III) is produced by reacting the carboxylic acid represented by the formula (I) with the cysteine derivative represented by the formula (II). Protein that has an activity to promote the reaction
  • the protein having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 12 can be isolated from, for example, Photinus pyralis.
  • the amino acid sequences of luciferases are described in the present sequence listing, and are also available from databases such as NCBI (National Center for Biotechnology Information). Firefly luciferase derived from Phtinus pyralis is available, for example, under accession number AB261988 (DDBJ: DNA DATA BANK OF JAPAN).
  • a protein substantially the same as the protein (A), (C), (E), or (G) may be used.
  • the protein shown in (B) is provided as substantially the same protein as the protein (A).
  • protein (D) is provided as protein substantially the same as protein (C).
  • protein (F) is provided as protein substantially the same as protein (E).
  • protein (H) is provided as protein substantially the same as protein (G).
  • the number represented by the term “one or several” is, for example, 1 to 100, preferably 1 to 70, more preferably 1 to 40, more preferably 1 to 20, preferably 1 to 10, More preferably, the number is 1 to 5.
  • an amino acid sequence containing a mutation of one or several amino acids selected from the group consisting of one or several substitutions, deletions, insertions, and additions in the amino acid sequence of the protein (B) It is desirable to maintain an enzyme activity of about half or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more of the protein (A) under the condition of pH 7-8.
  • Amino acid mutations such as those shown in the proteins (B), (D), (F) and (H) are substituted by an amino acid at a specific site of the gene encoding the protein, for example, by site-directed mutagenesis. It can be obtained by modifying the base sequence so that it is deleted, inserted, added, etc. A polynucleotide having the modified base sequence as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment.
  • protein (A) will be described.
  • Mutation treatment includes a method of treating DNA encoding protein (A) in vitro with hydroxylamine or the like, and a bacterium belonging to the genus Escherichia holding DNA encoding protein (A). Examples thereof include a method of treating with ultraviolet rays or a mutagen usually used for artificial mutation such as N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) or nitrous acid.
  • NTG N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine
  • mutations such as substitutions, deletions, insertions, and additions of bases as described above include naturally occurring mutations such as differences in microorganism species or strains.
  • a DNA encoding the protein substantially the same as the protein (A) or (C) can be obtained by expressing the DNA having the mutation as described above in an appropriate cell and examining the enzyme activity of the expression product.
  • the homology by amino acid sequence is preferably 60% or more, more preferably 70% or more, more preferably Is exemplified by proteins having a homologous sequence of 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 98%.
  • the software GENETYX Ver 7.0.9 (Genetics Co., Ltd.) is used, and the total length of the polypeptide chain encoded by the ORF is used.
  • the present invention also provides a method using a polynucleotide encoding the protein (A).
  • the polynucleotide that can be used in the production method of the present invention includes a polynucleotide having a base sequence encoding the protein (A).
  • Examples of the polynucleotide having the base sequence encoding the protein (A) include the polynucleotide (a) having the base sequence described in SEQ ID NO: 5.
  • the polynucleotide which can be used in the production method of the present invention includes a polynucleotide having a base sequence encoding the protein (C).
  • polynucleotide having the base sequence encoding the protein (C) examples include the polynucleotide (c) having the base sequence described in SEQ ID NO: 7.
  • the polynucleotide which can be used in the production method of the present invention includes a polynucleotide having a base sequence encoding the protein (E).
  • examples of the polynucleotide having the base sequence encoding the protein (E) include the polynucleotide (e) having the base sequence described in SEQ ID NO: 9.
  • the polynucleotide which can be used in the production method of the present invention includes a polynucleotide having a base sequence encoding the protein (G). Examples of the polynucleotide having the base sequence encoding the protein (G) include the polynucleotide (g) having the base sequence described in SEQ ID NO: 11.
  • the polynucleotide (a) can be isolated from, for example, Pseudomonas chlorolafis.
  • the polynucleotides (c) and (e) can be isolated from, for example, Saccharomyces cerevisiae.
  • the polynucleotide (g) can be isolated from, for example, Photonus pyralis.
  • the sequences of these polynucleotides can be obtained from databases such as NCBI (National Center for Biotechnology Information) as well as those described in the Sequence Listing.
  • a polynucleotide encoding the acyl CoA synthase derived from Pseudomonas chlororaphis having the base sequence of SEQ ID NO: 5 is available under accession number AB1255061, for example. Further, polynucleotides encoding the Saccharomyces cerevisiae-derived acyl-CoA synthase having the base sequence of SEQ ID NO: 7 or 9 are available, for example, under accession numbers NC_001133 and NC_001144, respectively.
  • a polynucleotide encoding the firefly luciferase derived from Photinus pyralis having the base sequence of SEQ ID NO: 1 is available, for example, under Accession No. AB261988 (DDBJ).
  • DNA having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5 is obtained from Pseudomonas chlororafis stained DNA or DNA library by PCR (polymerase chain reaction, White, TJ et al; Trends Genet., 5, 185 (1989). Etc.) or by hybridization.
  • Primers used for PCR can be designed based on an internal amino acid sequence determined based on a purified protein having an activity of catalyzing a reaction in the production method of the present invention, for example.
  • a primer or a probe for hybridization can be designed based on the base sequence described in SEQ ID NO: 1, or can be isolated using the probe.
  • a combination of primers having sequences corresponding to the 5 'untranslated region and the 3' untranslated region is used as a PCR primer so as to sandwich the coding region, the entire coding region of the protein can be amplified.
  • the polynucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 7 can also be isolated in the same manner as described above.
  • the primer can be synthesized, for example, using a DNA synthesizer model 380B manufactured by Applied Biosystems, using the phosphoamidite method (see Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859).
  • the PCR reaction can be performed, for example, using Gene Amp PCR System 9600 (manufactured by PERKIN ELMER), TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit (Takara Bio), or the like and according to the method specified by the supplier such as each manufacturer.
  • polynucleotide that is substantially the same as the polynucleotide (a) is also included in the polynucleotide that can be used in an embodiment of the production method of the present invention.
  • examples of the polynucleotide substantially the same as the polynucleotide (a) include the following polynucleotide (b).
  • polynucleotide that is substantially the same as the polynucleotide (c) is also included in the polynucleotide that can be used in an embodiment of the production method of the present invention.
  • examples of the polynucleotide substantially the same as the polynucleotide (c) include the following polynucleotide (d).
  • polynucleotide that is substantially the same as the polynucleotide (e) is also included in the polynucleotide that can be used in an embodiment of the production method of the present invention.
  • examples of the polynucleotide substantially the same as the polynucleotide (e) include the following polynucleotide (f).
  • polynucleotide that is substantially the same as the polynucleotide (g) is also included in the polynucleotide that can be used in an embodiment of the production method of the present invention.
  • examples of the polynucleotide substantially the same as the polynucleotide (g) include the following polynucleotide (h).
  • a probe can be used as the polynucleotide to be hybridized.
  • the probe can be prepared by a conventional method based on the base sequence described in SEQ ID NO: 5, 7, 9 or 11.
  • a method of picking up a polynucleotide that hybridizes with a probe using a probe and isolating the target polynucleotide may be performed according to a conventional method.
  • a DNA probe can be prepared by amplifying a base sequence cloned into a plasmid or phage vector, cutting out and extracting the base sequence to be used as a probe with a restriction enzyme. The part to be cut out can be adjusted according to the target DNA. Further, once a substantially identical polynucleotide as described above is detected, it can be amplified by PCR or the like by a conventional method.
  • “Stringent conditions” refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Although it is difficult to quantify this condition clearly, for example, DNAs having high homology, for example, 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90%, are present. As mentioned above, it is preferable that DNAs having homology of 95% or more, more preferably 98% are hybridized, and DNAs having lower homology are not hybridized. In addition, when calculating
  • it corresponds to the washing conditions for normal Southern hybridization at 60 ° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 65 ° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
  • the conditions for hybridizing at a salt concentration are included.
  • the genes that hybridize under these conditions include those that have generated stop codons in the middle and those that have lost activity due to mutations in the active center. It can be easily removed by expressing in an appropriate host and measuring the enzyme activity of the expression product by the method described below.
  • the polynucleotide (b) in the case of the polynucleotide (b) as described above, it is about half or more of the protein (A) having the amino acid sequence encoded by the base sequence of SEQ ID NO: 5 under the conditions of 30 ° C. and pH 8. It is desirable to maintain the activity, more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more.
  • the activity of about half or more of the protein (E) having the amino acid sequence encoded by the base sequence of SEQ ID NO: 7 under the conditions of 30 ° C. and pH 8 It is desirable that the catalyst activity is maintained at 80% or more, more preferably 90% or more.
  • the activity of about half or more of the protein (G) having the amino acid sequence encoded by the base sequence of SEQ ID NO: 7 under the conditions of 30 ° C. and pH 8 It is desirable that the catalyst activity is maintained at 80% or more, more preferably 90% or more.
  • the form of the protein used in the present invention is not particularly limited as long as it exists in the reaction system in a state that can promote the reaction as described above. That is, when the reaction is carried out in the presence of a protein having a predetermined enzyme activity, the specific form of the protein in the reaction system is, for example, a culture containing microorganisms that produce the protein, from the culture. Separated microbial cells, treated cells, etc. are included.
  • a culture containing microorganisms is a product obtained by culturing microorganisms. More specifically, microbial cells, a medium used for culturing the microorganisms, and substances produced by the cultured microorganisms, And a mixture thereof.
  • the microbial cells may be washed and used as washed cells.
  • cell-treated products include those obtained by crushing, lysing, and lyophilizing the cells, and further purifying the cell-free extracts and crude proteins recovered by treating the cells. Examples include purified protein.
  • purified protein partially purified proteins obtained by various purification methods may be used, or immobilized proteins obtained by immobilizing these by a covalent bond method, an adsorption method, a comprehensive method, or the like may be used. Good.
  • some microorganisms are lysed during culturing, and in this case, the culture supernatant can also be used as a protein-containing material having enzyme activity.
  • a transformant that expresses the protein (A) can be prepared by preparing a recombinant polynucleotide incorporating a polynucleotide having any one of the above base sequences.
  • a transformant expressing the protein (A) can be obtained by preparing a recombinant DNA incorporating a DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and introducing it into a suitable host.
  • hosts for expressing a protein specified by the DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 5 include Escherichia bacteria such as Escherichia coli, Corynebacterium bacteria, and Bacillus subtilis.
  • eukaryotic cells such as Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis, Aspergillus oryzae, and the like can be used.
  • a host that is easy to handle such as culturing and can be cultured without requiring expensive components, mass production of cysteine derivatives can be carried out more easily and inexpensively.
  • Recombinant DNA used for introducing DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 5 into a host can express the DNA-encoded protein in a vector corresponding to the type of host to be expressed. It can be prepared by inserting in the form.
  • a promoter for expressing a protein when a promoter specific to a gene encoding the above enzyme derived from Pseudomonas chlororafis functions in a host cell, the promoter can be used. Further, if necessary, another promoter that works in the host cell may be linked to DNA such as SEQ ID NO: 5 and expressed under the control of the promoter.
  • transformation methods for introducing recombinant DNA into host cells include D.I. M.M. Morrison's method (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) or a method in which recipient cells are treated with calcium chloride to increase DNA permeability (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).
  • the target protein When the target protein is mass-produced using recombinant DNA technology, a form in which the protein associates in a transformant producing the protein to form an inclusion body is also cited as a preferred embodiment. It is done. Advantages of this expression production method are that the target protein is protected from digestion by proteases present in the microbial cells, and that the target protein can be easily purified by centrifugation following cell disruption. In order to obtain an active protein from a protein inclusion body, a series of operations such as solubilization and activity regeneration are necessary, and the operation becomes more complicated than when directly producing an active protein. However, when a large amount of a protein that affects the growth of bacterial cells is produced in the bacterial cells, the effect can be suppressed by accumulating them in the bacterial cells as inactive protein inclusion bodies.
  • a strain usually used for the expression of a heterologous gene can be used.
  • Methods for performing transformation and methods for selecting transformants are also described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor press (2001/01/15) and the like.
  • a method for producing transformed E. coli and producing a predetermined enzyme using the same will be described more specifically as an example.
  • a promoter for expressing a DNA encoding a protein having an enzyme activity used in the present invention a promoter usually used for heterologous protein production in Escherichia coli can be used.
  • a T7 promoter, a lac promoter, a trp promoter, trc Strong promoters such as promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, T5 promoter, and the like can be mentioned.
  • pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pACYC177, pACYC184, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218, pQE30, and derivatives thereof can be used.
  • phage DNA vectors can also be used.
  • an expression vector containing a promoter and capable of expressing the inserted DNA sequence can also be used.
  • a gene encoding another protein is linked upstream or downstream of the protein, and the fusion protein gene and To do.
  • a gene encoding another protein may be any gene that increases the accumulation amount of the fusion protein and enhances the solubility of the fusion protein after the denaturation / regeneration process.
  • T7gene 10, ⁇ -galactosidase gene, Dehydrofolate reductase gene, interferon ⁇ gene, interleukin-2 gene, prochymosin gene and the like are listed as candidates.
  • the codon reading frames should be matched. Ligation may be performed at an appropriate restriction enzyme site, or synthetic DNA having an appropriate sequence may be used.
  • a terminator which is a transcription termination sequence, downstream of the fusion protein gene.
  • the terminator include T7 terminator, fd phage terminator, T4 terminator, tetracycline resistance gene terminator, and E. coli trpA gene terminator.
  • a so-called multicopy type is preferable, and a plasmid having a replication origin derived from ColE1, such as a pUC-type plasmid or pBR322, is used.
  • the “derivative” for a plasmid means a plasmid that has been modified by base substitution, deletion, insertion, and / or addition.
  • the modification here includes modification by mutation treatment with a mutation agent, UV irradiation, or natural mutation.
  • the vector has a marker such as an ampicillin resistance gene in order to select transformants.
  • a marker such as an ampicillin resistance gene
  • an expression vector having a strong promoter is commercially available (for example, pUC system (manufactured by Takara Bio Inc.), pPROK system (manufactured by Clontech), pKK233-2 (manufactured by Clontech), etc.).
  • Recombinant DNA is obtained by ligating a vector DNA with a promoter, a gene encoding a target protein having a predetermined activity or a fusion protein of the target protein and another protein, or in some cases a terminator. .
  • the target protein When expressed as a fusion protein, the target protein may be excised using a restriction protease such as blood coagulation factor Xa, kallikrein, etc., which has a sequence not present in the target protein as a recognition sequence.
  • a restriction protease such as blood coagulation factor Xa, kallikrein, etc.
  • a medium usually used for culturing Escherichia coli such as M9-casamino acid medium and LB medium may be used.
  • the culture conditions and production induction conditions are appropriately selected according to the type of the marker, promoter, host fungus and the like used.
  • the target protein or a fusion protein containing the protein There are the following methods for recovering the target protein or a fusion protein containing the protein. If the target protein or its fusion protein is solubilized in the microbial cells, the microbial cells can be recovered and then disrupted or lysed to be used as a crude enzyme solution. Furthermore, if necessary, the target protein or a fusion protein thereof can be purified and used by a conventional method such as precipitation, filtration or column chromatography. In this case, a purification method using an antibody of the target protein or fusion protein can also be used. When a protein inclusion body is formed, the protein of interest can be obtained by solubilizing it with a denaturing agent and removing the denaturing agent by dialysis or the like.
  • acyl CoA synthase derived from Pseudomonas chlororaphis B23 strain is sometimes referred to as “ascA”.
  • acyl CoA synthase derived from Pseudomonas chlororaphis B23 strain is referred to as “AcsA”.
  • An acyl CoA synthetase having a histidine tag at its C-terminus may be referred to as “AcsHis”.
  • Example 1 Enzymatic reaction using L-cysteine and isobutyrate by AcsA as substrates
  • L-cysteine was used as an alternative substrate for CoA. used. Since AcsA shows the highest catalytic efficiency (K cat / K m ) when isobutyrate is used as a carboxylic acid for acyl CoA synthesis, an enzymatic reaction was performed using L-cysteine and isobutyrate as substrates.
  • the obtained reaction mixture was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) using a Shim-pack SCR-102H ion exclusion chromatography column (manufactured by Shimadzu Corporation), and a new product peak (retention time: 15 minutes) appeared.
  • the amount of product was proportional to the reaction time and enzyme concentration.
  • a decrease in ATP and isobutyrate and an increase in AMP were detected simultaneously. No other new product was produced. Without AcsA, no new product and AMP were detected.
  • N-isobutyryl-cysteine standard (CH 3 ) 2 CH—CO—NH—CH (COOH) CH 2 —SH] is exactly the same as the IC binding compound Elute at retention time.
  • HPLC CROWNPAK registered trademark
  • CR (+) column Daicel Chemical Industries, Ltd.
  • the N-isobutyryl-cysteine standard and the IC binding compound were eluted at the same retention time (9.0 minutes).
  • the structure of the new product, IC binding compound was also identified by LC-MS / MS. The results are shown in FIG. In FIG.
  • FIG. (A) to (d) in FIG. 2 are (a) N-isobutyryl-D-cysteine standard, (b) N-isobutyryl-L-cysteine standard, (c) a reaction mixture containing AcsA, And (d) HPLC chromatograph at 240 nm of the reaction mixture for no AcsA.
  • P1 in FIG. 2 (a) shows a peak of N-isobutyl-D-cysteine.
  • FIG. 2 (b) shows a peak of N-butyryl-L-cysteine.
  • FIG. 2 (d) is a chromatograph when AcsA is not added (ie, control). As shown by the peak of P3 in FIG. 2 (c), it was revealed that the obtained IC binding compound was N-isobutyryl-L-cysteine. From the above results, it was revealed that AcsA catalyzes the formation of an amide bond, that is, AcsA can catalyze not only S-acylation but also N-acylation.
  • the V max value (0.197 U / mg) of the IC binding activity was 1/15 of the isobutyryl-CoA synthesis activity (2.77 U / mg). Further, the K m values of isobutyrate of both reactions were almost the same. In contrast, there was a significant difference between the K m values for CoA and cysteine.
  • Example 2 Substrate specificity of AcsA for various carboxylic acids Table 2 shows the results of examining the ability of AcsA to catalyze the N-acylation of various acids. The relative activity shown in Table 2 was expressed as a relative ratio with respect to 100% for isobutyrate.
  • each product has a corresponding estimated molecular weight (molecular weight of N-propionyl-L-cysteine: 177, molecular weight of N-butyryl-L-cysteine: 191; N-acrylyl-L-cysteine The molecular weight of 175).
  • Example 3 Substrate specificity of AcsA for cysteine and its analogs Under these conditions, very little production of N-isobutyryl-D-cysteine was confirmed when D-cysteine was used as a substrate (N- 1/20 of isobutyryl-L-cysteine production). Therefore, it was estimated that a D-cysteine derivative could be produced by using this novel reaction and using a D-cysteine compound as a substrate.
  • Example 4 Reaction by Saccharomyces cerevisiae-derived acetyl-CoA synthase Furthermore, N-acyl-L-cysteine synthesis reaction of another type of acyl-CoA synthase was examined. First, L-cysteine and acetate as a substrate were reacted in the presence of acetyl CoA synthase (purchased from Sigma-Aldrich) derived from Saccharomyces cerevisiae. From the reaction mixture, a new product peak separated by a Shim-pack SCR-120 column was observed (retention time: 14.9 minutes).
  • acetyl CoA synthase purchased from Sigma-Aldrich
  • FIG. 4 shows an MS / MS spectrum of a linking compound of acetate and cysteine
  • FIG. 4 shows an MS / MS spectrum of an N-acetyl-L-cysteine standard.
  • Example 5 Reaction by firefly luciferase derived from Photinus pyralis Further, a synthesis reaction of cysteine derivatives was examined using a firefly luciferase derived from Photinus pyralis. First, L-cysteine and luciferin as substrates were reacted in the presence of Photinus pyralis-derived luciferase (purchased from Promega). From the reaction mixture a new product peak separated by a 5C 18 -MS-II column was observed (retention time: 38.0 min).
  • FIG. 5 shows an MS / MS spectrum of a linking compound of luciferin and cysteine, and (b) shows an MS / MS spectrum of an N-luciferyl-L-cysteine standard.
  • Oligonucleotide primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 and 2 shown in Table 3 below were used as primers for PCR.
  • the underlined part shown in the base sequence of SEQ ID NO: 1 shows the NdeI recognition site.
  • the underlined part shown in the base sequence of SEQ ID NO: 2 shows the XhoI recognition site.
  • the PCR product was digested with NdeI and XhoI and inserted into the corresponding site of pET-24a (+).
  • the obtained plasmid was designated as pET-acsAHis.
  • E. coli BL-21-CodonPlus- (DE-3) -RIL strain was transformed with pET-acsAHis.
  • Cells transformed at 37 ° C. in 2 ⁇ YT medium with kanamycin (50 ⁇ g / mL) and chloramphenicol (34 ⁇ g / mL) were grown.
  • a 600 nm was 0.6, the incubation temperature was lowered to 18 ° C. and protein expression was induced by 1 mM isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside.
  • the cells were collected by centrifugation, washed twice, and 20 mM potassium phosphate buffer (KPB) (pH 7.4) containing 1 mM EDTA and 10% (w / v) glycerol. ).
  • KPB potassium phosphate buffer
  • the resuspended cells were sonicated and the residue was removed by ultracentrifugation (100,000 ⁇ g, 60 minutes).
  • the resulting supernatant was applied to a Ni-chelated column HisTrap TM HP (5 mL) (GE Healthcare UK) and washed with 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.5 M NaCl. did.
  • AcsAHis was eluted with a linear gradient of imidazole (0.01-0.4M).
  • the active fraction was collected and dialyzed, and then the enzyme solution was applied to a ResourceQ column (6 mL) (GE Healthcare UK) equilibrated with 20 mM KPB (pH 7.5).
  • the enzyme was eluted by increasing the ionic strength of KCl in a linear fashion from 0 to 0.5 M in the same KPB.
  • the active fractions were mixed and dialyzed against 20 mM KPB with EDTA and glycerol. It was confirmed that EDTA and glycerol do not affect acyl CoA synthase and N-acylation activity.
  • the homogeneity of the purified AcsAHis was confirmed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
  • the circular dichroism (CD) spectrum of purified AcsAHis was confirmed to be identical to that of AcsA.
  • Both AcsAHis and untreated AcsA showed almost the same specific activity (isobutyryl-CoA synthase activity: 16.3 and 15.1 U / mg, respectively, N-isobutyryl-L-cysteine activity: 0. 012 and 0.013 U / mg).
  • the chirality of the product was determined with an HPLC column of CHIRALPAK (registered trademark) QN-AX or QD-AX (150 ⁇ 4.6 mm, manufactured by Nykaratech).
  • the solvent system of the mobile phase was 3% (v / v) acetic acid in methanol solvent, and chromatographic separation was performed at 25 ° C. and a flow rate of 0.8 mL / min.
  • the FAB mass spectrum of the purified acid-cysteine bond compound was obtained with a JMS-HX110A instrument (manufactured by JEOL Ltd.) using glycerol as a matrix.
  • LC-ESI-MS analysis was performed with a Shimadzu LCMS-2010EV system (manufactured by Shimadzu Corporation) equipped with a Shim-pack SCR-102H column. The sample was eluted with 0.1% formic acid solvent (pH 3.0) and chromatographed at 40 ° C. and a flow rate of 0.8 mL / min. An ESI voltage of +4.5 kV or ⁇ 3.5 kV was applied to the emitter.
  • the nebulizer gas flow rate and dry gas pressure were set at 1.5 L / min and 0.2 MPa, respectively. Each spectrum was taken at 1 scan per second.
  • LC-MS / MS analysis an Agilent 1100 HPLC system (manufactured by Agilent Technologies) equipped with a Shim-pack SCR-102H column was used. MS / MS analysis data was acquired in positive mode and negative mode of electrospray using a QSTAR XL mass spectrometer (Applied Biosystems). NMR spectra were measured with a Bruker Avance 600 spectrometer. Samples were prepared by dissolving in D 2 O used as an internal standard.
  • the reaction was stopped by adding an equal volume (60 ⁇ L) of methanol to the reaction mixture and the supernatant was obtained by centrifugation (15,000 ⁇ g, 10 min).
  • 220 mM KH 2 PO 4 -H 3 PO 4 buffer (pH 4.0) containing 0.05% dithiothreitol as mobile phase solvent A, 2% chloroform / 98% methanol (v / v) as mobile phase solvent B ) was used to separate acyl CoA with a Cosmosil 5C 18 -AR-II HPLC column (150 ⁇ 4.6 mm, manufactured by Nacalai Tesque).
  • the composition of the mobile phase solvent was as follows.
  • the reaction was stopped by adding 5% formic acid solvent (5 ⁇ L, finally 0.7%, pH 3.0) to the reaction mixture and the supernatant was obtained by centrifugation (15,000 ⁇ g, 10 min).
  • the reaction rate of the activity was measured by HPLC with a CROWNPAK CR (+) column (150 ⁇ 4 mm).
  • the mobile phase solvent was a perchloric acid solvent (pH 1.5), and chromatographic separation was performed at 25 ° C. and a flow rate of 0.8 mL / min.
  • the amount of product was determined by monitoring the column eluate at 192 nm with N-isobutyryl-L-cysteine or N-acetyl-L-cysteine standards as standards. (Retention time: N-isobutyryl-L-cysteine is 8.9 minutes and N-acetyl-L-cysteine is 3.1 minutes).
  • K cat values were respectively calculated by 60,210 or 61,278 of M r about AcsA or AcsAHis.
  • MS analysis was obtained by the following method.
  • a CDL (Curved Desolvation Line) 250 and a block heater temperature of 200 ° C. were set.
  • the nebulizer gas flow rate and the drying gas pressure were 1.5 L / min and 0.2 MPa, respectively.
  • the detection power was +4.5 kV or ⁇ 3.5 kV.
  • the polarity of the ion source was set to positive and negative modes.
  • the present invention is useful in the technical field to which a cysteine derivative is produced and a product group related thereto.

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Abstract

　システイン誘導体の新たな製造方法を提供することを課題とする。アデニレート合成酵素スーパーファミリーに属する酵素、例えば、アシルＣｏＡ合成酵素活性またはホタルルシフェラーゼ活性を有するタンパク質の存在下で、所定のカルボン酸と、所定のシステイン化合物とを混合して反応させ、システイン誘導体を生成させる。

Description

システイン誘導体の製造方法
　本発明は、システイン誘導体の製造方法に関し、詳しくは、カルボン酸とシステイン化合物とからシステイン誘導体を製造する方法に関する。
　アシルＣｏＡ合成酵素は、アセチル－ＣｏＡ合成酵素、アリル（ａｒｙｌ）ＣｏＡ合成酵素、長鎖脂肪酸アシルＣｏＡ合成酵素、ホタルルシフェラーゼ及び非リボソーム型ペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）のアデニル化ドメインなどを含むアデニレート合成酵素スーパーファミリーに属する。報告された酵素すべてのＸ線結晶構造は、互いに非常に類似しており、同じドメイン、大きなＮ末端ドメインとさらに小さなＣ末端ドメイン、で構成される。従来より、アシルＣｏＡ合成酵素の反応メカニズム及び構造は、盛んに研究されてきた。
　本発明者らは最近、シュードモナス　クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）Ｂ２３株のニトリル経路に関与するアシルＣｏＡ合成酵素（ＡｃｓＡ）を報告した（非特許文献１）。本酵素は、脂肪酸と補酵素Ａ（ＣｏＡ）のチオールエステル結合形成を触媒してアシルＣｏＡを合成する。例えば、下記反応式（２０）に示されるように、酢酸とＣｏＡとからアセチルＣｏＡが生成される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　従来、アシルＣｏＡ合成酵素の基質特異性について、脂肪酸に対しては詳細に調べられているが、ＣｏＡに代わるチオール基質については研究が行われていない。
　ところで、システイン及びその誘導体は、化粧料、医薬品、食品添加物などの成分およびその中間体として有用な物質である。そのため、システインおよび様々なシステイン誘導体を、より効率良く製造する手法の開発が進められている。
橋本ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０，８６６０－８６６７（２００５）
　本発明は、システイン誘導体の新たな製造方法を提供することを課題とする。
　本発明者等は、アデニレート合成酵素スーパーファミリーに属する酵素、例えば、アシルＣｏＡ合成酵素（ａｃｙｌ－ＣｏＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）やホタルルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）などの基質特異性について詳細な研究を進めたところ、これらの酵素が、所定の基質同士の反応を触媒し、アミド結合（－ＮＨ－ＣＯ－）を有する生成物を得る反応を促進し得るという知見を得た。本発明は、係る知見に基づくものであり、下記システイン誘導体の製造方法を提供する。
〔１〕アシルＣｏＡ合成酵素活性を有するタンパク質の存在下で、式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式（Ｉ）中、Ｒ１は、水素又は炭素数１から１９の飽和若しくは不飽和の炭化水素基を示す。Ｒ１は直鎖でも、分岐していてもよい。Ｒ１はさらに置換基として炭素数１から３のアルキル基を有していてもよい。）
で示されるカルボン酸と、式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式（ＩＩ）中、Ｒ２は、カルボキシル基又はそのエステルを示す。式（ＩＩ）中、ｎは１又は２の整数を示す。）
で示されるシステイン化合物とを混合して反応させ、式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式（ＩＩＩ）中、Ｒ１は式（Ｉ）におけるＲ１と同じであり、Ｒ２は式（ＩＩ）におけるＲ２と同じ。）
で示されるシステイン誘導体を生成させる、システイン誘導体の製造方法。
〔２〕前記式（Ｉ）のＲ１が炭素数１から９の飽和又は不飽和の炭化水素であり、該Ｒ１は直鎖でも分岐していてもよい、上記〔１〕に記載のシステイン誘導体の製造方法。
〔３〕前記式（Ｉ）で示されるカルボン酸が、酢酸、プロパン酸、ブタン酸、イソ酪酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、アクリル酸、及びクロトン酸からなる群より選ばれる１種又は２種以上である、上記〔１〕に記載のシステイン誘導体の製造方法。
〔４〕前記式（ＩＩ）中、Ｒ２が、下記式（ＩＶ）：
－ＣＯＯＲ３　　　・・・（ＩＶ）
（式（ＩＶ）中、Ｒ３は水素又は炭素数１から５のアルキル基を示す。）
で表される基である、上記〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載のシステイン誘導体の製造方法。
〔５〕前記式（ＩＩ）のシステイン化合物が、システイン、ホモシステイン、及びシステインメチルエステルからなる群より選ばれる１種又は２種以上である、上記〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載のシステイン誘導体の製造方法。
〔６〕前記アシルＣｏＡ合成酵素活性を有するタンパク質が、シュードモナス属及びサッカロミセス属からなる群より選ばれる属に属する微生物に由来するタンパク質である、上記〔１〕から〔５〕のいずれか一項に記載のシステイン誘導体の製造方法。
〔７〕前記アシルＣｏＡ合成酵素活性を有するタンパク質が、下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）および（Ｆ）からなる群：
（Ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、及び付加からなる群より選ばれる１又は数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、前記式（Ｉ）で示されるカルボン酸と、前記式（ＩＩ）で示されるシステイン化合物とを反応させて、前記式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有するタンパク質、
（Ｃ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｄ）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、及び付加からなる群より選ばれる１又は数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、前記式（Ｉ）で示されるカルボン酸と、前記式（ＩＩ）で示されるシステイン誘導体とを反応させて、前記式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有するタンパク質、
（Ｅ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、及び
（Ｆ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、及び付加からなる群より選ばれる１又は数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、前記式（Ｉ）で示されるカルボン酸と、前記式（ＩＩ）で示されるシステイン誘導体とを反応させて、前記式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有するタンパク質、
より選ばれる１種又は２種以上のタンパク質である、上記〔１〕から〔６〕のいずれか一項に記載のシステイン誘導体の製造方法。
〔８〕前記アシルＣｏＡ合成酵素活性を有するタンパク質を生産する微生物と、前記式（Ｉ）で示されるカルボン酸及び式（ＩＩ）で示されるシステイン化合物を混合して反応させ、前記式（ＩＩＩ）に示されるシステイン誘導体を生成させる、上記〔１〕から〔７〕のいずれか一項に記載のシステイン誘導体の製造方法。
〔９〕前記アシルＣｏＡ合成酵素活性を有するタンパク質を生産する微生物を含む培養物と、前記式（Ｉ）に示されるカルボン酸及び前記式（ＩＩ）に示されるシステイン化合物とを混合して反応させ、前記式（ＩＩＩ）に示されるシステイン誘導体を生成させる、上記〔１〕から〔７〕のいずれか一項に記載のシステイン誘導体の製造方法。
〔１０〕前記アシルＣｏＡ合成酵素活性を有するタンパク質を生産する微生物の菌体処理物と、前記式（Ｉ）に示されるカルボン酸及び前記式（ＩＩ）に示されるシステイン化合物とを混合して反応させ、前記式（ＩＩＩ）に示されるシステイン誘導体を生成させる、上記〔１〕から〔７〕のいずれか一項に記載のシステイン誘導体の製造方法。
〔１１〕前記アシルＣｏＡ合成酵素活性を有するタンパク質を生産する微生物が、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）からなる群：
（ａ）配列番号５に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、前記式（Ｉ）で示されるカルボン酸と、前記式（ＩＩ）で示されるシステイン化合物とを反応させて、前記式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号７に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号７に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、前記式（Ｉ）で示されるカルボン酸と、前記式（ＩＩ）で示されるシステイン化合物とを反応させて、前記式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号９に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド、及び
（ｆ）配列番号９に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、前記式（Ｉ）で示されるカルボン酸と、前記式（ＩＩ）で示されるシステイン化合物とを反応させて、前記式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
より選ばれる１種又は２種以上のポリヌクレオチドが導入された形質転換体である、上記〔８〕から〔１０〕のいずれか一項に記載のシステイン誘導体の製造方法。
〔１２〕アデニレート合成酵素スーパーファミリーに属し、かつ、下記（Ｇ）および（Ｈ）からなる群：
（Ｇ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、及び
（Ｈ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、及び付加からなる群より選ばれる１又は数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、前記式（Ｉ）で示されるカルボン酸と、前記式（ＩＩ）で示されるシステイン化合物とを反応させて、前記式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有するタンパク質、
より選ばれる１種または２種以上のタンパク質の存在下で、前記式（Ｉ）で示されるカルボン酸と前記（ＩＩ）で示されるシステイン化合物とを混合して反応させ、前記式（ＩＩＩ）のシステイン誘導体を生成せしめる、システイン誘導体の製造方法。
　本発明によれば、システイン誘導体を簡便な反応系によって製造することができる。
図１は、ＡｃｓＡによるイソブチレートとシステインの連結性反応生成物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析を示す図である。 図２は、ＡｃｓＡによるイソブチレートとシステインの連結性反応生成物のＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。 図３は、基質となり得るシステイン化合物（Ｇｒｏｕｐ　Ｉ）とそうではなかった化合物（Ｇｒｏｕｐ　ＩＩ）を示す図である。 図４は、出芽酵母に由来するアセチルＣｏＡ合成酵素によるアセテートとシステインの連結性反応生成物のＬＳ－ＭＳ／ＭＳ解析を示す図である。 図５は、フォティナス　ピラリス由来のホタルルシフェラーゼによるルシフェリンとＬ－システインとの反応生成物のＬＳ－ＭＳ／ＭＳ解析を示す図である。
　以下、本発明の実施の形態について説明する。なお、以下に挙げる種々の遺伝子工学的な技法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ（２００１年）、新遺伝子工学ハンドブック改訂第４版、村松ら編、羊土社（２００３年）など、多くの標準的な実験マニュアルがあり、これらの文献を参考にすることにより当業者であれば実施可能である。　
　本明細書において用いられる用語は、基本的に、化学分野、生命科学分野、遺伝子工学分野などにおける標準的な意味に従って用いられるが、本発明をより明確に説明するために本明細書において用いられる用語の一部について、以下説明する。本明細書において、酵素とは、化学反応を触媒する活性を有するタンパク質のことをいう。本明細書において、アシルＣｏＡ合成酵素（Ａｃｙｌ－ＣｏＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）とは、少なくとも一つの酵素活性として、脂肪酸のカルボキシル基および補酵素Ａ（ＣｏＡ）のチオール基を脱水縮合して、チオールエステルを形成し、アシルＣｏＡを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質のことをいう。本明細書において、アシルＣｏＡ合成酵素活性とは、脂肪酸のカルボキシル基および補酵素Ａ（ＣｏＡ）のチオール基を脱水縮合して、チオールエステルを形成し、アシルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性のことをいう。本明細書において、「システイン化合物」の用語は、システイン（すなわち、２－アミノ－３－メルカプトプロピオン酸）及びその誘導体の双方を包含する用語として用いられる。また、本明細書においては、特に断らない限り、配列番号は配列表中の配列番号を示す。
　本発明のシステイン誘導体の製造方法においては、アデニレート合成酵素スーパーファミリーに属する酵素、例えば、アシルＣｏＡ合成酵素（ａｃｙｌ－ＣｏＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）やホタルルシフェラーゼ（Ｆｉｒｅｆｌｙ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）などに属するタンパク質を用い得る。本発明のシステイン誘導体の製造方法では、アシルＣｏＡ合成酵素活性またはルシフェラーゼ活性を有するタンパク質の存在下で、式（Ｉ）で示されるカルボン酸と、式（ＩＩ）で示されるシステイン化合物とを混合して反応させ、式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成させる（反応式（１０））。用いられるタンパク質は１種でもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　本発明の製造方法の具体的な形態の一例として、イソ酪酸（イソブチレート）とシステインとを反応させた例を示す（反応式（１１））。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　本例では、反応式（１１）で示されるように、イソブチレートのカルボキシル基とシステインのアミノ基とがアミド結合して、Ｎ－イソブチリル－システインが生成する。本例においては、ＡＴＰ依存型の酵素を用い、反応系にＡＴＰが加えられ、反応後、ＡＭＰとピルビン酸（ＰＰｉ）が生成する。
　本発明で用い得るアシルＣｏＡ合成酵素活性を有するタンパク質は、少なくとも２つの酵素活性を有する。すなわち、上記式（Ｉ）で示されるカルボン酸と、式（ＩＩ）で示されるシステイン化合物とから式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する酵素活性と、アシルＣｏＡ合成酵素活性である。
　本発明の製造方法で用いられるタンパク質は、一つの酵素活性として、上記式（Ｉ）で示されるカルボン酸と、式（ＩＩ）で示されるシステイン化合物とから式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する酵素活性を有する。詳細な反応機構は必ずしも明確ではないが、このタンパク質が介在することにより、式（ＩＩ）で示されるシステイン化合物と式（Ｉ）のカルボン酸とを出発物質とする反応が促進され、最終的に式（ＩＩＩ）のシステイン誘導体が生成するに至る。アシルＣｏＡ合成酵素活性を有するタンパク質が、カルボン酸とシステイン化合物を出発物質としてアミド結合（－ＣＯＮＨ－）を形成させるに至る反応を促進する作用を有し得るということは従来の知見からは全く予期せぬことであった。
　アシルＣｏＡ合成酵素は、ＡＴＰ依存型、およびＧＴＰ依存型の酵素が含まれるが、本発明の製造方法において用いられるタンパク質はこれらの種別に限定されるものではない。また、アシルＣｏＡ合成酵素は、基質とし得る脂肪酸の炭素鎖の長さによって分類がなされる場合があるが、本発明の製造方法で用いられるタンパク質はそれらの分類に限定されるものではない。すなわち、本発明の製造方法で用いられるタンパク質は、アシルＣｏＡ合成酵素の分類によって限定されるものではない。
　本発明の製造方法で採用される反応系における基質の一つとして、式（Ｉ）で示されるカルボン酸が用いられる。式（Ｉ）中、Ｒ１は、水素、または炭素数１から１９の飽和若しくは不飽和の炭化水素基を示す。Ｒ１は直鎖でも、分岐していてもよい。式（Ｉ）で示されるカルボン酸としては、例えば、飽和脂肪族モノカルボン酸として、メタン酸（別称：ギ酸）、エタン酸（別称：酢酸）、プロパン酸（別称：プロピオン酸）、ブタン酸（別称：酪酸）、イソ酪酸、ペンタン酸（別称：吉草酸）、２－メチルブタノン酸（別称：イソ吉草酸）、２，２－ジメチルプロパン酸（別称：ピバル酸）、ヘキサン酸（別称：カプロン酸）、ヘプタン酸（別称：エナント酸）、ドデカン酸（別称：ラウリン酸）、ヘキサデカン酸（別称：パルミチン酸）、オクタデカン酸（別称：ステアリン酸）、イコサン酸（別称：アラキジン酸）などが挙げられ、不飽和脂肪族モノカルボン酸として、プロペン酸（別称：アクリル酸）、プロピン酸（別称：プロピオイル酸）、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸などが挙げられる。Ｒ１は、さらに置換基として炭素数１から３のアルキル基を有していてもよく、例えば、式（Ｉ）で示されるカルボン酸には、上記例示されるカルボン酸の炭化水素骨格における水素原子の１又は２以上が、炭素数１～３のアルキル基で置換されたカルボン酸も含まれる。
　式（Ｉ）で示されるカルボン酸として好ましくは、例えば、Ｒ１が、炭素数１から９の飽和又は不飽和の炭化水素であるカルボン酸が挙げられる。この場合において、Ｒ１は直鎖であっても、分岐であってもよい。より具体的には、例えば、エタン酸（別称：酢酸、アセテート）、プロパン酸（別称：プロピオン酸、プロピオネート）、ブタン酸（別称：酪酸、ブチレート）、イソ酪酸、ペンタン酸（別称：吉草酸、バレレート）、ヘキサン酸（別称：カプロン酸、ヘキサノエート）、ヘプタン酸（別称：エナント酸、ヘプタノエート）、アクリル酸（別称：アクリレート）、クロトン酸（別称：クロトネート）などが挙げられる。
　アミノ基を供与する基質として、式（ＩＩ）で示されるシステイン化合物が反応系に添加される。式（ＩＩ）中、Ｒ２はカルボキシル基又はそのエステルを示す。式（ＩＩ）で示されるカルボキシル基又はそのエステルとして好ましくは、例えば、Ｒ２が、下記式（ＩＶ）：
－ＣＯＯＲ３　　　・・・（ＩＶ）
で示される基が挙げられる。式（ＩＶ）中、Ｒ３は、水素又は炭素数１から５のアルキル基を示す。式（ＩＩ）のシステイン化合物として、より具体的には、システイン、ホモシステイン、及びシステインメチルエステルなどが挙げられる。
　各基質の組み合わせは、所望とするシステイン誘導体に基づいて適宜を選択し得る。また、本発明の製造方法の一形態としては、１種又は２種以上の脂肪族カルボン酸を混合して用いてもよい。また、本発明の製造方法の一形態としては、１種又は２種以上のシステイン化合物を混合して用いてもよい。
　反応温度は、好ましくは１０～６０℃、より好ましくは２０～４０℃である。また、反応系のｐＨは、好ましくは４～１０であり、より好ましくは６～８である。
　アシルＣｏＡ合成酵素には、ＡＴＰ依存型またはＧＴＰ依存型の酵素があり、これらの依存型酵素を用いる場合は、ＡＴＰおよび／またはＧＴＰを反応系に添加することが好ましい。アシルＣｏＡ合成酵素には、Ｍｇ依存型の酵素があり、これらの依存型酵素を用いる場合は、Ｍｇを反応系に添加することが好ましい。また、アシルＣｏＡ合成酵素には、塩要求型の酵素があり、これらの要求型酵素を用いる場合は、塩を反応系に添加することが好ましい。
　上記反応終了後の酵素反応液からは、例えば、以下のようにしてシステイン誘導体の単離を行うことができる。酵素反応液のｐＨを下げ、加熱殺菌と共に、溶存タンパクの凝集を行った後、遠心分離、ろ過、ＵＦ（ウルトラフィルトレーション：限外ろ過）等の手段により、除菌および除タンパクなどの夾雑物除去を行う。この液中には、無機塩類が含まれるため、晶析時に、これらの析出を回避する為、脱塩を行う。方法は、ＮＦ（ナノフィルトレーション：ナノろ過）、電気透析、イオン交換樹脂等何れの方法を用いてもよい。
　必要に応じ上記の脱塩処理を行った後、反応液を濃縮していくとＮ－アシル化されたシステイン誘導体の結晶が析出してくるが、性状は微細であり、結晶分離に際し、溶解度が高い故、高回収率が得られない上に、粘性も大きく取り扱いが困難であることが多い。その為、液を必要に応じてある程度予備的に濃縮した後に貧溶媒添加晶析を行うのが好ましい。予備的濃縮は、例えば結晶が析出し始めるまで行うことができる。ここで添加する貧溶媒としては、水溶性である低級アルコールやアセトンが好適である。貧溶媒晶析の後に、冷却晶析を組み合わせて、晶析率を上げることも可能である。このスラリーを分離し、湿ケーキを乾燥することにより、Ｎ－アシル化されたシステイン誘導体の結晶を得ることができる。
　本発明の一つの実施形態において、式（Ｉ）のカルボン酸と、式（ＩＩ）のシステイン化合物との反応はアシルＣｏＡ合成酵素活性を有するタンパク質の存在下において行われる。この２つの化合物同士の反応を触媒し得るタンパク質は、例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物から得ることができる。より具体的には、例えば、シュードモナス　クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、及びサッカロミセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、より具体的には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ　Ｂ２３株、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｓ２８８Ｃ株などから得ることができる。
　本発明において、式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応に用いられるタンパク質としては、より具体的には下記の（Ａ）から（Ｆ）のタンパク質が例示される。
（Ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、及び付加からなる群より選ばれる１又は数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、前記式（Ｉ）で示される脂肪族カルボン酸と、前記式（ＩＩ）で示されるシステイン誘導体とを反応させて、前記式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｄ）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、及び付加からなる群より選ばれる１又は数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、前記式（Ｉ）で示される脂肪族カルボン酸と、前記式（ＩＩ）で示されるシステイン誘導体とを反応させて、前記式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有するタンパク質
（Ｅ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｆ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、及び付加からなる群より選ばれる１又は数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、前記式（Ｉ）で示される脂肪族カルボン酸と、前記式（ＩＩ）で示されるシステイン誘導体とを反応させて、前記式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有するタンパク質
　配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質（Ａ）は、例えば、シュードモナス　クロロラフィスから単離し得る。また、配列番号８および１０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質（Ｃ）および（Ｅ）は、サッカロミセス　セレビシエから単離し得る。これらのアミノ酸配列については、本件配列表に記載されているほか、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などのデータベースから入手可能である。シュードモナス　クロロラフィス由来のアシルＣｏＡ合成酵素の一つは、例えば、アクセッション番号ＢＡＤ９０９３３にて入手可能である。サッカロミセス　セレビシエ由来のアシルＣｏＡ合成酵素は、例えば、アクセッション番号ＮＰ＿００９３４７（若しくはＮＣ＿００１１３３）、およびＮＰ＿０１３２５４（若しくはＮＣ＿００１１４４）などにて入手可能である。
　本発明の他の実施形態において、式（Ｉ）のカルボン酸と、式（ＩＩ）のシステイン化合物との反応はアデニレート合成酵素スーパーファミリー（Ａｄｅｎｙｌａｔｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ　Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）に属するタンパク質の存在下においても実施し得る。アデニレート合成酵素スーパーファミリーに属する他のタンパク質としては、例えば、フォティナス属（Ｐｈｔｉｎｕｓ）に属する昆虫類に由来するホタルルシフェラーゼなどが挙げられる。フォティナス属（Ｐｈｔｉｎｕｓ）に属する昆虫類としてより具体的には、例えば、フォティナス　ピラリス（Ｐｈｔｉｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓ）などが挙げられる。
　アデニレート合成酵素スーパーファミリーに属するタンパク質としてより具体的には、例えば下記のタンパク質が挙げられる。
（Ｇ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、及び
（Ｈ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、及び付加からなる群より選ばれる１又は数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、前記式（Ｉ）で示されるカルボン酸と、前記式（ＩＩ）で示されるシステイン誘導体とを反応させて、前記式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有するタンパク質
　配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、例えば、フォティナス　ピラリス（Ｐｈｔｉｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓ）などから単離し得る。ルシフェラーゼ類のアミノ酸配列については、本件配列表に記載されているほか、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などのデータベースからも入手可能である。フォティナス　ピラリス（Ｐｈｔｉｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓ）由来のホタルルシフェラーゼは、例えば、アクセッション番号ＡＢ２６１９８８（ＤＤＢＪ：ＤＮＡ　ＤＡＴＡ　ＢＡＮＫ　ＯＦ　ＪＡＰＡＮ）などにて入手可能である。
　本発明においては、タンパク質（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）、または（Ｇ）と実質的に同一のタンパク質も用い得る。タンパク質（Ａ）と実質的に同一タンパク質として、（Ｂ）に示すタンパク質が提供される。またタンパク質（Ｃ）と実質的に同一のタンパク質として、タンパク質（Ｄ）が提供される。またタンパク質（Ｅ）と実質的に同一のタンパク質として、タンパク質（Ｆ）が提供される。またタンパク質（Ｇ）と実質的に同一のタンパク質として、タンパク質（Ｈ）が提供される。タンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが、「１又は数個」の用語は、タンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲を示すものである。「１又は数個」の用語が示す数は、例えば、１～１００個、好ましくは１～７０個、より好ましくは１～４０個、より好ましくは１～２０個、好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個である。ただし、タンパク質（Ｂ）のアミノ酸配列において１又は数個の置換、欠失、挿入、及び付加からなる群より選ばれる１又は数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列の場合には、３０℃、ｐＨ７－８の条件下で、タンパク質（Ａ）の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
　上記タンパク質（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）および（Ｈ）に示されるようなアミノ酸の変異は、例えば部位特異的変異法によって、本タンパク質をコードする遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加などされるように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変された塩基配列を有するポリヌクレオチドは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。例えばタンパク質（Ａ）について説明すると、突然変異処理としては、タンパク質（Ａ）をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びタンパク質（Ａ）をコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射又はＮ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法などが挙げられる。
　また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、及び付加等の変異には、微生物の種あるいは菌株による差異等、天然に生じる変異も含まれる。上記のような変異を有するＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物の本酵素活性を調べることにより、タンパク質（Ａ）又は（Ｃ）と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
　また、タンパク質（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）または（Ｇ）とそれぞれ実質的に同一のタンパク質として、アミノ酸配列による相同性が、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％の相同性の配列を有するタンパク質が例示される。なお、本明細書において、アミノ酸配列の相同性の数値を厳格に求める場合には、例えば、株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ　Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド鎖全長をもちいて、Ｕｎｉｔ　Ｓｉｚｅ　ｔｏ　Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＭａｒｃｈｉｎｇ　ｃｏｕｎｔをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値が採用され、またはこれと同等の計算手法による数値を採用し得る。
　本発明は、上記タンパク質（Ａ）をコードするポリヌクレオチドを用いた方法も提供する。コドンの縮重により、１つのアミノ酸配列を規定する塩基配列は複数あり得る。すなわち、本発明の製造方法にて用い得るポリヌクレオチドとして、上記タンパク質（Ａ）をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。上記タンパク質（Ａ）をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号５に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド（ａ）などが挙げられる。さらに、本発明の製造方法にて用い得るポリヌクレオチドとして、上記タンパク質（Ｃ）をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。上記タンパク質（Ｃ）をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号７に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド（ｃ）などが挙げられる。さらに、本発明の製造方法にて用い得るポリヌクレオチドとして、上記タンパク質（Ｅ）をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。上記タンパク質（Ｅ）をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号９に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド（ｅ）などが挙げられる。さらに、本発明の製造方法にて用い得るポリヌクレオチドとして、上記タンパク質（Ｇ）をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。上記タンパク質（Ｇ）をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド（ｇ）などが挙げられる。
　上記ポリヌクレオチド（ａ）は、例えば、シュードモナス　クロロラフィスなどから単離し得る。上記ポリヌクレオチド（ｃ）および（ｅ）は、例えば、サッカロミセス　セレビシエなどから単離し得る。上記ポリヌクレオチド（ｇ）は、例えば、フォティナス　ピラリスなどから単離し得る。これらのポリヌクレオチドの配列は、本件配列表に記載されているほか、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などのデータベースから入手可能である。配列番号５の塩基配列を有する、シュードモナス　クロロラフィス由来のアシルＣｏＡ合成酵素をコードするポリヌクレオチドは、例えば、アクセッション番号ＡＢ１２５０６１にて入手可能である。また、配列番号７または９の塩基配列を有する、サッカロミセス　セレビシエ由来のアシルＣｏＡ合成酵素をコードするポリヌクレオチドは、例えば、アクセッション番号ＮＣ＿００１１３３およびＮＣ＿００１１４４などにてそれぞれ入手可能である。配列番号１の塩基配列を有する、フォティナス　ピラリス由来のホタルルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドは、例えば、アクセッション番号ＡＢ２６１９８８（ＤＤＢＪ）にて入手可能である。
　ポリヌクレオチドの単離の方法について、配列番号５の塩基配列を有するポリヌクレオチドを一例として挙げ、説明する。配列番号５に記載の塩基配列を有するＤＮＡは、シュードモナス　クロロラフィスの染色ＤＮＡもしくはＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｉｏｎ、Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ．，５，１８５（１９８９）等参照）又はハイブリダイゼーションによって取得することができる。ＰＣＲに用いるプライマーは、例えば、本発明の製造方法における反応を触媒する活性を有する精製タンパク質に基づいて決定された内部アミノ酸配列に基づいて設計することができる。また、配列番号１に記載された塩基配列に基づいてプライマー又はハイブリダイゼーション用のプローブを設計することもでき、あるいはプローブを使って単離することもできる。ＰＣＲ用のプライマーとして、コード領域を挟むように、５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域に対応する配列を有するプライマーの組み合わせを用いると、本タンパク質のコード領域全長を増幅することができる。配列番号７の塩基配列を有するポリヌクレオチドについても上記と同様にして単離可能である。
　プライマーの合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡ合成機　ｍｏｄｅｌ　３８０Ｂを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１），２２，１８５９参照）常法に従って合成できる。ＰＣＲ反応は、例えばＧｅｎｅ　Ａｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００（ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ社製）及びＴａＫａＲａ　ＬＡ　ＰＣＲ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）などを用い、各メーカーなど供給者により指定された方法に従って行うことができる。
　また、上記ポリヌクレオチド（ａ）と実質的に同一のポリヌクレオチドも本発明の製造方法の一形態において用い得るポリヌクレオチドに含まれる。ポリヌクレオチド（ａ）と実質的に同一のポリヌクレオチドとして、例えば、下記ポリヌクレオチド（ｂ）が挙げられる。
（ｂ）配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、前記式（Ｉ）で示される脂肪族カルボン酸と、前記式（ＩＩ）で示されるシステイン誘導体とを反応させて、前記式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　また、上記ポリヌクレオチド（ｃ）と実質的に同一のポリヌクレオチドも本発明の製造方法の一形態において用い得るポリヌクレオチドに含まれる。ポリヌクレオチド（ｃ）と実質的に同一のポリヌクレオチドとして、例えば、下記ポリヌクレオチド（ｄ）が挙げられる。
（ｄ）配列番号７に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、前記式（Ｉ）で示される脂肪族カルボン酸と、前記式（ＩＩ）で示されるシステイン誘導体とを反応させて、前記式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　また、上記ポリヌクレオチド（ｅ）と実質的に同一のポリヌクレオチドも本発明の製造方法の一形態において用い得るポリヌクレオチドに含まれる。ポリヌクレオチド（ｅ）と実質的に同一のポリヌクレオチドとして、例えば、下記ポリヌクレオチド（ｆ）が挙げられる。
（ｆ）配列番号９に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、前記式（Ｉ）で示される脂肪族カルボン酸と、前記式（ＩＩ）で示されるシステイン誘導体とを反応させて、前記式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　また、上記ポリヌクレオチド（ｇ）と実質的に同一のポリヌクレオチドも本発明の製造方法の一形態において用い得るポリヌクレオチドに含まれる。ポリヌクレオチド（ｇ）と実質的に同一のポリヌクレオチドとして、例えば、下記ポリヌクレオチド（ｈ）が挙げられる。
（ｈ）配列番号１１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、前記式（Ｉ）で示される脂肪族カルボン酸と、前記式（ＩＩ）で示されるシステイン誘導体とを反応させて、前記式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　ハイブリダイズさせるポリヌクレオチドとしては、例えばプローブを用い得る。それぞれの場合において、プローブは、配列番号５、７、９または１１に記載の塩基配列などに基づいて定法により作製することができる。また、プローブを用いてこれとハイブリダイズするポリヌクレオチドをつり上げ、目的とするポリヌクレオチドを単離する方法も、定法に従って行えばよい。例えば、ＤＮＡプローブは、プラスミドやファージベクターにクローニングされた塩基配列を増幅し、プローブとして用いたい塩基配列を制限酵素により切り出し、抽出して調製することができる。切り出す箇所は、目的とするＤＮＡに応じて調節することができる。また、一旦、上記のような実質的に同一のポリヌクレオチドが検出された後は、ＰＣＲ等によって増幅することも定法により可能である。
　「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。なお、塩基配列についての相同性（％）の数値を厳格に求める場合には、例えば、株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ　Ｖｅｒ７．０．９を使用し、各遺伝子のＯＲＦ全体（終止コドンを含む）を用いて、Ｕｎｉｔ　Ｓｉｚｅ　ｔｏ　Ｃｏｍｐａｒｅ＝６、ｐｉｃｋ　ｕｐ　ｌｏｃａｔｉｏｎ＝１の設定でｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値が採用され、またはこれと同等の計算手法による数値を採用し得る。また、他の例として、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の発現ベクターにつなぎ、適当な宿主で発現させて、発現産物の酵素活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
　なお、上記のように上記ポリヌクレオチド（ｂ）の場合には、３０℃、ｐＨ８の条件下で、上記配列番号５の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質（Ａ）の半分程度以上の活性、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の触媒活性を保持していることが望ましい。また、同様に、上記ポリヌクレオチド（ｄ）の場合には、３０℃、ｐＨ８の条件下で、上記配列番号７の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質（Ｃ）の半分程度以上の活性、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の触媒活性を保持していることが望ましい。また、同様に、上記ポリヌクレオチド（ｆ）の場合には、３０℃、ｐＨ８の条件下で、上記配列番号７の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質（Ｅ）の半分程度以上の活性、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の触媒活性を保持していることが望ましい。また、同様に、上記ポリヌクレオチド（ｈ）の場合には、３０℃、ｐＨ８の条件下で、上記配列番号７の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質（Ｇ）の半分程度以上の活性、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の触媒活性を保持していることが望ましい。
　本発明において用いられるタンパク質は、上記のような反応を促進し得る状態で反応系内に存在すれば、その形態に特に限定はない。すなわち、所定の酵素活性を有するタンパク質の存在下で反応を行う際の、反応系内における当該タンパク質の具体的な存在形態としては、例えば、タンパク質を生産する微生物を含む培養物、その培養物から分離された微生物菌体、菌体処理物などが含まれる。微生物を含む培養物とは、微生物を培養して得られる物のことであり、より具体的には、微生物菌体、その微生物の培養に用いた培地および培養された微生物により生成された物質、及びこれらの混合物などのことをいう。また、微生物菌体は洗浄し、洗浄菌体として用いてもよい。また、菌体処理物には、菌体を破砕、溶菌、凍結乾燥したものなどが含まれ、さらに菌体などを処理して回収される無細胞抽出物や粗精製タンパク質、これらをさらに精製した精製タンパク質などが含まれる。精製処理されたタンパク質としては、各種精製法によって得られる部分精製タンパク質等を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化タンパク質を使用してもよい。また、使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清も、酵素活性を有するタンパク質の含有物として利用できる。
　次に本発明で用い得るのタンパク質の調製方法、並びにこれに用いられる組換え体および形質転換体の作製方法について、上記（Ａ）のタンパク質を一例として説明する。他の（Ｂ）から（Ｈ）に示すタンパク質についても同様に実施可能である。
　上記タンパク質（Ａ）を発現する形質転換体は、上記のいずれかの塩基配列を有するポリヌクレオチドを組み込んだ組換えポリヌクレオチドを作製し、これを用いて作製することができる。例えば、配列番号５に示される塩基配列を有するＤＮＡを組み込んだ組換えＤＮＡを作製して適切な宿主に導入することにより、タンパク質（Ａ）を発現する形質転換体を得ることができる。配列番号５の塩基配列を有するＤＮＡにより特定されるタンパク質を発現させるための宿主としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、及びバチルス　ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピヒア　スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ　ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。培養等の取り扱いが簡便で、高価な成分を要せずとも培養できる宿主を用いることにより、システイン誘導体の大量生産をより簡便に、また安価に行うことができる。
　配列番号５の塩基配列を有するＤＮＡを宿主に導入するために用いる組換えＤＮＡは、発現させようとする宿主の種類に応じたベクターに、これらのＤＮＡを、ＤＮＡがコードするタンパク質が発現可能な形態で挿入することで調製可能である。タンパク質を発現させるためのプロモータとしては、シュードモナス　クロロラフィスなどに由来する上記酵素をコードする遺伝子固有のプロモータが宿主細胞で機能する場合には、そのプロモータを使用することができる。また、必要に応じて宿主細胞で働く他のプロモータを、配列番号５などのＤＮＡに連結し、そのプロモータ制御下で発現させるようにしてもよい。
　組換えＤＮＡを宿主細胞に導入するための形質転換法としては、例えば、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６８，　３２６　（１９７９））あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．　ａｎｄ　Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））等が挙げられる。
　目的のタンパク質を組換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、そのタンパク質を生産する形質転換体内でそのタンパク質が会合し、タンパク質の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ）を形成させる形態も好ましい一実施形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
　目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。
　形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、例えば、大腸菌Ｋ１２株亜種のエシェリヒア　コリ　ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株などから選択することが出来る。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ｐｒｅｓｓ　（２００１／０１／１５）などにも記載されている。以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いて所定の酵素を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。
　本発明で用いられる酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ、Ｔ５プロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。また、ベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８、ｐＱＥ３０およびその誘導体等を用いることができる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。さらに、プロモータを含み、挿入ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクターを使用することもできる。
　本発明で用いられるタンパク質を融合タンパク質封入体として生産させるためには、そのタンパク質の上流あるいは下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子とする。このような他のタンパク質をコードする遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパク質の溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ　１０、β－ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン－２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
　これらの遺伝子とタンパク質をコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよい。
　また、生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネータを連結することが好ましい場合がある。このターミネータとしては、例えば、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
　酵素活性を有するタンパク質又はその融合タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、プラスミドについての「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
　また、形質転換体を選別するために、ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが市販されている（例えば、ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３－２（クローンテック製）ほか）。
　プロモータ、所定の活性を有する目的タンパク質又はその目的タンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子、場合によってはターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。
　得られた組換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、所定のタンパク質又はその融合タンパク質が発現生産される。
　融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、目的タンパク質内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いて目的タンパク質を切り出せるようにしてもよい。
　生産培地としては、例えばＭ９－カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
　目的のタンパク質又はこれを含む融合タンパク質を回収するには、以下の方法などがある。目的タンパク質あるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法により、目的タンパク質あるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、目的タンパク質あるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化し、変性剤を透析等により除去して目的タンパク質を得ることができる。
　以下、本発明について実施例を示しより詳細に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。下記実施例において便宜上下記の略称が用いられる場合がある。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ　Ｂ２３株由来のアシルＣｏＡ合成酵素の遺伝子を「ａｓｃＡ」と表記する場合がある。また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ　Ｂ２３株由来のアシルＣｏＡ合成酵素を「ＡｃｓＡ」と表記する。そのＣ末端にヒスチジンのタグを付けたアシルＣｏＡ合成酵素を「ＡｃｓＨｉｓ」と表記する場合がある。
＜実施例１＞ＡｃｓＡによるＬ－システインとイソブチレートとを基質として用いた酵素反応
　ＡｃｓＡ（アミノ酸配列：配列番号６）の基質特異性を詳細に検討するために、ＣｏＡの代替基質としてＬ－システインを使用した。ＡｃｓＡはアシルＣｏＡ合成についてイソブチレートをカルボン酸として用いた場合に最高の触媒効率（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）を示すことから、Ｌ－システインとイソブチレートとを基質として用いた酵素反応を行った。得られた反応混合物を、Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ　ＳＣＲ－１０２Ｈイオン排除クロマトグラフィカラム（島津製作所社製）による高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）にかけて分析すると、新しい生成物ピーク（保持時間：１５分）が出現した。生成物の量は、反応時間及び酵素濃度に比例した。生成物の増加と平行して、ＡＴＰとイソブチレートの減少及びＡＭＰの増加が同時に検出された。他の新しい生成物は生じなかった。ＡｃｓＡがなければ、新しい生成物及びＡＭＰは検出されなかった。
　高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量スペクトルは、単離された新規生成物の分子量が１９１．２５であることを示した。その質量が、脱水を介してイソブチレートとシステインを結合させる化合物：（ＣＨ３）２ＣＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２－ＳＨ（Ｎ－イソブチリル－システイン）又は（ＣＨ３）２ＣＨ－ＣＯ－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨ（Ｓ－イソブチリル－システイン）に相当したので、この生成物を「ＩＣ結合化合物」と命名した。
　反応混合物を供給したＳｈｉｍ－ｐａｃｋ　ＳＣＲ－１０２Ｈカラムを用いて、Ｎ－イソブチリル－システイン標準品（ＣＨ３）２ＣＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２－ＳＨ］はＩＣ結合化合物と全く同一保持時間に溶出された。ＨＰＬＣ　ＣＲＯＷＮＰＡＫ（登録商標）ＣＲ（＋）カラム（ダイセル化学工業株式会社）を用いても、Ｎ－イソブチリル－システイン標準品とＩＣ結合化合物は同一保持時間（９．０分）に溶出された。新規生成物、ＩＣ結合化合物の構造は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによっても同定された。結果を図１に示す。図１において、（ａ）は、反応混合物のＭＳ／ＭＳスペクトル示し、（ｂ）は、標準品についてのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。図１に示される通り、生成物の断片化パターンは、Ｎ－イソブチリル－システイン標準品［（ＣＨ３）２ＣＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２－ＳＨ］のそれに完全に一致した。Ｎ－イソブチリル－システインにのみ認められるはずの断片（Ｍ．Ｗ．＝１１２）も検出された。
　さらに、この同定はＩＣ結合化合物のＮＭＲスペクトルによっても支持された。
［ＮＭＲスペクトル］
ＩＣ結合化合物（反応生成物）：１Ｈ－ＮＭＲ：　δ　４．３１　（ｄｄ，　Ｊ　＝　４．４６，　６．１７　Ｈｚ），　２．８５　（ｄｄ，　Ｊ　＝　４．４５，　１４．２　Ｈｚ），　２．８０　（ｄｄ，　Ｊ　＝　６．１７，　１４．０　Ｈｚ），　２．４７　（ｑ　ｏｒ　ｑｑ），　０．９７　（ｄ，　Ｊ　＝　５．７４　Ｈｚ），　０．９８　（ｄ，　Ｊ　＝　６．９５　Ｈｚ）．　　１３Ｃ－ＮＭＲ：　δ　１７６．２３，　５５．３１３，　２６．３５，　１８１．１２，　３５．２７，　１９．１９，　１８．７２．
Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（標準品）：１Ｈ－ＮＭＲ：　δ　４．４３　（ｄｄ，　Ｊ　＝　４．６８，　６．９９　Ｈｚ），　２．８５　（ｄｄ，　Ｊ　＝　４．６８，　１４．２　Ｈｚ），　２．８０　（ｄｄ，　Ｊ　＝　６．９９，　１４．２　Ｈｚ），　２．４７　（ｑ　ｏｒ　ｑｑ），　０．９７　（ｄ，　Ｊ　＝　６．９１　Ｈｚ），　０．９８　（ｄ，　Ｊ　＝　６．８６　Ｈｚ）．　　１３Ｃ－ＮＭＲ：　δ　１７４．１８，　５５．０３，　２５．４１，　１８１．６５，　３５．０６，　１９．０２，　１８．７８．
　キラル化合物の分離カラム、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＱＮ－ＡＸ（ダイセル化学工業株式会社）によるＨＰＬＣ分析を行った。その結果を図２に示す。図２中の（ａ）～（ｄ）は、それぞれ（ａ）Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン標準品、（ｂ）Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン標準品、（ｃ）ＡｃｓＡを含有した反応混合物、及び（ｄ）ＡｃｓＡなしについての反応混合物の２４０ｎｍにおけるＨＰＬＣクロマトグラフを示す。図２（ａ）のＰ１は、Ｎ－イソブチル－Ｄ－システインのピークを示す。図２（ｂ）のＰ２は、Ｎ－ブチリル－Ｌ－システインのピークを示す。図２（ｄ）は、ＡｃｓＡを添加しなかった場合（すなわち、コントロール）のクロマトグラフである。図２（ｃ）のＰ３のピークが示すように、得られたＩＣ結合化合物がＮ－イソブチリル－Ｌ－システインであることが明らかとなった。以上の結果から、ＡｃｓＡがアミド結合の形成を触媒する、すなわちＡｃｓＡはＳ－アシル化だけでなくＮ－アシル化も触媒することが可能であることが明らかとなった。
　Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン標準品を標準として用いて、ＡｃｓＡのＮ－イソブチリル－Ｌ－システイン合成活性を算出し、これらの値をイソブチリル－ＣｏＡ合成活性と比較した。その結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表１に示されるように、ＩＣ結合活性のＶｍａｘ値（０．１９７Ｕ／ｍｇ）は、イソブチリル－ＣｏＡ合成活性（２．７７Ｕ／ｍｇ）の１５分の１だった。
　また、双方の反応のイソブチレートのＫｍ値はほぼ一致していた。それにひきかえ、ＣｏＡとシステインのＫｍ値の間に有意差があった。
＜実施例２＞各種カルボン酸に対するＡｃｓＡの基質特異性
　種々の酸のＮ－アシル化を触媒するＡｃｓＡの能力を、調べた結果を表２に示す。表２に示す相対活性度は、イソブチレートの場合を１００％として、これに対する相対割合として表した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　表２に示されるように、アセテート（Ｃ２）、プロピオネート（Ｃ３）、ブチレート（Ｃ４）、バレレート（Ｃ５）、ヘキサノエート（Ｃ６）、ヘプタノエート（Ｃ７）、アクリレート又はクロトネートを基質として用いた場合、ＡＭＰの増加が示された。プロピオネート、ブチレート及びアクリレートの場合、反応生成物をＳｈｉｍ－ｐａｃｋ　ＳＣＲ－１２０によって分離し（保持時間はそれぞれ、１５分、１８分、１７．８分）、液体クロマトグラフィエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ）によって、それらの分子量を分析した。ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳの結果、それぞれの生成物が、相当する推定分子量（Ｎ－プロピオニル－Ｌ－システインの分子量：１７７、Ｎ－ブチリル－Ｌ－システインの分子量：１９１、Ｎ－アクリリル－Ｌ－システインの分子量：１７５）に一致した。これらの結果は、ＡｃｓＡが種々のＮ－アシル－Ｌ－システインの合成反応を触媒することを実証するものである。
＜実施例３＞システインおよびその類似化合物に対するＡｃｓＡの基質特異性
　本条件においては、Ｄ－システインを基質として用いると、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システインの非常にわずかな生成が確認された（Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン生成の２０分の１）。従って、この新規の反応を利用して、Ｄ－システイン化合物を基質として用いればＤ－システイン誘導体を製造可能と推定された。
　さらに、イソブチレートと、Ｌ－システインの代わりにＤＬ－ホモシステイン（図３、式（ｃｙ２））又はＬ－システインメチルエステル（図３、式（ｃｙ３））を基質として用いるとＡＭＰの増加が認められ、Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ　ＳＣＲ－１２０によって生成物の分離が確認された（保持時間はそれぞれ１９分又は２８分）。ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳによって分析されたそれらの分子量がどちらも２０５であったことから、Ｎ－イソブチリル－ＤＬ－ホモシステイン又はＮ－イソブチリル－Ｌ－システインメチルエステルが生じたことを示している。
　他方、セリン（図３、式（ｎａ１））、Ｌ－２－アミノブチレート（図３、式（ｎａ２））又はシステアミン（図３、式（ｎａ３））をそれぞれ基質として用いると、ＡＭＰの増加は検出されなかった。したがって、この新規のＮ－アシル化反応のアミノ供与体基質は、チオール基（－ＳＨ）と、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）又はそのエステル基とを必要とするものと考えられる。
＜実施例４＞Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のアセチルＣｏＡ合成酵素による反応
　さらに、別の種類のアシルＣｏＡ合成酵素のＮ－アシル－Ｌ－システイン合成反応を検討した。先ず、サッカロミセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のアセチルＣｏＡ合成酵素（シグマ－アルドリッチ社より購入）の存在下で基質としてのＬ－システイン及びアセテートを反応させた。反応混合物から、Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ　ＳＣＲ－１２０カラムによって分離された新しい生成物ピークが認められた（保持時間：１４．９分）。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析の結果は、生成物の分子量及びピークの断片化がＮ－アセチル－Ｌ－システイン標準品のそれらに一致することを示した（図４）。図４（ａ）は、アセテートとシステインの連結性化合物のＭＳ／ＭＳスペクトル、（ｂ）は、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン標準品のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。Ｎ－アセチル－Ｌ－システインを標準として用いて、システインのＶｍａｘ値０．０２Ｕ／ｍｇ及びＫｍ値１４．６ｍＭを算出した。
　アセテート及びＤＬホモシステインを基質として用いると、生成物と予想される新しいピークが検出され、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳによる分析の結果、生成物の分子量は、Ｎ－アセチル－ＤＬ－ホモシステインの分子量１７７に一致したことから、Ｎ－アセチル－ＤＬ－ホモシステインが生じたことを示している。同様に、アセテート及びＬ－システインメチルエステルを基質として用いると、生成物と予想される新しいピークが検出され、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳによる分析の結果、生成物の分子量は、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインメチルエステルの分子量１７７に一致したことから、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインメチルエステルが生じたことを示している。
　以上の結果から、原核生物のみならず、真核生物に由来するアシルＣｏＡ合成酵素も、式（ＩＩＩ）のシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有することを示す。
＜実施例５＞Ｐｈｏｔｉｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓ由来のホタルルシフェラーゼによる反応
　さらに、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓ（フォティナス　ピラリス）由来のホタルルシフェラーゼを用いて、システイン誘導体の合成反応を検討した。先ず、フォティナス　ピラリス由来のルシフェラーゼ（プロメガ社より購入）の存在下で、基質としてのＬ－システイン及びルシフェリンを反応させた。反応混合物から、５Ｃ１８－ＭＳ－ＩＩカラムによって分離された新しい生成物ピークが認められた（リテンションタイム：３８．０分）。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析の結果は、生成物の分子量及びピークの断片化がＮ－ルシフェリル－Ｌ－システイン標準品のそれらに一致することを示した（図５）。図５（ａ）は、ルシフェリンとシステインの連結性化合物のＭＳ／ＭＳスペクトル、（ｂ）は、Ｎ－ルシフェリル－Ｌ－システイン標準品のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
　以上の結果から、以上の結果から、アデニレート合成酵素スーパーファミリーに属する酵素も、式（ＩＩＩ）のシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有することを示す。
＜方法の詳細な説明＞
　以下、上記において用いられた試料の調製および各種測定の方法について、より詳細に説明する。
（１）アシルＣｏＡ合成酵素の調製方法
　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ　Ｂ２３株におけるインタクト（ｉｎｔａｃｔ）なアシルＣｏＡ合成酵素を発現させるためのプラスミドｐＥＴ－ａｃｓＡを構築し、橋本ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０，８６６０－８６６７（２００５）において報告された方法に準じて、発現産物（ＡｃｓＡ：受入番号：ＢＡＤ９０９３３）を精製した。Ｃ末端にヒスチジンのタグを付けたアシルＣｏＡ合成酵素を発現させるために、ｐＥＴ－ａｃｓＡを鋳型としてＡｃｓＡ遺伝子（配列番号５）のフラグメントをＰＣＲによって増幅した。
　ＰＣＲ用のプライマーとして、下記表３に示す配列番号１及び２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。配列番号１の塩基配列に示した下線部は、ＮｄｅＩ認識部位を示す。また、配列番号２の塩基配列に示した下線部はＸｈｏＩ認識部位を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩでＰＣＲ産物を消化して、ｐＥＴ－２４ａ（＋）の相当する部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＥＴ－ａｃｓＡＨｉｓと表した。ｐＥＴ－ａｃｓＡＨｉｓによって大腸菌ＢＬ－２１－ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ－（ＤＥ－３）－ＲＩＬ株を形質転換した。カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍＬ）を伴った２ｘＹＴ培地中で３７℃にて形質転換させた細胞を増殖させた。Ａ６００ｎｍが０．６のとき、インキュベート温度を１８℃に下げ、１ｍＭのイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシドによってタンパク質の発現を誘導した。
　１２時間の培養の後、遠心分離によって細胞を回収し、２回洗浄し、１ｍＭのＥＤＴＡ及び１０％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含有する２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）（ｐＨ７．４）に懸濁させた。再懸濁させた細胞を超音波処理し、その残渣を超遠心分離（１００，０００ｘｇ、６０分）によって除いた。得られた上清をＮｉでキレートしたカラムＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＨＰ（５ｍＬ）（ＧＥヘルスケア英国社）にかけ、０．５ＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。イミダゾールの線形勾配（０．０１～０．４Ｍ）によってＡｃｓＡＨｉｓを溶出した。活性のある分画を回収し、透析し、次いで酵素溶液を、２０ｍＭのＫＰＢ（ｐＨ７．５）で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラム（６ｍＬ）（ＧＥヘルスケア英国社）にかけた。同じＫＰＢにおいて０～０．５Ｍに線形様式でＫＣｌのイオン強度を高めることによって酵素を溶出した。活性のある分画を混合し、ＥＤＴＡ及びグリセロールを伴う２０ｍＭのＫＰＢに対して透析した。ＥＤＴＡ及びグリセロールがアシルＣｏＡ合成酵素及びＮ－アシル化活性に影響を与えないことを確認した。
　精製したＡｃｓＡＨｉｓの均質性をドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって確認した。精製したＡｃｓＡＨｉｓの円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルはＡｃｓＡのそれと同一であることが確認された。また、ＡｃｓＡＨｉｓ及び未処理のＡｃｓＡの双方がほとんど同一の比活性を示した（イソブチリル－ＣｏＡ合成酵素活性：それぞれ１６．３及び１５．１Ｕ／ｍｇ，Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン活性：それぞれ０．０１２及び０．０１３Ｕ／ｍｇ）。
　そのほかの精製酵素、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）のアセチルＣｏＡ合成酵素はそれぞれシグマ－アルドリッチ社及びプロメガ社から購入した。
（２）酸－システイン連結性化合物の検出及びその構造決定の方法
　Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ　ＳＣＲ－１０２Ｈカラム（８．０ｘ３００ｍｍ）を備えた島津ＬＣ－６Ａシステム（島津製作所社製）によるＨＰＬＣによって反応混合物を分析した。移動相の溶媒系は、０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸溶媒（ｐＨ３．０）とし、４０℃、流速０．８ｍＬ／分にてクロマトグラフィ分離を行った。生成物としての試料の量は、１９２ｎｍでのカラム溶出物をモニターすることによって測定した。ＩＣ結合化合物（イソブチレート(Ｉｓｏｂｕｔｙｒａｔｅ）とシステイン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）の結合化合物）の精製、及び、そのほかの酸－システイン結合化合物（すなわち、アシル－Ｌ－システイン、アシル－ＤＬ－ホモシステイン及びアシル－Ｌ－システインメチルエステル）について分析する際にも、このＨＰＬＣアッセイを用いた。
　ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＱＮ－ＡＸ又はＱＤ－ＡＸ（１５０ｘ４．６ｍｍ、ナイカラテック社製）のＨＰＬＣカラムによって生成物のキラル性を決定した。移動相の溶媒系はメタノール溶媒中３％（ｖ／ｖ）の酢酸とし、２５℃、流速０．８ｍＬ／分にてクロマトグラフィ分離を行った。
　精製された酸－システイン結合化合物のＦＡＢ質量スペクトルは、マトリクスとしてグリセロールを用いたＪＭＳ－ＨＸ１１０Ａ機器（日本電子株式会社（ＪＥＯＬ）製）によって得た。Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ　ＳＣＲ－１０２Ｈカラムを備えた島津ＬＣＭＳ－２０１０ＥＶシステム（島津製作所社製）にてＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ解析を行った。０．１％のギ酸溶媒（ｐＨ３．０）によって試料を溶出し、４０℃、流速０．８ｍＬ／分にてクロマトグラフィ分離を行った。＋４．５ｋＶ又は－３．５ｋＶのＥＳＩ電圧をエミッタに適用した。ネブライザーのガスの流速及び乾燥ガス圧はそれぞれ１．５Ｌ／分及び０．２ＭＰａに設定した。各スペクトルは、１秒当たり１スキャンで取った。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析については、Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ　ＳＣＲ－１０２Ｈカラムを備えたＡｇｌｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣシステム（アグリレントテクノロジーズ社製）を用いた。ＱＳＴＡＲ　ＸＬ質量分析装置（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて電気スプレーのポジティブモード及びネガティブモードにてＭＳ／ＭＳ解析のデータを取得した。Ｂｒｕｋｅｒ　Ａｖａｎｃｅ６００分光計によってＮＭＲスペクトルを測定した。内部標準として使用されたＤ２Ｏに溶解することによって試料を調製した。
（３）酵素アッセイの方法
　（３－１）アシルＣｏＡ合成酵素の活性の測定方法
　橋本ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０，８６６０－８６６７（２００５）で報告されたアッセイ系に準じて、アシルＣｏＡ合成酵素の活性測定した。反応混合物（６０μＬ）として、２００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中にＡＴＰ（５ｍＭ）、ＣｏＡ（８ｍＭ）、酸（５ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（８ｍＭ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（１００ｍＭ）及び精製した酵素（１μｇ）を混合した。酵素を添加することによって反応を開始し、２０℃にて４分間インキュベートした。等量（６０μＬ）のメタノールを反応混合物に添加することにより反応を停止し、遠心分離（１５，０００ｘｇ、１０分）によって上清を得た。移動相溶媒Ａとして０．０５％のジチオスレイトールを含む２２０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４ーＨ３ＰＯ４緩衝液（ｐＨ４．０）、移動相溶媒Ｂとして２％クロロホルム／９８％メタノール（ｖ／ｖ）を用いてＣｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８－ＡＲ－ＩＩ　ＨＰＬＣカラム（１５０ｘ４．６ｍｍ、ナカライテスク社製）によってアシルＣｏＡを分離した。
移動相溶媒の組成は、次の通りとした。
０分；９４％移動相溶媒Ａ／６％移動相溶媒Ｂ
３分；９２％移動相溶媒Ａ／８％移動相溶媒Ｂ
４．５分；８７％移動相溶媒Ａ／１３％移動相溶媒Ｂ
６分；８０％移動相溶媒Ａ／２０％移動相溶媒Ｂ
９分；５５％移動相溶媒Ａ／４５％移動相溶媒Ｂ
１０．５分；５５％移動相溶媒Ａ／４５％移動相溶媒ＢＢ
１３分；９４％移動相溶媒Ａ／６％移動相溶媒Ｂ
１５分；９４％移動相溶媒Ａ／６％移動相溶媒Ｂ
　（３－２）Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システインの合成活性の測定方法
　Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン合成活性のための反応混合物（６０μＬ）として、２００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中にＡＴＰ（５ｍＭ）、システイン（１０ｍＭ）、酸（５ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（８ｍＭ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（１００ｍＭ）及び精製した酵素を混合した。酵素（６μｇ）を添加することによって反応を開始し、２０℃にて４分間インキュベートした。５％ギ酸溶媒（５μＬ、最終的に０．７％、ｐＨ３．０）を反応混合物に添加することにより反応を停止し、遠心分離（１５，０００ｘｇ、１０分）によって上清を得た。ＣＲＯＷＮＰＡＫ　ＣＲ（＋）カラム（１５０ｘ４ｍｍ）によるＨＰＬＣによって活性の反応率を測定した。移動相の溶媒は過塩素酸溶媒（ｐＨ１．５）とし、２５℃、流速０．８ｍＬ／分にてクロマトグラフィ分離を行った。Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン又はＮ－アセチル－Ｌ－システインの標準品を標準として１９２ｎｍにてカラムの溶出物をモニターすることによって生成物の量を測定した。（保持時間：Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システインは８．９分であり、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインは３．１分である）。
　（３－３）酸依存性のＡＭＰ形成の測定方法
　ＴｉｔａｎｓｐｈｅｒｅＴｉＯ　ＨＰＬＣカラム（１５０ｘ４．６ｍｍ、ＧＬサイエンス社）によって各反応シリーズにおけるＡＭＰ、ＡＤＰ及びＡＴＰを測定した。移動相の溶媒は、５０％（ｖ／ｖ）のアセト二トリルを伴った５０ｍＭのＫＰＢ（ｐＨ７．０）とし、５０℃、流速１ｍＬ／分にてクロマトグラフィ分離を行い、２６０ｎｍにてモニターした。アシルＣｏＡ合成活性の１単位は、１分当たり、１μｍｏｌのアシルＣｏＡ及び１μｍｏｌのＡＭＰの形成を触媒する酵素の量として定義した。同様に、Ｎ－アシル－Ｌ－システインの１単位は、１分当たり、１μｍｏｌのＮ－アシル－Ｌ－システイン及び１μｍｏｌのＡＭＰのそれとして定義した。
　比活性は、単位／ｍｇタンパク質として表現した。Ｋｃａｔ値は、それぞれＡｃｓＡ又はＡｃｓＡＨｉｓについての６０，２１０又は６１，２７８のＭｒによって算出した。
（４）他の基質についての酵素アッセイの方法
　アシルＣｏＡ、アミノ酸、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン、及びＮ－アセチル－Ｌ－システインはすべてシグマ・アルドリッチ社から購入した。酸及びＡＴＰはそれぞれナカライテック社及びキシダ化学株式会社から購入した。市販の甲虫ルシフェリン（別名：Ｄ－ルシフェリン、プロメガ社）をホタルルシフェラーゼの基質として使用した。ウシ血清アルブミンを標準としてナカライテスク社のタンパク質アッセイキットによってタンパク質濃度を測定した。ラムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）によって記載された１１％のポリアクリルアミドスラブゲルでＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。クマシーブリリアントブルーＲ－２５０でゲルを染色した。２０℃にて分光光度計Ｊ７２０（日本分光株式会社（Ｊａｓｃｏ）社製）を用いて、精製したタンパク質のＣＤスペクトルを得た。
（５）Ｎ－ルシフェリル－Ｌ－システインのアッセイ方法
　１０ｍＭ　Ｄ－ルシフェリン、１００ｍＭ　Ｌ－システイン、１０ｍＭ［ＡＴＰ、１６ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む溶液と、Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（ｐＨ７．８）に懸濁された精製ホタルルシフェラーゼとを混合した反応溶液を、２０℃でインキュベートした。反応終了後、５Ｃ１８－ＭＳ－ＩＩカラム（４．６ｘ１５０ｍｍ、ナイカラテスク製）を備えたＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ（ＬＣＭＳ－２０１０ＥＶ、島津製作所製）を用いて分析した。移動相溶媒として、１０％アセトニトリルを含む２０ｍＭアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ４．９）を用い、クロマトグラフィー分離を５０℃、フローレート１ｍｌ／分にて実施した。１９０－６００ｎｍの波長をモニタリングして、生成物の定量を行った。
　ＭＳ分析は、以下の手法により得た。ＣＤＬ（Ｃｕｒｖｅｄ　Ｄｅｓｏｌｖｔａｉｏｎ　Ｌｉｎｅ）２５０、ブロックヒーター温度２００℃に設定した。ネブライザーガス流量および乾燥ガス圧力はそれぞれ１．５Ｌ／分、０．２ＭＰａとした。検出電力は＋４．５ｋＶまたは－３．５ｋＶとした。イオンソースのポラリティは、ポジティブ及びネガティブモードに設定した。
　本発明は、システイン誘導体の製造及びこれに係る製品群が属する技術分野において有用である。

Claims (12)

  1. 　アシルＣｏＡ合成酵素活性を有するタンパク質の存在下で、式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式（Ｉ）中、Ｒ１は、水素又は炭素数１から１９の飽和若しくは不飽和の炭化水素基を示す。Ｒ１は直鎖でも、分岐していてもよい。Ｒ１はさらに置換基として炭素数１から３のアルキル基を有していてもよい。）
    で示されるカルボン酸と、式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式（ＩＩ）中、Ｒ２は、カルボキシル基又はそのエステルを示す。式（ＩＩ）中、ｎは１又は２の整数を示す。）
    で示されるシステイン化合物とを混合して反応させ、式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式（ＩＩＩ）中、Ｒ１は式（Ｉ）におけるＲ１と同じであり、Ｒ２は式（ＩＩ）におけるＲ２と同じ。）
    で示されるシステイン誘導体を生成させる、システイン誘導体の製造方法。
  2. 　前記式（Ｉ）のＲ１が炭素数１から９の飽和又は不飽和の炭化水素であり、該Ｒ１は直鎖でも分岐していてもよい、請求項１に記載のシステイン誘導体の製造方法。
  3. 　前記式（Ｉ）で示されるカルボン酸が、酢酸、プロパン酸、ブタン酸、イソ酪酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、アクリル酸、及びクロトン酸からなる群より選ばれる１種又は２種以上である、請求項１に記載のシステイン誘導体の製造方法。
  4. 　前記式（ＩＩ）中、Ｒ２が、下記式（ＩＶ）：
    －ＣＯＯＲ３　　　・・・（ＩＶ）
    （式（ＩＶ）中、Ｒ３は水素又は炭素数１から５のアルキル基を示す。）
    で表される基である、請求項１から３のいずれか一項に記載のシステイン誘導体の製造方法。
  5. 　前記式（ＩＩ）のシステイン化合物が、システイン、ホモシステイン、及びシステインメチルエステルからなる群より選ばれる１種又は２種以上である、請求項１から３のいずれか一項に記載のシステイン誘導体の製造方法。
  6. 　前記アシルＣｏＡ合成酵素活性を有するタンパク質が、シュードモナス属及びサッカロミセス属からなる群より選ばれる属に属する微生物に由来するタンパク質である、請求項１から５のいずれか一項に記載のシステイン誘導体の製造方法。
  7. 　前記アシルＣｏＡ合成酵素活性を有するタンパク質が、下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）および（Ｆ）からなる群：
    （Ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
    （Ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、及び付加からなる群より選ばれる１又は数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、前記式（Ｉ）で示されるカルボン酸と、前記式（ＩＩ）で示されるシステイン化合物とを反応させて、前記式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有するタンパク質、
    （Ｃ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
    （Ｄ）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、及び付加からなる群より選ばれる１又は数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、前記式（Ｉ）で示されるカルボン酸と、前記式（ＩＩ）で示されるシステイン誘導体とを反応させて、前記式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有するタンパク質、
    （Ｅ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、及び
    （Ｆ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、及び付加からなる群より選ばれる１又は数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、前記式（Ｉ）で示されるカルボン酸と、前記式（ＩＩ）で示されるシステイン誘導体とを反応させて、前記式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有するタンパク質、
    より選ばれる１種又は２種以上のタンパク質である、請求項１から６のいずれか一項に記載のシステイン誘導体の製造方法。
  8. 　前記アシルＣｏＡ合成酵素活性を有するタンパク質を生産する微生物と、前記式（Ｉ）で示されるカルボン酸及び式（ＩＩ）で示されるシステイン化合物を混合して反応させ、前記式（ＩＩＩ）に示されるシステイン誘導体を生成させる、請求項１から７のいずれか一項に記載のシステイン誘導体の製造方法。
  9. 　前記アシルＣｏＡ合成酵素活性を有するタンパク質を生産する微生物を含む培養物と、前記式（Ｉ）に示されるカルボン酸及び前記式（ＩＩ）に示されるシステイン化合物とを混合して反応させ、前記式（ＩＩＩ）に示されるシステイン誘導体を生成させる、請求項１から７のいずれか一項に記載のシステイン誘導体の製造方法。
  10. 　前記アシルＣｏＡ合成酵素活性を有するタンパク質を生産する微生物の菌体処理物と、前記式（Ｉ）に示されるカルボン酸及び前記式（ＩＩ）に示されるシステイン化合物とを混合して反応させ、前記式（ＩＩＩ）に示されるシステイン誘導体を生成させる、請求項１から７のいずれか一項に記載のシステイン誘導体の製造方法。
  11. 　前記アシルＣｏＡ合成酵素活性を有するタンパク質を生産する微生物が、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）からなる群：
    （ａ）配列番号５に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド、
    （ｂ）配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、前記式（Ｉ）で示される脂肪族カルボン酸と、前記式（ＩＩ）で示されるシステイン化合物とを反応させて、前記式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
    （ｃ）配列番号７に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド、
    （ｄ）配列番号７に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、前記式（Ｉ）で示されるカルボン酸と、前記式（ＩＩ）で示されるシステイン化合物とを反応させて、前記式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
    （ｅ）配列番号９に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド、及び
    （ｆ）配列番号９に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、前記式（Ｉ）で示されるカルボン酸と、前記式（ＩＩ）で示されるシステイン化合物とを反応させて、前記式（ＩＩＩ）で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
    より選ばれる１種又は２種以上のポリヌクレオチドが導入された形質転換体である、請求項８から１０のいずれか一項に記載のシステイン誘導体の製造方法。
  12. 　アデニレート合成酵素スーパーファミリーに属し、かつ、下記（Ｇ）および（Ｈ）からなる群：
    （Ｇ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、及び
    （Ｈ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、置換、欠失、挿入、及び付加からなる群より選ばれる１又は数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式（Ｉ）中、Ｒ１は、水素又は炭素数１から１９の飽和若しくは不飽和の炭化水素基を示す。Ｒ１は直鎖でも、分岐していてもよい。Ｒ１はさらに置換基として炭素数１から３のアルキル基を有していてもよい。）
    で示されるカルボン酸と、式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （式（ＩＩ）中、Ｒ２は、カルボキシル基又はそのエステルを示す。式（ＩＩ）中、ｎは１又は２の整数を示す。）
    で示されるシステイン化合物とを反応させて、式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （式（ＩＩＩ）中、Ｒ１は式（Ｉ）におけるＲ１と同じであり、Ｒ２は式（ＩＩ）におけるＲ２と同じ。）
    で示されるシステイン誘導体を生成する反応を促進する活性を有するタンパク質、
    より選ばれる１種または２種以上のタンパク質の存在下で、前記式（Ｉ）で示されるカルボン酸と前記（ＩＩ）で示されるシステイン化合物とを混合して反応させ、前記式（ＩＩＩ）のシステイン誘導体を生成せしめる、システイン誘導体の製造方法。
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